JP2006517451A - ナノ結晶表面被膜の方法及び材料ならびにその上へのペプチド両親媒性物質ナノ繊維の付着物 - Google Patents
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Abstract
Description
米国政府は、登録番号DEFG02-00ER45810及びDMR0108342(それぞれエネルギー省及び国立科学財団からノースウエスタン大学に)に準じて、この発明の一定の権利を有する。
チタン及びその合金のような金属で形成されるステントは、組織化された内皮細胞の成長を促進させるために設計されている。そのようなステントは、ステント本体の少なくとも一部の表面に、好ましくは、ステント本体の少なくとも内表面に、格子縞波形のような規則的なパターンが配置された複数の凹部を含む。他のステントは、ステント本体に、複数のひだ、リッジ、チャネル又は孔を有する表面特性を有し、少なくとも孔のいくつかは、ステント本体の内部から外側面の間に及んでおり(つまり、ステント本体を貫通している)、組織化された細胞成長を促進するように所定の大きさを有している。
実質的に全ての表面を被覆するように、バイオミネラルで材料表面を被覆することは望ましいかもしれず、その被膜は、化学的改質、ペプチド両親媒性ナノ繊維の付着、細胞及び組織成長及び接着に対して有利な表面を提供する。さらに、被膜は、患者に対して移植片に適した材料を適用することができ、被膜が生理学的条件下で分解し得るのであれば、望ましいであろう。
一つには、本発明の実施形態は、自己組織化ペプチド両親媒性物質が金属のような他の材料へ結合することに指向する。新たに形成された結合は、他の材料へ元の自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維又は球状ミセル集合体を結合させるであろう。適当な自己組織化ナノ繊維又はミセルと第2表面との結合は、さらに、第2表面への細胞又は組織成長を正しい位置に配置するために用いることができる。あるいは、ペプチド両親媒性物質は、表面に結合するかもしれず、成長したペプチド両親媒性ナノ繊維を正しい位置に配置するために用いることができるかも知れず、又はナノ繊維構造の材料表面への自己組織化を開始するために用いることができる。そのような表面は、興味深い材料がステントである場合、組織修復、細胞の移植片への接着及び再狭窄のような症状の最小化に有用であろう。
本発明の実施形態では、プレシード化された基体上の被膜は、カルシウム−金属欠乏(リン酸オクタカルシウム)ミネラル(結晶成長が、ポリアミン、好ましくはミネラル化中に存在するポリ(L−リシン)のようなアミノ酸を含むポリアミンによって阻まれ又は改質されている)からなる。さらに、ポリ(L−リシン)ポリアミノ酸は、密接にミネラル相に組み込まれると考えられている。
一実施形態では、被膜は細胞成長及び細胞接着に有用であり、被膜は、生理学的条件下で分解しやすい。
新たな材料は、チタン上の溶液−相リン酸カルシウム成長の多機能性及び簡便性に、ポリ(L−リシン)の化学的及び生物学的機能性を兼備させる。
従って、本発明の実施形態は、また、移植可能なスカフォールド、外科用デバイス、電極、ステント及び他の基体表面へ被覆された自己組織化ペプチド両親媒性物質を含むことができる。これら表面への被膜を含むペプチド両親媒性物質は、細胞の成長を高めることによって、生体での組織の成長を高めることができる。
他の実施形態では、ペプチド両親媒性物質のペプチド成分は、一旦繊維に組織化されると、これらの繊維は、金属表面又は他のいずれかのタイプの表面を機能化するために、さらなる又はカルバミド結合に関わることができるように、カルボキシで終結されていることが好ましい。
本発明の他の実施形態は、内皮細胞、器官組織及び神経細胞のための移植直後のインビトロ及びインビボ双方での支持構造として、細胞成長に利用することができる、生体分解可能、非毒性自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆表面及びスカフォールドである。
本発明の他の実施形態は、細胞成長用の支持体を与えるが、その表面又はスカフォールドの移植後の成長細胞塊の血管新生を可能にし、かつ高める、生体分解可能な自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆表面及びスカフォールドを形成及び構成する方法である。
本発明の他の実施形態は、細胞の1以上のタイプが成長することができ、又は細胞の基体への成長速度を制御することができるように、化学的に異なる自己組織化ペプチド両親媒性被膜のドメインで表面が被覆された自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維である。
本発明の他の実施形態は、ステントが移植される血管又は他の管腔内での血管形成を促進するために適応される移植可能な自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステントである。
本発明の他の実施形態は、細胞−リッチなインビトロ環境において培養された際又は体管腔(血管のような)内に移植された際、生存細胞の内殖を促進するために適応される移植可能な自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステントである。
本発明の他の実施形態は、細胞が体管腔又は器官に移植された際、組織化された細胞構造への細胞の成長を促進するために設計された生存細胞成長貫通孔及び/又は他の表面外観で占められる、移植可能な自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステントである。
本発明の他の実施形態は、例えば、移植されたステント内で脈管内膜の血管形成又は増殖を阻害又は促進するために選択されたものなど、生存細胞が、被膜ナノ繊維から放出されるように治療用生物活性剤を生成するために遺伝子工学で作られた自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステントである。
一部には、本発明の実施形態の他の観点、特性、利益及び利点は、以下の記載、添付の請求項及びここに伴う図面に関して明らかになるであろう。
また、ここ及び添付の請求項で用いられる単数形「a」「an」及び「the」は、特に明確に断りのない限り、複数を含む。よって、例えば、「細胞」とは、1以上の細胞及び当業者等に公知の等価を示す。
また、繊維及びミセルに自己組織化するトリブロックボラ両親媒性物質が、本発明の実施において有用であるかもしれない。
第2表面は、自己組織化ペプチド両親媒性物質に付着した細胞への栄養物及び成長因子の適当な拡散を可能にするために表面積を最大限にする形状にすべきである。密に圧縮された細胞による適当な拡散は、栄養物及び酸素が血管から周辺組織に拡散する生体内で起こるのと同様の条件下で、約200から300μmの範囲で起こすことができる。
適切な場合、免疫抑制剤を第2表面又はスカフォールド、移植片又は電極の部位に注入することができる。あるいは、免疫抑制剤を、自己組織化ナノ繊維又はミセル被覆スカフォールド又は外科移植片に組み込むことができる。
培地に、欠損したタンパク質生成物を形成する新たな遺伝子を導入する間、細胞を操作することができ又はそれらを細胞表面に抗原発現を抑制するために修飾することができるため、器官機能の損失を処置する他の手段に他の利点を有し、そのため、同じHLA組織型の細胞が有効でない場合に、免疫抑制が必要でない。
また、神経成長は、例えば、適当な神経細胞成長ペプチド配列を含む自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維で被覆された電極又は他の表面によって促進される。繊維長に沿う神経の成長を受けて、構造物は、適当な位置に移植され、神経源から神経機能が望まれる領域に拡張する。
有機添加物を含む被膜材料で被覆された基体を、細胞、組織の成長又は付着のために、あるいは治療用組成物を放出させるために用いてもよい。組織の例は、限定されないが、骨及び象牙質を含んでもよい。被覆基体は、適当な細胞、栄養物及び細胞組織成長用の他の試薬が入ったベッセル中にそれを配置することによって、インビトロで、細胞又は組織を培養するために用いることができる。被覆基体又はその上に細胞の培養物を有するものは、患者の細胞、組織、象牙質又は骨の成長又は培養のための移植後にインビボで用いることができる。基体は、材料中へのポリ(アミノ酸)のような有機添加物の組み込みによって改質された材料で被覆される生体適合材料から形成されるであろう。
市販の純粋なチタン又は二酸化チタンを含むいずれかのチタン合金の表面を超音波で、有機非極性溶媒、有機極性溶媒及び最後に蒸留水中で洗浄する。次いで、洗浄されたチタンを、弱フッ化水素酸、硝酸溶液中でエッチングし、硝酸で再不動化する。不動化されたサンプルを蒸留水で完全にすすぎ、乾燥する。次いで、洗浄され、不動化したサンプルを真空脱水によって脱水し、120℃で保存し、アミノ−シラン化する。乾燥し、不動化した表面を、窒素下、トルエンのような無水疎水性有機溶媒中のアミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)のようなアミノシランの希釈溶液に導入した。アミノ−シラン化されたチタン表面を、次いで、有機非極性溶媒、有機極性溶媒、最後に水で完全にすすぎ、60℃で1時間、窒素下でのアニールする。
プレ組織化ペプチドナノ繊維のチタン表面上のポリ(L−シリン)改質リン酸カルシウム被膜への共有結合。PAナノ繊維の製造。ペプチドナノ繊維を、上記のように組織化、架橋、透析、凍結乾燥及びDMF中で再懸濁した。
リン酸カルシウム被膜の製造。上記のように、チタン箔を洗浄、エッチング、不動体化及び洗浄した。それらを乾燥し、それらをAPTESで処理するよりもむしろ、箔を、CaCl2及びNa2HPO4の溶液中に、少なくとも30分間浸し、リン酸カルシウムで表面をプレシード化する。このプレシード化溶液を、次いで、ポリ(L−リシン、CaCl2及びNa2HPO4)を含む溶液中に、少なくも3時間放置し、サンプルを水ですすぎ、室温で乾燥する。ポリ(L−リシン)が、新たに形成されたリン酸カルシウム被膜の得られたミネラル相に取り込まれ、ポリ(L−リシン)の側鎖からの遊離アミンが組織化された被膜表面に表れたと考えられる。
pLy-OCPの成長手順。チタン表面を、連続的に、有機非極性溶媒、有機極性溶媒及び水で洗浄する。洗浄されたチタン箔を簡単に弱フッ化水素酸、硝酸溶液でエッチングして、表面に存在する酸化物を除去してもよく、表面を不動体化するためにより濃度の高い硝酸溶液で不動体化する。酸処理サンプルを、次いで、蒸留水で完全にすすぎ、2mMのCaC12及び1.2mMのNa2HPO4を含むプレシード溶液中に、少なくとも30分間室温で放置する。さらし時間を長くすること(24時間まで)によって、より良好な適用範囲を得てもよい。プレシーディングの後、サンプルを次いで、1mMのポリ(Lリシン)を添加した2mMのCaCl及び1.2mMのNa2HPO4を含有する新鮮なミネラル化溶液中に放置し、少なくとも3時間室温でインキュベートする。このミネラル化工程を、被膜厚さをかせぐために繰り返してもよい。ミネラル化されたサンプルを蒸留水で完全にすすぎ、室温で乾燥する。
化学試薬を、シグマ−アルドリッチ(セントルイス、MO)から入手した。溶液をFisher Scientific(Hanover Park, IL)から得た。チタン箔をGoodfellow Inc.(Berwyn, PA)から得た。
市販の純粋なチタン(Ti)箔(0.032 mm)を、5×8mmの径の長方形に切断した。各サンプルの一つの角を箔の面に垂直に折り曲げた。次いで、箔を試薬級のジクロロメタン、アセトン及び脱イオン水中でそれぞれ15分間超音波洗浄した。洗浄された箔を、次いで、0.25%のフッ化水素酸(HF)、2.5%の(HNO3)中で1分間エッチングし、表面不動体化のために10分間、40%の硝酸(HNO3)中に放置した。酸処理サンプルを、次いで、脱イオン水で完全にすすいた。洗浄、不動体化されたサンプルを24ウェルの組織培養ポリスチレン(TCPS)ウェルプレートのウェル中に、折り曲げた角を下に向けて載せ、図1に示したように、箔の下側をTCPS表面の上方に有効に浮遊させた。この形状は、チタン基体の下側に見られるいずれの被膜も箔表面に直接成長し、溶液から析出した沈殿物を付着させないようにした。
被膜及び前処理のXPSによる分析を以下の表4に要約する。
無機被膜中の1.31の比は、OCP (1.33)の予測値に適当に一致している。pLyCP被膜の1.14は、カルシウム不足のOCPに一致している。XPSデータも、プレシード・プロセスに関するいくらかの情報を与える。第1に、そのデータは、少量のカルシウム単独では、リン酸が存在しない被膜のないTi表面に吸収されるかもしれないが、一方、リン酸単独では、24時間の値の被膜のないTi表面に顕著に結合しないことを示す。あるいは、CaC12 及びNa2HPO4での表面の予備処理は、わずか10分間で比較的Caリッチのリン酸カルシウム複合体の形成をもたらすが、約1.5から2時間までに、SEMで認識できる結晶形成の指標はない。しかし、2時間までに、図6において認識できる小さい結晶が、金属表面を飾り、リン酸カルシウム比が1.3に降下する。
チタン表面上のこのシード層の形成は、Ti表面にpLy-CPの成功裏の成長をもたらす。以下の表5は、種々のプレシード処理の適用範囲を要約する。
また、pLysCP被膜は、生物学的に関連する分解条件を特に可能にすることが分かった。表6はこれらの観察を要約し、一方、図7は、被膜における分解作用を示すEDSパターンに対応するSEM顕微鏡写真を示す。
EDS分析はCa及びPのピーク強度の実質的な降下を示す。無機シードの残渣、このpHでの安定性のため、ピークは全体的に消失しないからである。pH6.0のわずかに酸性の条件下で、双方の被膜は十分に溶解した。これら基体の顕微鏡写真は、不毛であることを示し、EDSスキャンはカルシウム又はリン酸の証拠を示さない。pH7.4で緩衝されたトリプシン及びプロナーゼの酵素溶液での被膜の処理は、純粋な無機被膜は安定であるが、一方、pLy-CP被膜はこの場合もやはり不安定で、無機プレシード層のみを残し、CaとPとの小さいEDSピークを示した。
この実施例は、ペプチド両親媒性ナノ繊維のチタン表面上のpLy-OCP被膜への化学的な付着を示す。PLy-OCPに対してペプチド両親媒性ナノ繊維は、標準的なアミド結合反応を基礎にしており、予備組織化、架橋ペプチドナノ繊維に適用される。特にペプチドセグメントのC末端近傍でカルボン酸および構造ペプチドセグメントにおいて少なくとも2つのシステインを含む、ペプチド両親媒性分子の希釈溶液(図9及びHartgerinkら、PNAS、vol99、pp51335138、2002及びそのようなペプチドを形成する方法及び材料を参照、全趣旨を参照することによりここに取り込む)は、弱い還元剤(ジリオールスレイトール(DTT)のような)の溶液中に維持され、酸性条件下で自己組織化し、ペプチドナノ繊維を形成する。これらのナノ繊維は、非破壊的な酸化剤(イオジンのような)の添加によって架橋することができ、安定な分子間、繊維内ジスルフィド結合を形成する。これらの繊維の得られた懸濁液を水に対して透析し、全ての還元又は酸化剤(DTT及びイオジンのような)を取り除く。この架橋繊維の透析された懸濁液を、次いで、凍結乾燥し、乾燥繊維を、ペプチド溶解性極性有機溶媒(N,Nジメチルホルムアミド (DMF) 又はNMPのような)中で、強力な攪拌及び超音波によって再懸濁する。繊維の共有架橋は、非水性環境においてそれらを安定にする。
Claims (20)
- 生体適合性基体、
前記基体上のリン酸カルシウム成分及び
前記リン酸カルシウム成分上のナノ組織化されたミネラル相を含み、該ミネラル相はリン酸カルシウム及びポリ(L−リシン)を含むナノ組織化生体適合性複合体。 - ミネラル相のカルシウム含量が、化学量論比未満であり、ポリ(L−リシン)がリン酸カルシウムに組み込まれてなる請求項1の複合体。
- ミネラル相が少なくとも1つの酸及び分解酵素と反応する請求項1の複合体。
- さらに、ポリ)L−リシン)に結合するペプチド両親媒性物質のナノ繊維を含み、該ペプチド両親媒性物質の少なくとも1つがカルボキシル基官能性である請求項1の複合体。
- 少なくとも1つのペプチド両親媒性物質がRGD配列を含む請求項4の複合体。
- さらに、哺乳類の前骨芽細胞培養物を含む請求項4の複合体。
- 基体がチタンを含む請求項1の複合体。
- アミン−改質リン酸カルシウム組成物の成長を促進する方法であって、
生体適合性基体を準備し、
該基体上に実質的に単相のリン酸カルシウム成分を堆積し、
前記基体をリン酸カルシウムメディウムに導入し、該メディウムはポリ(L−リシン)成分を含む方法。 - 基体を反応性カルシウム試薬と反応性リン酸試薬とを含むメディウムに接触させ、接触は基体にリン酸カルシウム成分が堆積するのに十分な時間行う請求項7の方法。
- リン酸カルシウムメディウムが、少なくとも反応性カルシウム試薬及び反応性リン酸試薬を含む請求項8の方法。
- 少なくとも1つの試薬がポリ(L−リシン)成分を含む請求項10の方法。
- 堆積は、結晶リン酸カルシウムの形成を含み、導入によりポリ(L−リシン)をリン酸カルシウム相に組み込む請求項8の方法。
- 導入によりリン酸カルシウムとポリ(L−リシン)とを含むナノ組織化成分を誘導する請求項12の方法。
- 生体適合性基体にペプチド両親媒性物質を結合させる方法であって、
生体適合性基体を準備し、
該基体上に実質的に単相のリン酸カルシウム成分を堆積し、
該リン酸カルシウム相にミネラル相を堆積し、該ミネラル相はリン酸カルシウムとそこに組み込まれたポリ(L−リシン)とを含み、及び
ポリ(L−リシン)をペプチド両親媒性物質に接触させ、少なくとも一つの両親媒性物質はカルボキシル官能基を含む方法。 - ペプチド両親媒性物質はナノ繊維組織を含む請求項14の方法。
- 基体を反応性カルシウム試薬と反応性リン酸試薬とを含むメディウムに接触させ、
接触は基体にリン酸カルシウム成分が堆積するのに十分な時間行う請求項14の方法。 - ミネラル相はカルシウム試薬とリン酸試薬との反応性生物であり、ポリ(L−リシン)の導入は反応中に行われる請求項14の方法。
- さらに、ミネラル相を少なくとも1つの酸と分解酵素とに接触されることを含む請求項14の方法。
- 少なくとも1つのペプチド両親媒性物質がRGD配列を含む請求項14の方法。
- さらに、ペプチド両親媒性物質上に哺乳類の細胞を培養させることを含む請求項14の方法。
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