SU1377292A1 - Способ очистки протеиназ цистеинового типа - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к способам очистки протеолитических ферментов цистеино- вого типа из растений. С целью упрощени  процесса в способе очистки протеиназ цистеинового типа аффинной хроматографией предложено в качестве сорбента использовать сефаро- зу, модифицированную иминодиуксус- ной кислотой, содержащую координационно св занные ионы ртути, а элю- цию вести буферным раствором, содержащим 0,4-0,6 М NaCl, при рН 6,5-7,5. Принципиальным отличием предлагаемого сорбента  вл етс  то, что, сорбирование происходит за счет ионов ртути, координационно св занных с поверхностью сорбента, а не ковалентно св занных с ним, что позвол ет осуществл ть злюцию сорбированного белка в более м гких услови х солевым раствором фосфатного буфера, а не дорогосто щими М вредными реактивами , такими как вб -цистеин и Jb -мер- каптоэтанол. Кроме того, способ очистки ферментов на предлагаемом сорбенте дает возможность значительно упростить стадию сорбции протеиназ т.к. отсутствует необходимость обрабатывать ферменты активирующими добавками и освобождатьс  от них перед очисткой, а также увеличить производительность за счет высокой емкости сорбента. (Л оа sj ю со to

Description

113

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к способам очистки протеолитических ферментов цистеино- .вого типа из растений.

Цель изобретени  - упрощение процесса .

Изобретение заключаетс  в том, чт в способе очистки протеиназ цистеино вого типа аффинной хроматографией предложено в качестве сорбента использовать сефарозу, модифицированную иминодиуксусной кислотой, содержащую координационно -св занные ионы ртути, а элюцию вести фосфатным буфером , содержащим 0,4-0,6 М NaCl при рН 6,5-7,5.

Принципиальным отличием предлагаемого сорбента  вл етс  то, что сорбирование происходит за счет ионо ртути, координационно св занных с поверхностью сорбента, а не ковалент- но св занньгх с ним. Это позвол ет осуществл ть элюцию сорбированного белка в более м гких услови х.

Способ осуществл ют следующим образом .

Очистке подвергают препараты ферментов , полученные из латекса дынного дерева Carica papaya или растений рода Ficus. Сорбент получают кова- леитным присоединением к эпоксипро- изводному сефарозы иминодиуксусной кислоты при 65 С в течение 24 ч. На- сьпцение поверхности полученного сорбента осуществл ют пропусканием через колонку с сорбентом 1%-ного раствора HgCl. Несорбированные ионы рту

ти отмывают водой. На колонку нанос т раствор белка в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,,5. Элюцию ведут тем же буфером, содержащим 0,4-0,6 М NaCl. При значени х рН меньщих, чем 6,5, не происходит полна  сорбци  белка, а при значени х выше 7,5 наблюдаетс  неспецифическа  сорбци  белков . Использование меньших, чем 0,4 М концентраций NaCl приводит к неполной злюции ферментов, а при концентраци х больших 0,6 М элюируютс  неспецифически сорбированные белки. Достигаема  степень очистки равна 2.

Изобретение иллюстрируетс  следующими примерами.

Пример 1. 140 мг латекса из дынного дерева Carica papaya (отечественный препарат производства Гагрс кого опорного пункта Главного Ботанического сада АН СССР) с активностью

5

5

0

5

Q

5

19 ед/мг белка раствор ли в 40 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,5 и пропускали через колонку с 6 мл сефарозы , модифицированной иминодиуксусной кислотой, содержащей координационно св занные ионы ртути. После отмывани  колонки тем же буфером от несорбированного белка проводили

элюцию 0,1 М фосфатным буфером, рН 6,5, содержащим 0,4 М NaCl. Получен- рый раствор содержал 36 мг белка с протеолитической активностью 38 ед/мг белка.

П р и М е р 2. 140 мг латекса раствор ли в 40 МП 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 и пропускали через колонку с 6 МП сорбента. После отмывани  колонки тем же буфером от несорбированного белка проводили элюцию 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 0,6 М NaCl. Полученный раствор содержал 120 мг белка с протеолитической активностью 30 ед/мг белка.

Примерз. Через колонку с 6 мл сорбента пропускали раствор 140 мг латекса в 40 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0. После отмывани  колонки от несорбированного белка осуществл ли элюцию сорбированного белка с помощью 0,5 М NaCl в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0. Получили 107 мг белкового материала с протео5 литической активностью 38 ед/мг,

Пример4. 50 мг фицина (препарат латекса растений рода Ficus, Calb iochem) раствор ли в 30 мл 0,1 М фосфатного буфера и пропускали через колонку с сорбентом. После промывани  колонки белковый материал элюи- ровали 0,5 М NaCl в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0. Получили 7 мг фицина , активность которого соответствует 40 ед/мг, что в 2 раза превышает активность исходного препарата.

Как видно из представленных примеров , оптимальными услови ми дл  элюции цистеиновых протеиназ с поверхности сорбента  вл ютс  0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0, содержащий 0,5 М NaCl. В результате полученные препараты ферментов латекса и фицин имеют активность 38 и 40 ед/мг соответственно . Таким образом, применение более простого сорбента, содержащего на своей поверхности координационно св занные ионы ртути, позвол ет примен ть дл  элюции сорби0

рованных протеинаэ простой способ, заключающийс  в промывании сорбента фосфатным буфером, содержащим NaCl.

Способ очистки ферментов на предлагаемом сорбенте дает возможность значительно упростить стадию сорбции протеиназ, так как отсутствует необходимость обрабатывать ферменты активирующими добавками и освобождатьс  от них перед очисткой, позвол ет осуществл ть элюцию более простым способом, т.е. солевым раствором фосфатного буфера, который исключает применение более дорогосто щих («t-цистеин и -меркаптоэтанол) и вредных (й-меркаптоэтанол) реактивов более дешевьш и безвредным (хлористый натрий), а также увеличить

производительность за счет высокой емкости сорбента.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ очистки протеиназ цистеи- нового типа, предусматривающий аффинную хроматографию на сорбенте на основе сефарозы, содержащем ионы lig , с последующей элюцией, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  процесса, в качестве сорбента используют сефарозу, модифицированную

   иминодиуксусной кислотой, содержащую координационно св занные ионы Hg, элюцию ведут фосфатным буфером, содержащим 0,4-0,6 М NaCl, а рН буферного раствора устанавливают 6,5-7,5.