KR101874236B1 - 망간 및 코발트 결합 펩티드의 표면 발현 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 표면 발현 시스템을 이용하여 망간 및 코발트 흡착 미생물을 제조하는 방법 및 이를 이용하여 폐수 또는 해수로부터 망간 및 코발트를 회수하는 방법에 대한 것이다.

Description

망간 및 코발트 결합 펩티드의 표면 발현 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물{CELL SURFACE EXPRESSION VECTOR FOR MANGANESE AND COBALT BINDING PEPTIDE AND MICROORGANISM TRANSFORMED BY THE SAME}
본 발명은 망간 및 코발트 결합 펩티드를 세포 표면 발현 시스템에 도입하여 망간 및 코발트를 흡착하는 미생물을 제조하는 방법에 대한 것이다.
Mn (망간)은 철, 알루미늄 및 구리와 함께 가장 널리 사용되는 금속이다. 전세계적으로 생산되는 망간의 약 95%가 강철의 탈황 및 강화를 위해 사용되며 나머지 5%는 배터리 및 화학 산업에 사용된다. 자연적으로 드러나는 망간 양은 상대적으로 적은 반면, 인위적인 활동에 의해 지표수 또는 지하수에서 생성되는 망간의 양은 상대적으로 많다. 폐배터리, 사용된 전극 등과 같은 망간을 함유하는 물질은 다른 광석을 갖는 폐수로 망간을 침출시키는 원천의 일부이다. 대량의 망간이 광범위한 채굴에 의해 발생한 광산 폐수 및 비처리된 인위적 활동 및 산업 활동에 의해 발생한다. 물 1 리터 당 0.05 mg 초과의 농도로 망간이 수돗물에 포함될 경우 U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA, 2004)에서 안전하지 않은 것으로 간주한다. 망간은 고농도 노출시 신경독소로서 인지되며, 채굴, 용접 및 인위적 폐수의 생성에 의해 이 금속에 만성적으로 노출될 경우 파킨슨병, 정신 증상, 신경퇴행성 질병 및 그외 운동계에서의 장애와 같은 건강에 유해한 증상을 야기한다.
Co (코발트)는 비타민 B12의 일종으로 인간 건강에 필수적이이나, 고농도의 코발트는 저혈압, 마비, 설사, 골 결손 등을 야기할 수 있다. 코발트는 희유 원소로서 간주되며, 야금, 페인트, 채굴 및 전자 산업 폐기물과 같은 다양한 산업 폐수에서 일반적으로 존재한다. 코발트는 특히 긴 반감기(5.27년)로 인해 특히 유해한 이의 활성화 방사성 동위원소로서도 존재한다. 수용액으로부터 금속 이온을 제거하기 위해 사용되는 화학 침전, 이온교환, 응고/응집과 같은 금속 제거 방법들은 오염물의 농도를 낮추는데 효과적이지 않다. 이에 따라 신규한 정화 방법에 대한 요구가 증가하고 있다.
재조합 DNA 기술에 의한 단백질 또는 펩티드의 미생물 표면 발현은 다양한 분야에 적용할 수 있는 유망한 기술로서 생물학적 환경 정화(bioremediation)에서 주로 사용되고 있다. 표면 발현은 생백신 개발, 스크리닝 디스플레이 펩티드 라이브러리, 생체흡착제, 오염물의 정화 및 바이오연료 생산을 위한 전체-세포 생촉매와 같은 다양한 생명공학 분야에 적용될 수 있다. 현재까지, 작은 펩티드로부터 큰 복합체 단백질까지의 많은 단백질들이 박테리아, 효모, 시아노박테리아 등과 같은 다양한 숙주의 표면에 발현되었다. Escherichia coli는 이의 높은 재조합 단백질 수율 및 유전자 조작에 대한 유연성 때문에 단백질 및 펩티드의 표면 발현에 가장 자주 사용되는 박테리아 숙주이다. 세포 표면 상에 적합한 단백질 발현을 이루기 위해서, 시스템은 주변세포질에 의해 분리되는 내막 및 외막 둘 다로 구성되어야 한다. 세포 표면에 발현하고자 하는 유전자는 담체 단백질과 융합되어야 한다. 담체 단백질은 세포 외피를 가로질러 전달하기 위해 사용되는 것으로 숙주 세포 표면으로 원하는 물질을 정박시킨다. 이러한 표면 발현된 펩티드 또는 단백질은 외부적으로 추가되는 기질에 효과적으로 노출되어, 다양한 분야에 적용될 수 있는 효율적인 시스템으로서 세포 표면 발현의 사용을 위해 조성된다. 여러 다양한 담체 단백질이 단백질의 세포 표면 발현을 위해 개발되었으며, 각 담체 단백질은 숙주 세포에서의 여러 생리학적 효과를 야기하였다. 부정확한 모티프는 세포 외피 온전성을 불안정하게 하여 세포에 영향을 줄 수 있으므로 담체 단백질 또는 앵커링 모티프(anchoring motif)의 선택은 매우 중요하다. 박테리아 세포 표면 발현 시스템에서, 외막 단백질, 자가수송체(autotranspoters), S-층 단백질 등과 같은 다양한 앵커링 모티프가 사용되었다. 세포 표면에 단백질 또는 펩티드의 발현을 위해 가장 자주 사용되는 시스템은 OMPs이다. 이들은 긴 표면 도달가능한 루프(surface reachable loop)와 주변세포질쪽 및 바깥쪽으로 연결된 상이한 수의 막관통 β-가닥으로 구성된 β배럴의 일반적인 구조적 모티프를 갖는 단백질과 같은 구별되는 내재막(integral membrane)을 형성한다. 많은 상이한 OMPs는 oprF, PhoE, OmpS, OmpF 및 OmpC와 같은 표면 발현 시스템의 개발을 위해 사용되어 왔다. 다양한 앵커링 모티프가 있지만, 펩티드 또는 단백질의 삽입 또는 융합을 위한 담체 단백질의 위치는, 융합 단백질의 고정화, 안정화, 특이 활성 및 번역-후 변이에 영향을 미치므로 매우 중요하다.
다양한 OMPs 중에서, OmpC는 세포 당 2x105개 분자를 갖는 이의 높은 카피 수준 때문에 세포 표면 발현에 적합한 후보자로 고려된다. OmpC는 E. coli의 외막에서 발견되는 포린 삼량체 단백질로서 외막의 안정화에 구조적으로 중요하다. 3개의 OmpC 분자는 E. coli 세포의 막 상에 포어 구조를 형성하여, 소분자가 통과하도록 한다. OmpC 분자는 큰 채널을 둘러싸는 구조를 형성하여 7개의 내부 루프 및 8개의 외부 루프와 연결되는 16개의 막통과 역평행 β-가닥을 포함한다. 그러나 ompC는 다양한 적용 분야의 표면 발현을 위해 많이 연구되었으며, 각 앵커링 모티프는 크기 및 특성과 관련된 다양한 앵커링 모티프에 노출되었을 때 상이한 단백질 발현 능력을 갖는 것으로 알려져 있다.
한국등록특허 10-0313135호
본 발명은 앵커링 모티프로서 3개의 다양한 OmpC 루프를 사용하여 3회 반복된 (TRSRSHTSEG)3과 OmpC 루프를 융합시켜 표면 발현 시스템을 개발함으로써, 오염된 환경, 예를 들어, 폐수 또는 해수로부터 망간 및 코발트를 효과적으로 제거 또는 회수하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표현되는 염기 서열로 이루어진 OmpC(outer membrane protein C)를 코딩하는 유전자와 및 서열번호 4로 표현되는 염기서열로 이루어진 망간 및 코발트 결합 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 OmpC는 N 말단으로부터 2번째, 6번째 또는 8번째 루프에서 절단된 OmpC를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 망간 및 코발트 결합 펩티드는 Cap43 단백질의 일부로서 3회 반복된 아미노산 서열인 (TRSRSHTSEG)3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 OmpC의 C 말단에 상기 망간 및 코발트 결합 펩티드가 융합된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 세포 표면 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩코커스로 이루어지는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 형질전환된 미생물을 배양하여 망간 및 코발트 결합 펩티드를 세포 표면에 발현하는 단계; 및 상기 망간 및 코발트 결합 펩티드가 표면에 발현된 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 망간 및 코발트 결합 펩티드의 세포 표면 발현 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 형질전환된 미생물 또는 상기 본 발명에 따른 세포 표면 발현 방법에 따라 망간 및 코발트 결합 펩티드가 세포 표면 발현된 미생물을 포함하는 망간 및 코발트 회수용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 형질전환된 미생물 또는 상기 본 발명에 따른 세포 표면 발현 방법에 따라 망간 및 코발트 결합 펩티드가 세포 표면 발현된 미생물을 이용하여 폐수 또는 해수로부터 망간 및 코발트를 회수하는 방법을 제공한다.
본 발명은 망간 및 코발트 결합 펩티드를 세포 표면 발현 시스템에 도입하여 망간 및 코발트를 흡착하는 미생물을 제조함으로써 오염된 환경으로부터 환경 친화적으로 망간 및 코발트를 제거 또는 회수할 수 있는 기술을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 OmpC-융합 발현 시스템의 개략도이다. (A) 8개 루프를 포함하는 전체 OmpC 외부 루프 구조. (B) 189bp 위치에서 루프 2와 융합된 Mn 및 Co 결합 펩티드. (C) 726bp 위치에서 루프 6과 융합된 Mn 및 Co 결합 펩티드. (D) 993bp 위치에서 루프 8과 융합된 Mn 및 Co 결합 펩티드.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서 각각 3개의 루프에서 ompC와 융합된 3개의 재조합 균주의 플라스미드 구성을 나타낸 것이다. (A) 루프 2에서의 pBADO189(189bp). (B)루프 6에서의 pBADO726(726bp). (C) 루프 8에서의 pBADO993(993bp).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서 OmpC의 다양한 루프에서의 Mn 및 Co 결합 펩티드를 담지한 3개의 재조합 균주의 SDS page 분석 결과를 나타낸 것이다. (A) pBADO189(루프 2) - 10kda (B) pBADO726(루프 6) - 29.7kda (C) pBADO993(루프 8) - 39.71kda. 균주는 0% 내지 0.5% 농도의 아라비노스로 유도되었다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서 OmpC의 3개 외부 루프에 융합된 Mn 및 Co 결합 펩티드를 보유한 3개의 재조합 균주를 이용한 LB 배지 내의 Mn 흡착 결과를 나타낸 것이다. (A) 루프 2에서의 pBADO189. (B) 루프 6에서의 pBADO726. (C)루프 8에서의 pBADO993. 모든 실험은 독립적으로 3회 반복되어 실시되었으며 표준 편차는 결정되었다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서 OmpC의 3개 외부 루프에 융합된 Mn 및 Co 결합 펩티드를 보유한 3개의 재조합 균주를 이용한 LB 배지 내의 Co 흡착 결과를 나타낸 것이다. (A) 루프 2에서의 pBADO189. (B) 루프 6에서의 pBADO726. (C)루프 8에서의 pBADO993. 모든 실험은 독립적으로 3회 반복되어 실시되었으며 표준 편차는 결정되었다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서 인공 오염 폐수에서의 3개의 재조합 균주에 의한 다양한 금속의 흡착 결과를 나타내 것이다. (A) 루프 2에서의 pBADO189. (B) 루프 6에서의 pBADO726. (C)루프 8에서의 pBADO993. 모든 실험은 독립적으로 3회 반복되어 실시되었으며 표준 편차는 결정되었다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서 Mn 및 Co 흡착 전 및 후의 Mn 및 Co 결합 펩티드를 발현하는 세포의 FE-SEM 이미지이다. (A) 및 (B)는 흡착 전 pBADO726을 보유한 재조합 세포이다. (C) 0.2mM의 염화코발트 흡착 후 pBADO726을 보유한 재조합 균주이다. (D) 1mM of 염화망간 흡착 후 pBADO726을 보유한 재조합 균주이다. 화살표는 세포 표면에 금속의 흡착을 나타낸 것이다. (E) Co 흡착 후 pBADO726 재조합 균주의 EDS 분석 결과이다. F. Mn 흡착 후 pBADO726재조합 균주의 EDS 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서 osmporin 단백질 (2J1N)의 구조적 주형과 융합 단백질의 다중 서열 정렬 및 이차 구조 정렬을 나타낸 것이다. 서열 위의 화살표는 β 시트를 나타낸 것이고 헬릭스는 알파 헬릭스를 나타낸 것이며 TT는 회전을 나타낸 것이다. 청록색 박스는 금속 결합 펩티드의 짧은 반복체를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서 융합 단백질의 3차원 구조의 리본 모형을 나타낸 것으로(부분 ompC- cap43 단백질의 금속 결합 부분의 삼중 반복체), (A) 융합 단백질 2, (B) 융합 단백질 6 및 (C) 융합 단백질 3의 모델 구조이다. 청록색 헬릭스 및 스틱은 Cap43의 금속 결합 부분을 나타낸 것이고; 다른 부분은 부분 ompc 단백질 구조를 나타낸 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
본 발명의 명세서 전체에서 용어 "유전자"는 유전적 기능이 관련되어 있는 핵산 분자(염색체, 플라스미드 등)의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 유전자는, 예를 들어, 유기체의 게놈 내의 특정 물리적 위치("유전자좌")를 차지하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 포유동물의 DNA 서열)을 포함하는, 유기체의 유전 단위이다. 유전자는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 발현 생산물을 코딩할 수 있다. 일반적으로, 유전자는 폴리펩티드 코딩 서열과 같은 코딩 서열 및 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열)과 같은 비코딩 서열을 포함한다. 다수의 진핵생물 유전자가 "인트론"(비코딩 서열)이 개재되어 있는 "엑손"(코딩 서열)을 갖는다.
본 발명의 명세서 전체에서 용어 "형질전환 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 의미한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 용어 "벡터" 또는 "플라스미드"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내 및/또는 사이로 전달하는 핵산 분자, 바람직하게 는 자가-복제성 핵산 분자를 의미한다. 이 용어는 1차적으로 DNA 또는 RNA의 세포 내로의 삽입을 위해 기능하는 벡터,1차적으로 DNA 또는 RNA의 복제를 위해 기능하는 벡터의 복제물, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 또한, 하나 초과의 상기 기능을 제공하는 벡터도 포함된다. "발현 벡터"는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때 폴리펩티드(들)로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템"은 대체로 요구되는 발현 생산물을 생산하도록 기능할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서 용어 "~로부터 얻은" 또는 "~유래의" 이란 예를 들어, 소정 유기체, 전형적으로 미생물과 같은 특정 공급원으로부터 단리되거나, 이로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 추출물 또는 폴리펩티드 추출물 등과 같은 샘플을 의미한다. 또한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 특정 유기체 또는 미생물로부터 단리 되거나, 이로부터 유도된 상황도 의미할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 용어 "재조합" 미생물은 전형적으로, 예컨대 플라스미드 또는 벡터에 하나 이상의 외래 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명은 세포 표면 발현 시스템을 이용하여 망간 및 코발트를 흡착할 수 있는 재조합 미생물 및 이를 이용한 망간 및 코발트 회수 방법에 관한 것으로, 구체적으로 세포 외막 단백질을 코딩하는 유전자와 및 망간 및 코발트 결합 펩티드를 코딩하는 유전자가 융합된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터를 미생물에 형질전환시킨 후 망간 및 코발트 결합 펩티드를 세포 표면에 발현시켜 망간 및 코발트를 흡착할 수 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여, 세포 외막 단백질을 코딩하는 유전자와 및 망간 및 코발트 결합 펩티드를 코딩하는 유전자가 융합된 뉴클레오티드 서열을 기본 벡터에 삽입하여 형질전환시킨 재조합 미생물을 배양함으로써 구현할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 적합한 미생물 내에서 상기 유전자들의 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.　상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있으며, 일 예로서 pBAD30 플라스미드일 수 있다.　적당한 숙주 미생물로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 본 발명에서 플라스미드(plasmid)와 벡터(vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다.　
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 도입된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다.　바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.　발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에서 "작동 가능하게 연결된"이란 언급된 구성요소들이 그 일반적 기능을 수행하도록 구성되어 있는 요소들의 배열을 의미한다. 따라서, 코딩 서열(예를 들어, 관심있는 펩티드를 코딩하는 서열)에 작동 가능하게 연결된 특정 프로모터는 조절 단백질 및 적절한 효소가 존재할 경우 코딩 서열의 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 경우, 특정 조절 요소가 이들이 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 할 수 있는 한 코딩 서열에 인접할 필요는 없다.
전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질 전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다.　적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
통상적으로, 하나 이상의 제한 효소로 DNA 서열 및 벡터를 절단하고 단편들을 함께 결찰하여 최종적으로 발현될 DNA 서열을 벡터에 결합시킨다. 제한 효소 소화처리 및 결찰은 당업자들에게 익히 알려졌다.
본 발명의 재조합 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩코커스로 이루어지는 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 대장균을 재조합 미생물로서 사용하였다.
박테리아 게놈으로부터 원하는 유전자를 얻는 방법은 분자 생물학 분야에서 일반적이며 잘 알려져 있다. 예를 들어, 당해 유전자의 서열이 공지되어 있는 경우, 적합한 게놈 라이브러리가 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성될 수 있으며, 원하는 유전자 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 일단 당해 서열이 단리되면, 그 DNA는 표준 프라이머-유도 증폭 방법, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용하여 증폭되어 적절한 벡터를 이용한 형질전환에 적합한 양의 DNA가 얻어질 수 있다. 이종 숙주에서의 발현을 위한 코돈 최적화 도구는 쉽게 이용가능하다. 코돈 최적화를 위한 일부 도구는 숙주 유기체의 GC 함량을 기반으로 하여 이용가능하다. 일단 관련 경로 유전자가 동정되어 단리되면, 이 유전자는 당업계에 잘 알려진 수단에 의해 적합한 발현 숙주를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 또는 형질감염(transfection))은 전기천공(electroporation), 극미 주입(microinjection), 유전자총(biolistics)(또는 입자 폭격 매개된 전달), 또는 아그로박테리움 매개된 형질전환 등을 비롯한 다수의 수단 중에서 하나에 의해 달성될 수 있다
본 발명의 명세서 전체에서 "재조합 미생물" 및 "재조합 균주"라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용되며, 본 발명의 특정 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하거나 과다 발현하기 위하여 유전적으로 변형된 미생물을 지칭한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
박테리아 균주 및 배지
실시예에 사용된 박테리아 균주는 표 1에 나타냈다. 균주는 250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 항생제(100 mg/L 암피실린)가 보충된 LB 배지(10 g/L bacto-tryptone, 5 g/L bacto-yeast extract 및 5 g/L NaCl)에서 배양되었다.
Figure 112017025707362-pat00001
재조합 균주의 설계
3개의 반복 펩티드(TRSRSHTSEG)3를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열을 루프 2 (189bp)(서열번호 1), 루프 6 (726bp)(서열번호 2), 루프 8 (993bp)(서열번호 3)의 다양한 외부 루프에서 절단된 E. coli 유래 ompC 유전자의 C-말단과 융합시킨 후 증폭하였다. 증폭은 표 2에 기재된 바와 같은 서열을 사용하여 실시하였다. Expand High Fidelity PCR system (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)을 사용하는 MJ Mini Personal Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 PCR을 수행하였다. 3개의 PCR 산물을 SacI 및 HindIII 제한효소를 사용해 pBAD30 플라스미드 내로 클로닝하여 각각 pBADO189, pBADO726, pBADO993을 구성하였다(도 1). 펩티드와 함께 OmpC의 발현은 PBAD프로모터의 조절 하에서 이루어졌다. 3개의 플라스미드를 추가 연구를 위해 화학적으로 감응된(competent) XL1-Blue E. coli 균주 내로 형질전환시켰다.
효율적인 발현 시스템의 개발에서, 단백질 또는 펩티드의 효과적인 발현을 위해 담체 단백질에서의 위치가 매우 중요하다. E. coli의 외막 단백질인 OmpC는 펩티드 또는 단백질의 융합을 위해 사용될 수 있는 8개의 외부 루프를 포함한다. 본 발명에서는, Mn 및 Co 결합 펩티드 (TRSRSHTSEG)3의 C-말단 융합이 OmpC의 3개의 다양한 외부 루프에서 사용되었다. 융합은 189bp에서 루프 2, 726bp에서 루프 6, 993bp에서 루프 8로 3개의 루프에서 이루어졌다(도 1). 다양한 부위에서 ompC 유전자를 절단한 후 표 2에 언급된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 절단된 루프의 C-말단에 Mn 및 Co 결합 펩티드가 융합되어 구성될 수 있다. 유전자를 SacI 및 HindIII 부위를 사용하여 pBAD30 벡터 내로 클로닝시켜 pBADO189, pBADO726 및 pBADO993를 만들었다(표 1). 3개 재조합 균주 발현 모두 PBAD프로모터의 제어 하에서 이루어졌으며 단백질 발현은 아라비노스의 추가로 유도되었다 (도 2).
Figure 112017025707362-pat00002
<실험예 1>
SDS-PAGE에 의한 발현 연구
OmpC의 다양한 앵커링 부위에 융합된 Mn 및 Co 결합 펩티드를 보유한 3개의 재조합 E. coli 균주를 37℃에서 LB 배지에 밤새 배양한 후, 배양물을 동일 배지에서 100배 희석하였다. 600nm에서의 광학 밀도(OD600)가 0.5에 이르렀을 때, 아라비노스를 0~0.5%의 다양한 농도로 배양 배지에 추가하고 6시간 동안 인큐베이션하였다. 수확된 재조합 균주를 초음파 발생장치를 이용하여 초음파 처리하고(30 sec ON, 30 sec OFF, 12 사이클) 세포를 8000 rpm에서 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)를 추가하여 외막 분획을 세포 펠렛으로부터 분리한 후 현탁된 세포를 4℃에서 밤새 유지시켜 용액으로 막 분획이 떠오르게 하고 12% (w/v) SDS-PAGE로 분석하였다. 분획된 단백질 샘플을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 염색하였다.
망간 및 코발트 생물흡착 및 회수의 분석
pBADO189,pBADO726,pBADO993을 각각 보유한 3개의 재조합 균주를 37℃에서 밤새도록 100 mg/L 암피실린이 보충된 LB 배지에서 성장시켰다. 밤새 배양한 배양물을 신선한 LB 배지에 100배로 희석시키고, OD600이 0.5가 될 때까지 인큐베이션하였다. 0.5%의 아라비노스로 세포를 유도하고 균주를 30℃에서 6시간 동안 배양하였다. 균주를 0.85% (w/v)의 NaCl로 2회 세척하고, 세포를 0.1mM 내지 1mM의 다양한 농도의 MnCl2 및 별도의 0.01mM 내지 0.3mM 농도의 CoCl2와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음, 균주를 0.85% (w/v) NaCl로 2회 세척하고, 세포를 30분 동안 얼음에서 5mM의 EDTA와 함께 인큐베이션하여 세포 표면에 흡착된 망간 및 코발트를 회수하였다.
산업 분야로의 적용을 위한 3개 재조합 균주의 능력 및 회수 금속에 대한 펩티드의 선택성을 인공 오염 폐수를 이용하여 시험하였다. 인공 오염 폐수의 모든 금속 농도는 0.1mm인 것으로 측정되었다. LB 배지에서의 금속 회수와 동일한 공정을 실시하였다.
가장 우수한 재조합 균주의 흡착을 JEOL 대조로서 XL1-Blue E. coli 균주와 함께 흡착된 망간 및 코발트를 시각화하였다. 흡착 후 샘플의 원소 조성을 확인하기 위해 EDS (Energy dispersive spectroscopy)를 사용하였다. SEM/EDS 분석을 위한 샘플을 얻기 위해, 흡착 후 샘플을 EYELA FDU-2200 동결건조기로 동결건조시킨 후 EDS가 장착된 JEOL 전계방출형 주사전자현미경으로 분석하였다.
분자 모델링 연구
금속 결합 친화력에 차이가 있는 이유를 연구하기 위해, 비교 모델링 툴인 Modeler(Eswar N, Webb B, Marti-Renom MA, Madhusudhan MS, Eramian D, Shen M-y, Pieper U, Sali A (2001) Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Protein Science John Wiley & Sons, Inc.)를 사용하여 3개 융합 단백질에 대한 3차원 구조를 구성하였다. 또한, 구조적 주형으로 융합 단백질의 전장 서열을 정렬하고 온라인 툴을 사용하여 이차 구조를 분석하였다. 3개의 상이한 융합 단백질이 ompc 단백질의 부분 루프 및 cap43 단백질의 Mn(II) 및 Co(II) 이온 결합 펩티드 부분의 3개 반복체를 포함하기 때문에, 구조 연구를 위해 융합 모델 구조를 구성하였다. 3차원 구조를 개발하기 위해, 융합 단백질의 전장 서열, ompc 및 금속 결합 펩티드의 개별 서열을 위한 구조적 주형 탐색을 BlastP 툴을 사용하여 PDB 데이터베이스에서 실시하였다. 반면에, 다중 서열 정렬을 온라인 툴인 espript3을 사용하여 구조적 주형(PDB ID-2J1N)의 이차 구조와 비교하였다. 또한, 구조적 주형으로 osmoporin OmpC를 사용하여 전장 융합 단백질에 대해 모델 구조를 구성하였다.
<결과>
Mn 및 Co 결합 박테리아 표면 발현 시스템의 구성
효율적인 발현 시스템의 개발에서, 단백질 또는 펩티드의 효과적인 발현을 위해 담체 단백질에서의 위치가 매우 중요하다. E. coli의 외막 단백질인 OmpC는 펩티드 또는 단백질의 융합을 위해 사용될 수 있는 8개의 외부 루프를 포함한다. 본 발명에서는, Mn 및 Co 결합 펩티드 (TRSRSHTSEG)3의 C-말단 융합이 OmpC의 3개의 다양한 외부 루프에서 사용되었다. 융합은 189bp에서 루프 2, 726bp에서 루프 6, 993bp에서 루프 8로 3개의 루프에서 이루어졌다(도 1). 다양한 부위에서 ompC 유전자를 절단한 후 표 2에 언급된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 절단된 루프의 C-말단에 Mn 및 Co 결합 펩티드가 융합되어 구성될 수 있다. 유전자를 SacI 및 HindIII 부위를 사용하여 pBAD30 벡터 내로 클로닝시켜 pBADO189, pBADO726 및 pBADO993를 만들었다(표 1). 3개 재조합 균주 발현 모두 PBAD프로모터의 제어 하에서 이루어졌으며 단백질 발현은 아라비노스의 추가로 유도되었다 (도 2).
표면 발현 조건의 최적화
효율적인 펩티드 발현 조건을 연구하기 위해, 균주 pBADO189,pBADO726 및 pBADO993를 0% 내지 0.5% 농도의 아라비노스로 유도하였다. 3개의 다양한 루프와 융합된 Mn 및 Co 결합 펩티드를 보유한 재조합 균주에 대해 SDS PAGE 분석을 하여 단백질 발현을 관찰하였다. 각각 10kda, 29.7kda 및 39.7kda에서 3개 균주 pBADO189, pBADO726 및 pBADO993의 발현 패턴이 증가함을 관찰되었다(도 3). OmpC의 발현이 온도에 의해 상당히 영향을 받으므로, 3개 재조합 균주의 발현을 다른 2개 온도(25℃및 30℃)에서 연구하였다. 3개 균주 모두 25℃에서의 발현은 30℃에서보다 매우 낮았다(결과는 도시하지 않음). 상기 결과에 근거하여, 펩티드의 발현에 적합한 조건은 6시간 동안 30℃에서 0.5%의 아라비노스를 사용하여 펩티드를 발현시키는 것이다.
Mn 및 Co 흡착 분석
OmpC의 3개 루프와 융합된 Mn 및 Co 결합 펩티드를 보유한 3개 재조합 균주의 성능을 염화망간 및 염화코발트의 다양한 농도에 대해 펩티드를 발현하는 세포를 인큐베이션하여 평가하였다. 3개 재조합 균주에서, 이들 각각의 융합 부위에서 펩티드를 무효화하여 대조 플라스미드를 제조하여 이를 음성 대조로서 사용하고(표 2) 아라비노스 유도 없이 각각의 융합 부위에서 펩티드를 담지하는 균주를 양성 대조로서 사용하였다.
망간 흡착에서, 루프 2, 루프 6, 루프 8에서 ompC만을 담지하는 3개의 음성 대조 균주는 1mM의 망간 농도에서 각각 최대 53, 61 및 78 μmol/g DCW의 망간 흡착을 보였다(데이터는 도시하지 않음). 플라스미드 pBADO189, pBADO726 및 pBADO993를 보유한 균주는 1mM에서 각각 586.32, 1235.14 및 1125.24 78 μmol/g DCW의 망간의 최대 망간 흡착을 보였다(도 4A-C). pBADO189, pBADO726 및 pBADO993를 보유한 3개 재조합 균주 중 유도되지 않은 균주는 1mM에서 각각 156.6, 230.15 및 218.54 μmol/g DCW의 망간의 최대 흡착을 보였다(도 4A-C). 망간의 흡착은 0.1mM에서 1mM로 증가하였다. 3mM로 농도가 증가하면, 흡착은 침체되고 더 이상 증가하지 않았다(데이터는 도시하지 않음). 이러한 데이터로부터, 루프 6이 더 높은 망간 흡착을 보임을 확인하였으며, 루프 2 및 루프 8가 그 뒤를 이었다.
또한 코발트에 대한 3개의 재조합 균주의 흡착 전략을 평가하기 위해, 세포 표면에 펩티드를 발현시킨 후 염화코발트를 세포에 추가하였다. 동일한 음성 및 양성 대조 세포를 대조로서 사용하였다. 코발트 흡착에서, 음성 대조 균주 pBAD189, pBAD726 및 pBADO993는 0.2mM의 염화코발트에서 각각 약 43.5, 59.54, 76.14 μmol/g DCW의 코발트 흡착능을 보였다(데이터는 도시하지 않음). pBADO189, pBADO726 및 pBADO993을 보유한 재조합 균주는 펩티드 발현 후 0.2mM에서 약 236.93, 379.68, 369.65 μmol/g DCW의 더 높은 코발트 흡착을 보였다(도 5A-C). 코발트 흡착에서, 망간에서와 같이 루프 6에 융합된 펩티드가 더 높은 흡착능을 보였다. 유도되지 않은 세포에서 흡착은 펩티드 발현 세포에 비해 상대적으로 낮았다 (도 5A-C).
환경 적용에서의 3개 재조합 균주의 능력 및 펩티드의 선택성을 0.1mM의 각 금속을 함유하는 인공 오염 폐수에서 또한 시험하였다. 3개 재조합 균주 모두는 망간에 대해 우선 더 높은 선택성을 보였으며, 코발트가 그 뒤를 이었다. 다양한 금속에 대한 선택성은 3개 재조합 균주 모두에서 Mn>Co>Cu>Pb>Li의 순서였다(도 6A-C). 본 발명에서는 또한 pBADO726플라스미드를 보유하는 균주가 각각 약 326.325 및 220.153 μmol/g DCW의 망간 및 코발트의 더 높은 망간 및 코발트 흡착을 보였다(도 6B). 이러한 결과에 근거하여, 3개의 반복 펩티드(TRSRSHTSEG)의 30개 아미노산이 환경에서 망간 및 코발트를 효과적이고 선택적으로 흡착하는데 사용될 수 있음을 제시하는 것이다.
pBADO 726 의 지지 화학적 특성화
재조합 균주에 의한 망간 및 코발트의 흡착에 대한 좀더 많은 증거를 보이기 위해, 흡착 후 흡착된 금속의 확인 및 이의 조성을 확인하기 위해 pBADO726플라스미드 함유 균주에 FE-SEM 분석 및 EDS 분석을 실시하였다. 흡착 후 세포를 세척하고 FE-SEM으로 시각화시킨 후 동일한 세포를 EDS 분석을 위해 동결건조하였다. 흡착 전 및 후의 pBADO726 플라스미드 함유 균주의 흡착을 도 7에 나타냈다. EDS 분석은 또한 흡착 후 각각의 균주에서 Mn 및 Co의 존재를 명확히 보였다(도 7E 및 7F).
분자 모델링 연구
구조 연구에 근거하여, 짧은 금속 결합 반복체 자체가 개별적인 루프 대신 전장 단백질의 형성에 도움이 됨이 명백하다. OmpC와 융합 단백질의 다중 서열 정렬 및 이의 이차 구조(2J1N)는 도 1에 나타냈다. 여기에서, 융합 단백질 2(루프 2에 융합된 단백질)의 짧은 금속 결합 펩티드의 2개 반복체가 β 시트 4 및 5에서 정렬되며 단일 반복체만이 회전 또는 코일로서 자유로웠다. 유사하게, 융합 단백질 6(루프 6에 융합된 단백질)의 금속 결합 펩티드의 짧은 반복체는 β 시트 12 및 13의 중간에 존재하며 금속 결합 펩티드의 1개의 반복체만이 자유 형태이다. 또한, 융합 단백질 3(루프 8에 융합된 단백질)의 서열은 B17-알파 헬릭스-b18로부터 시작하여 정렬되었다. 융합 단백질이 osmporin OmpC과 유사한 방식으로 폴드될 경우, cap43의 두 번째 반복체는 금속 결합 활성에 관련된다. 다른 두 개의 반복체는 헬릭스 형성에 관련된다(B17 및 B18). 금속 결합 펩티드의 짧은 반복체는 또한 OmpC 단백질과 함께 헬릭스를 형성할 것으로 여겨진다. 이를 입증하기 위해, 구조적 주형으로서 OmpC를 사용하여 전장 단백질에 대한 모델 구조를 구성하였다. 말단을 무시하지 않고 융합 단백질의 모델을 구성하였다. 모델에 근거하였을 때, 삼중 반복 금속 이온 결합 짧은 펩티드가 헬릭스 형성에 관련되며 금속 결합 펩티드의 단일 반복체만이 융합 단백질 2의 금속 결합 활성의 이유가 될 수 있는 루프로서 자유로움이 명백하다(도 2A). 또한, 융합 단백질 6의 경우, 금속 결합 펩티드의 2개 반복체만이 자유 루프이며 다른 하나는 헬릭스 형성에 관련된다(도 2B). 이는 융합 펩티드의 금속 결합 활성에서의 차이가 짧은 금속 결합 반복체의 자유 루프의 유용성에 의해 주로 결정됨을 명백하게 나타내는 것이다. 융합 단백질 6의 회전 개연성 및 β 시트 형성은 어려울 것이다. 융합 단백질 3은 또한 유사한 방식으로 형성되며 하나 및 절반의 서열이 금속 결합에 도움이 될 수 있는 자유 루프 형성에 관련되어 있다(도 2C). 자유롭게 접근가능한 삼량체 반복체가 루프를 형성함으로써 금속 이온에 결합할 수 있음이 명백하다. 그러나, 다른 부분은 융합된 OmpC 단백질과 함께 이차 구조의 형성에 관련된 것으로 보인다.
Figure 112017025707362-pat00003
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> CELL SURFACE EXPRESSION VECTOR FOR MANGANESE AND COBALT BINDING PEPTIDE AND MICROORGANISM TRANSFORMED BY THE SAME <130> PN1612-485 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpC <400> 1 atgaaagtta aagtactgtc cctcctggtc ccagctctgc tggtagcagg cgcagcaaac 60 gctgctgaag tttacaacaa agacggcaac aaattagatc tgtacggtaa agtagacggc 120 ctgcactatt tctctgacaa caaagatgta gatggcgacc agacctacat gcgtcttggc 180 ttcaaaggt 189 <210> 2 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpC <400> 2 atgaaagtta aagtactgtc cctcctggtc ccagctctgc tggtagcagg cgcagcaaac 60 gctgctgaag tttacaacaa agacggcaac aaattagatc tgtacggtaa agtagacggc 120 ctgcactatt tctctgacaa caaagatgta gatggcgacc agacctacat gcgtcttggc 180 ttcaaaggtg aaactcaggt tactgaccag ctgaccggtt acggccagtg ggaatatcag 240 atccagggca acagcgctga aaacgaaaac aactcctgga cccgtgtggc attcgcaggt 300 ctgaaattcc aggatgtggg ttctttcgac tacggtcgta actacggcgt tgtttatgac 360 gtaacttcct ggaccgacgt actgccagaa ttcggtggtg acacctacgg ttctgacaac 420 ttcatgcagc agcgtggtaa cggcttcgcg acctaccgta acactgactt cttcggtctg 480 gttgacggcc tgaactttgc tgttcagtac cagggtaaaa acggcaaccc atctggtgaa 540 ggctttacta gtggcgtaac taacaacggt cgtgacgcac tgcgtcaaaa cggcgacggc 600 gtcggcggtt ctatcactta tgattacgaa ggtttcggta tcggtggtgc gatctccagc 660 tccaaacgta ctgatgctca gaacaccgct gcttacatcg gtaacggcga ccgtgctgaa 720 acctac 726 <210> 3 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpC <400> 3 atgaaagtta aagtactgtc cctcctggtc ccagctctgc tggtagcagg cgcagcaaac 60 gctgctgaag tttacaacaa agacggcaac aaattagatc tgtacggtaa agtagacggc 120 ctgcactatt tctctgacaa caaagatgta gatggcgacc agacctacat gcgtcttggc 180 ttcaaaggtg aaactcaggt tactgaccag ctgaccggtt acggccagtg ggaatatcag 240 atccagggca acagcgctga aaacgaaaac aactcctgga cccgtgtggc attcgcaggt 300 ctgaaattcc aggatgtggg ttctttcgac tacggtcgta actacggcgt tgtttatgac 360 gtaacttcct ggaccgacgt actgccagaa ttcggtggtg acacctacgg ttctgacaac 420 ttcatgcagc agcgtggtaa cggcttcgcg acctaccgta acactgactt cttcggtctg 480 gttgacggcc tgaactttgc tgttcagtac cagggtaaaa acggcaaccc atctggtgaa 540 ggctttacta gtggcgtaac taacaacggt cgtgacgcac tgcgtcaaaa cggcgacggc 600 gtcggcggtt ctatcactta tgattacgaa ggtttcggta tcggtggtgc gatctccagc 660 tccaaacgta ctgatgctca gaacaccgct gcttacatcg gtaacggcga ccgtgctgaa 720 acctacactg gtggtctgaa atacgacgct aacaacatct acctggctgc tcagtacacc 780 cagacctaca acgcaactcg cgtaggttcc ctgggttggg cgaacaaagc acagaacttc 840 gaagctgttg ctcagtacca gttcgacttc ggtctgcgtc cgtccctggc ttacctgcag 900 tctaaaggta aaaacctggg tcgtggctac gacgacgaag atatcctgaa atatgttgat 960 gttggtgcta cctactactt caacaaaaac atg 993 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cap43 <400> 4 acccgcagcc gcagccatac cagcgaaggc acccgcagcc gcagccatac cagcgaaggc 60 acccgcagcc gcagccatac cagcgaaggc 90

Claims (9)

  1. OmpC(outer membrane protein C)의 N 말단으로부터 6번째 루프가 절단되고 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자; 및
    망간 및 코발트 결합 펩티드를 코딩하고 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 유전자;를 상기 OmpC의 C 말단에 융합한 재조합 유전자를 포함하는 망간 및 코발트의 흡착 또는 제거용 재조합 벡터.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 망간 및 코발트 결합 펩티드는 (TRSRSHTSEG)3의 아미노산 서열로 이루어진 것인 망간 및 코발트의 흡착 또는 제거용 재조합 벡터.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 따른 망간 및 코발트의 흡착 또는 제거용 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩코커스로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인 미생물.
  7. 삭제
  8. 제1항의 재조합 벡터 또는 제5항의 형질전환 미생물을 포함하는 망간 및 코발트의 흡착 또는 제거용 조성물.
  9. 제1항의 재조합 벡터 또는 제5항의 형질전환 미생물을 폐수 또는 해수에 처리하는 단계를 포함하는 망간 및 코발트를 흡착 또는 제거하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100313135B1 (ko) * 1999-02-22 2001-11-05 윤덕용 세포 표면 발현 모체로서의 대장균 유래 세포외막 단백질 ｃ(ｏ
KR101544270B1 (ko) * 2013-10-01 2015-08-12 울산대학교 산학협력단 세포 표면 발현 기술을 이용한 gaba의 대량 생산방법

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