CN108295779B - 一种磁性琼脂糖复合微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种磁性琼脂糖复合微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种磁性琼脂糖复合微球及其制备方法和应用。该磁性琼糖复合微球的制备方法包括：以环氧氯丙烷为交联剂和活化剂，以1,4‑二氧六环为间隔臂依次对四氧化三铁/琼脂糖复合微球进行交联和活化。使用本发明的制备方法得到的磁性琼脂糖微球的磁响应性提高，靶向性提高，对细胞裂解液中目标蛋白的提纯效率提高。

Description

一种磁性琼脂糖复合微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及聚合物微球技术领域，更具体地，涉及一种磁性琼脂糖复合微球及其制备方法和应用。
背景技术
传统的琼脂糖微球是多孔且具有高表面积，蛋白质在其中可以相互接触，并可以容纳大量的液体。在纯化大量蛋白的时候，传统的琼脂糖微球是最理想的材料。但是这种多孔的结构也会带来一些问题，如：1)抗体被困在孔内，难以洗去，因此需要大量的洗涤来降低背景；2)免疫沉淀的洗涤是在微量离心管中进行的，液体之间的交换通过移液枪来完成，很容易丢失样品。3)微球上的抗体与目标蛋白接触的慢，需要长的孵育时间。4)长的孵育时间及大量的洗涤导致目标蛋白的机械及生物(蛋白酶水解)损失。
磁性微球是广泛应用于生物医学领域的一种多功能材料，核心部位赋予了其分离功能，外层生物高分子功能基团赋予了其载体的功能，在酶的固定化、免疫测定、细胞分离、靶向药物、化学分析等领域有广泛的应用前景。琼脂糖有较好的生物相容性，表面有大量的官能团，因此琼脂糖磁性微球是一种很有应用前景的磁性微球。长期以来，人们一直用四氧化三铁作为磁核来制备琼脂糖磁性微球，但在粒径较小时，其磁响应性却不够理想，其纯化效果也不够理想。
发明内容
本发明提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的磁性琼脂糖复合微球的制备方法。该制备方法包括：
以环氧氯丙烷为交联剂和活化剂，以1,4-二氧六环为间隔臂依次对四氧化三铁/琼脂糖复合微球进行交联和活化。
使用环氧氯丙烷为交联剂和1,4-二氧六环为环氧剂依次对四氧化三铁/琼脂糖复合微球进行活化，使得得到的磁性琼脂糖微球的磁响应性提高，靶向性提高，对细胞裂解液中目标蛋白的提取效率提高。
在一个优选实施方式中，环氧氯丙烷与所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比为(0.1～1):1，优选为(0.3～0.6):1，进一步优选为0.5:1。其中，体积质量比优选为mL:g。即环氧氯丙烷与所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比为(0.1～1)mL:1g。
在一个优选实施方式中，1,4-二氧六环与所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比为(1～5):1，优选为(1～3):1。其中，1,4-二氧六环优选为体积比为50％的1,4-二氧六环水溶液。
在一个优选实施方式中，该制备方法具体包括：
1)取四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于溶剂中，向其中加入环氧氯丙烷，碱性条件下，50～80℃下反应90～150min，得到交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球；
2)取所述交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于碱溶液中，加入环氧氯丙烷和所述1,4-二氧六环，30～60℃下反应12～30h，得到接入间隔臂的磁性琼脂糖复合微球。该接入间隔臂的磁性琼脂糖复合微球即为所述磁性琼脂糖复合微球。
在一个优选实施方式中，步骤1)中环氧氯丙烷为交联剂，步骤2)中环氧氯丙烷为活化剂。其中，步骤1)中环氧氯丙烷与所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比优选为(0.02～0.2):1，进一步优选为0.1:1。步骤2)中环氧氯丙烷与所述交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比优选为(0.08～0.8):1，进一步优选为0.4:1。
在一个优选实施方式中，步骤1)中加入3～6M氢氧化钠溶液以形成碱性条件，优选在60～70℃下反应100～130min。
在一个优选实施方式中，步骤2)中碱溶液为1～3M氢氧化钠溶液。
在一个优选实施方式中，步骤2)中环氧氯丙烷与所述1,4-二氧六环的体积比为1:(1-5)，优选为1:(1-3)。
在一个优选实施方式中，四氧化三铁/琼脂糖复合微球的制备方法为：以琼脂糖和四氧化三铁为原料，以液体石蜡为油相溶剂，水为水相溶剂，司盘80为乳化剂，通过反相悬浮包埋法制备所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
在一个优选实施方式中，四氧化三铁/琼脂糖复合微球的制备方法具体为：将四氧化三铁分散于琼脂糖水溶液中，向其中加入含有司盘80的液体石蜡，在60～90℃下，在750～800转/分钟下搅拌10～40min。
在一个优选实施方式中，四氧化三铁与所述琼脂糖的质量比为1:(3～10)，优选为1:(3～6)。
在一个优选实施方式中，液体石蜡与水的体积比为(5～10):1，优选为(6～7):1。
根据本发明的另一个方面，提供了上述磁性琼脂糖复合微球的制备方法制备得到的磁性琼脂糖复合微球。
根据本发明的另一个方面，提供了上述磁性琼脂糖复合微球的制备方法在制备金属化磁性微球中的应用，包括以下步骤：
向含有配体溶液中加入所述磁性琼脂糖复合微球反应过夜，洗涤至中性得到复合微球，将所述复合微球分散于含有金属离子的溶液中反应，得到所述金属化磁性微球。
在一个优选实施方式中，金属离子优选为镍离子、钴离子、锌离子、铜离子或铁离子。配体优选为IDA。
在一个优选实施方式中，金属离子优选为镍离子，配体优选为IDA。得到的金属化磁性微球可以实现细胞裂解液中含有His组氨酸的蛋白的高效提取。
本发明提出的磁性琼脂糖复合微球的制备方法，使得到的磁性琼脂糖微球的磁响应性提高，靶向性提高，对细胞裂解液中目标蛋白的提取效率提高，在提取过程中孵育时间可缩短至25分钟以内，分离时间可缩短至15s以内，优选10s以内。
附图说明
图1为本发明试验例1中在提取细胞裂解液中含有His组氨酸的GP120蛋白时聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种磁性琼脂糖复合微球的制备方法，包括：
(1)0.1g四氧化三铁分散于含有0.5g琼脂糖的16mL水溶液；
(2)取4.0g Span80溶于100mL液体石蜡；
(3)在80℃的条件下，将两溶液混合，并强力机械搅拌(750～800转/分钟)30min，冷却至室温之后，用超纯水和乙醇洗涤三次，得到四氧化三铁/琼脂糖复合微球；
(4)取5g四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于5mL超纯水，并加入0.5mL环氧氯丙烷和5M氢氧化钠水溶液6mL在60℃下反应120min，得到交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
(5)取5g交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于2M氢氧化钠水溶液6.5mL，加入2mL环氧氯丙烷和1,4-二氧六环水溶液(50％，7.5mL)，在45℃下反应24h，得到磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
实施例2
本实施例提供了一种磁性琼脂糖复合微球的制备方法，包括：
(1)0.1g四氧化三铁分散于含有0.5g琼脂糖的16mL水溶液；
(2)取4.0g Span80溶于100mL液体石蜡；
(3)在80℃的条件下，将两溶液混合，并强力机械搅拌(750～800转/分钟)30min，冷却至室温之后，用超纯水和乙醇洗涤三次，得到四氧化三铁/琼脂糖复合微球；
(4)取5g四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于5mL超纯水，并加入0.6mL环氧氯丙烷和5M氢氧化钠水溶液6mL在60℃下反应120min，得到交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
(5)取5g交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于2M氢氧化钠水溶液6.5mL，加入2.4mL环氧氯丙烷和1,4-二氧六环水溶液(50％，15mL)，在45℃下反应24h，得到磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
实施例3
本实施例提供了一种磁性琼脂糖复合微球的制备方法，包括：
(1)0.1g四氧化三铁分散于含有0.5g琼脂糖的16mL水溶液；
(2)取4.0g Span80溶于100mL液体石蜡；
(3)在80℃的条件下，将两溶液混合，并强力机械搅拌(750～800转/分钟)30min，冷却至室温之后，用超纯水和乙醇洗涤三次，得到四氧化三铁/琼脂糖复合微球；
(4)取5g四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于5mL超纯水，并加入0.3mL环氧氯丙烷和5M氢氧化钠水溶液6mL在60℃下反应120min，得到交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
(5)取5g交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于2M氢氧化钠水溶液6.5mL，加入1.2mL环氧氯丙烷和1,4-二氧六环水溶液(50％，5.0mL)，在45℃下反应24h，得到磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
实施例4
本实施例提供了一种磁性琼脂糖复合微球的制备方法，包括：
(1)0.1g四氧化三铁分散于含有0.3g琼脂糖的16mL水溶液；
(2)取4.0g Span80溶于80mL液体石蜡；
(3)在80℃的条件下，将两溶液混合，并机械搅拌(300转/分钟)30min，冷却至室温之后，用超纯水和乙醇洗涤三次，得到四氧化三铁/琼脂糖复合微球；
(4)取5g四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于5mL超纯水，并加入0.5mL环氧氯丙烷和5M氢氧化钠水溶液6mL在60℃下反应120min，得到交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
(5)取5g交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于2M氢氧化钠水溶液6.5mL，加入2mL环氧氯丙烷和1,4-二氧六环水溶液(50％，7.5mL)，在45℃下反应24h，得到磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
实施例5
本实施例提供了一种磁性琼脂糖复合微球的制备方法，包括：
(1)0.1g四氧化三铁分散于含有1.0g琼脂糖的16mL水溶液；
(2)取4.0g Span80溶于160mL液体石蜡；
(3)在80℃的条件下，将两溶液混合，并机械搅拌(1000转/分钟)30min，冷却至室温之后，用超纯水和乙醇洗涤三次，得到四氧化三铁/琼脂糖复合微球；
(4)取5g四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于5mL超纯水，并加入0.5mL环氧氯丙烷和5M氢氧化钠水溶液6mL在60℃下反应120min，得到交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
(5)取5g交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于2M氢氧化钠水溶液6.5mL，加入2mL环氧氯丙烷和1,4-二氧六环水溶液(50％，7.5mL)，在45℃下反应24h，得到磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
试验例1
镍化磁性微球的制备
取4g IDA溶于1M碳酸钠水溶液25mL，并用饱和氢氧化钠溶液调节pH＝11.5，加入实施例1中得到的磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球，反应过夜，洗涤至中性，分散于0.5M的氯化镍水溶液100mL反应48h后，得到镍化磁性微球。
细胞裂解液中含有His组氨酸的蛋白的提取
1)用1x PBS缓冲液洗涤3次；
2)添加细胞破碎上清液，孵育15min后，用磁性分离约5s；
3)用1X PBS缓冲液洗涤3次；
4)用咪唑/1x PBS混合溶液洗脱；
5)取适量洗脱液，用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。
该实验例的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳的结果如图1所示，其中，1为标准Mark样品电泳的条带，2为由实施例1的磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球制备得到的镍化磁性微球提取细胞破碎液中样品电泳的条带，3为对比样中不含His组氨酸的蛋白的条带，4为商品化的镍琼脂糖微球填料柱。
从图1中可以看出，由实施例1的磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球制备得到的镍化磁性微球能有效提取分离含His组氨酸的蛋白。另外，由实施例1的磁性四氧化三铁/琼脂糖复合微球制备得到的镍化磁性微球提取细胞破碎液中样品时孵育时间为15分钟，磁分离时间为5s，实施例2～5中孵育时间为17分钟、20分钟、22分钟、25分钟，实施例2～5中磁分离时间分别为7s、8s、9s、15s，远远高于现有技术中30分钟以上的孵育时间，30s以上的磁分离时间。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种磁性琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，包括：
以环氧氯丙烷为交联剂和活化剂，以1,4-二氧六环为间隔臂依次对四氧化三铁/琼脂糖复合微球进行交联和活化；该制备方法具体包括：
1)取四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于溶剂中，向其中加入环氧氯丙烷，碱性条件下，50～80℃下反应90～150min，得到交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球；
2)取所述交联四氧化三铁/琼脂糖复合微球分散于碱溶液中，加入环氧氯丙烷和所述1,4-二氧六环，30～60℃下反应12～30h，得到接入间隔臂的磁性琼脂糖复合微球；
其中，步骤2)中碱溶液为1～3M氢氧化钠溶液。
2.根据权利要求1所述的磁性琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，所述环氧氯丙烷与所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比为(0.1～1):1。
3.根据权利要求2所述的磁性琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，所述环氧氯丙烷与所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比为(0.3～0.6):1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述1,4-二氧六环与所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比为(1～5):1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述1,4-二氧六环与所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的体积质量比为(1～3):1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中加入3～6M氢氧化钠溶液以形成碱性条件，在60～70℃下反应100～130min。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中环氧氯丙烷与所述1,4-二氧六环的体积比为1:(1-5)。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中环氧氯丙烷与所述1,4-二氧六环的体积比为1:(1-3)。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的制备方法为：以琼脂糖和四氧化三铁为原料，以液体石蜡为油相溶剂，水为水相溶剂，司盘80为乳化剂，通过反相悬浮包埋法制备所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的制备方法为：以琼脂糖和四氧化三铁为原料，以液体石蜡为油相溶剂，水为水相溶剂，司盘80为乳化剂，通过反相悬浮包埋法制备所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的制备方法为：以琼脂糖和四氧化三铁为原料，以液体石蜡为油相溶剂，水为水相溶剂，司盘80为乳化剂，通过反相悬浮包埋法制备所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球的制备方法为：以琼脂糖和四氧化三铁为原料，以液体石蜡为油相溶剂，水为水相溶剂，司盘80为乳化剂，通过反相悬浮包埋法制备所述四氧化三铁/琼脂糖复合微球。
13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁与所述琼脂糖的质量比为1:(3～10)。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁与所述琼脂糖的质量比为1:(3～6)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的制备方法制备得到的磁性琼脂糖复合微球。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的制备方法制备的磁性琼脂糖复合微球或权利要求15所述的磁性琼脂糖复合微球在制备金属化磁性微球中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
向含有配体溶液中加入所述磁性琼脂糖复合微球反应过夜，洗涤至中性得到复合微球，将所述复合微球分散于含有金属离子的溶液中反应，得到所述金属化磁性微球。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述金属离子为镍离子、钴离子、锌离子、铜离子或铁离子。
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