CN1329516C - 含多糖材料的修饰 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于使含多糖材料交联和/或改变含多糖材料性能的组合物。用于使含多糖材料交联的方法包括用PBD融合蛋白处理多糖结构的步骤。通过用包含一个官能部分的PBD融合蛋白进行处理，可以对含多糖材料的性能进行官能化。描述了湿强度和/或弹性增强的含多糖材料，例如纸和纺织品。

Description

含多糖材料的修饰
发明领域和发明背景
本发明涉及用于改变多糖材料的结构特性、化学性能、物理性能和机械性能的方法和组合物，所述方法和组合物使用基于与生物实体或化学实体融合或连接的多糖结合结构域的多聚结构和所得的生物组合物的生物交联剂。本发明的例子是应用含两个纤维素结合结构域的纤维素结合结构域(CBD)融合蛋白、纤维素结合结构域-A蛋白-Ab复合物或S-肽-纤维素结合结构域-S-蛋白融合体，以增强薄棉纸、滤纸和棉纱的机械性能，例如湿强度。
多糖是在自然界中发现的普遍存在的稳定的结构组分。许多生物利用多糖作为细胞内外的结构材料，来提供三维形状和表面结构。得自天然来源的多糖的结构完整性在多糖分离后常常保留，使得可将其用于各种各样的商业目的。多糖因其理想的物理性能，也已经采用合成法合成用于商业目的。在这两种情况下，得自或者合成或者非合成来源的多糖(例如纤维素)包括用于各种各样商业上重要的产品(例如纸浆和纺织纤维)的原材料。
传统上造纸方法包括四个主要步骤：形成纤维素纤维的含水悬浮液，通常称为纸浆；将各种加工物料和纸增强物料(例如增强材料和/或施胶材料)加入纸浆中；抄纸，通过在成形纤维上浇注所得的悬浮液，滤出大多数水，并将所述纤维干燥，形成所需的纤维素网；以及在所述纸初步干燥后，对所述网进行后处理，以为所得的纸提供各种所需特性，包括表面应用施胶材料以提高纸的干强度。在含水浆料中施用于纸浆的那些添加剂被称为湿部添加剂，包括：助留剂，以保留细料和填料，例如明矾、聚乙烯亚胺、阳离子型淀粉等；助滤剂(drainageaids)，例如聚乙烯亚胺；消泡剂；和树脂或添加剂，例如微细纤维和吸收性填料。其它湿部添加剂包括加入以改进纸的湿强度以及干强度的聚合物，例如阳离子型聚芳基酰胺类和聚(酰胺胺类/环氧氯丙烷)。也加入淀粉、瓜耳胶和聚丙烯酰胺，以改进干强度。有时加入施胶剂，以赋予亲水性纤维素纤维以疏水特性。这些药剂用于制造用于液体容器(例如乳或汁液)、纸杯和需要防止墨水扩散的用水性墨水印刷的表面的纸。这类施胶剂包括得自松树的松香胶、蜡乳液和最近的纤维素反应胶。在初步干燥所述纸片后，通过喷雾涂布、毛细管吸着涂布、浸渍涂布、辊式涂布等，将添加剂施用于纸，通常称为干部添加。聚(乙烯醇)、丙烯酸乳液或乙酸乙烯酯乳液、淀粉、施胶剂、聚氨基甲酸酯和SBR胶乳通常于干部加入。
造纸工业的主要产品是瓦楞芯层(corrugating medium)，即用于瓦楞容器中的中间层瓦楞纸。淀粉占瓦楞纸总重量的2-5％。已经使用各种技术来该改进瓦楞芯层的湿强度，包括应用化学交联剂例如甲醛树脂，或应用疏水性材料例如蜡。然而，由于这些化合物对经处理纸的再循环能力有不利影响，因而已经基本上停止向纸中添加这类化合物或用这类化合物处理纸。使用的其它技术利用更昂贵的原料例如半化学浆，以便增加每平方米纸的重量和强度。这后一种方法导致原材料和生产过程本身的费用增加。
同造纸一样，将纤维素材料(例如棉纤维)加工成织物也涉及几个步骤：将纤维纺纱成纱线；由纱线织造机织物或针织物和后续的前处理、染色和整理操作。机织品是织物织造的主要形式。纱线一般在浆槽中上浆，然后在蒸汽圆筒烘燥机上脱水，使纱线成形为片纱，片纱经过分纱棒将片纱分为单纱。然后用纱线织造，即通过纬纱在一系列经纱之间织造。前处理所包括的分步骤是退浆、煮练和漂白。在该工业中也使用一步联合练漂工艺。
将各种化合物用作经纱的浆料，以防止织造期间断纱。良好的纱线浆料是形成足够强度的膜以为上浆的纱线提供保护、但不会强致在浆膜下断纱的浆料。在织造之前将浆料置于经纱上，为纱线提供强度并且保护纱线免遭磨损。含棉纱线的传统的浆料一般包括成膜剂(例如淀粉、淀粉衍生物、聚乙烯醇、聚酯树脂、蜡、丙烯酸聚合物和共聚物及其盐)、润湿剂、抗静电剂及其组合。传统的热固性树脂体系(或者后固化的或者预固化的)导致纤维素纤维脆化和其微观结构单位流动性的降低，致使耐磨损性、断裂强度和撕破强度常常受到严重损害。耐磨损性通常降低75-85％，断裂强度降低50-60％，而撕破强度降低约50％。此外，如果含纤维素纤维的纱线用上述传统方法上浆，则难以使浆纱完全退浆。即使浆纱完全退浆，退浆过程也是复杂或昂贵的。
最近，对在一个简单过程中实现退浆而无污染的需求变得越来越重要。因此，有价值的是开发用于含多糖材料(例如纸或纺织品)、减少或避免应用潜在有毒并且其应用昂贵且费时的化学交联剂的添加剂。
相关文献：
Din等(1991)Bio/Technology 9：1096-1099描述了用细菌纤维素酶的结合结构域破坏纤维素纤维。Kim等(1993，Protein Science 2：348-356)描述了一种具有S-肽载体、一个具有蛋白酶识别序列的寡肽间隔区和一个半乳糖苷酶靶的重组融合蛋白。Shpigel等(1999)Biotech.Bioeng.65：17-23描述了与C.cellulovorans的CBD的N末端或C末端融合的肝素酶I(得自肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum))融合蛋白的表达。
Kilburn等的美国专利第5,137,819号公开了包括一个纤维素酶底物结合区的融合蛋白的制备以及所述融合蛋白在多肽固定化和纯化方面的应用。Kilburn等的美国专利第5,928,917号公开了非蛋白化学部分和具有纤维素结合区的多肽的缀合物。多糖结合蛋白和缀合物在Kilburn等的美国专利第5,962,289号中有描述。Gilkes等的美国专利第5,821,358号公开了用多糖酶的结合结构域和/或催化结构域修饰多糖结构(例如棉纤维和苎麻纤维)的方法和组合物。
Shoseyov等的美国专利第5,837,814号公开了一种对结晶纤维素和壳多糖具有高亲和力的CBD以及所述CBD与第二蛋白的融合产物。也公开了所述CBD和所述融合产物的应用，包括药物传递、亲和分离和诊断技术。也参见Shoseyov等的美国专利第5,719,044号、美国专利第5,496,934号和U.S.5,856,201，每个专利的内容都通过引用结合到本文中。
B.B.Spence Encyclopedia of Polymer Science and Technology，第二版，Wiley-Interscience，第10卷，第761-786页，New York(1987)给出了有关纸用添加剂效用的综述。
发明概要
本发明涉及使用包含至少一个多糖结合结构域的组合物使聚合材料或多糖材料交联和/或官能化的组合物和方法。本发明的组合物包括多糖结合结构域(PBD)融合蛋白、PBD偶联剂单位、PBD官能部分和用这些组合物修饰的多糖。本发明的PBD偶联剂单位包括一个、两个或更多个PBD，每个PBD都能够独立地与一个多糖结合，还可任选地包含在所述PBD之间偶联的一个或多个接头单位。所述方法包括使多糖结构与足够量的PBD融合蛋白接触的步骤，其接触条件和接触时间使得足以修饰含一种多糖结构的多糖材料的一个或多个特性。所述方法和组合物可应用于制造机械性能、化学性能、电学性能和/或物理性能改变的含多糖材料。
按照本发明的一个方面，提供一种制造具有至少一种所需结构特性、化学性能、物理性能、电学性能和/或机械性能的含多糖材料的方法，所述方法包括以下步骤：使含多糖材料的多糖结构与含多糖结合结构域的组合物在将所述多糖结构加工到所述含多糖材料中之前、期间和/或之后进行接触，从而制造具有所需结构特性、化学性能、物理性能、电学性能和/或机械性能的所述含多糖材料。
按照本发明的另一方面，提供一种题述组合物，所述组合物包含：一种包含多糖结构的含多糖材料；和一种含有多糖结合结构域的组合物，所述组合物待与所述含多糖材料的多糖结构结合，为所述含多糖材料提供至少一种所需的结构特性、化学性能、物理性能、电学性能和/或机械性能。
按照下述本发明优选实施方案的其它特征，在将所述含多糖材料的多糖结构加工到所述含多糖材料中之前，实现使所述多糖结构与所述含多糖结合结构域组合物接触。
按照所述优选实施方案的其它特征，在将所述含多糖材料的多糖结构加工到所述含多糖材料中期间，实现使所述多糖结构与所述含多糖结合结构域组合物接触。
按照所述优选实施方案的其它特征，在将所述含多糖材料的多糖结构加工到所述含多糖材料中之后，实现使所述多糖结构与所述含多糖结合结构域组合物接触。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖材料选自纸、纺织品、纱线和纤维。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述结构特性选自所述含多糖材料的多糖结构之间预定水平的交联、所述含多糖材料的多糖结构的预定聚集、以及所述含多糖材料的预定表面网纹。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述化学性能选自预定的疏水性、预定的亲水性、预定的可湿性、预定的化学反应性、预定的光化学反应性、预定的官能性和预定的表面张力。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述物理性能选自预定的杨氏模量、最大负荷下的预定应变、预定的断裂点能、预定吸水性、预定的溶胀性和预定的韧性。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述电学性能选自预定的表面电荷和预定的导电性。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述机械性能选自预定的抗张强度、预定的抗剪力、预定的耐磨损性、预定的摩擦系数、预定的弹性和预定的湿强度。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和至少一个与其共价偶联的另外的多糖结合结构域。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和与其共价偶联的另一蛋白质。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的疏水性基团。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的亲水性基团。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的生物学部分。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的酶。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的化学反应基团。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的化学光反应基团。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的脂酶。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的漆酶。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的A蛋白-抗体。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的肽。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的多肽。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的烃或烃衍生物。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的脂肪酸衍生物。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的带电荷部分。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的离子部分。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的硅结合部分。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的聚合物结合部分。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一种与其共价偶联的金属。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的金属硫蛋白样蛋白。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的铁蛋白。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的金属结合部分。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的细菌铁载体。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的金属硫蛋白。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的巯基。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的醛。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的马来酰亚胺。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的酰肼。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的环氧化物。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的碳二亚胺。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的叠氮基苯。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是纤维素结合结构域。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是淀粉结合结构域。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与纤维素结合的多糖结合结构域。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与淀粉结合的多糖结合结构域。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与壳多糖结合的多糖结合结构域。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是葡聚糖结合结构域，例如β-1，3-葡聚糖结合结构域。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域包括链球菌葡聚糖结合重复序列。
按照本发明的又一方面，提供一种题述组合物，所述组合物包含：一种包含多糖结构的含多糖材料；和一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少两个共价偶联的多糖结合结构域，形成使所述含多糖材料的多糖结构交联的多糖结合结构域偶联剂。
按照本发明的再一方面，提供一种题述组合物，所述组合物包含：一种包含多糖结构的含多糖材料；和一种待与所述含多糖材料的多糖结构结合的所述含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的官能化部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述官能化部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接。
按照本发明的另一方面，提供一种题述组合物，所述组合物包含：一种包含多糖结构的含多糖材料；和一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的疏水性部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述疏水性部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接。
按照本发明的再一方面，提供一种题述组合物，所述组合物包含：一种包含多糖结构的含多糖材料；和一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的亲水性部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述亲水性部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接。
按照本发明的又一方面，提供一种题述组合物，所述组合物包含：一种包含多糖结构的含多糖材料；和一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的化学反应性部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述化学反应性部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接。
按照本发明的另一方面，提供一种题述组合物，所述组合物包含：一种包含多糖结构的含多糖材料；和一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的光化学反应性部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述光化学反应性部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接。
按照本发明的又一方面，提供一种题述组合物，所述组合物包含一个多糖结合结构域偶联剂，所述偶联剂包括至少两个共价偶联的多糖结合结构域。
按照本发明的再一方面，提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包括至少两个多糖结合结构域。最好是，所述核酸构建体还包含至少一个编码至少一个接头肽的另外的多核苷酸，所述接头肽偶联所述至少两个多糖结合结构域。
按照本发明的又一方面，提供一种制造含多糖材料的方法，所述含多糖材料具有至少一种所需的结构特性、化学性能、物理性能、电学性能和/或机械性能，所述方法包括以下步骤：使含多糖材料的多糖结构与多糖结合结构域在将所述多糖结构加工到所述含多糖材料中期间和/或之后进行接触，并且此后将至少一个部分或基团共价与所述多糖结合结构域偶联，从而制造所述具有所需结构特性、化学性能、物理性能、电学性能和/或机械性能的含多糖材料。
本发明通过提供用于制造优良的含多糖结构材料(例如纸和纺织品)的方法和试剂，成功地克服了目前已知结构的缺点。
附图简述
在此仅通过实施例并参考附图描述本发明。现在具体参见附图的细节，强调的是，所示的具体细节是作为实例，仅仅用于说明性地论述本发明的优选实施方案，其目的是提供所认为最有用的最容易理解本发明原理和概念方面的描述。在这一方面，没有花力量来显示比基本理解本发明所必需的更详细的本发明结构细节，所述描述与附图结合，使得关于在实践中可以如何具体实现本发明的几种形式对于本领域技术人员是显而易见的。
图1A是pET-CBD质粒的图式说明。
图1B-1C显示了CBDclos的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图1D是pET-CBD-180的图示说明。
图1E-G显示了CBD-180的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)以及限制性内切核酸酶识别位点。
图2A是含有一个拷贝CBD-180和一个拷贝的与其符合读框地融合的CBD的pET-CCP-180的图示说明。
图2B-E显示了CCP(纤维素交联蛋白)的核苷酸序列(SEQ IDNO：5)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)以及限制性内切核酸酶识别位点。
图3A是pET-ProtA-CBD的图式说明。
图3B-G显示了ProtA-CBD的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图4A是pET29-Spep-CBD-Sprot的图式说明。
图4B-G显示了Spep-CBD-Sprot的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。
图5A图式说明每分子具有两个纤维素结合结构域的纤维素交联蛋白。
图5B图式说明图5A的纤维素交联蛋白，其中一个纤维素结合结构域与第一聚合结构单位结合，而第二纤维素结合结构域与第二聚合结构单位结合。
图6图式说明一个属类的CBD偶联剂单位。
图7A-C分别图式说明CBD偶联剂单位的各个实施方案。图7A显示了一种CBD偶联剂单位，它具有：由一个接头单位连接的一对末端CBD，所述接头单位包括一对分别与一个CBD偶联的淀粉结合结构域；和一个淀粉部分，所述淀粉部分与两个淀粉结合结构域偶联。图7B显示了一种CBD偶联剂单位，它具有：由一个接头单位连接的一对末端CBD，所述接头单位包括多个CBD，每个CBD通过一个JUN/FOS桥与一个相邻的CBD偶联。图7C显示了具有由一个大蛋白部分连接的一对末端CBD的CBD偶联剂单位。
图8图式说明具有至少一个CBD和一个与其连接的官能部分(FM)的CBD官能部分(CBDC)。
图9A-C图式说明CBD偶联剂单位可以与聚合结构单位相互作用和结合的各种方式。
图10A-D是柱状图表，分别显示对照、CBD处理和CCP处理的纸条的杨氏模量、最大负荷下的应变、断裂点能和韧性。
图11图式说明用于用实验制剂处理纱线的纱线涂层装置。
图12A-B是柱状图表，分别显示对照、CCP处理、ProtA-CBD处理和Ab-ProtA-CBD处理的纱线的杨氏模量和最大负荷下的应变。
图13是一张照片，显示了S-蛋白-CBD-S-肽(SCS)在大肠杆菌中的表达结果。蛋白质标记物(1道)，用IPTG诱导之前的大肠杆菌总蛋白(2道)，用IPTG诱导之后的大肠杆菌总蛋白(3道)，和含SCS蛋白的包含体(4道)。
图14显示了用CBD、CCP或SCS处理Whatman纸结果的杨氏模量图。所有测量均在23℃、65％相对湿度下进行。
图15显示了经CBD、CCP和SCS处理的Whatman纸的断裂点能。所有测量均在23℃、65％相对湿度下进行。
图16显示了经CBD、CCP和SCS处理的Whatman纸的韧性结果。所有测量均在23℃、65％相对湿度下进行。
图17显示了经CBD、CCP和SCS处理的Whatman纸在最大负荷下的应力。所有测量均在23℃、65％相对湿度下进行。
图18显示了用CBD或CCP处理的预成形Whatman纸的典型的应力与应变关系曲线。所有测量均在23℃、65％相对湿度和20mm/min的恒定变形速率(deformation rate)下进行。方形-对照；圆形-2.5mg/ml CBD；三角形-2.5mg/ml CCP。
图19显示了用不同浓度的CBD或CCP处理的预成形Whatman纸的吸水时间。所有测量均在23℃进行。吸取蒸馏水(10μl)置于经处理的纸上，以秒测量完全吸收的时间(对照-实心条带；CBD-点画条带；CCP-空心条带)。
图20显示经CCP处理的预成形Whatman纸上水吸收的时间推移照片。将水滴(每滴20μl)滴到经CCP处理的纸上，每25ms拍摄照片。在水与纸接触前拍摄第一帧(A)。B-E帧分别摄于2、4、6和8分钟后。在水与纸接触后25ms在未经处理的纸上拍摄最后一帧(F)。用光接触角度计(optical contact angle meter)显现水的吸收。
优选实施方案的详细描述
按照本发明，提供用于改变多糖材料表面特性、化学性能、电学性能和机械性能的方法和组合物。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应该理解，本发明的应用不限于以下描述或实施例所例举的细节。本发明能够以各种方式实施其它实施方案。也应该理解，本文所用的措辞和术语是为了描述，不应该被认为是限制性的。
例如纤维和长丝的多糖结构在将所述结构加工到含多糖材料中期间或之后，用含PBD组合物处理，从而使所述多糖结构和/或其产品(例如纺织品和纸)交联和/或官能化。含PBD组合物用作万能生物交联剂，其结构可以改变，以适应含多糖成品的所需结果，例如弹性或疏水性增强。所述生物交联剂是多聚蛋白，含有至少一个PBD(例如纤维素结合结构域)，所述PBD与一个或多个生物实体或化学实体融合或连接(“融合或连接”＝共价偶联)，所述生物实体或化学实体的大小范围是数百道尔顿至数百万道尔顿。所述生物实体一般是一种或多种第二蛋白质。所述第二蛋白质可以是另一种PBD，例如纤维素结合结构域或淀粉结合结构域或官能化PBD，例如与疏水基团或酶结合的PBD，所述酶尤其是可以改进或加速所述含多糖成品的多糖结构和/或特性加工的酶，例如脂酶或漆酶。或者，所述第二蛋白质可以是一种非PBD蛋白，例如A蛋白-抗体复合物。
为了制备经修饰的含多糖材料，使多糖结构在将其加工到多糖材料中期间或之后，与足量的生物交联剂接触，其接触条件和时间足以改变含所述多糖结构的多糖材料的一种或多种性能。作为一个例子，在将纤维素纤维加工为纸或将棉花加工为纱线期间不用传统的施胶或上浆步骤，或结合传统的施胶或上浆步骤，可以用所述PBD融合蛋白使多糖结构聚集和/或使多糖结构(例如多糖纤维和长丝)交联，以便增强所述结构自身在加工期间的湿强度和/或所制造的含多糖材料的湿强度。最好是，用PBD融合蛋白处理，来替代传统的施胶或上浆步骤。然而，在某些应用中，可以有用的是将这两种方法例如与淀粉胶和含淀粉结合蛋白的PBD融合蛋白相结合，以使所述淀粉与所述纤维交联。另外，包含官能部分的PBD可以用来将具有例如疏水部分(例如脂肪酸衍生物或疏水性氨基酸序列)的含多糖材料(例如纤维素基质)官能化，以降低含多糖材料(例如纸)的可湿性。
本发明提供优于例如用于商业票据和纺织加工的现有处理多糖结构方法的几个优点。通过用生物交联剂处理合适的含多糖材料(例如纤维素纤维)，可以获得与未经处理的材料和/或用非PBD融合蛋白的增强材料处理的材料相比机械性能改进(例如强度和耐用性增强)的产品。另外，在瓦楞纸的制造中，可以在或者成形阶段或者施胶阶段之前或之后应用所述PBD试剂，以增强所述纸的湿强度。如果在成形阶段应用，则它提供足够的湿强度，使得可以除去施胶步骤。因为可以省去纸加工所用机器中大约三分之一的机器，所以这不仅节约了时间，而且显著降低造纸成本。与化学交联剂和疏水材料相反，应用生物交联剂也改进了使用该方法制造的纸产品的再循环能力。
本发明的另一优点是：在造纸的成形步骤中，许多细小纤维因为穿过成形网而损失。而所述PBD试剂将它们保留在纸浆中，导致原料的回收率更高。另外，在制造瓦楞容器的最后一个加工步骤中，使用碱性胶，以将所述瓦楞纸结合于壁板上。用强碱性条件洗脱PBD分子，这增强了所述碱性胶渗透所述纸的能力。
本发明的多聚PBD融合蛋白具有两种基本构件-一种PBD和一种第二蛋白，其中所述第二蛋白可以是或不是PBD。PBD可以是包含氨基酸序列与多糖(例如纤维素)或含有所述PBS所结合多糖底物基本结构单位的聚合物的蛋白质或肽，所述多糖底物包括或者骨架糖和/或末端糖和所述糖本身，包括单糖和双糖。PBD的定义包括天然存在的PBD的突变体、变异体等，唯一的要求是它们与含多糖底物结合。PBD可以与底物多糖可逆或不可逆地结合，并且所述底物可以是天然的或是合成的。PBD融合蛋白可以是具有多个多糖结合结构域的蛋白质分子，所述多糖结合结构域可以来源于相同或不同的多糖酶或支架蛋白，并且它们可以与相同或不同的多糖结合。当存在多个PBD时，它们最好占据所述PBD融合蛋白内的不同结构域，并且可以相互独立地发挥作用。术语CBD是指可得自参与纤维素结合的天然蛋白质的结构域，或是指自身与纤维素结合的天然蛋白的分离的氨基酸序列或其片段(参见例如Goldstein等(1993)J.Bacteriol.175：5762-5768和Gilkes等(1988)J.Biol.Chem.263：10401-10407，这两个文献的内容通过引用结合到本文中)。PBD和CBD可以是天然的、合成的或部分合成的。
所述多糖结合结构域包括包含多糖结合结构域的、有或没有催化能力的多糖酶，可以采用包括生物化学和/或遗传工程技术在内的多种技术中的任一种来获得。因此，它们可以通过蛋白水解(参见例如Gilkes等，J.Biol.Chem(1988)213：10401-10407)或通过采用本领域技术人员已知的技术通过基因操作(例如随机突变、定点诱变或DNA改组(DNAshuffling))来获得。利用定点诱变，可以对与所述多糖酶催化活性相关的特定氨基酸进行诱变，用抑制或阻断催化活性、但不干扰结合多糖的氨基酸取代。例如，在CenA中，可以取代位点283的天冬氨酸。这样一种方法有效地产生与原始多糖序列相当相似的氨基酸序列，但含所述催化活性的功能结构域由于诱变或生物化学修饰而变得没有功能；仅结合结构域保留功能。可以在各种PBD的氨基酸序列中取代、插入或缺失一个或多个预定的氨基酸残基，以提供变异型或突变型PBD。可以以基于例如靶氨基酸残基的极性、电荷、疏水性、亲水性等的相似性或差异的合理的方式，进行PBD蛋白或多肽序列中的氨基酸取代。在蛋白质中通常见到的所有氨基酸的特性(例如极性和疏水性)是本领域众所周知的，特异性地改变(突变)氨基酸序列的技术也是众所周知的。所得的变异型或突变型PBD被认为属于本发明的范围。可以进行取代、插入和/或缺失，以提供具有多种所需性质(例如用于特定含多糖材料的交联或官能化)的变异型PBD。
可以使用仅对应于所述多糖结合结构域的氨基酸序列，而非具有特定突变或修饰的完整多糖序列。在这种情况下，通过将所述多糖酶切割为功能结构域，获得PBD。例如，使分离的多糖经过蛋白酶处理，将所述蛋白质切割为由功能结构域构成的两个或更多个片段。有时，所述多糖含有一个特异性蛋白酶位点。例如，粪肥纤维单胞菌(C.fini)内切葡聚糖酶A(CenA)含有一个被构象特异性粪肥纤维单胞菌蛋白酶切割的PT框。该反应的产物是具有一个PT序列的多糖结合结构域和一个多糖酶催化结构域。如果所述多糖酶不被高度序列特异性的蛋白酶切割，则使其经受特异性较低的蛋白酶处理，可以通过色谱和本领域技术人员已知的其它肽纯化技术，分离所述活性片段。
可以用来获得结合结构域的其它技术包括应用氨基酸序列信息，来产生用于克隆编码多糖酶或多糖结合蛋白的DNA序列的探针。这些克隆序列可以用来产生仅编码多糖结合结构域的缺失突变体。相反，如果多糖酶或多糖结合蛋白的cDNA序列是已知的，则可以采用生物化学、氨基酸和DNA序列的数据，来根据与其它多糖酶的序列同源性预测所述多糖结合结构域的位置，具体构建对应于所述多糖结合结构域的DNA序列。用于分离多糖酶基因和多糖结合蛋白的技术是本领域已知的，包括合成、从基因组DNA中分离、从cDNA制备或它们的组合。可以用以获得多糖结合结构域的其它技术包括基因融合、噬菌体展示、DNA改组以及随机或定点诱变。用于基因操作的各种技术是众所周知的，包括限制、消化、切除、连接、体外诱变、引物修补、利用接头和连接物等(参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，Sambrook等(编著)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，(1989)，该文献通过引用结合到本文中)。可以从分离纯化的RNA或者通过基因组克隆，获得编码本发明PBD蛋白的核酸。可以用本领域众所周知的技术，制备或者cDNA文库或者基因组文库，并且可以在所述文库中用与所述编码序列的任一部分基本互补的探针，筛选特定的PBD核苷酸序列。或者，可以将cDNA或基因组DNA用作模板，采用合适的寡核苷酸引物进行PCR克隆。可以选择全长克隆，即含有所需PBD蛋白的完整编码序列的那些克隆，来构建表达载体，或者可以将重叠cDNA连接在一起，形成完整的编码序列或其所需的部分，例如结合结构域。或者，可以采用本领域熟知的固相技术，通过化学合成完全或部分合成编码PBD的DNA。
所述PBD可以从多种来源获得，包括与可应用于本发明的寡糖结合的酶。在以下表5中，列出了与一种或多种可溶性/不溶性多糖结合的那些结合结构域，包括对可溶性葡聚糖α、β和/或混合键具有亲合性的所有结合结构域。得自粪肥纤维单胞菌内切葡聚糖酶CenC的N1纤维素结合结构域与可溶性纤维素糖类(cellosaccharides)和已知与任何可溶性多糖结合的一小组蛋白质之一结合。此外，在表1-4中列出了含有推定的β-1，3-葡聚糖结合结构域的蛋白质的例子(表1)；含有链球菌葡聚糖结合重复序列的蛋白质(Cpl超家族)(表2)；具有壳多糖结合结构域的酶(表3)；和淀粉结合结构域(表4)。包括纤维素结合结构域蛋白(例如由噬纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)产生的纤维素结合结构域蛋白(Shoseyov等，PCT/US94/04132))在内的支架蛋白，也可以用以制备PBP。几种真菌，包括木霉(Trichodenma species)和其它真菌也产生可以分离出PBP的多糖酶。
表1
含推定β-1，3-葡聚糖结合结构域的蛋白质的概述
来源(菌株)  蛋白质     登记号 Ref.1
类型I
环状芽孢杆菌(B.circulans)(WL-12)环状芽孢杆菌(IAM 1165  GLCAlBglH     P23903/M34503/JQ0420JN0772/D17519/S67033 12
类型II
马杜拉放线菌(Actinomadura sp.)(FC7)节杆菌(Arthrobacter sp.)(YCWD3)溶黄嘌呤厄氏菌(O.xanthineolytica)渣腐稀有杆菌(R.faecitabidus)(YLM-50)蓖麻(R.communis)浅青紫链霉菌(S.lividans)(1326)T.tridentatus  XynIIGLCIGLCRPIRicinXlnAFactorGa     U08894D23668P22222/M60826/A39094Q05308/A45053/D10753A12892P26514/M64551/JS07986D16622 3945a，b678
B：芽孢杆菌属(Bacillus)，O.：厄氏菌属(Oerskovia)，R.faecitabidus：渣腐稀有杆菌(Rarobacterfaecitabidus)，R.communis：蓖麻(Ricinus communis)，S：链霉菌属(Streptomyces)，T.：鲎属(Tachypleus)(美洲鲎)
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表2
含链球菌葡聚糖结合重复序列的蛋白质(Cpl超家族)的概述
来源 蛋白质  登记号 Ref.2
汗毛(表兄)链球菌(S.downei(sobrinus))(OMZ176)汗毛(表兄)链球菌(MFe28)汗毛(表兄)链球菌(MFe28)汗毛(表兄)链球菌(6715)汗毛(表兄)链球菌变异链球菌(S.mutants)(Ingbritt)变异链球菌(GS-5)变异链球菌(GS-5)变异链球菌变异链球菌(GS-5) GTF-IGTF-IGTF-SGTF-IDEIGBPGTF-BGTF-BGTF-B3′-ORFGTF-C  D13858P11001/M17391P29336/M30943/A41483P27470/D90216/A38175L34406M30945/A37184A33128P08987/M17361/B33135P05427/C33135P13470/M17361/M22054 1234567889
  变异链球菌(GS-5)变异链球菌(GS-5)唾液链球菌(S.salivarius)唾液链球菌唾液链球菌(ATCC25975)唾液链球菌(ATCC25975)肺炎链球菌(S.pneumoniae)R6肺炎链球菌噬菌体HB-3噬菌体Cp-1噬菌体Cp-9噬菌体EJ-1艰难梭菌(C.difficile)(VPI 10463)艰难梭菌(BARTS W1)艰难梭菌(VPI 10463)艰难梭菌(1470)诺氏梭菌(C.novyi)诺氏梭菌丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(NCIB8052)丙酮丁醇梭菌(NCIB8052)丙酮丁醇梭菌(NCIB8052)丙酮丁醇梭菌(NCIB8052)  GTF-CGTF-DGTF-JGTF-KGTF-LGTF-MLytAPspAHBLCPL-1CPL-9EJLToxAToxAToxBToxBa-toxina-toxinCspACspBCspCCspD     not availableM29296/A45866A44811/S22726/S28809Z11873/M64111S22737/S22727/Z11872L35495L35928P06653/A25634/M13812A41971/M74122P32762/M34652P15057/J03586/A31086P19386/M34780/JQ0438A42936P16154/A37052/M30307X51797/S08638A60991/X17194P18177/X53138/X60984S10317S44271/Z23277S44272/Z23280Z48636S49255/Z37723Z50008Z50033Z50009 101112131414151617181920212223，2425，26272829303030
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可以以多种方式之一，鉴定并筛选具有令人感兴趣的结合特性和特异性的新PBP，所述方式包括：光谱(滴定)法，例如NMR光谱法(Zhu等(1995)Biochemistry34：；Gehring等(1991)Biochemistry30：5524-5531)、UV示差光谱法(Beishaw等(1993)Eur.J.Biochem.211：717-724)、荧光(滴定)光谱法(Miller等(1983)J.Biol.Chem.258：13665-13672)、UV或荧光停流分析(De Boeck等(1985)Eur.J.Biochem.149：141-415)；亲和法，例如在固定化单糖或寡糖上的亲和电泳(Mimura等(1992)J.Chronmatography597：345-350)或亲和色谱；沉淀或凝集分析，包括浊度分析(Knibbs等(1993)J.Biol.Chem.14940-14947)；竞争性抑制测定(有或没有定量IC50测定)；以及各种物理方法或物理化学方法，包括示差扫描或等温滴定量热法(Sigurskjold等(1992)J.Biol.Chem.267：8371-8376；Sigurskjold等(1994)Eur.J.Biol.225：133-141)或使用热CD或荧光光谱法在寡糖存在或不存在情况下的比较性蛋白质稳定性测定(熔体(melts))。
一般而言，所述PBP与寡糖结合的Ka至少在弱抗体-抗原提取(antibody-antigen extraction)范围内，即10-3，最好是10-4，最优选10-6。如果所述PBP与所述寡糖的结合是放热或吸热的，则分别在较低温度下结合的增加或降低为多糖结构加工期间的温度调节提供了一种手段。
表3
具有壳多糖结合结构域的酶的概述
来源(菌株) 酶     登记号    Ref.3
细菌酶
类型I
气单胞菌(Aeromonas sp.)(No10S-24)环状芽孢杆菌(WL-12)环状芽孢杆菌(WL-12)兰黑紫色杆菌(Janthinobacterium lividum)  ChiChiA1C hiDChi69     D31818P20533/M57601/A38368P27050/D10594U07025    1234
  灰色链霉菌(Streptomyces griseus)     Protease C     A53669   5
   类型II
  豚鼠气单胞菌(Aeromonas cavia)(K1)交替单胞菌(Alteromonas sp)(0-7)Autographa californica(C6)粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)     ChiChi85NPH-128aChiA     U09139A40633/P32823/D1 3762P41684/L22858A25090/X03657/L01455/P07254   6789
   类型III
  少孢根霉(Rhizopus oligosporus)(IFO8631)少孢根霉(IFO8631)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酿酒酵母Chi1(DBY939)酿酒酵母Chi2(DBY918)     Chi1Chi2Chi     P29026/A47022/D10157/S27418P29027/B47022/D10158/S27419S50371/U17243P29028/M74069P29029/M7407/B41035   1010111212
  植物酶
   橡胶蛋白超家族
  蒜(Allum sativum)尾穗苋(Amaranthus caudatus)尾穗苋拟南芥(Arabidopsis thaliana)(cv.colombia)拟南芥欧洲油菜(Brassica napus)欧洲油菜Hevea brasiliensis大麦(Hordeum vulgare)番茄(Lycopersicon esculentum)烟草(Nicotiana tabacum)烟草烟草(cv.Havana)烟草(FB7-1)烟草(cv.Samsun)烟草(cv.Havana)烟草(cv.BY4)烟草(cv.Havana)稻(Oryza sativum)(IR36)稻稻稻(cv.Japonicum)稻(cv.Japonicum)稻稻(cv.Japonicum)稻稻稻(IR58)稻豌豆(Pisum sativum)(cv Birte)豌豆(cv.Alcan)Populus trichocarpaPopulus trichocarpa(H11-11)     ChiAMP-1bAMP-2bChiBPHPcChiChi2HevldChi33Chi9CBP20eChiChiChiChiChiChiChiChiAChiBChiChiChi1Chi2Chi3ChiAChi1ChiChiChiChi2ChiChi     M94105P27275/A40240S37381/A40240P19171/M38240/B45511U01880U21848Q09023/M95835P02877/M36986/A03770/A38288L34211Q05538/Z15140/S37344S72424A21091A29074/M15173/S20981/S19855JQ0993/S0828A16119P08252/X16939/S08627P24091/X51599/X64519//S13322P29059/X64518/S20982L37289JC2253/S42829/Z29962S39979/S40414/X56787X56063P24626/X54367/S14948P25765/S15997D16223JC2252/S42828D16221U02286X87109P36907/X63899L37876S18750/S18751/X59995/P29032U01660   1314，1514，151617181920，21222324252627282726，27，29263031323334353032363738394041
 菜豆(Phaseolus vulgaris)(cv.Saxa)菜豆(cv.Saxa)西洋接骨木(Sambucus nigra)黑麦(Secale cereale)马铃薯(Solanum tuberosum)马铃薯马铃薯马铃薯马铃薯(cv.Maris Piper)马铃薯(cv.Maris Piper)普通小麦(Triticum aestivum)普通小麦普通小麦普通小麦美洲榆(Ulmus americana)(NPS3-487)狭叶荨麻(Urtica dioica)豇豆(Vigna unguiculata)(cv.Red caloona)   ChiChiPR-3fChiChiB1ChiB2ChiB3ChiB4WTN-1gWTN-2gChiWGA-1hWGA-2hWGA-3ChiAGLiChi1  A24215/S43926/Jq0965/P36361P06215/M13968/M19052/A25898Z46948JC2071U02605U02606U02607/S43317U02608P09761/X13497/S04926P09762/X13497/S04927S38670/X76041P10968/M25536/S09623/S07289P02876/M25537/S09624P10969/J02961/S10045/A28401L22032M87302X88800 4243，44，4546474848484849495051，5251，5354555657
aNHP：核型多角体病毒内切壳多糖酶样序列；Chi：壳多糖酶；b抗微生物肽，c前橡胶蛋白样蛋白，d橡胶蛋白，e壳多糖结合蛋白，f致病相关蛋白，g创伤诱导蛋白，h麦胚凝集素，i凝集素。
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表4
含有淀粉结合结构域的酶的概述
  来源(菌株)   酶  登记号   Ref.4
  泡盛曲霉(A.awarori)(var.Kawachi)   AMYG  P23176/D00427/JT0479   1，2
  黑曲霉(A.niger)(T21)   AMYG  S73370   3
  黑曲霉-泡盛曲霉   AMYG1/G2  P04064/A90986/A29166/X00712/X00548K02465 4，5，67，8，9
  米曲霉(A.oryzae)   AMYG(GLAA)  P36914/JQ1346/D01035/S75274/D01108 10，11
  A.Shirousamii   AMYG(GLA)  P22832/JQ0607/D10460   12
  芽孢杆菌(B1018)   AMYa  P17692/M33302/D90112/S09196   13
  芽孢杆菌(TS-23)   α-AMY  U22045   14
  芽孢杆菌(1-1)   CGT  P31746/S26399   15
  芽孢杆菌(6.63)   CGT  P31747/X66106/S21532   16
  芽孢杆菌(17-1)   CGT  P30921/M28053/A37208   17
  芽孢杆菌(38-2)   CGT  P09121/M19880/D00129/S24193   18，19
  芽孢杆菌(1011)   CGT  P05618/A26678/M17366   20
  芽孢杆菌(DSM5850)   CGT  A18991   21
  芽孢杆菌(KC 201)   CGT  D13068   15，22
  蜡状芽孢杆菌(B.cereus)(SPOII)   β-AMY  A48961/P36924/S54911   23
  环状芽孢杆菌(8)   CGT  P30920/X68326/S23674   24
  环状芽孢杆菌(251)   CGT  X78145   25
  地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)   CGTA  P14014/X15752/S15920   26
  浸麻芽孢杆菌(B.macerans)(IFO 3490)   CGTM(CDG1)  P04830/X5904/S31281   27
  浸麻芽孢杆菌(IAM 1243)   CGT  M12777   28
   浸麻芽孢杆菌B.ohbensis嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)嗜热脂肪芽孢杆菌(NO2)罗耳伏革菌(C.rolfsii)(AHU 9627)盘基网柄菌(D.discoideum)H.grisea(var.thermoidea)H.resinae(ATCC20495)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)(M5A1)粗糙链孢霉(N.crassa)(74-OR23-1A)嗜糖假单胞菌(P.saccharophila)(IAM1504)假单胞菌(KO-8940)施氏假单胞菌(P.stutzeri)(MO-19)灰色链霉菌(S.griseus)(IMRU 3570)淤泥链霉菌(S.limosus)(S.albidoflavus)AML紫色链霉菌(S.violaceus)(S.venezuela)AML(ATCC15068)Th.curvata(CCM 3352)热产硫磺热厌氧杆菌(Th.thermosulfurogenes)f(DSM3896/EM1)热产硫磺热厌氧杆菌(ATCC 33743)   CGT(CDG2)CGTAMYMbCGTAMYG2ORFGLA1GAMPCGTGLA-1MTAcAMF-1dAMYPcAMYTAMeAMYAAMYB   P31835/S26589P27036/D90243P19531/M36539/S28784P31797/X59042/S26588/X59043/X59404/S31284D49448S15693/X51947M89475Q03045/X68143/X67708/S31422/S33908P08704/M15264/A29023P14804/X67291/S13711/S13710/S36364P22963/X16732/S05667D10769/JS0631/D01143P13507/M24516/A32803P30270/X57568/S14063P09794/M18244/B28391P22998/M25263/JS0101P29750/X59159/JH0638P26827/X54654/X54982/S17298/S37706P19584/M22471/A31389 2930313233343536-383940，41424344454647484950
a生淀粉消化性淀粉酶，b产麦芽糖α-淀粉酶，c生成麦芽四糖的淀粉酶(1，4-α-麦芽四糖水解酶，d生成麦芽戊糖的淀粉酶，e热稳定α-淀粉酶，f先前称为热产硫磺梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)，AMYG、GAM和GLA：葡糖淀粉酶，AMY或AML：α-淀粉酶，CGT：β-环糊精糖基转移酶或环麦芽糊精葡聚糖基转移酶(glucanotransferase)，ORF：可读框。A.：曲霉属(Aspergillus)，B.：芽孢杆菌属，C.：伏革菌属(Corticium)，D.：网柄菌属(Dictiostelium)，H.grisea：Humicola grisea，H.resinea：Hormoconis resinae(Amorphotheca resinae)，K.：克雷伯氏菌属(Klebsiella)，N.：链孢霉属(Neurospora)，S.：链霉菌属(Streptomyces)，Th.curvata：弯曲高温单胞菌(Thermomonospora curvata)，Th.：热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)。
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表5
多糖结合结构域的来源
结合结构域 发现有结合结构域的蛋白质
纤维素结合结构域1淀粉/麦芽糊精结合结构域葡聚糖结合结构域β-葡聚糖结合结构域壳多糖结合结构域 β-葡聚糖酶(微晶纤维素酶，CMC酶，纤维糊精酶)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶纤维素结合蛋白木聚糖酶混合木聚糖酶/葡聚糖酶酯酶壳多糖酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，3-(β-1，4-)-葡聚糖酶(β-)甘露聚糖酶β-葡糖苷酶/半乳糖苷酶纤维素合酶(未证实)α-淀粉酶2，3β-淀粉酶4，5支链淀粉酶葡糖淀粉酶6，7环糊精葡糖基转移酶8-10(环麦芽糊精葡聚糖基转移酶)麦芽糊精结合蛋白11(链球菌属)糖基转移酶12葡聚糖蔗糖酶(未证实)梭菌毒素13，14葡糖淀粉酶6葡聚糖结合蛋白β-1，3-葡聚糖酶15，16β-1，3-(β-1，4)-葡聚糖酶(未证实)17β-1，3-葡聚糖结合蛋白壳多糖酶壳二糖酶壳多糖结合蛋白(也参见纤维素结合结构域)橡胶蛋白
1Gilkes et al.，Adv.Microbiol Reviews，(1991)303-315.
2S？gaard et al.，J.Biol.Chem.(1993)268：22480.
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4Svensson et al.，J.(1989)264：309.
5Jespersen et al.，J.(1991)280：51.
6Belshaw et al.，Eur.J.Biochem.(1993)211：717.
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15Klebl et al.，J.Bacteriol.(1989)171：6259.
16Watanabe et al.，J.Bacteriol.(1992)174：186.
17Duvic et al.，J.Biol.Chem.(1990)：9327.
已知许多CBD，CBD分为至少12个家族，根据CBD的计划用途，可以将其中任一个家族用作CBD源。家族I仅含有真菌酶的CBD。其余11个家族中的绝大多数CBD来源于细菌。最为了解的CBD是属于家族I、II、III和IV的那些CBD，其CBD的平均长度分别为36个、105个、150个和150个氨基酸。家族I、II、III和IV中的某些CBD已经被鉴定为包含折叠成肉冻卷状折叠桶的多个反平行β-折叠。家族I、II和III的CBD既与非晶态纤维素结合，又与晶态纤维素结合，而家族IV的CBD与非晶态纤维素结合，但不与晶态纤维素结合。家族IV的CBD仅与可溶性纤维素衍生物和纤维寡糖结合。与晶态纤维素和壳多糖结合的CBD以相似的亲和性进行结合，其结合常数在微摩尔浓度范围内。家族I的CBD与纤维素可逆地结合，而家族II和III的CBD看来在非变性条件下不可逆地结合。优选的CBD包括会得自以下的那些CBD：属于粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Trichodermareesei和M.Bispora的菌株(N.R.Gilkes等，(1988)J.Biol.Chem.263：10401-10407；N.R.Gilkes等，(1991)，Microbiol.Rev.55：303-315)；得自粪肥纤维单胞菌的纤维素酶基因(Whittle等(1982)Gene17：139-145；Gilkes等(1984)J.Gen.Microbiol.130：1377-1384)；得自粪肥纤维单胞菌的外切葡聚糖酶(Cex)和内切葡聚糖酶(CenA)以及其基因cex和cenA的序列(Wong等(1986)Gene 44：315-324；O’Neill等(1986)Gene 44：325-330)；得自噬纤维梭菌的17 KD(肽)CBD，由Shoseyov等描述(1992)(Proc.Natl.Acad.Sci.89：3483-3487)。该CBD的重组形式表现出对纤维素和壳多糖的强亲和性(Goldstein等(1993)J.Bacteriol.175：5762-5768)。
通过将包含编码多糖酶或多糖结合蛋白的多糖结合区的至少一个功能部分的DNA的DNA构建体转化到宿主细胞中，也可以制备PBD蛋白。所述PBD DNA序列可以在宿主细胞(或者为真核细胞，或者为原核细胞)中表达。然后将已表达和分离的PBD与其它PBD和/或一种或多种官能化蛋白缀合。
在任一这些情况下，所述分离的多糖结合结构域一般都足够纯，以排除多糖酶催化活性，除非这是所计划的融合蛋白的所需特性。优选这种制剂的催化活性低于得自表达所述多糖酶的细胞的粗提物的催化活性。更优选所述催化活性将反映低于每1000个功能结合结构域1个功能催化结构域的化学计量。为了测试所需表达产物的活性，可以例如通过与微晶纤维素(例如Avicel(微晶纤维素))结合并且表明从溶液中除去所述推定的结合结构域，来测定PBD的结合活性。可容易地从所述纤维素中以高度纯化的形式分离出具有所需活性的多肽。已经将与Avicel的结合用于天然纤维素酶的纯化(Gilkes等，J.Biol.Chem.(1984)259：10455-10459)，也用于重组纤维素酶的纯化(Owolabi等，Appl.Environ.Microbiol.(1988)54：518-523)。
多聚PBD融合蛋白的第二基本构件是一种蛋白质，所述蛋白质可以是与作为第一构件的PBD相同或不同的第二种PBD。因此，所述多聚融合蛋白可以是由一对核苷酸序列编码的符合读框地连接的二聚PBD融合蛋白，每种核苷酸序列编码一种PBD，这是本领域众所周知的(参见例如Shoseyov等的美国专利第5,856,201号和美国专利第5,837,814号，这两个文献通过引用全部结合到本文中)。图5A显示了一种PBD融合蛋白的实例，其中所述第一蛋白和第二蛋白都是CBD，因而形成一种二聚CBD，其中所述CBD可以相同(同源二聚CBD)或不同(异源二聚CBD)。图5B显示了图5A的纤维素交联蛋白的应用，其中一个纤维素结合结构域与第一种聚合结构单位结合，而第二个纤维素结合结构域与第二种聚合结构单位结合。图6图式说明了一个属类的CBD偶联剂单位，所述单位包括通过一个接头单位连接的一对CBD。
另一方面，所述第二构件可以是一种PBD，所述PBD任选地包括一个或多个官能化基团。所谓官能化基团是指可以改变含多糖材料的一种或多种性能的官能团。一般而言，所述官能化基团是一种蛋白质或肽，例如硅结合肽、聚合物结合肽或金属结合肽(Ljungquist等，(1989)Eur.J.Biochem.86：563-569；Spanner等，(1995)Bone 17：161-165；Slice等(1990)J.Biol.Chem.265：256-263；Pessi等(1993)Nature 362：367-369)。官能化多肽的其它实例包括：淀粉结合结构域，它为多糖纤维和淀粉分子的交联提供工具；所述淀粉可以是所述纤维的内源组分，或可以作为施胶剂应用。淀粉结合结构域可以得自例如曲霉属葡糖淀粉酶(Chen等(1991)，Gene 99：121-126)。同样，通过运用作为第二多肽的基质蛋白例如高分子量麦谷蛋白(HMWG)，可以使多糖和谷蛋白分子交联。关于具体应用，所述官能化基团也可以包括化学基团，例如一个或多个巯基、生色团、染料、反应基(例如醛、马来酰亚胺、酰肼、环氧化物、碳二亚胺)或光反应基(例如与PBD结合的叠氮基苯)。使各种化学实体与PBD缀合的方法在美国专利第5,962,289号中有描述，该专利通过引用全部结合到本文中。
所述PBD融合蛋白的第一构件可以任选地通过一个接头单位与所述第二构件连接。PBD偶联剂单位的接头单位可以包括各种天然或合成分子，包括生物聚合物(例如蛋白质、多肽或多糖)和合成聚合物(例如丙烯酸聚合物)以及基质蛋白高分子量麦谷蛋白。接头单位肽或蛋白组分的实例包括JUN蛋白和FOS蛋白(参见，例如Gentz等(1989)Science 243：1695-1699)；淀粉结合结构域(SBD)(参见例如Chen等(1991)Gene 99：121-126)和S-肽或S-蛋白(参见例如Kim等(1993)Protein Science 2：348-356)。部分根据融合蛋白的计划用途，融合蛋白中的第一多肽和第二多肽(或多个第一多肽和/或第二多肽)可以通过肽键或较大的接头单位直接连接。图8图示了一种CBD偶联剂单位(在该图中名为CU)，所述偶联剂单位具有一个第一CBD、一个第二CBD和一个连接所述第一和第二CBD的接头单位(LU)。虽然所述第一CBD和第二CBD在图8中描绘为是末端的，并且位于所述接头单位的相反方向，但考虑了CBD和接头单位的其它数目和布置，这些在本发明范围内。可以通过一种方法或各种方法的组合，包括共价键、离子键、疏水键、氢键、蛋白质翻译和蛋白质表达，可以将接头单位与PBD偶联剂单位的每个PBD连接。
接头单位的多糖组分可以是不被PBD结合或以低亲合性被PBD结合的多糖。这种多糖的一个实例是淀粉。另外，PBD偶联剂单位的接头单位可以是除PBD以外的一种或多种多糖结合结构域。作为一个实例，图7A显示了一种CBD偶联剂单位，所述偶联剂单位具有通过一个偶联剂单位连接的一对末端CBD，所述CBD偶联剂单位包括一个与一个第一CBD偶联的第一淀粉结合结构域、一个与一个第二CBD偶联的第二淀粉结合结构域、和一个与所述第一淀粉结合结构域和所述第二淀粉结合结构域两者偶联的淀粉部分。
PBD偶联剂单位的接头单位也可以包括一个或多个PBD。作为一个实例，图7B显示了一种CBD偶联剂单位，所述偶联剂单位具有通过一个包含多个CBD的偶联剂单位连接的一对末端CBD，其中所述接头单位的每个CBD通过一个JUN/FOS桥(参见例如Gentz等(1989)Science 243：1695-1699)与一个相邻CBD偶联。图7C显示了一种CBD偶联剂单位，所述CBD偶联剂单位具有通过一个包含一个肽或蛋白质部分的偶联剂单位连接的一对末端CBD，所述肽或蛋白质部分与纤维素或相关聚合物不结合或仅以低亲合性结合。偶联剂单位的肽或蛋白质组分(例如接头蛋白)的大小可以为数百道尔顿至高于1兆道尔顿不等。作为一个实例，图7C所示的接头单位可以是数个氨基酸的短肽或相对大的接头蛋白(例如HMWG)。
可以化学制备或重组制备多聚PBD融合蛋白。例如，可以在其自身上产生多糖结合区或其多个区，将其纯化，然后采用本领域技术人员已知的技术，将其与具有或不具有官能化基团的第二蛋白质化学连接。蛋白质缀合的方法包括体外缀合化学反应，以修饰多糖结合结构域，这可以在将所述结构域或者与多糖基质结合或者从多糖基质上除去的同时进行。实例包括应用Reichlin在Methods of Enzymology(1980)70：159-165中描述的戊二醛缀合法。当将多糖结合结构域与所述基质结合时，它提供的优点是保护真正与基质结合的位点，而留下其它残基与所述第二部分反应，所述第二部分或者是一种第二PBD，或者是一种官能化蛋白。如果所述化学部分与多糖结合结构域的结合导致结合多糖底物的能力减弱，则最好使用要求所述多糖基质存在的反应方法，以保留所述结构域的结合特性。
另一方面，可以重组制备多聚PBD融合蛋白。为了重组制备PBD融合蛋白，用编码所述PBD融合蛋白组分的核苷酸序列来构建能够表达PBD融合蛋白的重组表达载体。一般而言，如果一个核酸构建体含有的核苷酸序列含有与蛋白质的核苷酸编码序列有效连接的转录和翻译调节信息，则该核酸构建体能够表达所述蛋白质。“有效连接”是指这样一种连接，其中所述调节DNA序列和待表达的DNA序列连接的方式使得允许转录和翻译。将编码多糖结合结构域的片段和编码所述第二多糖结合结构域或官能化多肽的DNA连接，使得编码所述PBD的核酸与编码所述第二蛋白质的核酸连接在一起，致使所述PBD和所述第二蛋白质的联合可读框是完整的，允许发生完整PBD融合蛋白的翻译。如果所述PBD融合蛋白具有一个蛋白质偶联剂单位，则将所述核苷酸序列有效插入所述表达构建体中所述PBD编码序列和编码所述第二蛋白质的序列之间。然后可以以提供表达的各种各样的方式，对所得的连接DNA进行操作。
用于核酸扩增的载体和用于核酸表达的载体都是本领域众所周知的。适宜载体的选择取决于各种参数，包括计划的功能(例如扩增或表达)、DNA插入片段的大小和所述载体将转化的具体宿主细胞。本领域技术人员可以利用各种表达载体/宿主系统来重组表达PBD蛋白和PBD融合蛋白。这类系统包括微生物，例如用含有所需PBD编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有所需PBD编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有所需PBD编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有所需PBD编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)；烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有所需PBD编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或用重组病毒表达载体(例如腺病毒或痘苗病毒)感染的动物细胞系统，包括工程改造以含有或者稳定扩增的(例如CHO/dhfr、CHO/谷氨酰胺合成酶)或者在双微染色体中不稳定扩增的多个PBD核酸拷贝的细胞系(例如鼠细胞系)。
含有一种或多种以上所列组分并且包括所需编码序列和控制序列的适宜载体的构建，使用标准连接技术。将分离的质粒或核酸片段进行切割、修剪(tailor)和以产生所需质粒需要的形式再连接(参见Current Protocols in Molecular Biology，第I-III卷，Ausubel，R.M.编著(1994))。为了确证DNA构建体(例如质粒)中正确的序列，用连接混合物转化大肠杆菌菌株X1-1和DH52，并且适当地通过抗生素(例如氨苄青霉素)抗性选择成功转化体。制备来自所述转化体的质粒，通过限制进行分析和/或测序(参见例如Messing等，Nucleic Acids Res.9：309(1981)；Maxam等，Methods in Enzymology65：499(1980))。一般而言，表达载体能够在宿主细胞中有效复制，使得所述宿主细胞积累许多拷贝的表达载体，进而合成高水平的目的蛋白。表达盒可以包括在复制系统中，以在合适的细胞宿主中以附加体保持，或者在它可以整合到宿主基因组中的情况下，可以不用所述复制系统而提供所述表达盒。
一旦获得了编码PBD融合蛋白的DNA，则将其置于能够在宿主细胞中复制的载体中，或利用诸如PCR或长距离PCR的技术使其体外增殖。复制型载体可以包括质粒、噬菌体、病毒、粘粒、人工染色体等。理想的载体包括会用于对目的基因进行诱变的载体或者会用于在宿主细胞中表达目的基因的载体。长距离PCR的技术使得体外增殖大构建体成为可能，使得目的基因的修饰(例如诱变或添加表达信号)和所得构建体的增殖可以完全在体外发生，而无需使用复制型载体或宿主细胞。
关于PBD融合蛋白的表达，将功能性转录和翻译起始和终止区与编码所述PBD融合蛋白的DNA有效连接。所述融合蛋白编码区的表达可以在体外或在宿主细胞中进行。转录和翻译起始和终止区得自各种各样的非竭尽性来源，包括待表达的DNA、已知能够或怀疑能够在所需系统中表达的基因、表达载体、化学合成或来自宿主细胞中的内源基因座。
例如通过将所述PBD融合蛋白的编码区置于设计用于体外应用的表达载体中，并且添加兔网织红细胞裂解物和辅因子，完成体外表达；如果需要，可以加入标记的氨基酸。这种体外表达载体可以提供在所用系统中必需的某些或全部表达信号。这些方法是本领域众所周知的，并且该系统的组分可在市场上获得。然后可以直接分析反应混合物的融合蛋白，例如通过测定其结合活性来分析，或者可以纯化所合成的融合蛋白，然后进行分析。
在宿主细胞中的表达可以以瞬时方式或稳定方式来实现。可以由所导入的含有在宿主细胞中有功能的表达信号的构建体而发生瞬时表达，但所述构建体不复制，并且极少整合到宿主细胞中，或者其中宿主细胞并不处于增殖中。通过诱导与目的基因有效连接的调节型启动子的活性，也可以实现瞬时表达，虽然这种诱导型系统常常表现出基础表达水平低。通过导入可以整合到宿主基因组中或者在宿主细胞中自主复制的构建体，可以实现稳定表达。利用位于表达构建体的选择标记或者用表达构建体转染的选择标记，对目的基因的稳定表达进行选择，然后选择表达所述标记的细胞。当稳定表达是由于整合引起的，则构建体的整合可以在宿主基因组中随机发生，或者可以利用含有与宿主基因组同源的区以足以使与宿主基因座的重组定向的构建体来定向。在构建体靶向内源基因座的情况下，可以由所述内源基因座提供全部或某些转录和翻译调节区。
当需要PBD融合蛋白在源生物的表达增加时，可以采用几种方法。可以将编码所述PBD融合蛋白的额外基因导入宿主生物中。例如也可以通过应用较强的启动子，通过从宿主基因组中缺失信息而从mRNA或者从所编码的蛋白质中除去不稳定序列，或者通过将稳定化序列加入mRNA中，来增加表达(美国专利第4,910,141号)。
表达载体和克隆载体一般含有被宿主生物识别并且与编码目的多肽或蛋白质的核酸有效连接的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5’)(一般在起始密码子的约100-1000bp内)并且控制与其有效连接的特定核酸序列(例如编码PBD融合蛋白的核酸序列)转录和翻译的非翻译序列。
启动子一般分为两类：诱导型和组成型。诱导型启动子是响应培养条件中某些变化(例如存在或缺乏一种营养素或温度的变化)而启动受其控制的核酸的提高水平的转录的启动子。许多被各种各样潜在的宿主细胞识别的启动子是本领域众所周知的。通过限制性酶消化从源核酸中取出所述启动子，并且将所述分离的启动子序列与所述融合蛋白的编码序列一起加入载体中，可以将所述启动子与编码所述融合蛋白的核酸有效地连接。所述启动子可以是合成的、半合成的、天然的(对于宿主细胞而言)启动子序列，或者可以使用异源(对于宿主细胞而言)启动子来指导所述融合蛋白的扩增和/或表达。适合与原核宿主一起使用的启动子是本领域众所周知的(参见例如Chang等(1978)Nature275：615；Goeddel等(1979)Nature 281：544；Goeddel(1980)Nucleic AcidsRes.8：4057；EPO申请公布号36,776；和H.de Boer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：21-25)。这类启动子的核苷酸序列一般是已知的，从而使得技术人员能够利用提供任何所需限制位点的接头或连接物，将其与编码融合蛋白的核苷酸序列有效连接(参见Siebenlist等，(1980)Cell20：269)。
用于细菌系统的启动子也含有与编码所述PBD的核酸有效连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。对于细菌而言，说明性的转录调节区或启动子包括lac启动子、λ左和右启动子、trp和lac启动子、tac启动子等。转录调节区可以额外包括允许调节所融合基因的表达时间(例如存在或缺乏营养素或生长培养基中的表达产物、温度等)的调节序列。例如，可以用包含噬菌体λPL启动子、噬菌体λOL操纵基因和温度敏感型阻抑物的调节序列，通过温度调节融合基因的表达。通过所述阻抑物和所述操纵基因之间的相互作用来实现对启动子的调节。用于原核宿主细胞的表达载体也可以含有转录终止或稳定mRNA所必需的序列。在存在某些诱导物(例如对于金属硫蛋白启动子而言为锌离子和镉离子)的情况下，可以增加来自某些启动子的表达。以这种方式，可以控制所述PBD融合蛋白的表达。控制表达的能力可能是重要的，例如当所述PBD融合蛋白对于宿主细胞是致死时。
当宿主细胞是酵母时，提供在酵母细胞中有功能的转录和翻译区，尤其是来自宿主物种的转录和翻译区。转录起始调节区可以得自例如：糖酵解途径的基因，诸如醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、磷酸葡糖异构酶、磷酸甘油酸激酶等；或可调节基因，例如酸性磷酸酶、乳糖酶、金属硫蛋白、葡糖淀粉酶等。在特定的场合下，根据需要组成型转录或还是诱导型转录、与目的可读框连接的启动子的具体效率、将强启动子与来自不同启动子的提供诱导型转录的控制区连接的能力、构建的容易程度等等，可以使用多种调节序列中的任一种。值得特别注意的是在半乳糖存在下被激活的启动子。半乳糖诱导型启动子(GAL1、GAL7和GAL10)已经广泛用于在酵母中高水平受调节地表达蛋白质(Lue等，Mol.Cell.Biol.第7卷，第3446页，1987；Johnson，Microbiol.Rev.第51卷，第458页，1987)。来自GAL启动子的转录被GAL4蛋白激活，GAL4蛋白与启动子区结合，并且在存在半乳糖时激活转录。在缺乏半乳糖的情况下，拮抗剂GAL80与GAL4结合，阻止GAL4激活转录。添加半乳糖防止GAL80抑制由GAL4引起的激活。
已经发现，翻译起始密码子ATG周围的核苷酸序列影响在酵母细胞中的表达。如果所需多肽在酵母中的表达差，则可以修饰外源基因的核苷酸序列，使其包括有效的酵母翻译起始序列，以获得最佳基因表达。例如，在酵母属(Saccharomyces)中，这可以通过将表达效率低的基因与内源酵母属基因(最好是高水平表达的基因，例如乳糖酶基因)符合读框地融合，对所述基因进行定点诱变来完成。终止区可以得自获得所述起始区的基因的3’区，或者得自不同的基因。已知许多终止区，并且发现它们在来自相同和不同属和物种的各种各样的宿主中是令人满意的。终止区的选择通常更多的是考虑到便利性，而不是由于任何特定的特性来选择终止区。所述终止区最好得自酵母基因，特别是酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)基因。也已知两种哺乳动物基因χ干扰素和α2干扰素基因的3’区在酵母中有功能。
在某些情况下，可能理想的是提供结构基因上游并且与所述结构基因符合读框的信号序列(分泌前导序列)，这保证所融合基因的分泌。说明性分泌前导序列包括青霉素酶、免疫球蛋白、T细胞受体、外膜蛋白等的分泌前导序列。通过以正确的读框融合，可以将嵌合多肽分泌到培养基中。
可以用标准技术，将包含所述融合蛋白编码序列的构建体导入宿主细胞中。这些技术包括转化、原生质体融合、脂质转染、转染、转导、接合、感染、基因枪冲击、电穿孔、微注射、刮擦或将目的基因导入宿主细胞的任何其它方法。可以使用的转化法包括乙酸锂转化(Methods in Enzymology，第194卷，第186-187页，1991)。用于原核生物和真核生物或细胞遗传转化的各种方法是本领域众所周知的(参见例如Cohen等(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)69：2110；和CurrentProtocols in Molecular Biology，参见上文)。可以用上述本发明的表达载体或克隆载体转染或更优选转化宿主细胞，可以将转化细胞在常规营养培养基中培养，所述培养基可以适当地修改，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需PBD或PBD融合蛋白的基因。所谓 “转化”是指将核酸导入生物中，使得所述核酸可以或者作为染色体外元件复制或者通过整合到宿主生物基因组中而复制。
所述题述宿主将具有至少一个拷贝的表达构建体，可以具有两个或更多个，这取决于所述基因是整合到基因组中扩增，还是存在于染色体外元件上并具有多个拷贝数。当所述题述宿主是酵母时，可以使用四个主要类型的酵母质粒载体：酵母整合型质粒(YIp)、酵母复制型质粒(YRp)、酵母中心粒质粒(YCp)和酵母附加体质粒(YEp)。YIp缺乏酵母复制起点，必须作为酵母基因组中整合的元件来增殖。YRp具有染色体来源的自主复制序列，以中等拷贝数(20-40个)自主复制型不稳定分离型质粒来增殖。YCp既有复制起点，又有中心粒序列，作为低拷贝数(10-20个)自主复制型稳定分离型质粒增殖。YEp具有一个来自酵母2μ质粒的复制起点，作为高拷贝数自主复制型不规则分离型质粒来增殖。通过维持根据所述质粒上的标记进行选择，可以确保在酵母中存在所述质粒。值得特别关注的是酵母载体pYES2(一种YEp质粒，可得自Invitrogen，赋予尿嘧啶原养型以及为表达提供GAL1半乳糖诱导型启动子)、pRS425-pG1(一种YEp质粒，得自T.H.Chang博士，分子遗传学助理教授，Ohio State University，含有一个组成型GPD启动子，并且赋予亮氨酸原养型)和pYX424(一种YEp质粒，具有一个组成型TP1启动子，并赋予亮氨酸原养型；Alber和Kawasaki(1982)J.Mol.&Appl.Genetics 1：419)。
通过根据所导入构建体上含有的标记进行选择，可以鉴定转化宿主细胞。或者，可以将单独的标记构建体与所需构建体一起导入，许多转化技术可将许多DNA分子导入宿主细胞中。通常，根据在选择培养基上生长的能力，对转化宿主进行选择。选择培养基可以加入抗生素或缺乏未转化宿主生长所必需的因子，例如营养素或生长因子。一种为此所导入的标记基因可以赋予抗生素抗性，或编码必需生长因子或酶，并且当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。当可以或者直接或者间接检测所表达的标记蛋白时，也可以进行转化宿主的选择。标记蛋白可以单独表达，或者作为与另一种蛋白的融合体来表达。可以根据标记蛋白的酶活性来检测所述标记蛋白；例如β半乳糖苷酶可以将底物X-gal转化为有色产物，荧光素酶可以将荧光素转化为发光产物。可以根据其发光或修饰特征来检测标记蛋白；例如，当用蓝光照射时可检测到维多利亚水母(Aequorea victoria)荧光的绿色荧光蛋白(GFP)。可以用抗体来检测标记蛋白或例如目的蛋白上的分子标志。表达所述标记蛋白或标志的细胞可以例如通过目测来选择，或者利用例如FACS或用抗体淘选的技术来选择。关于酵母转化体的选择，可以使用在酵母中起作用的任何标记。理想的是，所考虑的是对卡那霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸或色氨酸的培养基生长的能力。
一旦将融合基因导入合适宿主中，则可以让宿主生长以在用于诱导启动子、选择转化体或扩增基因的常规营养培养基(合适时进行修改)中表达所述融合基因。用来生产本发明多肽或蛋白质的原核细胞可以在合适的培养基中培养，一般而言，所述培养基如在Sambrook等(1989)Bacterial Media in Molecular Cloning(Nolan，C.编著)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY，第A.1-4页中描述的培养基，该文献通过引用结合到本文中。当分泌所述产物时，可以收集营养培养基，通过与多糖基质结合来分离所述产物。在产物保留在宿主细胞中时，收获细胞，将其裂解，分离所述产物，并通过与多糖底物结合来纯化。为了生产活性蛋白质，可能必需让所述蛋白质再折叠。选择调节所插入序列表达或以所需的特定方式修饰并加工所述基因产物的宿主细胞株。术语“宿主细胞”可以定义为能够表达目的PBD蛋白或PBD融合蛋白的那些细胞。宿主细胞可以包括原核细胞(细菌)和真核细胞(哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。蛋白产物的修饰(例如磷酸化)和加工(例如切割)可能对于所述蛋白的功能是重要的。不同的宿主细胞通常具有特征性的或特定的对所表达蛋白进行翻译后加工的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达的PBD蛋白或PBD融合蛋白的正确修饰和加工。作为一个实例，所述重组产物可以被糖基化或未被糖基化，具有野生型或其它糖基化。糖基化的量部分取决于特定肽的序列以及用来生产的生物。因此，在大肠杆菌细胞中表达所述产物，产生未糖基化的产物，而在昆虫细胞中表达产物，一般导致糖基化程度低于在哺乳动物细胞中表达所述产物的糖基化程度。在酵母中表达，可能导致糖基化过多。最好是，所述宿主细胞应该分泌最低量的蛋白水解酶。在表达将在真核宿主(例如植物或哺乳动物)中进行时，最好是所述构建体中都不含潜在的糖基化位点。
可以或者在原核宿主细胞或者在真核宿主细胞中进行PBD融合蛋白的生产。感兴趣的原核细胞包括埃希氏菌属(Eschericia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、蓝细菌属(Cyanobacteria)等。值得特别关注的用于克隆和表达PBD融合蛋白的原核细胞是大肠杆菌菌株BL2(DE3)PLYS。真核细胞包括哺乳动物细胞(例如分泌乳汁的动物的细胞)、鸟类细胞(例如鸡细胞)和适合于遗传操作的其它细胞，包括昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞和藻类细胞。可以培养所述细胞，或作为宿主生物(包括动物)的部分或整体而形成所述细胞。病毒和噬菌体也可以与所述细胞一起用于生产PBD融合蛋白，尤其是对于基因转移、细胞打靶和选择而言。宿主动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、鸡、鹌鹑、火鸡、牛、绵羊、猪、山羊、牦牛等，这些动物适合于用于快速扩增转基因表达群体的遗传操作和克隆。关于动物，通过修饰所述基因调节区，可以改变所述PBD融合蛋白编码序列以在靶细胞器、组织和体液中表达，例如在宿主动物的乳汁中表达。
宿主微生物的实例包括酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)或其它酵母，例如念珠菌属、克鲁维酵母属或其它真菌，例如丝状真菌如曲霉属、链孢霉属、青霉属(Penicillium)等。宿主微生物的理想特征是例如它在遗传学上已很好地表征，并且可以用于运用超高密度发酵来高水平表达所述产物。
关于在鸟类物种(例如鸡、火鸡、鹌鹑和鸭)和细胞中生产PBD融合蛋白，可以通过按照本领域已知的方法将编码PBD融合蛋白的核酸序列导入细胞中，进行基因转移。如果需要转基因动物，则可以为胚胎多能干细胞提供携带PBD融合蛋白编码转基因的载体，并且让其发育为成年动物(美国专利第5,162,215号；Ono等(1996)ComparativeBiochemistry and Physiology A 113(3)：287-292；WO 9612793；WO9606160)。在大多数情况下，修饰所述转基因以表达高水平的PBD融合蛋白。可以例如通过提供在鸟类细胞中有功能的转录和/或翻译调节区(例如在特定组织和蛋部分如蛋黄中指导表达的启动子)，来修饰所述转基因。所述基因调节区可以得自各种各样的来源，包括鸡贫血病病毒或禽类白血病病毒或鸟类基因(例如鸡卵白蛋白基因)。
运用带有PBD融合蛋白转基因的杆状病毒表达载体，可以在昆虫细胞中生产PBD融合蛋白。杆状病毒表达载体可得自几个商业来源，例如Clonetech。关于上述其它表达系统，可以通过使所述多肽编码序列与选择用于特定用途的合适的转录和翻译调节区相符，可以调节所述PBD融合蛋白转基因表达时间、程度和活性。值得特别关注的是可以在预先选定的生长条件下被诱导的启动子区。例如，在转基因编码序列、其调节区和/或转基因所导入的细胞的基因组中导入温度敏感型和/或代谢物效应型突变，可以用于此目的。
使转化宿主细胞在适合于所需最终结果的合适条件下生长。对于在培养物中生长的宿主细胞，通常对所述条件进行优化，以达到PBD融合蛋白的最大或最经济的收率。可以优化的培养基条件包括：碳源、氮源、底物的添加、所添加底物的终浓度、所添加底物的形式、有氧或厌氧生长、生长温度、诱导物、诱导温度、诱导时的生长期、收获时的生长期、pH、密度和选择的维持。诸如酵母的微生物例如最好用目的选择培养基进行培养，所述培养基包括酵母蛋白胨肉汤(YPD)和基本培养基(含有氨基酸、酵母含氮碱和硫酸铵，并且缺乏用于选择的组分，例如尿嘧啶)。理想的是，首先将待添加的底物溶于乙醇中。必要时，可以例如通过包含或添加半乳糖来诱导来自GAL启动子的表达，诱导目的多肽的表达。
同样可以以瞬时方式或稳定方式来实现宿主动物细胞中的表达。可以通过已知方法，例如感染或脂质转染实现瞬时表达，可以将其重复，以维持所需表达水平的所导入构建体(参见Ebert，PCT公布说明书WO 94/05782)。稳定的表达可以通过使构建体整合到宿主基因组中而产生转基因动物来实现。可以例如通过将构建体微注射到受精卵的原核中，或通过转染、反转录病毒感染或其它技术导入构建体，从而将所述构建体导入可以发育成成年动物或加入到成年动物体内的细胞系(美国专利第4,873,191号；美国专利第5,530,177号；美国专利第5,565,362号；美国专利第5,366,894号；Wilmut等(1997)Nature385：810)。将重组卵或胚胎转移到代理母亲体内(美国专利第4,873,191号；美国专利第5,530,177号；美国专利第5,565,362号；美国专利第5,366,894号；Wilmut等(参见上文))。
出生后，例如根据所导入标记基因(例如毛色)或用血液、乳或组织样品通过PCR或DNA印迹法检测所导入的构建体，或通过免疫测定或酶学测定以检测所表达的蛋白或由其产生的产物，鉴定转基因动物(美国专利第4,873,191号；美国专利第5,530,177号；美国专利第5,565,362号；美国专利第5,366,894号；Wilmut等(参见上文))。所得的转基因动物可以是完全转基因的，或者是嵌合体，仅在其一个细胞亚群中具有所述转基因。通过将有核细胞与去核卵融合、随后将其转移到代理母亲体内而实现的哺乳动物克隆法的出现，使得有可能在获得包含所导入构建体的“建立者”动物或细胞后进行快速而大规模的生产；而在此之前，在用于繁殖的动物的种系中必需存在所述转基因(Wilmut等(参见上文))。
所述宿主动物中的表达，提供了某些功效，尤其是在所述宿主是家畜的情况下。为了在容易从宿主动物中获得的体液(例如乳)中生产PBD融合蛋白，可以在来自雌性宿主的乳腺细胞中表达所述转基因。可以使所述转基因适用于表达，使得所述转基因保留在乳腺细胞中或者分泌到乳中，形成定位于乳中的PBD融合蛋白(PCT公布说明书WO95/24488)。可以用特异性调节序列，例如牛α-乳清蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、χ-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白或乳清酸性蛋白的调节序列，使表达定向，以在乳腺组织中表达，或者可以任选地包括一个或多个内含子和/或分泌信号序列(美国专利第5,530,177号；Rosen的美国专利第5,565,362号；Clark等的美国专利第5,366,894号；Garner等的PCT公布说明书WO 95/23868)。如果必需纯化，则采用底物多糖，通过亲和层析容易地纯化所述PBD融合蛋白。
在应用本发明时，通过使多糖结构与足量的所述PBD融合蛋白接触足够的时间，以在合适的试剂、温度等条件下达到所需的修饰，来应用PBD融合蛋白修饰多糖结构。一般对修饰条件进行优化，以达到所述PBD的Km、Vmax和kcat以及其它生化参数例如最适pH。所述PBD与底物的相互作用一般极其快速。为了达到所需效应，则必需评估达到所需效应的PBD融合蛋白的各种浓度和/或处理时间和/或处理温度。所用的条件凭经验确定，并且基于对所用PBD融合蛋白和所需最终结果的要求。作为一个实例，包含得自内切葡聚糖酶的PBD的PBD融合蛋白的典型条件包括mM磷酸盐pH7.0、PBD的浓度一般为每25mg纤维素纤维(例如棉)约0.1-10mg/ml。温度一般为约20-37℃，最好是约25℃。处理时间从5分钟至12小时不等，虽然可以使用较长的处理时间，只要多糖结构不受损害。一般而言，合适的是温和地搅拌混合物，以促进所述结构的均一处理。在处理所述结构之后，将所述结构干燥，然后用于制备最终的产品，例如纸或纺织品。或者或另外，考虑到与以上所述相似，可以用PBD处理最终产品例如纸或纺织品。
可以采用对修饰进程或反应速率的测定，来检测可能在修饰处理期间形成的抑制性终产物，以及检测在处理期间产生的中间的或最终的理想性能。例如，可能理想的是使纤维不完全交联。相反，可能最好是在某个中间点终止反应，以获得具有由于所述结构不完全交联所引起的理想性能的多糖结构，例如获得用于编织的刚性较低的纱线。本领域技术人员已知用于评估所述PBD处理的许多客观测验，包括杨氏模量、最大负荷下的应变、断裂点能和韧性。
所达到的多糖结构的修饰类型至少部分取决于与所述结合结构域融合的蛋白质的性质。用PBD修饰，定义为可观测到的(可检测到的)多糖结构的变化。这包括所述多糖结构的聚集，导致可观测到的改变，例如湿强度增加、表面性能例如疏水性、亲水性、可湿性、表面网纹等的变化。可以改变的含多糖材料的电学性能包括表面电荷(正或负)和导电性。可以改变的含多糖材料的化学性能包括将各种化学和光化学反应性化学基团引入到至少所述含多糖材料的表面。可以改变的含多糖材料的机械性能包括抗张强度、抗剪力、耐磨损性、摩擦系数和弹性。作为一个实例，当所述多糖结构是纤维素时，可以用每分子具有两个或更多个CBD的试剂或组合物使纤维素纤维交联。图9A-C图示了某些方法，其中可以使本发明的一个CBD偶联剂单位与多糖的一个聚合结构单位相互作用并与之结合。图9A图示了，一个CBD偶联剂单位具有一个与第一聚合结构单位结合的第一CBD、和与一个第二聚合结构单位结合的第二CBD。可以预料，至少在使用具有高度柔性的接头单位的情况下，CBD偶联剂单位的第一CBD和第二CBD都可以与同一聚合结构单位结合。图9B显示了一个具有一个柔性接头单位的CBD偶联剂单位，其中所述第一CBD和第二CBD都与一个聚合结构单位结合。图9C图示了可以如何用多个CBD偶联剂单位使多个聚合结构单位交联以形成三维聚合材料网。这样，可以形成丝状多糖的聚集体，例如纤维素长丝。由纤维素材料构成的通过CBD偶联剂单位交联的材料例如纸、棉纱和棉织物(机织物和无纺织物)，可以改变机械性能，例如杨氏模量。纤维素材料的交联可以在含纤维素材料制造的各个阶段进行。例如，就纸产品而论，可以通过在造纸过程的各个阶段用CBD偶联剂单位组合物处理纤维素纤维，来进行交联，或者可以用CBD偶联剂单位处理成形的纸产品。同样，可以用CBD偶联剂单位组合物使棉纱或棉织物交联，以提供表面性能和/或机械性能改进的纱线或棉织物。
通过用包含官能部分的PBD融合蛋白处理多糖结构或含多糖材料，可以获得具有各种各样新的物理性能、电学性能、化学性能和机械性能的新型材料。图8图示了一种CBD官能化部分，该部分包括至少一个CBD和一个与之连接的官能部分(FM)。所述官能部分可以是多种化学种类中的任一种，包括：疏水性部分，例如疏水性氨基酸序列或肽或脂肪酸衍生物；以降低可湿性并提供增强的所述材料对湿度和水的耐受性；亲水性部分；带电荷或离子部分；硅结合部分；聚合物结合部分；金属或金属结合部分，以提供与金属底物的结合(金属结合蛋白的实例包括细菌铁载体、金属硫蛋白和金属硫蛋白样蛋白(Slice等(1990)J.Biol.Chem.265：256-263)、铁蛋白(Spanner等(1995)Bone 17：161-165)和设计的金属结合蛋白(例如Pessi等(1993)Nature 362：367-369))；化学反应基；光化学反应基；或巯基。本发明的化学反应基可以包括例如醛、马来酰亚胺、酰肼、环氧化物或碳二亚胺。本发明的光化学反应基可以包括叠氮基苯。
同样，可以用具有一个疏水性部分(例如疏水性多肽、长链烃或烃衍生物)的组合物，为纤维素纤维或由纤维素纤维制成的产品提供疏水性。疏水性导致由经修饰纤维素纤维制成材料的可湿性降低，间接导致所述材料在存在水的情况下耐用性增强。另一方面，纤维素纤维的交联直接导致所述材料的湿强度增强。为了简单起见，本文关于纸或其它含纤维素材料的强度的提及并非专门用来包括这类材料的湿强度。
可以用本方法修饰的多糖材料的类型是变化的。实例包括木产品、得自纤维素纤维的纸产品和得自棉或苎麻的产品(例如纱线或织物)。术语“纸”包括由纤维状纤维素材料以及纤维素材料和合成材料的组合制成的片状物和模压产品。纸的实例包括薄棉纸、办公用纸、新闻纸、瓦楞纸、纸巾纸、层压纸和纸板纸。术语“多糖材料”或“含多糖材料”是指包含至少一种多糖、一般包含相当大量的至少一种多糖(例如纤维素或壳多糖)的材料。
含CBD组合物也可应用于造纸过程中。按照本发明，可以在造纸过程中的不同阶段用含CBD组合物处理纤维素材料。例如，可以在成形阶段或在施胶阶段进行处理。通过将CBD交联组合物(例如CBD偶联剂单位组合物或纤维素交联(融合)蛋白(CCP))加至纤维素纤维悬浮液中，在造纸的成形阶段进行处理。最好是，在成形阶段或在其之前用含CBD组合物处理纤维素材料。可以按照上文关于接头单位与CBD连接形成CBD偶联剂单位(图4A-G、5A-B)所述的方法将官能部分与CBD连接、缀合或偶联(也参见例如美国专利第5,962,289号)。
查看以下非限制性实施例时，本发明的其它目的、优点和新特征对于本领域技术人员而言将变得显而易见。另外，上文描述的以及在以下权利要求书一节要求保护的本发明各种实施方案和方面中的任一个，在以下实施例中可找到实验的支持。
实施例
现在参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起，以非限制性方式说明了本发明。
一般而言，本文所用的命名法和本发明中所用的实验室方法包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中有充分的解释。参见例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”Sambrook等(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷Ausubel，R.M.编著(1994)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A PracticalGuide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，New York(1988)；Waston等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等(编著)“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；美国专利第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号和第5,272,057号中描述的方法学；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，第I-III卷Cellis，J.E.编著(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual ofBasic Technique”Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；“CurrentProtocols in Immunology”第I-III卷Coligan J.E.编著(1994)；Stites等(编著)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton&lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著)，“Selected Methods inCellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；在所述专利和科学文献中广泛地描述了可利用的免疫测定，参见例如美国专利第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771号和第5,281,521号；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.编著(1984)；“Nucleic AcidHybridization”Hames，B.D.和Higgins S.J.编著(1985)；“Transcriptionand Translation”Hames，B.D.和Higgins S.J.编著(1984)；“Animal CellCulture”Freshney，R.I.编著(1 986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications”，Academic Press，SanDiego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有上述文献都通过引用结合到本文中，如同本文全部描述一样。在本文件中提供其它一般性参考文献。认为其中的方法是本领域众所周知的，提供这些方法是为了方便读者。其中所含的所有信息都通过引用结合到本文中。
生物材料的保藏
大肠杆菌pET-CBD于1993年4月12日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，M，VA 20110-2209，保藏号为75444。
实施例1
CBD和CBD融合蛋白的构建和表达
以下美国专利的内容公开了各种CBD和CBD融合蛋白的构建和表达，这些专利的内容通过引用结合到本文中：Shoseyov等的美国专利第5,496,934号、美国专利第5,670,623号、美国专利第5,719,044号、美国专利第5,738,984号、美国专利第5,837,814号和美国专利第5,856,201号；Kilbum等的美国专利第5,137,819号、美国专利第5,202,247号、美国专利第5,340,731号、美国专利第5,928,917号和美国专利第5,962,289号；以及Gilkes等的美国专利第5,821,358号。
1.1噬纤维梭菌的纤维素结合结构域(CBDclos)的构建和表达：
M.A.Goldstein等(1993)(J.Bacteriol.175：5762-5768)已经描述了噬纤维梭菌纤维素结合蛋白A的纤维素结合结构域的构建以及在含有pET-CBD质粒(参见图1A-C)的大肠杆菌BL12(DE3)中的过量表达。也参见美国专利第5,496,934号和美国专利第5,719,044号，这两个专利通过引用全部结合到本文中。
1.2CCP-180的构建和表达：
从pET-CBD(图1A-C，M.A.Goldstein等(1993)J.Bacteriol.175：5762-5768)和pET-CBD-180(图1D-E，E.Shpigel等(1999)Biotech.Bioeng.65：17-23)构建pET-CCP-180(图2A-E)，并且用NcoI和BamHI消化pET-CBD和pET-CBD-180，将所得的DNA片段分别在1.2％和0.6％琼脂糖凝胶上分离。用Qiaex DNA凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc，California)从凝胶中提取pET-CBD的500bp片段和pET-CBD-180的5Kb片段，连接所述两种片段。将连接混合物转化到大肠杆菌XL1-blue感受态细胞中，然后转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。含有符合读框地融合的两个CBD的阳性克隆命名为pET-CCP-180，并经测序确证。如MA.Goldstein等(1993)J.Bacteriol.175：5762-5768关于CBDclos所述的方法，进行CCP-180的表达。
1.3 A蛋白-CBD的克隆和表达：
用cbpA基因(Shoseyov等，(1992)Proc.Natl.Acad Sci.USA 89：3483-3487)作为模板，使用含有一个EcoRI位点的引物A(N末端引物)：5’-GGGGGAATTCCATGGCAGCGACAT-3’(SEQ ID NO：11)和含有一个终止密码子后接一个BamHI位点的引物B(C末端引物)：5’-GGGGGATCCTATGGTGCT-3’(SEQ ID NO：12)，经PCR扩增CBD。设计所述引物，使得可以将所述500 bp DNA片段经EcoRI/BamHI强制克隆到质粒pRIT2中，与A蛋白基因的C末端符合读框地融合。PCR条件如以下文献中所述：Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods&Applications.Innis等编著，Academic Press，San Diego，1990)，并且作出以下修改：在反应混合物中使用2 ng模板DNA和1mM MgCl2。用可编程热控制仪(M&J Research，Inc.，)进行反应。按照Sambrook等编著(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press的方法，进行标准DNA操作。
用EcoRI和BamHI消化PCR扩增产物，用Qiaex凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc.)从1.5％琼脂糖凝胶中分离出预期的500bp DNA片段。用T4连接酶将EcoRI/BamHI片段连接到用EcoRI/BamHI预先消化的pRIT2中。用连接混合物转化大肠杆菌菌株2097感受态细胞，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化菌落。含有目的DNA插入片段的成功构建体被命名为pRIT2-CBD。
将Prot A-CBD克隆到T7介导的过量表达载体pET3d(F.Studier等，(1986)J.Mol.Biol.189：113-130)中。用pRIT2-CBD作为模板，用以下引物经PCR扩增Prot A-CBD：C末端引物：如上所述(即5’-GGGGGGATCCTATGGTGCT-3’SEQ ID NO：12)；和N末端引物：5’-GGGGGGTACCATGGAACAACGC-3’(SEQ ID NO：13)，该引物在NcoI位点中含有一个起始位点。用NcoI部分消化PCR产物。用BamHI消化回收的DNA，将1.3Kb DNA片段克隆到pET3d中。用连接混合物转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化菌落。含有所述DNA插入片段的成功构建体被命名为pET-ProtA-CBD(图3A-G)。将pET-ProtA-CBD转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。如Nilsson等，(1985)，EMBOJ.4：1075-1080所述，进行所述融合蛋白的表达。所有细胞均在250rpm下的摇瓶中40ml体积的LB中生长，所述LB中补充有50mg/L氨苄青霉素，用400μl含有pRIT2-CBD的大肠杆菌2097的过夜培养物接种。培养物在30℃的温度下生长，直至达到O.D.600nm为0.4。然后将温度升至42℃达45分钟，然后再降至37℃达2小时。
在带有pET-ProtA-CBD的大肠杆菌BL21(DE3)中获得ProtA-CBD的过量表达。通过在含有50μg/ml氨苄青霉素的M9基本培养基(0.65Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.255 NaCl、0.5％NH4Cl、20％葡萄糖、2mMMgSO4、0.1mM CaCl2和1mM盐酸硫胺素)过夜培养所述细胞，制备接种物。将接种物在含有100μg/ml氨苄青霉素的TB培养基(1.2％细菌培养用胰胨、2.4％细菌培养用酵母膏、0.4％(v/v)甘油、0.17MKH2PO4和0.72M K2HPO4)以1∶50稀释后，让细胞于37℃生长至O.D.600nm为1.5，此后加入0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。让细胞于37℃再生长4小时。以2,000g离心10分钟收获细胞。
1.4 ProtA-CBD的纯化：
将细胞以0.1g/ml的浓度悬浮于50mM Tris/HCl、10mM EDTA pH8中，用RANNIE高压实验室匀浆器(MINI/LAB 8.30H型)破碎细胞。将悬浮液离心，将蛋白浓度为5mg/ml的1升上清液上样至纤维素(Avicel 200 Sigma)柱(2.6×32cm)。该柱用PBS(15mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，3mM KCl，pH 7.4)平衡。以5ml/min的流速洗涤该柱，直至280nm下的吸光度低于0.05。用50mM Tris/NaOH溶液pH 12.5洗脱ProtA-CBD。将洗脱出的ProtA-CBD立即用HCl滴定至pH 8，然后冻干。按照Laemmli的方法(U.K.Laemmli(1970)Nature 227：680-685)，在12.5％SDS-PAGE上分析大肠杆菌总蛋白(在上样至纤维素柱之前)和从所述纤维素柱洗脱的峰(ProtA-CBD)。ProtA-CBD峰显示出一条约45 kD的条带。
实施例2
经处理(CBD修饰的)材料和未经处理材料机械性能的测量
用通用试验机(图11，Instron，HighWycombe，UK)界面型1011系列测量机械性能，取样速率(Sample rate)：10pts/sec，十字头速度(Crosshead speed)：5mm/min。所有测量均在23℃和65％相对湿度下进行。
2.1杨氏模量：
拉伸弹性模量即杨氏模量是材料的一个重要性能。杨氏模量可以被宽松地定义为用不致不可逆拉伸材料的相对小的力以弹性方式(regime)使材料延伸所需的力。
2.2纸的处理：
通过在CBDclos、CCP、Prot-A-CBD、Ab-ProtA-CBD在20mM Tris碱pH7中浓度分别为2.5mg/ml和2.0mg/ml的溶液中浸渍10分钟，处理薄棉纸矩形纸条(尺寸：45mm×10mm×0.1mm)。对照处理也在20mM Tris碱pH 7溶液中浸渍10分钟。在浸渍后，从液体中取出经处理纸条和对照纸条，在真空下干燥2天。
2.3纸处理的结果：
2.3.1杨氏模量：
在图10A中给出了对照纸样、CBDclos处理纸样和CCP-180处理纸样的杨氏模量值。用CBD处理的纸的杨氏模量显著大于对照(未经处理)纸的杨氏模量。用CCP处理纸的杨氏模量甚至大于CBD处理纸的杨氏模量。这些结果表明，用CBD或用CCP处理纸，改变了所述纸的至少一种机械性能。更具体地讲，与未经处理纸相比，用或者CBD或者CCP处理纸，导致经处理纸的抗张强度增加(根据杨氏模量值测定)。
2.3.2最大负荷下的应变：
在图10B中显示了表明CBDclos处理纸样和CCP-180处理纸样在最大负荷下应变的结果。与对照值相比，或者CBD处理或者CCP处理没有导致最大负荷下应变的显著改变。这些结果表明，用CBD或CCP处理纸不会显著影响其弹性。
2.3.3断裂点能：
在图10C中显示了表明CBD或CCP-180处理纸样断裂点能的结果。CBD处理纸的断裂点能与对照基本相同。然而，用交联蛋白CCP-180处理的纸显示出与对照相比断裂点能显著增加。
2.3.4韧性：
在图10D中显示了表明CBD和CCP处理纸样韧性的结果。CBD处理纸的韧性与对照基本相同。然而，用CCP处理的纸再次显示出与对照相比韧性显著增加。
2.4纱线处理：
用于该项研究的棉纱是T.P.U.(每英寸的捻数)低的100％本色棉双纱纤维(34/2)。纱线直径为0.5mm，单位长度的重量为0.8mg/cm。在每种处理中，利用本领域已知类型的特制的纱线处理仪(YTA)，将纱线试样浸入蛋白质溶液中。图11图示了所述纱线处理机。该机器包括一个喂纱轮、一个卷绕轮、一个第一槽A、一个第二槽B和一个与卷绕轮连接的发动机。喂纱轮和卷绕轮可以交换，从而允许纱线重新通过槽A和槽B。发动机可以以各种选定速度运行，从而允许测定纱线试样的浸渍时间。纱线的长度可以在喂纱轮和卷绕轮之间连接，通过使纱线通过槽A和槽B中含有的液体，可以使纱线从喂纱轮移动至卷绕轮。这样，可以使纱线浸入一种液体(两个槽中存在的)或在两种不同液体中达特定的时间。
将多段(lengths of)棉纱(3-4米)卷绕在YTA的喂纱轮上，纱线的一端连接至卷绕轮，纱线借助发动机前进通过槽A和槽B。纱线的浸渍时间约为45秒。
上述的棉纱处理如下：
(i)用CCP-180处理：将纱线纤维浸入(槽A)CCP-180溶液(1mg/ml，在20mM Tris碱pH 8中)中。
(ii)用A蛋白-CBD处理(将CBD-PA纱线纤维浸入(槽A)CBD-PA溶液(0.75mg/ml，在20mM Tris碱pH 8中)中，然后在1×TBS中洗涤(槽B)(浸渍时间45秒)。
(iii)用A蛋白CBD和抗体双重处理：将纱线纤维浸入(槽A)CBD-PA溶液(0.75 mg/ml，在20mM Tris碱pH 8中)中，并且在1×TBS中洗涤(槽B)(浸渍时间45秒)。然后将卷绕轮与喂纱轮交换，将纱线浸入(槽A)抗血清溶液(0.75mg IgG/ml)中，并在1×TBS中洗涤(槽B)。
(iv)对照：将纱线纤维浸入(槽A)20mM Tris碱pH 8中达45秒。
处理之后，将所有三种经处理试样和对照于室温干燥数小时。
2.5纱线处理结果：
2.5.1杨氏模量：
在图12A中给出了对照纱线试样、CCP-180处理的纱线试样、A蛋白-CBD处理的纱线试样和Ab-A蛋白-CBD处理的纱线试样的杨氏模量值。用CCP-180和Ab-A蛋白-CBD处理的纱线的杨氏模量值显著高于对照(未经处理)纱线的杨氏模量值。这些数据表明，与对照相比，用Ab-A蛋白-CBD和CCP处理纱线，导致经处理纱线的抗张强度(根据杨氏模量值测定)增强。有趣的是，用CBD-PA处理的纱线的杨氏模量值比对照纱线的杨氏模量值低得多。虽然不希望受理论的束缚，但CBD-PA处理的纱线的杨氏模量降低的可能解释是CBD-PA使纤维素纤维松散(参见例如美国专利第5,821,358号，其内容通过引用结合到本文中)。
2.5.2最大负荷下应变：
在图12B中显示了表明用CCP-180、CBD-PA和CBD-PA-Ab处理的纱线试样在最大负荷下应变的结果。与对照相比，用或者CCP-180或者CBD-PA-Ab处理的纱线，其最大负荷下应变值较低，因而表明这些处理使得纱线的弹性低于对照的弹性。用CBD-PA处理的纱线的最大负荷下应变值与对照的相似。
实施例3
材料的官能化
3.1将过滤介质官能化以从液体中除去重金属种类：
通过将一个CBD与一个对重金属具有亲和性的官能部分(例如金属结合蛋白)偶联，制备CBD官能部分(参见例如图9A-C)。包含纤维素材料的底物(例如棉纤维)用所述CBD官能部分处理，其处理条件(pH、温度、离子浓度等)使得CBD官能部分的CBD组分与底物结合，因而所述底物被所述金属结合官能部分官能化，从而提供金属结合底物或过滤介质。使含有过量水平重金属的液体流通过所述金属结合过滤介质，从而使所述液体流中所述重金属的浓度大大地降至无毒水平。
3.2将纤维素纤维官能化以制造可湿性降低的包装用纸产品：
通过将一个CBD与一个疏水官能部分偶联，制备CBD官能部分。适用于造纸的纤维素纤维用所述CBD疏水官能部分处理，其处理条件(pH、温度、离子浓度等)使得CBD官能部分的CBD组分与所述纤维素纤维结合，从而提供连接有疏水部分的纤维素纤维。由所述经处理纤维素纤维制造的纸是疏水性的，因而耐水。
在一个替代的实施例中，在将由未处理(未官能化)纤维素纤维生产的纸干燥之前或之后，用一种CBD连接的疏水性部分将所述纸官能化。用所述CBD疏水性官能部分处理的纸是疏水性的，因而耐水。
3.3将纤维素纤维官能化以制造可湿性增强的薄棉纸：
通过将一个CBD与一个亲水官能部分偶联，制备CBD官能部分。在造纸过程的第一干燥阶段或第二干燥阶段之前或者之后，用所述CBD亲水官能部分处理(官能化)薄棉纸。用所述CBD亲水官能部分处理的薄棉纸是亲水性的，显示出对水和水性液体的吸收增强。
实施例4
表达S-蛋白-CBD-S-肽(SSC)
图13显示了SCS在大肠杆菌中表达的结果。2道显示用IPTG诱导之前的大肠杆菌蛋白，3道显示用IPTG诱导之后的大肠杆菌总蛋白，而4道显示含所述SCS蛋白的包含体。
实施例5
用CBD、CCP或SCS处理预成形纸
图14显示了用CBD、CCP或SCS处理Whatman纸结果的杨氏模量图。注意到，用所有所测试浓度的CBD或CCP处理Whatman纸，都导致杨氏模量增加。
图15显示了经CBD、CCP或SCS处理的Whatman纸的断裂点能。注意到，应用2.5mg/ml浓度的CCP导致断裂点能增加约30％。另外，用所有所测试浓度的SCS处理，导致断裂点能增加。
图16显示了经CBD、CCP或SCS处理的Whatman纸的韧性结果。注意到，应用2.5mg/ml浓度的CCP导致韧性增加约40％。另外，用所有所测试浓度的SCS处理，导致韧性增加。
图17显示了经CBD、CCP或SCS处理的Whatman纸在最大负荷下的应力。注意到，所测试的所有处理都导致最大负荷下应力增加。用2.5mg/ml浓度的CCP获得最为显著的效应。最大负荷下应力的增加表明纸强度增加。
在另一组实验中，测定CBD和CCP对预成形Whatman纸的影响。
将40×10mm、厚0.18mm的1号Whatman纸(Whatman，Maidstone，England)的矩形纸片浸入含有2.5mg/ml CBD或CCP的溶液(20mMTris碱，pH7)中达10分钟。然后试样在65％相对湿度、23℃下干燥24小时。所述纸最终的水分含量为3.2％。按照用于纸和纸板抗张性能的国际标准检验方法(ISO 1924-2)评估机械性能。经处理纸的抗张检验用Instron通用检验仪(Universal Testing Machine)(UTM)1011型(HighWycombe，UK)以拉伸模式进行。将矩形纸插入上下张力夹(螺丝紧定的夹子，Instron Corp.，Canton，MA)，使得在抗张实验期间能够适当夹住。所有测量均在23℃、65％相对湿度下以恒定变形速率20mm/min进行。所测量的抗张性能包括破裂时的应力、破裂时的应变、断裂点的伸长量和能量吸收。按照Hayden，W.，Moffatt，W.G.和Wulff，J.Mechanical Behavior.1-22(Johan Wiley&Sons，Inc.，NY；1956)和Dufresne，A，Cavaille，J.Y.和Vignon，M.R.Mechanical behavior of sheetsprepared from sugar beet cellulose microfibrils.J.Appl.Polym.Sci.64，1185-1194(1996)所述的方法进行所有的计算。
按照公式1计算应力(σ)：
σ＝F/S                                           (1)
其中F是施加的负荷，而S是横截面。S通过假设试样的总体积保持不变来确定，因此：
S＝S0×l0/l                                       (2)
其中S0是零时的横截面。可以按照以下公式确定应变(ε)：
ε＝ln(l/l0)                                      (3)
其中l0和l分别是检验期间的长度和零时的长度。该数据允许对应力与应变曲线关系作图，而杨氏模量(E)的计算如下：
E＝Δσ/Δε                                      (4)
以下报道的数值是至少15次测量的平均值。
图18显示了用CBD或CCP处理的预成形Whatman纸的典型的应力与应变关系曲线。经处理纸在所施加负荷下的变形行为可以根据应力-应变曲线来推导。在至多0.02应变下，观测到在应力和应变之间有线性关系。然而，在高于0.02的应变下，发现有非线性关系。从图18可明显看出，张应力分别从对照增加至CBD然后增加至CCP。CCP处理纸的抗张强度值比未处理纸高约40％，比CBD处理纸高14％。CBD处理纸的强度比未处理纸高约25％。在两种处理中，所述差异都是统计学上显著的(表6)。
表6
    对照     CBD2.5mg/ml     CCP2.5mg/ml
破裂时的应力(MPa)破裂时的应变(％)杨氏模量(MPa)*破裂时的能量(103J/m3)     7.4c10.4b183.3b0.208c     9.2b11.7ab197.2ab0.254b     10.5a15.5a214.5a0.418a
*杨氏模量以3％变形来计算。一行中后接一个不同的字母上标的数值有显著性差异，p＝0.01。
纸破裂应变的变化也是显著性的。在用CCP处理的纸中，破裂应变相对于未处理纸而言增加约50％。CBD的效应明显较低，仅导致增加12％。用CBD或CCP处理纸，产生脆性较低的纸。在表1中总结了由应力-应变曲线(直至3％变形为线性)的初始斜率得出的经处理纸的杨氏模量。用CCP处理纸，导致其杨氏模量增加17％，而CBD处理导致仅增加7.5％。通过计算应力-应变曲线下的面积，确定能量吸收，在表6中总结了所述结果。在抗张强度的数据中观测到的倾向适用于能量吸收；然而，其大小更大。CCP处理纸的能量吸收比对照高约100％，而CBD处理纸的能量吸收仅高23％。CCP处理纸的数值比其CBD处理对应物高约64％。在所测试的所有参数中，CCP的效应在统计学上是显著的，而用CBD处理仅在破裂时应力和能量吸收方面有统计学显著性(表6)。
图19显示了用不同浓度的CBD或CCP处理的预成形Whatman纸的吸水时间。图20显示用CCP处理的预成形Whatman纸上水吸收的时间推移照片。吸取蒸馏水(10μl)，将其置于所述经处理纸上，以秒测量完全吸收所需的时间。也用光接触角度计CAM2000(KSVInstruments，Helsinki，Finland)显现水的吸收。将一滴水滴到纸样上，以20ms的时间推移拍摄照片。在水与纸接触后25ms时，拍摄第一帧。在未处理纸中，吸收时间小于1秒。CBD处理纸和CCP处理纸的吸水时间随蛋白量的增加而增加。当以2.5mg/ml的浓度应用CCP时，吸水时间比用同一浓度的CBD处理的纸高2个数量级(CCP为580秒，相比之下CBD为5秒)，比未处理低高至少3个数量级(CCP为580秒，相比之下对照小于1秒)。
用光接触角度计(CAM)来显现滴在CCP处理纸上的水的动力学。图20(照片F)描绘了25ms后水滴与未处理纸接触。显然，在接触后水立即被吸收到纸中。图20(照片A-E)进一步描绘了CCP处理纸对水滴的吸收与推移时间之间的关系。在前2分钟内，没有检测到吸收，接触角保持＞90°。4分钟后，才观测到被吸收到纸中。甚至在8分钟后，水还没有被纸完全吸收。在10分钟后才观测到被完全吸收到纸中(图19)。
实施例6
在造纸过程的成形阶段之前使细小纤维素纤维交联
通过将至少两个CBD与一个接头单位连接，制备CBD偶联剂单位组合物或试剂。使包括显著量的能通穿过成形网(滤器(filter))的细小纤维素纤维的纤维素纤维的悬浮液通过成形网之前，用所述CBD偶联剂单位组合物处理所述悬浮液。CDB偶联剂单位组合物的CBD偶联剂单位与所述细小纤维素纤维交联形成多个三维纤维素纤维聚集体。在经处理的悬浮液通过成形网之后，所述滤器保留了纤维素纤维的三维聚集体，从而保证原料(纤维素纤维)回收率大大提高。
以上结果证明，可以制备包括双重或二聚PBD的PBD融合蛋白(例如两个CBD的融合产物，例如纤维素交联蛋白(CCP))、CBD与A蛋白的融合产物和S肽-CBD-S蛋白融合体，并且可以用它们来修饰多糖结构。
人们会认识到，在不同的实施方案中描述了本发明的某些特征以便理解，所述特征也可以在一个实施方案中以组合提供。相反，为了简便起见，在一个实施方案中描述了本发明的不同特征，这些特征也可以分开提供或以任何合适的亚组合方式提供。
虽然已经结合具体实施方案描述了本发明，但显然，许多替代方案、修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。因此，本发明将包括属于所附权利要求书的精神和范围内的所有这类替代方案、修改和变化。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全部结合到本文中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体而单独地指明通过引用结合到本文中一样。另外，本申请中的任何参考文献的引证或标识不应该被解释为承认这种参考文献可以用来作为本发明的现有技术。
说明书序列表
<110>Levy，Ilan
Shoseyov，Oded
Nussinovitch，Amos
<120>含多糖材料的修饰
<130>00/20910
<140>60/166，389和60/164，140
<141>1999-11-18和1999-11-08
<160>13
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>507
<212>DNA
<213>Clostridium cellulovorans
<400>1
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<212>PRT
<213>Clostridium cellulovorans
<400>2
Met Ala Ala Thr Ser Ser Met Ser Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Lys
1               5                   10                  15
Ser Ala Gln Thr Asn Ser Ile Thr Pro Ile Ile Lys Ile Thr Asn Thr
            20                  25                  30
Ser Asp Ser Asp Leu Asn Leu Asn Asp Val Lys Val Arg Tyr Tyr Tyr
        35                  40                  45
Thr Ser Asp Gly Thr Gln Gly Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Gly
    50                  55                  60
Ala Leu Leu Gly Asn Ser Tyr Val Asp Asn Thr Ser Lys Val Thr Ala
65                  70                  75                  80
Asn Phe Val Lys Glu Thr Ala Ser Pro Thr Ser Thr Tyr Asp Thr Tyr
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Val Glu Phe Gly Phe Ala Ser Gly Arg Ala Thr Leu Lys Lys Gly Gln
            100                 105                 110
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Thr Ala Pro
<210>3
<211>573
<212>DNA
<213>Clostridium cellulovorans
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<211>1030
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Gly Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Val Leu Gly Thr Ala Pro Gly Pro Asp
145                 150                 155                 160
Val Pro Ser Ser Ile Ile Asn Pro Thr Ser Ala Thr Phe Asp Pro Gly
                165                 170                 175
Thr Met Ala Ala Thr Ser Ser Met Ser Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn
            180                 185                 190
Lys Ser Ala Gln Thr Asn Ser Ile Thr Pro Ile Ile Lys Ile Thr Asn
        195                 200                 205
Thr Ser Asp Ser Asp Leu Asn Leu Asn Asp Val Lys Val Arg Tyr Tyr
    210                 215                 220
Tyr Thr Ser Asp Gly Thr Gln Gly Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala
225                 230                 235                 240
Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Tyr Val Asp Asn Thr Ser Lys Val Thr
                245                 250                 255
Ala Asn Phe Val Lys Glu Thr Ala Ser Pro Thr Ser Thr Tyr Asp Thr
            260                 265                 270
Tyr Val Glu Phe Gly Phe Ala Ser Gly Arg Ala Thr Leu Lys Lys Gly
        275                 280                 285
Gln Phe Ile Thr Ile Gln Gly Arg Ile Thr Lys Ser Asp Trp Ser Asn
    290                 295                 300
Tyr Thr Gln Thr Asn Asp Tyr Ser Phe Asp Ala Ser Ser Ser Thr Pro
305                 310                 315                 320
Val Val Asn Pro Lys Val Thr Gly Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Val Leu
                325                 330                 335
Gly Thr Ala Pro
            340
<210>7
<211>1288
<212>DNA
<213>重组核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(791)
<223>pRIT2T克隆载体
<220>
<221>misc_feature
<222>(795)..(1280)
<223>得自cbpA基因
<400>7
ccatggaaca acgcataacc ctgaaagaag cttgggatca acgcaatggt tttatccaaa    60
gccttaaaga tgatccaagc caaagtgcta acgttttagg tgaagctcaa aaacttaatg   120
actctcaagc tccaaaagct gatgcgcaac aaaataactt caacaaagat caacaaagcg   180
ccttctatga aatcttgaac atgcctaact taaacgaagc gcaacgtaac ggcttcattc   240
aaagtcttaa agacgaccca agccaaagca ctaacgtttt aggtgaagct aaaaaattaa   300
acgaatctca agcaccgaaa gctgataaca atttcaacaa agaacaacaa aatgctttct   360
atgaaatctt gaatatgcct aacttaaacg aagaacaacg caatggtttc atccaaagct   420
taaaagatga cccaagccaa agtgctaacc tattgtcaga agctaaaaag ttaaatgaat   480
ctcaagcacc gaaagcggat aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct ttctatgaaa   540
tcttacattt acctaactta aacgaagaac aacgcaatgg tttcatccaa agcctaaaag   600
atgacccaag ccaaagcgct aaccttttag cagaagctaa aaagctaaat gatgctcaag   660
caccaaaagc tgacaacaaa ttcaacaaag aacaacaaaa tgctttctat gaaattttac   720
atttacctaa cttaactgaa gaacaacgta acggcttcat ccaaagcctt aaagacgatc   780
cggggaattc catggcagcg acatcatcaa tgtcagttga attttacaac tctaacaaat   840
cagcacaaac aaactcaatt acaccaataa tcaaaattac taacacatct gacagtgatt   900
taaatttaaa tgacgtaaaa gttagatatt attacacaag tgatggtaca caaggacaaa   960
ctttctggtg tgaccatgct ggtgcattat taggaaatag ctatgttgat aacactagca   1020
aagtgacagc aaacttcgtt aaagaaacag caagcccaac atcaacctat gatacatatg   1080
ttgaatttgg atttgcaagc ggacgagcta ctcttaaaaa aggacaattt ataactattc   1140
aaggaagaat aacaaaatca gactggtcaa actacactca aacaaatgac tattcatttg   1200
atgcaagtag ttcaacacca gttgtaaatc caaaagttac aggatatata ggtggagcta   1260
aagtacttgg tacagcacca taggatcc                                      1288
<210>8
<211>426
<212>PRT
<213>重组蛋白质序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(263)
<223>得自克隆载体的A蛋白
<220>
<221>misc_feature
<222>(265)..(426)
<223>CBPA
<400>8
Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Glu Ala Trp Asp Gln Arg Asn Gly
1               5                   10                  15
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu
            20                  25                  30
Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala
        35                  40                  45
Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
    50                  55                  60
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala
                85                  90                  95
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn
            100                 105                 110
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
    130                 135                 140
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser
145                 150                 155                 160
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
                165                 170                 175
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
            180                 185                 190
Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
        195                 200                 205
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp
    210                 215                 220
Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
225                 230                 235                 240
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
                245                 250                 255
Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Met Ala Ala Thr Ser Ser Met Ser Val
            260                 265                 270
Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Lys Ser Ala Gln Thr Asn Ser Ile Thr Pro
        275                 280                 285
Ile Ile Lys Ile Thr Asn Thr Ser Asp Ser Asp Leu Asn Leu Asn Asp
    290                 295                 300
Val Lys Val Arg Tyr Tyr Tyr Thr Ser Asp Gly Thr Gln Gly Gln Thr
305                 310                 315                 320
Phe Trp Cys Asp His Ala Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Tyr Val Asp
                325                 330                 335
Asn Thr Ser Lys Val Thr Ala Asn Phe Val Lys Glu Thr Ala Ser Pro
            340                 345                 350
Thr Ser Thr Tyr Asp Thr Tyr Val Glu Phe Gly Phe Ala Ser Gly Arg
        355                 360                 365
Ala Thr Leu Lys Lys Gly Gln Phe Ile Thr Ile Gln Gly Arg Ile Thr
    370                 375                 380
Lys Ser Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Thr Asn Asp Tyr Ser Phe Asp
385                 390                 395                 400
Ala Ser Ser Ser Thr Pro Val Val Asn Pro Lys Val Thr Gly Tyr Ile
                405                 410                 415
Gly Gly Ala Lys Val Leu Gly Thr Ala Pro
            420                 425
<210>9
<211>984
<212>DNA
<213>重组核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(68)..(624)
<223>取自Clostridium cellulovorans
<220>
<221>misc_feature
<222>(652)..(981)
<223>取自牛
<400>9
catatgaaag aaaccgctgc tgctaaattc gaacgccagc acatggacag cccagatctg    60
ggtaccctgg tgccacgcgg ttccatggca gcgacatcat caatgtcagt tgaattttac    120
aactctaaca aatcagcaca aacaaactca attacaccaa taatcaaaat tactaacaca    180
tctgacagtg atttaaattt aaatgacgta aaagttagat attattacac aagtgatggt    240
acacaaggac aaactttctg gtgtgaccat gctggtgcat tattaggaaa tagctatgtt    300
gataacacta gcaaagtgac agcaaacttc gttaaagaaa cagcaagccc aacatcaacc    360
tatgatacat atgttgaatt tggatttgca agcggacgag ctactcttaa aaaaggacaa    420
tttataacta ttcaaggaag aataacaaaa tcagactggt caaactacac tcaaacaaat    480
gactattcat ttgatgcaag tagttcaaca ccagttgtaa atccaaaagt tacaggatat    540
ataggtggag ctaaagtact tggtacagca ccaggtccag atgtaccatc ttcaataatt    600
aatcctactt ctgcaacatt tgatcccggt accatgggtc ctcctcctgg aagcac ttcc   660
gctgccagca gctccaacta ttgcaaccag atgatgaaga gccggaacct gaccaaagat    720
cgatgcaagc cagtgaacac ctttgtgcac gagtccctgg ctgatgtcca ggccgtgtgc    780
tcccagaaaa atgttgcctg caagaatggg cagaccaatt gctaccagag ctactccacc    840
atgagcatca ccgactgccg tgagaccggc agctccaagt accccaactg tgcctacaag    900
accacccagg cgaataaaca catcattgtg gcttgtgagg gaaacccgta cgtgccagtc    960
cacttcgacg cttcagtgta gatc                                           984<210>10<211>326<212>PRT<213>重组蛋白质序列<220><221>misc_feature<222>(30)..(208)<223>取自Clostridium cellulovorans<220><221>misc_feature<222>(226)..(326)<223>取自牛<400>10His Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp1               5                   10                  15Ser Pro Asp Leu Gly Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Ala Ala Thr
           20                  25                  30Ser Ser Met Ser Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Lys Ser Ala Gln Thr
       35                  40                  45Asn Ser Ile Thr Pro Ile Ile Lys Ile Thr Asn Thr Ser Asp Ser Asp
   50                  55                  60Leu Asn Leu Asn Asp Val Lys Val Arg Tyr Tyr Tyr Thr Ser Asp Gly65                  70                  75                  80Thr Gln Gly Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Gly Ala Leu Leu Gly
               85                  90                  95Asn Ser Tyr Val Asp Asn Thr Ser Lys Val Thr Ala Asn Phe Val Lys
           100                 105                 110
Glu Thr Ala Ser Pro Thr Ser Thr Tyr Asp Thr Tyr Val Glu Phe Gly
        115                 120                 125
Phe Ala Ser Gly Arg Ala Thr Leu Lys Lys Gly Gln Phe Ile Thr Ile
    130                 135                 140
Gln Gly Arg Ile Thr Lys Ser Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Thr Asn
145                 150                 155                 160
Asp Tyr Ser Phe Asp Ala Ser Ser Ser Thr Pro Val Val Asn Pro Lys
                165                 170                 175
Val Thr Gly Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Val Leu Gly Thr Ala Pro Gly
            180                 185                 190
Pro Asp Val Pro Ser Ser Ile Ile Asn Pro Thr Ser Ala Thr Phe Asp
        195                 200                 205
Pro Gly Thr Met Gly Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ser Ala Ala Ser Ser
    210                 215                 220
Ser Asn Tyr Cys Asn Gln Met Met Lys Ser Arg Asn Leu Thr Lys Asp
225                 230                 235                 240
Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val His Glu Ser Leu Ala Asp Val
                245                 250                 255
Gln Ala Val Cys Ser Gln Lys Asn Val Ala Cys Lys Asn Gly Gln Thr
            260                 265                 270
Asn Cys Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr Met Ser Ile Thr Asp Cys Arg Glu
        275                 280                 285
Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys Ala Tyr Lys Thr Thr Gln Ala
    290                 295                 300
Asn Lys His Ile Ile Val Ala Cys Glu Gly Asn Pro Tyr Val Pro Val
305                 310                 315                 320
His Phe Asp Ala Ser Val
                325
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸；
<400>11
gggggaattc catggcagcg acat                                   24
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸；
<400>12
gggggatcct atggtgct                                          18
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>合成寡核苷酸；
<400>13
ggggggtacc atggaacaac gc                                        22

Claims (74)

1.一种制造具有至少一种所需性能的含多糖材料的方法，所述的性能是指抗张强度、弹性、断裂点能、韧性、吸水性、抗剪力、耐磨损性、摩擦系数和/或湿强度，所述方法包括以下步骤：使所述含多糖材料的多糖结构与含多糖结合结构域的组合物在将所述多糖结构加工到所述含多糖材料中之前、期间和/或之后进行接触，从而制造具有所需性能的所述含多糖材料，其中所述的含多糖材料是纸产品、木产品或纺织品。
2.权利要求1的方法，其中在将所述含多糖材料的所述多糖结构加工到所述含多糖材料中之前，实现使所述多糖结构与所述含多糖结合结构域组合物接触。
3.权利要求1的方法，其中在将所述含多糖材料的所述多糖结构加工到所述含多糖材料中期间，实现使所述多糖结构与所述含多糖结合结构域组合物接触。
4.权利要求1的方法，其中在将所述含多糖材料的所述多糖结构加工到所述含多糖材料中之后，实现使所述多糖结构与所述含多糖结合结构域组合物接触。
5.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和至少一个与其共价偶联的另外的多糖结合结构域。
6.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和与其共价偶联的另一蛋白质。
7.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的疏水性基团。
8.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的亲水性基团。
9.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的生物学部分。
10权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的酶。
11.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的化学反应基团。
12.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的A蛋白-抗体。
13.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的肽。
14.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的多肽。
15.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的烃或烃衍生物。
16.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的脂肪酸衍生物。
17.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是纤维素结合结构域。
18.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是淀粉结合结构域。
19.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与纤维素结合的多糖结合结构域。
20.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与淀粉结合的多糖结合结构域。
21.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与壳多糖结合的多糖结合结构域。
22.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是葡聚糖结合结构域。
23.权利要求1的方法，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域包括链球菌葡聚糖结合重复序列。
24.一种组合物，所述组合物包含：
一种包含多糖结构的含多糖材料；和
一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，为所述含多糖材料提供至少一种所需的性能，所述的性能是指抗张强度、弹性、断裂点能、韧性、吸水性、抗剪力、耐磨损性、摩擦系数和/或湿强度，其中所述的含多糖材料是纸产品、木产品或纺织品。
25.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和至少一个与其共价偶联的另外的多糖结合结构域。
26.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和与其共价偶联的另一蛋白质。
27.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的疏水性基团。
28.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的亲水性基团。
29.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的生物学部分。
30.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的酶。
31.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的化学反应基团。
32.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的A蛋白-抗体。
33.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的肽。
34.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的多肽。
35.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的烃或烃衍生物。
36.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的脂肪酸衍生物。
37.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是纤维素结合结构域。
38.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是淀粉结合结构域。
39.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与纤维素结合的多糖结合结构域。
40.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与淀粉结合的多糖结合结构域。
41.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个能够与壳多糖结合的多糖结合结构域。
42.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域是葡聚糖结合结构域。
43.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域组合物包括一个多糖结合结构域，所述多糖结合结构域包括链球菌葡聚糖结合重复序列。
44.权利要求24的组合物，其中所述含多糖结合结构域的组合物包括至少一个另外的多糖结合结构域。
45.权利要求44的组合物，其中所述多糖结合结构域与至少一个另外的多糖结合结构域通过接头单位连接。
46.权利要求45的组合物，其中所述接头单位包括一个或多个天然分子。
47.权利要求45的组合物，其中所述接头单位包括一个或多个合成分子。
48.权利要求47的组合物，其中所述合成分子是丙烯酸聚合物。
49.权利要求47的组合物，其中所述合成分子是麦谷蛋白。
50.权利要求45的组合物，其中所述连接是通过共价键、离子键、疏水键、氢键、蛋白质翻译或蛋白质表达。
51.权利要求45的组合物，其中所述接头单位具有多糖组分。
52.权利要求51的组合物，其中所述多糖组分是淀粉。
53.权利要求45的组合物，其中所述接头单位包括一个或多个多糖结合结构域。
54.权利要求44的组合物，其中所述多糖结合结构域是一蛋白质的部分，而所述至少一种另外的多糖结合结构域是另一蛋白质的部分。
55.一种组合物，所述组合物包含：
一种包含多糖结构的含多糖材料；和
一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少两个共价偶联的多糖结合结构域，形成使所述含多糖材料的所述多糖结构交联的多糖结合结构域偶联剂，其中所述的含多糖材料是纸产品、木产品或纺织品。
56.一种组合物，所述组合物包含：
一种包含多糖结构的含多糖材料；和
一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的官能化部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述官能化部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接，其中所述的含多糖材料是纸产品、木产品或纺织品。
57.一种组合物，所述组合物包含：
一种包含多糖结构的含多糖材料；和
一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的疏水性部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述疏水性部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接，其中所述的含多糖材料是纸产品、木产品或纺织品。
58.一种组合物，所述组合物包含：
一种包含多糖结构的含多糖材料；和
一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的亲水性部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述亲水性部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接，其中所述的含多糖材料是纸产品、木产品或纺织品。
59.一种组合物，所述组合物包含：
一种包含多糖结构的含多糖材料；和
一种待与所述含多糖材料的所述多糖结构结合的含多糖结合结构域组合物，所述含多糖结合结构域组合物包括至少一个多糖结合结构域和一个与其共价偶联的化学反应性部分，所述至少一个多糖结合结构域将所述化学反应性部分与所述含多糖材料的所述多糖结构连接，其中所述的含多糖材料是纸产品、木产品或纺织品。
60.一种组合物，所述组合物包含一个多糖结合结构域偶联剂，所述偶联剂包括至少两个共价偶联的多糖结合结构域。
61.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包括至少两个多糖结合结构域。
62.权利要求61的核酸构建体，所述核酸构建体还包含至少一个编码至少一个接头肽的另外的多核苷酸，所述接头肽偶联所述至少两个多糖结合结构域。
63.一种制造具有至少一种所需性能的含多糖材料的方法，所述的性能是指抗张强度、弹性、断裂点能、韧性、吸水性、抗剪力、耐磨损性、摩擦系数和/或湿强度，所述方法包括以下步骤：使所述含多糖材料的多糖结构与多糖结合结构域在将所述多糖结构加工到所述含多糖材料中期间和/或之后进行接触，并且此后将至少一个部分或基团共价与所述多糖结合结构域偶联，从而制造所述具有所需结构特性、化学性能、物理性能、电学性能和/或机械性能的含多糖材料，其中所述的含多糖材料是纸产品、木产品或纺织品。
64.权利要求63的方法，其中所述含多糖结合结构域的组合物包括至少一个另外的多糖结合结构域。
65.权利要求64的方法，其中所述多糖结合结构域与至少一个另外的多糖结合结构域通过接头单位连接。
66.权利要求65的方法，其中所述接头单位包括一个或多个天然分子。
67.权利要求65的方法，其中所述接头单位包括一个或多个合成分子。
68.权利要求67的方法，其中所述合成分子是丙烯酸聚合物。
69.权利要求67的方法，其中所述合成分子是麦谷蛋白。
70.权利要求65的方法，其中所述连接是通过共价键、离子键、疏水键、氢键、蛋白质翻译或蛋白质表达。
71.权利要求65的方法，其中所述接头单位具有多糖组分。
72.权利要求71的方法，其中所述多糖组分是淀粉。
73.权利要求65的方法，其中所述接头单位包括一个或多个多糖结合结构域。
74.权利要求64的方法，其中所述多糖结合结构域是一蛋白质的部分，而所述至少一种另外的多糖结合结构域是另一蛋白质的部分。
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