CN115925830A - 一种内含肽变体及其在生物法制备类蛇毒肽前体中的应用 - Google Patents
一种内含肽变体及其在生物法制备类蛇毒肽前体中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种内含肽变体及其在生物法制备类蛇毒肽前体中的应用,所述内含肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。通过将其与AP二肽组成融合蛋白,在导入载体质粒后制备得到高效、稳定的AP二肽的重组表达载体,通过诱导表达能够获得高纯度的无修饰AP二肽。而且,基于该方法的AP二肽制备难度低,能够有效降低污染和有毒有害副产物的产生,产出量大,适用于AP二肽的大规模工业化量产,具有较大的市场价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种内含肽变体及其在生物法制备类蛇毒肽前体中的应用。
背景技术
类蛇毒肽(SYN-AKE)又被称为蛇毒三肽或类蛇毒三肽,INCI名为二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐。类蛇毒肽是一种模拟蛇毒毒素Waglerin 1活性的人工合成三肽,可拮抗性的与乙酰胆碱受体结合,局部阻断神经传递肌肉收缩信息,使脸部肌肉放松,以达到抚纹祛皱的目的。因此类蛇毒肽具有重要的市场应用价值。但是,目前关于类蛇毒肽的工业化合成主要依赖于化学合成,这种合成方法副产物多、产率低、污染大、成本高,难以符合“碳中和”的时代需求。生物合成可以有效解决化学合成的缺陷,具有产率高、成本低和节能环保等优点。但对于复杂结构的类蛇毒肽,目前并没有高效的生物合成途径。而且,采用化学合成会带来很多合成副产物,有些副产物甚至具有较大的细胞毒性,从而使得类蛇毒肽的生产和提纯消耗大量的成本,且容易带来严重的污染,极大地限制了类蛇毒肽的进一步开发与应用。因此,开发一种更加绿色经济且高效的合成方式,是类蛇毒肽工业化生产所急需的。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种内含肽变体及其在生物法制备类蛇毒肽前体中的应用,通过该内含肽变体与类蛇毒肽前体AP二肽的融合,能够高效且规模化生产高纯度AP二肽,有效避免了副产物和有毒有害物质的产生,获得的AP二肽品质优,可有效用于生产类蛇毒肽。
本发明的第一个方面,提供一种内含肽变体,所述内含肽变体由Thermusthermophilus HB8的RNR基因中的片段融合、突变得到。
根据本发明的第一个方面,在本发明的一些实施方式中,所述基因片段选自GenBank:BAD69898.1中第888~1294位氨基酸残基片段中的片段。
发明人发现,Thermus thermophilus HB8的RNR蛋白(GenBank:BAD69898.1)中第888~1294位氨基酸残基片段与现有的内含肽序列具有一定的同源性,且通过对GenBank:BAD69898.1进行三级结构预测以及序列保守型分析,猜测GenBank:BAD69898.1中的片段可能具有内含肽相似的功能。
根据本发明的第一个方面,在本发明的一些实施方式中,所述基因片段为GenBank:BAD69898.1中第888~989、1048~1102和1125~1294位氨基酸残基片段。
发明人将GenBank:BAD69898.1中的第888~989、1048~1102和1125~1294位氨基酸残基片段提取出来后进行重新组合,得到了一种新的融合片段(命名为Tth RNR内含肽母体)以作为内含肽使用。利用AlphaFold2对得到的Tth RNR内含肽母体进行三级结构预测,发现其与常规内含肽GP41-1具有很高的结构相似性。因此,可以说明Tth RNR内含肽母体可能具有内含肽相似的功能。
在本发明的一些实施方式中,所述内含肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的一些实施方式中,所述内含肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
发明人为了进一步提高Tth RNR内含肽在蛋白纯化上的应用效果与价值,发明人进一步基于SEQ ID NO:3所示序列,将第一个氨基酸残基(半胱氨酸,C)突变成丙氨酸(A),得到Tth RNR内含肽(SEQ ID NO:5)。
该突变在在保证SEQ ID NO:5的功能性的同时,有效提高了Tth RNR内含肽在蛋白纯化上的应用效果。
本发明的第二个方面,提供编码本发明第一个方面所述的内含肽变体的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中,所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明的一些实施方式中,所述核酸分子还包括与SEQ ID NO:6具有85%以上同一性且具有同样功能的序列。
在本发明的一些实施方式中,所述同一性为85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
在本发明的一些实施方式中,所述核酸分子还包括SEQ ID NO:4。
本发明的第三个方面,提供一种内含肽-类蛇毒肽前体融合蛋白,所述融合蛋白中包括SEQ ID NO:5所示的序列和类蛇毒肽前体序列。
在本发明的一些实施方式中,所述类蛇毒肽前体为AP二肽。
在本发明的一些实施方式中,所述融合蛋白中还包括修饰序列。
在本发明的一些实施方式中,所述修饰序列包括his标签序列、GST标签序列、Flag标签序列、Halo标签序列、HA标签序列、Myc标签序列、Snap标签序列中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中,所述修饰序列为His标签。
在本发明的一些实施方式中,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在本发明的一些实施方式中,所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明的第四个方面,提供一种类蛇毒肽前体产品,所述类蛇毒肽前体产品包括如下(1)~(8)中的至少一种:
(1)本发明第一个方面所述的内含肽变体;
(2)本发明第二个方面所述的核酸分子;
(3)含有(2)中核酸分子的表达载体;
(4)本发明第三个方面所述的融合蛋白;
(5)编码(4)中融合蛋白的核酸分子;
(6)含有(5)中核酸分子的表达载体;
(7)含有(2)或(5)中核酸分子的转化体;
(8)含有(3)或(6)中表达载体的转化体;
在本发明的一些实施方式中,所述转化体包括病毒、细菌、真菌和细胞。
在本发明的一些实施方式中,所述转化体为细菌。
在本发明的一些实施方式中,所述转化体为大肠杆菌。
在本发明的一些实施方式中,(6)中的表达载体是基于SEQ ID NO:8所示序列得到的。
在本发明的一些实施方式中,(6)中的表达载体的制备方法为:使用双酶切法处理SEQ ID NO:8所示序列和空白载体质粒,使用T4 DNA连接酶连接即可。
在本发明的一些实施方式中,(6)中的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在本发明的一些实施方式中,(8)中的转化体的制备方法为:取(6)中的表达载体转化细菌,将转化后的细菌涂布在含卡那霉素的平板上,筛选出阳性克隆即可。
在本发明中,发明人发现本发明中的内含肽Tth RNR-AP表达载体具有高表达内含肽Tth RNR-AP融合蛋白的效果,且其能够基于内含肽Tth RNR快速去除各种标签,从而获得可直接作为原材料使用的无修饰AP二肽。
本发明的第五个方面,提供一种类蛇毒肽前体的制备方法,包括如下步骤:基于SEQ ID NO:5所示的内含肽和类蛇毒肽前体序列构建融合蛋白表达载体,诱导蛋白表达,置于层析柱中进行内含肽切割,收集流通液即为类蛇毒肽前体。
在本发明的一些实施方式中,基于SEQ ID NO:5所示的内含肽和AP二肽序列构建得到的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在本发明的一些实施方式中,表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在本发明的一些实施方式中,诱导蛋白表达的试剂包括IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。
在本发明的一些实施方式中,所述内含肽切割的步骤为:在层析柱介质上加入缓冲液,孵育过夜。
在本发明的一些实施方式中,所述缓冲液包括但不限于磷酸缓冲液。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤还包括对流通液和洗脱液进行浓缩、干燥。
在本发明中,发明人发现基于上述方法可以高效地获得高纯度、无修饰的AP二肽,其纯度高达95%以上。
本发明的第六个方面,提供本发明第一个方面所述的内含肽变体在生物法制备类蛇毒肽前体或类蛇毒肽中的应用。
类蛇毒肽前体是丙氨酸A和脯氨酸P组成的二肽(AP二肽),可通过进一步的C端和N端修饰合成完整的类蛇毒肽,因此,高效获得类蛇毒肽的关键之一在于获得高纯度的类蛇毒肽前体。发明人发现,通过利用天然生物系统中“中心法则”里的mRNA翻译成多肽链,其能有序的按照基因编码信息实现氨基酸添加,使得AP二肽可以通过体外制备好的遗传信息转入到细胞系统中获得稳定表达该遗传信息产物的工程生命体表达得到。从而在技术角度上相比化学合成具有至少以下优势:1)操作简单,只要构建出表达特定肽类的工程菌,就可以持续的进行肽类的表达;2)成本低,底物都是一些最基础的营养物质,不需要昂贵的材料;3)副产物少,提纯容易,基本没有合成副产物,只有生命体代谢的产物,容易分离和提纯;4)清洁环保,几乎无污染,符合“碳中和”的时代需求;5)效率高,合成效率高效,可以大规模生产和获得。因此,可以看出,本发明中的相关应用相较于化学合成具有显著的技术优势。但现有技术中的问题在于没有AP二肽生物合成的案例,这是因为AP二肽肽链太短,难以在生物培养物中检测和分离。虽然有方法提及可以利用包含蛋白酶切割位点的寡肽融合蛋白来提高寡肽的肽链的长度,使其易于在表达过程中检测寡肽的产量,并利用亲和标签来降低寡肽的纯化难度。但这种办法需要在蛋白纯化后引入额外的蛋白内切酶来进行寡肽的释放和分离。这增加了寡肽的生产复杂程度,降低了寡肽的产能。同时还容易引入额外的氨基酸残基,导致寡肽的性能或功能改变。而本发明中的内含肽能够有效地解决上述问题。内含肽是一类能够通过自催化完成切割的氨基酸序列,其能够在特定的条件完成自身和蛋白之间的分离。而本发明中的内含肽能够针对AP二肽实现定向切割,实现特定蛋白上各类蛋白标签的有效去除。
本发明的有益效果是:
1.本发明中提供了一种新的内含肽变体序列Tth RNR,通过将其与类蛇毒肽前体(AP二肽)组成融合蛋白,在导入载体质粒后制备得到高效、稳定的AP二肽的重组表达载体,在转入细菌得到工程菌后,通过诱导表达能够获得高纯度的无修饰AP二肽。
2.本发明中的AP二肽是基于内含肽Tth RNR-AP二肽重组表达载体得到的,其制备方法简单,仅需经过细胞破碎、内含肽切割等简单的步骤,就可以高效地获得高纯度的AP二肽,且生物合成方法能够有效降低污染和有毒有害副产物的产生,产出量大,适用于AP二肽的大规模工业化量产,从而获得高品质的类蛇毒肽,具有较大的市场价值。
附图说明
图1为GenBank:BAD69898.1第888~1294位氨基酸残基片段与现有的内含肽的序列比对。
图2为Tth RNR内含肽母体(野生型Tth RNR)、Tth RNR内含肽(Tth RNR变体)与常规内含肽GP41-1的三级蛋白结构预测比较。
图3为实施例中的内含肽Tth RNR-AP表达载体的质粒图谱。
图4为内含肽Tth RNR-AP表达载体诱导表达、过柱纯化后的AP二肽电泳图。
图5为使用本发明实施例中的方法制备得到的AP二肽HPLC鉴定结果。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰,以下结合具体实施方式,对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是,本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明,并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂,若无特别说明,均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
Tth RNR内含肽母体的设计
在本发明实施例中,发明人发现通过提取出Thermus thermophilus HB8的RNR蛋白(GenBank:BAD69898.1)中第888~1294位氨基酸残基片段与现有的内含肽序列具有一定的同源性(如图1所示)。同时,发明人对GenBank:BAD69898.1进行三级结构预测以及序列保守型分析,猜测GenBank:BAD69898.1中的片段可能具有内含肽相似的功能。
其中,GenBank:BAD69898.1第888~1294位氨基酸残基片段具体为:
CFVGSTRIPTERGLVPIEELAREGGSFYLVTDNRAPFGGRGAPLPGHGTAVRKAVRAFFTGVKPVVRLRTREGLEVTLTPDHLLLTPEGYREAGKLRPGEKILVQSGEGLFPKEESLPAQALAVVHERVATAGGRGGRGRADVRAQYRNLPTRWSRELGVALGWLLGDGYLREDGVGFYFSRKDFADLAWLPDLLRDWFGQGTLQETRSDTFHLHFNRIPAEFFQALGLKAARATEKRVPESLFRAPREAVVGFLQGLFSADGSVQINEKKQDATIRLASSSLALLQDVQLLLLNLGILGKIHKRREAARKALPDGKGALREYPVAPQYELILGGENRDRFAEVVGFLQEEKQSKLLAFLRHRPRGSYRKPFLATVASVEPAGEAPVYDLTEPVTHSLIANGLVAHN(SEQ ID NO:1)。
其对应的核苷酸序列为:5’-TGTTTCGTCGGCAGCACTCGTATTCCGACTGAACGTGGTCTGGTACCGATTGAAGAACTGGCGCGTGAAGGCGGTTCTTTCTATCTGGTTACTGACAACCGTGCACCGTTCGGTGGTCGTGGTGCTCCACTGCCTGGTCACGGTACCGCTGTTCGTAAAGCCGTTCGCGCATTCTTTACGGGTGTAAAGCCGGTTGTGCGTCTGCGTACTCGTGAAGGTCTGGAAGTCACCCTGACCCCGGATCACCTGCTGCTGACCCCAGAAGGCTACCGTGAGGCGGGTAAACTGCGTCCGGGTGAAAAAATCCTGGTTCAGTCTGGTGAAGGCCTGTTTCCTAAAGAAGAATCTCTGCCGGCACAGGCACTGGCGGTAGTACATGAACGTGTTGCTACTGCAGGTGGTCGTGGTGGTCGTGGTCGTGCAGACGTTCGTGCACAGTACCGCAATCTGCCAACTCGTTGGTCCCGTGAACTGGGTGTAGCCCTGGGTTGGCTGCTGGGTGACGGTTACCTGCGTGAAGACGGCGTGGGCTTCTACTTTTCTCGTAAAGACTTCGCCGATCTGGCTTGGCTGCCGGATCTGCTGCGTGATTGGTTCGGCCAGGGTACTCTGCAGGAAACCCGTTCCGATACCTTTCATCTGCACTTTAACCGTATTCCGGCAGAATTCTTCCAGGCACTGGGTCTGAAAGCTGCGCGCGCAACCGAAAAACGCGTTCCAGAATCTCTGTTCCGTGCTCCGCGTGAAGCCGTTGTAGGTTTTCTGCAAGGTCTGTTCTCTGCCGACGGTTCTGTTCAGATCAACGAAAAAAAACAGGATGCCACCATTCGCCTGGCGTCTTCTAGCCTGGCACTGCTGCAAGATGTTCAGCTGCTGCTGCTGAACCTGGGTATTCTGGGTAAGATCCACAAGCGTCGTGAAGCGGCACGTAAAGCTCTGCCTGATGGCAAAGGTGCCCTGCGTGAATATCCGGTAGCCCCGCAGTATGAACTGATCCTGGGTGGTGAGAACCGTGACCGTTTCGCTGAAGTGGTGGGCTTCCTGCAGGAAGAAAAACAGTCTAAACTGCTGGCTTTTCTGCGTCACCGTCCGCGCGGTTCTTACCGTAAACCGTTTCTGGCGACTGTGGCATCTGTAGAACCGGCGGGTGAAGCTCCAGTGTACGACCTGACCGAACCGGTTACTCATTCTCTGATTGCGAACGGCCTGGTTGCGCACAAC-3’(SEQ ID NO:2)。
对此,发明人将GenBank:BAD69898.1中的第888~989、1048~1102和1125~1294位氨基酸残基片段提取出来后进行重新组合,得到了一种新的融合片段(命名为Tth RNR内含肽母体)以作为内含肽使用。利用AlphaFold2对得到的Tth RNR内含肽母体进行三级结构预测(如图2所示),发现其与常规内含肽GP41-1具有很高的结构相似性。因此,可以说明TthRNR内含肽母体可能具有内含肽相似的功能。
Tth RNR内含肽母体的氨基酸序列为:
CFVGSTRIPTERGLVPIEELAREGGSFYLVTDNRAPFGGRGAPLPGHGTAVRKAVRAFFTGVKPVVRLRTREGLEVTLTPDHLLLTPEGYREAGKLRPGEKIALGWLLGDGYLREDGVGFYFSRKDFADLAWLPDLLRDWFGQGTLQETRSDTFHLHRGSYRKPFLATVASVEPAGEAPVYDLTEPVTHSLIANGLVAHN(SEQ ID NO:3)。
其核苷酸序列为:
5’-TGTTTCGTTGGTTCCACTCGCATTCCAACTGAACGCGGCCTGGTTCCGATTGAAGAACTGGCGCGCGAGGGCGGTTCCTTTTACCTGGTCACCGATAACCGTGCACCGTTCGGTGGCCGTGGCGCGCCGCTGCCGGGCCACGGCACCGCGGTTCGTAAAGCTGTGCGCGCTTTTTTCACCGGTGTGAAGCCGGTGGTACGCCTGCGTACCCGCGAAGGCCTGGAAGTTACCCTGACTCCGGACCACCTGCTGCTGACCCCGGAAGGTTATCGTGAAGCAGGTAAACTGCGTCCGGGCGAAAAAATCGCACTGGGTTGGCTGCTGGGTGACGGTTACCTGCGTGAAGACGGCGTGGGCTTTTACTTCTCCCGCAAAGATTTTGCTGATCTGGCATGGCTGCCGGATCTGCTGCGTGACTGGTTCGGTCAGGGTACCCTGCAGGAAACTCGTTCTGATACCTTCCACCTGCATCGCGGCTCTTACCGTAAACCGTTCCTGGCAACCGTTGCGTCTGTGGAGCCGGCAGGTGAAGCACCGGTCTATGACCTGACTGAACCTGTAACCCACTCCCTGATCGCTAACGGCCTGGTAGCACACAAT-3’(SEQ ID NO:4)。
Tth RNR内含肽的的构建及其在构建AP二肽表达载体中的应用
AP二肽是一种类蛇毒肽前体,其是由丙氨酸A和脯氨酸P组成的二肽,其可以通过进一步的C端和N端修饰合成完整的类蛇毒肽。因此,高效便捷的获得AP二肽是规模化生产类蛇毒肽的关键之一。
(1)Tth RNR内含肽的的构建:
为了进一步提高Tth RNR内含肽在蛋白纯化上的应用效果与价值,发明人进一步基于SEQ ID NO:3所示序列,将第一个氨基酸残基(半胱氨酸,C)突变成丙氨酸(A),得到TthRNR内含肽(SEQ ID NO:5)。
AFVGSTRIPTERGLVPIEELAREGGSFYLVTDNRAPFGGRGAPLPGHGTAVRKAVRAFFTGVKPVVRLRTREGLEVTLTPDHLLLTPEGYREAGKLRPGEKIALGWLLGDGYLREDGVGFYFSRKDFADLAWLPDLLRDWFGQGTLQETRSDTFHLHRGSYRKPFLATVASVEPAGEAPVYDLTEPVTHSLIANGLVAHN(SEQ ID NO:5)。
SEQ ID NO:5对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5’-GCATTCGTTGGTTCCACTCGCATTCCAACTGAACGCGGCCTGGTTCCGATTGAAGAACTGGCGCGCGAGGGCGGTTCCTTTTACCTGGTCACCGATAACCGTGCACCGTTCGGTGGCCGTGGCGCGCCGCTGCCGGGCCACGGCACCGCGGTTCGTAAAGCTGTGCGCGCTTTTTTCACCGGTGTGAAGCCGGTGGTACGCCTGCGTACCCGCGAAGGCCTGGAAGTTACCCTGACTCCGGACCACCTGCTGCTGACCCCGGAAGGTTATCGTGAAGCAGGTAAACTGCGTCCGGGCGAAAAAATCGCACTGGGTTGGCTGCTGGGTGACGGTTACCTGCGTGAAGACGGCGTGGGCTTTTACTTCTCCCGCAAAGATTTTGCTGATCTGGCATGGCTGCCGGATCTGCTGCGTGACTGGTTCGGTCAGGGTACCCTGCAGGAAACTCGTTCTGATACCTTCCACCTGCATCGCGGCTCTTACCGTAAACCGTTCCTGGCAACCGTTGCGTCTGTGGAGCCGGCAGGTGAAGCACCGGTCTATGACCTGACTGAACCTGTAACCCACTCCCTGATCGCTAACGGCCTGGTAGCACACAAT-3’(SEQ ID NO:6)。
(2)Tth RNR内含肽在构建AP二肽表达载体中的应用:
将步骤(1)中得到的Tth RNR内含肽与AP二肽序列进行融合,得到的融合蛋白序列如SEQ ID NO:7所示。
AFVGSTRIPTERGLVPIEELAREGGSFYLVTDNRAPFGGRGAPLPGHGTAVRKAVRAFFTGVKPVVRL RTREGLEVTLTPDHLLLTPEGYREAGKLRPGEKIALGWLLGDGYLREDGVGFYFSRKDFADLAWLPDLLRDWFGQG TLQETRSDTFHLHRGSYRKPFLATVASVEPAGEAPVYDLTEPVTHSLIANGLVAHNAP(SEQ ID NO:7)。
其中下划线部分为Tth RNR内含肽。
融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
5’-GCATTCGTTGGTTCCACTCGCATTCCAACTGAACGCGGCCTGGTTCCGATTGAAGAACTGGCGCGCGAGGGCGGTTCCTTTTACCTGGTCACCGATAACCGTGCACCGTTCGGTGGCCGTGGCGCGCCGCTGCCGGGCCACGGCACCGCGGTTCGTAAAGCTGTGCGCGCTTTTTTCACCGGTGTGAAGCCGGTGGTACGCCTGCGTACCCGCGAAGGCCTGGAAGTTACCCTGACTCCGGACCACCTGCTGCTGACCCCGGAAGGTTATCGTGAAGCAGGTAAACTGCGTCCGGGCGAAAAAATCGCACTGGGTTGGCTGCTGGGTGACGGTTACCTGCGTGAAGACGGCGTGGGCTTTTACTTCTCCCGCAAAGATTTTGCTGATCTGGCATGGCTGCCGGATCTGCTGCGTGACTGGTTCGGTCAGGGTACCCTGCAGGAAACTCGTTCTGATACCTTCCACCTGCATCGCGGCTCTTACCGTAAACCGTTCCTGGCAACCGTTGCGTCTGTGGAGCCGGCAGGTGAAGCACCGGTCTATGACCTGACTGAACCTGTAACCCACTCCCTGATCGCTAACGGCCTGGTAGCACACAATGCACCG-3’(SEQ ID NO:8)。
SEQ ID NO:8的合成交由南京金斯瑞生物科技有限责任公司。当然,本领域技术人员也可以根据实际情况选择其他本领域常规方式按照上述序列组成进行合成。
在SEQ ID NO:7的5’端使用酶切位点BamH I进行切割,3’端使用酶切位点Xho I进行切割,得到切割片段。然后取1μg同样经过NcoI和XhoI酶切处理后的空白pET28a质粒(使用2%琼脂糖凝胶回收相应大小的片段,即可得到线性化的酶切后的质粒)。使用T4 DNA连接酶对切割片段和pET28a骨架进行连接过夜,连接方法参考pET28a质粒使用说明或本领域中常规技术手册进行。连接后的产物转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,将转化后的大肠杆菌涂布在含卡那霉素的固体LB平板上,37℃培养过夜。挑取阳性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中,震荡培养后进行测序鉴定。
内含肽Tth RNR-AP表达载体的质粒图谱如图3所示。
内含肽Tth RNR-AP表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
Tth RNR-AP融合蛋白的纯化
在本实施例中,基于内含肽Tth RNR-AP表达载体的Tth RNR-AP融合蛋白的纯化步骤具体如下:
(1)诱导表达:
将上述实施例中的内含肽Tth RNR-AP表达载体转化到BL21(DE3)表达菌株中,挑取单克隆菌株至LB培养基中扩大培养中OD600值为0.8,加入1/20体积的1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和终浓度为1mM的IPTG,37℃,200rpm继续培养4-6h。4℃,10000rpm离心20min,收集菌体。收集得到的菌体用PBS清洗2次。
(2)菌体破碎:
将洗涤后的菌体重悬在裂解缓冲液(由终浓度20mM Tris和终浓度500mM NaCl组成,pH 8.0)中,使用压力或超声进行菌体破碎,直至镜检染色确认没有明显的菌体。4℃,12000rpm离心20min,收集上清,0.45μm滤膜过滤。
(3)亲和层析:
Ni-NTA亲和层析柱用20倍柱体积裂解缓冲液充分平衡后,加入过滤后的细菌裂解液以0.5mL/min流速移入Ni-NTA亲和层析柱中,再用5倍柱体积的含20mM咪唑的裂解缓冲液充分清洗。
(4)内含肽切割:
加入pH 6.0的50mM磷酸缓冲液,混匀后室温孵育过夜,收集流通液,即得纯化后的类蛇毒肽前体。用5倍柱体积的含200mM咪唑的裂解缓冲液洗脱掉剩余的内含肽。
纯化结果如图4所示。
使用HPLC检测纯化的目的蛋白的含量和纯度。
可以发现,通过在Ni-NTA树脂亲和层析介质中进行内含肽切割后可以高效地纯化出AP二肽。通过内含肽切割后,流通液中的AP二肽的含量可达11mg/L菌液,纯度在95%以上(图4)。上述结果表明本发明中的方法能够快速高效获得纯化AP二肽,为类蛇毒肽的合成提供高质量的AP二肽中间体。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种内含肽变体,其特征在于,所述内含肽变体由Thermus thermophilus HB8的RNR基因中的片段融合、突变得到;
所述基因片段优选自GenBank:BAD69898.1中第888~1294位氨基酸残基片段中的片段;所述基因片段更优选为GenBank:BAD69898.1中第888~989、1048~1102和1125~1294位氨基酸残基片段。
2.根据权利要求1所述的内含肽变体,其特征在于,所述内含肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
3.编码权利要求1~2任一项所述的内含肽变体的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。
5.一种内含肽-类蛇毒肽前体融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白中包括SEQ ID NO:5所示的序列和类蛇毒肽前体序列;所述类蛇毒肽前体优选为AP二肽。
6.根据权利要求5所述的内含肽-类蛇毒肽前体融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白中还包括修饰序列,所述修饰序列包括his标签序列、GST标签序列、Flag标签序列、Halo标签序列、HA标签序列、Myc标签序列、Snap标签序列中的至少一种。
7.一种类蛇毒肽前体产品,其特征在于,所述类蛇毒肽前体产品包括如下(1)~(8)中的至少一种:
(1)权利要求1~2任一项所述的内含肽变体;
(2)权利要求3~4任一项所述的核酸分子;
(3)含有(2)中核酸分子的表达载体;
(4)权利要求5或6所述的融合蛋白;
(5)编码(4)中融合蛋白的核酸分子;
(6)含有(5)中核酸分子的表达载体;
(7)含有(2)或(5)中核酸分子的转化体;
(8)含有(3)或(6)中表达载体的转化体;
其中,所述转化体包括病毒、细菌、真菌和细胞。
8.一种类蛇毒肽前体的制备方法,包括如下步骤:基于SEQ ID NO:5所示的内含肽和类蛇毒肽前体序列构建融合蛋白表达载体,诱导蛋白表达,置于层析柱中进行内含肽切割,收集流通液即为类蛇毒肽前体。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述内含肽切割的步骤为:在层析柱介质上加入缓冲液,孵育过夜。
10.权利要求1~2任一项所述的内含肽变体在生物法制备类蛇毒肽前体或类蛇毒肽中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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