WO2022230977A1 - 網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬 - Google Patents

網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2022230977A1
WO2022230977A1 PCT/JP2022/019293 JP2022019293W WO2022230977A1 WO 2022230977 A1 WO2022230977 A1 WO 2022230977A1 JP 2022019293 W JP2022019293 W JP 2022019293W WO 2022230977 A1 WO2022230977 A1 WO 2022230977A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
aggregates
string
retinal pigment
pigment epithelial
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/019293
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
政代 高橋
佑治 田中
陽 田中
信行 田中
諭 天谷
光宏 西田
道子 万代
Original Assignee
国立研究開発法人理化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人理化学研究所 filed Critical 国立研究開発法人理化学研究所
Priority to JP2023517622A priority Critical patent/JPWO2022230977A1/ja
Priority to CN202280031558.9A priority patent/CN117597433A/zh
Priority to CA3218400A priority patent/CA3218400A1/en
Priority to AU2022266430A priority patent/AU2022266430A1/en
Priority to EP22795890.7A priority patent/EP4331673A1/en
Publication of WO2022230977A1 publication Critical patent/WO2022230977A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to retinal pigment epithelial cell string-like aggregates, devices and methods for producing the same, and therapeutic agents containing the string-like aggregates.
  • Non-Patent Documents 1, 2 It is difficult to control, and transplanted cells often form an epiretinal membrane (ERM) in the vitreous (Non-Patent Documents 1, 2).
  • RPE sheets allow visual confirmation that the implant sheets have been placed in a targeted and precise manner, but sheet preparation requires time, cost, and large incisions in the sclera and neural retina. Invasive surgical procedures involving Therefore, there is still an unsolved problem of providing a transplant material for retinal pigment epithelial cells that can be prepared in a short time at a low cost, is non-invasive in the method of transplantation, and can be easily controlled at the transplantation site. remained.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a retinal pigment epithelial cell transplantation material that can be prepared in a short time at low cost, is a non-invasive transplantation method, and is easily controllable at the transplantation site; A method of manufacturing an implantable material.
  • [1] String-like aggregates of retinal pigment epithelial cells.
  • [2] The string-like aggregate according to [1] above, characterized in that the ratio of the total length to the outer diameter of the body is 2 to 1,000.
  • [3] The string-like aggregate according to [2] above, which has a circular or elliptical cross-sectional shape.
  • [4] The filamentous aggregate according to any one of [1] to [3] above, wherein the retinal pigment epithelial cells are cells differentiated from pluripotent stem cells.
  • a method for producing a string-like aggregate of retinal pigment epithelial cells comprising the following steps; (1) a step of seeding retinal pigment epithelial cells suspended in a liquid medium into the grooves of the device according to any one of [5] to [7] above; (2) a step of culturing retinal pigment epithelial cells in the groove to form string-like aggregates of retinal pigment epithelial cells; [9] The method of [8] above, wherein the medium contains a ROCK inhibitor.
  • FIG. 1 is a perspective view illustrating the structure of the device of the present invention and a method for producing a string-like aggregate using the same.
  • FIG. 1(a) shows a state in which retinal pigment epithelial cells are seeded together with a liquid medium (not shown) in grooves.
  • FIG. 1(b) shows that seeded retinal pigment epithelial cells have grown into thread-like aggregates within the grooves.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the shapes of grooves and cavity portions.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a preferred embodiment of grooves and cavity portions.
  • FIG. 4 is a schematic diagram for explaining the dimensions of each part of the string-like aggregate, the configuration of the device of the present invention, and the relationship between the string-like aggregate and the device.
  • FIG. 4(a) is a diagram showing a simplified overall shape of the string-like aggregate for explanation.
  • FIG. 4(b) is a diagram showing an example of the dimensional relationship between the string-like aggregates formed in the groove and the groove.
  • FIG. 5 is a diagram showing a preferred embodiment of the device of the present invention.
  • FIG. 5(a) is a perspective view showing the entire device, and FIG. 5(b) shows the device shown in FIG. It is a cross-sectional view when cut in the thickness direction of the device.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a mold for manufacturing the device of the present invention, and also a diagram showing an example of a method for manufacturing the mold.
  • FIG. 6(b) is a perspective view of the die part shown in FIG. 6(a).
  • FIG. 6(d) is a perspective view of the mold shown in FIG. 6(c).
  • FIG. 7 is a cross-sectional view showing an example of the manufacturing process of the device of the present invention, schematically showing how the device is resin-molded using the molds shown in FIGS. 6(c) and (d).
  • shown in 8A and 8B are a photograph showing a mold actually manufactured in the example of the present invention (Fig.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing a method for producing a string-like aggregate according to the present invention.
  • FIG. 9(a) shows retinal pigment epithelial cells seeded in the grooves of the device shown in FIG. 5 (liquid medium is not shown), and FIG. It schematically shows how the string-like aggregate is taken out from the groove.
  • FIG. 10 shows the measurement results of the PDMS groove structure.
  • B Photograph of a PDMS-based culture device for groove structure measurement with five grooves of 19.5 mm length, 1 mm width, and 1.6 mm depth.
  • C Measurement image of the bottom of the groove with a laser microscope.
  • D Measured groove shape of a PDMS-based culture device. The average value of each measurement item is 0.21 mm for bottom curvature radius, 1.16 mm for groove width, and 1.60 mm for groove depth.
  • FIG. 11 shows that stranded aggregates restored some of the function as they replaced damaged RPE-deficient regions.
  • A Experimental schedule for in vitro disease models and transplantation.
  • the pathological RPE degeneration/damage situation was mimicked by treating RPE cells with MMC, creating wounds, and then depleting either hiPSC-RPE cell suspensions or ligamentous aggregates (201B7modFucci strain).
  • the transplantation process was mimicked in vitro by plating on areas.
  • B Expansion of plated hiRPE cells on RPE-deficient regions was monitored by mCherry expression by cells in the G0-G1 cell cycle of the 201B7-Fucci hiPSC line. Dotted lines indicate the initially injured area and the missing area in the control wells.
  • B' Panel shows RPE-deficient areas after scratching and refilling areas by RPE cell expansion from RPE cell suspensions or ligamentous aggregates.
  • C RPE cells expanded from stranded aggregates appeared to stop expanding upon contact with resident RPE with increased expression of mCherry along the border.
  • D The boundary between pre-existing MMC-treated RPE and freshly plated RPE was rationally distinguished by mCherry expression and RPE cell size (arrows). MMC-treated RPE was generally larger than RPE expanded from ligamentous aggregates. ZO-1 expression was observed between cells within each population of resident MMC-treated and freshly plated/expanded RPE cells, and also between cells at the border.
  • FIG. 12 shows optimization of ligamentous aggregate formation.
  • FIG. 13 shows the effect of starting cell number and Y-27632 concentration on ligamentous aggregate formation.
  • A Appearance of day 4 string-like aggregates formed by 150000 or 450000 RPE cells placed on a dish and photographed the next day and 14 days later. RPE cells expanded from each strand-like aggregate, and strand-like aggregates formed with 15,000 cells lost their shape after 14 days, whereas strand-like aggregates formed with 450,000 cells retained their initial shape. was maintained.
  • A' Fragmented stringy aggregates lost most of their initial shape after cell expansion.
  • B Appearance of stringy aggregates 2 days after seeding with RPE (2 ⁇ 10 5 ).
  • C Cross section of ligamentous aggregates formed with either 10 ⁇ M or 2.5 ⁇ M Y-27632. Expression of ezrin and laminin is fragmented, but ZO-1 is expressed intercellularly and apical-basal polarity is not differentiated.
  • Right panel shows control staining of RPE sheets.
  • D,E,F,G Twisted aggregates formed with 2.5 ⁇ M Y-27632 adhered better to the plate and covered more area than those formed with 10 ⁇ M Y-27632.
  • FIG. 14 shows optimization of Y-27632 concentration for ligamentous aggregate formation.
  • A String aggregate formation under different Y-27632 concentrations.
  • B Day 2 stringy aggregates (M8 strain) were plated in 24-well plates to monitor expansion of coverage by hiPSC-RPE cells. Twisted aggregates spiked with 2-2.5 ⁇ M Y-27632 were the most adherent to the plate and tended to adhere flat when placed on the wells.
  • D Day 2 stringy aggregates (201B7modFucci strain) were placed in 24-well plates and monitored for expansion of the area covered by hiPSC-RPE cells. Twisted aggregates spiked with 2-2.5 ⁇ M Y-27632 were consistently adherent to the plate and tended to adhere flat when placed over the wells.
  • Figure 15-1 shows the reproducibility of stringy aggregate formation using different hiPSC lines (M8 and 201B7modFucciL).
  • A Different hiPSC lines were used to similarly form stranded aggregates, but optimization of Y-27632 was required for each line.
  • the 201B7modFucci strain required 5 ⁇ M Y-27632 to stably form stranded aggregates.
  • B Twisted aggregates formed by each of the M8 and 201B7 modFucci strains adhered to the plate, were well expanded, and exhibited the characteristic cobblestone appearance and pigmentation of RPE.
  • C RPE cells expanded from stranded aggregates expressed tight junction marker ZO-1 and RPE marker MiTF.
  • FIG. 16 shows string aggregate implantation in nude rats.
  • E Implanted RPE showed well orientation as indicated by the polar markers human-specific ezrin and collagen type IV. Scale bar, 50 ⁇ m (B) 20 ⁇ m (E).
  • Figure 17 shows ligamentous aggregates loaded into a 24G intravenous cannula.
  • Figure 18 shows the implantation of ligamentous aggregates into two rabbit eyes.
  • FIG. 19 shows a COP trench structure.
  • FIG. 20 is a photograph showing the moment when a string-like aggregate suspended in a medium consisting of a viscoelastic substance diluted 4- to 7-fold with OptiMEM is aspirated with a cannula. Bar; 1mm Figure 21 shows the implantation of ligamentous aggregates into monkey eyes.
  • the present invention provides a retinal pigment epithelial cell string-like aggregate (hereinafter referred to as a string-like aggregate of the present invention).
  • retinal pigment epithelial cells refer to epithelial cells that constitute the retinal pigment epithelium and their progenitor cells. Whether the cells are retinal pigment epithelial cells is determined, for example, by the expression of cell markers (RPE65, CRALBP, MERTK, BEST1, etc.), cell morphology (melanin pigmentation in cells, polygonal flattened epithelial-like cell morphology, polymorphism, etc.). It can be confirmed by the formation of square actin bundles, etc.).
  • the progenitor cells of retinal pigment epithelial cells mean cells directed to differentiate into retinal cells.
  • Pax6 pigment epithelial progenitor cells
  • Rx retina progenitor cells
  • OTX2 retina progenitor cells
  • RPE65 retinal progenitor cells
  • BEST1 retinal pigment epithelial cells
  • functional evaluation of retinal pigment epithelial cells can be confirmed using, for example, cytokine (VEGF, PEDF, etc.) secretion ability, phagocytosis ability, and the like as indicators.
  • cytokine VEGF, PEDF, etc.
  • RPE cells can be obtained from any animal (e.g., human) that possesses RPE cells, or can be obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells by a method known per se. Cells that have been induced to differentiate from pluripotent stem cells are more preferred in that more appropriate cell supply is possible. Pluripotent stem cells are not particularly limited as long as they are stem cells that have pluripotency capable of differentiating into all cells existing in a living body and also have proliferative potential.
  • embryonic stem cells ES cells
  • embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer
  • ntES cells spermatogonial stem cells
  • GS cells embryonic germ cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Muse cells pluripotent cells derived from bone marrow stem cells.
  • Preferred pluripotent stem cells are iPS cells.
  • the origin of the pluripotent stem cells is not particularly limited. Humans are preferred.
  • iPS cells can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein, and have almost the same characteristics as ES cells, such as pluripotency and self-renewal proliferation ability, (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006), Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);
  • somatic cell refers to any animal cell (preferably mammalian cells including humans) excluding germ line cells or totipotent cells such as eggs and oocytes.
  • Somatic cells include, but are not limited to, both fetal somatic cells, neonatal somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells, passaged cells, and Any cell line is included.
  • somatic cells include, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, dental pulp stem cells, (2) tissue progenitor cells, (3) lymphocytes, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, enterocytes, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells and differentiated cells such as adipocytes.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, dental pulp stem cells
  • tissue progenitor cells such as lymphocytes, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, enterocytes, splen
  • a reprogramming factor is a gene, its gene product or non-coding RNA that is specifically expressed in ES cells, or a gene, its gene product or non-coding RNA that plays an important role in maintaining undifferentiated ES cells, or It may be composed of a low-molecular-weight compound.
  • Genes involved in reprogramming factors include, for example, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc., and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • Combinations of initialization factors include WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/091659 101407 ⁇ WO2009/102983 ⁇ WO2009/114949 ⁇ WO2009/117439 ⁇ WO2009/126250 ⁇ WO2009/126251 ⁇ WO2009/126655 ⁇ WO2009/157593 ⁇ WO2010/009015 ⁇ WO2010/033906 ⁇ WO2010/033920 ⁇ WO2010/042800 ⁇ WO2010/050626 ⁇ WO2010/056831 ⁇ WO2010/068955 ⁇ WO2010/098419 ⁇ WO2010/102267 ⁇ WO2010/111409 ⁇ WO2010/111422 ⁇ WO2010/115050 ⁇ WO2010/124290 ⁇ WO2010/147395 ⁇ WO2010/147612 ⁇ Huangfu D, et al.
  • iPS cells into RPE cells can be induced (for example, Neurosci. Lett., 458: 126-131, 2009; PLoS One, 8: 409-412, 2011).
  • the methods described in WO2015/053375, WO2015/053376, WO2015/125941, WO2017/043605, etc. can also be used.
  • the string-like aggregates of the present invention are formed by adhesion between RPE cells.
  • adhesion between cells means surface adhesion between RPE cells in the string-like aggregates of the present invention.
  • Cell-to-cell plane attachment refers to cell-to-cell adhesion on a plane. More specifically, cell-to-cell surface adhesion means that the proportion of the surface area of a cell that is adhered to the surface of another cell is, for example, 1% or more, preferably 3% or more, and more preferably 5%. It means that it is more than Cell surfaces can be observed by staining with a membrane staining reagent (eg, DiI) or by immunostaining with cell adhesion factors (eg, E-cadherin and N-cadherin).
  • a membrane staining reagent eg, DiI
  • cell adhesion factors eg, E-cadherin and N-cadherin.
  • the present invention also provides a device for producing string-like aggregates of retinal pigment epithelial cells (hereinafter referred to as the device of the present invention or the device).
  • the device of the present invention has a base member 110 which is the body portion of the device.
  • One or more grooves 120 are provided in the upper surface 110a of the base member 110 .
  • FIG. 1 for the sake of explanation, only one groove is depicted, but in a preferred embodiment, as will be described later, a plurality of grooves are arranged adjacent to each other, and grooves are arranged adjacent to each other.
  • the cross-sectional shape of the groove is V-shaped so that there is no upper surface (flat surface) between the .
  • the groove 120 has a cavity portion with a length of the aggregate strand to be formed and a width corresponding to the outer diameter of the aggregate strand.
  • the bottom portion of groove 120 is the cavity portion.
  • the cavity portion is a concave mold that allows retinal pigment epithelial cells seeded within the cavity portion to grow into ligamentous aggregates.
  • string-like aggregates A1 having a shape corresponding to the length and width of the cavity portion are obtained.
  • the string-like aggregate obtained by the device has a smoothly molded body surface (the lower surface of the string-like aggregate A1 in FIG. (the upper surface of the string-like aggregate A1 in FIG. 1(b)).
  • the overall shape and size of the base member is not particularly limited, and any shape or size that has an upper surface capable of forming one or more cavity portions capable of forming agglomerate strands to be produced is available.
  • a plate-like shape is exemplified as a preferable shape because it does not occupy a wasteful space, is easy to manufacture, and is easy to handle when manufacturing aggregates.
  • the overall shape of the base member 110 is disc-shaped.
  • the outer peripheral shape is not limited to a circle (that is, disc-shaped), and may be a square, a rectangle, or the like.
  • a disk shape is preferable in that it can be placed in a commercially available petri dish, which is generally circular, without causing dead space.
  • Portions may be provided in integral molding or by attachment of separate parts.
  • the entire groove 120 may be the cavity portion as shown in FIG. 2(a), or the bottom of the groove 120 may be the cavity portion 121 as shown in FIGS. 2(b), (c) and (d). There may be a structure with an upper portion 122 above the cavity portion. In the embodiment shown in FIG. 2(a), the string-like aggregates may protrude from the opening of the groove and swell.
  • the cavity portion 121 and the upper portion 122 may be formed integrally with each other as shown in the examples of these figures, or may be separated into upper and lower parts (separately separated parts) as shown in FIGS. may be a combination of the parts of
  • the embodiment of FIG. 2(e) is a modification of the embodiment of FIG. 2(d), but the cavity part and the upper part in various grooves such as FIG. 2(b) and (c) may be made separable.
  • the boundary surface of separation does not necessarily have to match the boundary surface between the cavity portion and the upper portion. good.
  • FIG. 3 is a diagram showing a specific embodiment of a device for making the cavity part and the upper part separable.
  • the base portion 110 comprises a first base portion 111 and a second base portion 112 disposed thereon, as shown in the assembled state in FIG. 3(a). .
  • the second base portion 112 is detachable from the first base portion 111, as shown separately in FIG. 3(b).
  • the first base portion 111 is provided with the cavity portion 121 of the groove 120 and the second base portion 112 is provided with the upper portion 122 of the groove 120 .
  • first base portion 111 and the second base portion 112 have a predetermined positional relationship (that is, one cavity portion 121 and one upper portion 122 are Positioning structures are preferably provided so that they are connected in a positional relationship forming one groove 120 .
  • a positioning structure is not particularly limited. A positioning structure can be employed as appropriate.
  • the materials of each part may be different from each other.
  • the first base portion 111 provided with a cavity has biocompatibility (GCP: Good Clinical Practice compatible) that allows the string-like aggregates to grow preferably, and the string-like aggregates can be easily removed from the cavity. It is preferable to use a material to which cells are unlikely to adhere so that they can be peeled off and taken out (such a material may also be used for the second base portion 112).
  • both the first base portion 111 and the second base portion 112 are made of materials that can be sterilized (e.g., heat resistant for autoclave heating, radiation resistant for gamma irradiation, EOG sterilization compatible). It is preferable to use a material that is inexpensive and easy to process.
  • the term “string-like aggregates” refers to aggregates in which RPE cells are randomly aggregated to form a string-like shape, and have clear apical and basal polarities like the retinal pigment epithelium in vivo. It does not have to be held, and there is no particular limitation as long as the aggregate is strong enough to allow the desired number of cells to be efficiently put in and taken out as a mass with a needle or a tube-like tip for transplantation during transplantation.
  • the "string-like" of the string-like aggregates means an elongated shape that clearly has a longitudinal direction compared to the shapes seen in known cell aggregates and cell sheets, i.e., in a certain direction. It has an elongated shape. As shown as a model for explanation in FIG. , 2 or more, more preferably 5 or more, still more preferably 10 or more, even more preferably 20 or more, and particularly preferably 50 or more. If the shape has the ratio (L1/d1) as described above, especially the lower limit ratio of 2, the direction (that is, the longitudinal direction as a string-like aggregate) can be defined rather than a mere cell mass.
  • the string-like aggregate has the above-mentioned ratio, it can be conveyed as one elongated structure by passing through the inside of the syringe needle.
  • the effect of efficiently transporting and arranging cells can be obtained more remarkably, and it is possible to pass through narrow parts (for example, minute through holes, etc.) that are difficult for known cell sheets to pass through. Therefore, the effect of being able to suppress the invasiveness to the living body can be obtained more remarkably.
  • the ratio (L1/d1) is below the lower limit of 2, the above effect is not significant.
  • the upper limit of the ratio (L1/d1) is not particularly limited, and for example, even if the total length L1 is longer than the area of the target site to which the string-like aggregate is to be transplanted, it may be appropriately cut.
  • the ratio (L1/ The upper limit of d1) is about 1000, more preferably about 200, particularly preferably about 100.
  • the ratio (L1/d1) in the string-like aggregates obtained by the devices fabricated in the examples of the present invention was about 2-100.
  • the lower limit of the ratio is the minimum value required for the aggregate to be in the form of a "string", but the upper limit of the ratio is not particularly limited, The upper limit of the ratio can be appropriately determined according to the range of the diameter d1, the time required for cutting into lengths suitable for cell transplantation, and the like.
  • Outer diameter d1 of body of string-like aggregate When a string-like aggregate is produced using the device, the cross-sectional shape of the string-like aggregate (the shape of the cross section when the string-like aggregate is cut perpendicular to its longitudinal direction) is as shown in FIG. ) to (d), the lower part during culture has a shape along the cavity part, and the upper part has a freely proliferating shape. Therefore, the outer diameter d1 of the body of the string-like aggregate is indeterminate depending on the direction of measurement.
  • Such an outer diameter d1 may be an average value of outer diameter values measured in a plurality of directions, but as illustrated in FIG. It is possible to observe the state together with the device (that is, observe the inside of the groove from above in FIG.
  • the cross-sectional shape of the string-like aggregates is not particularly limited, and is usually irregular, but the distance from the tissue surface to the inside of the tissue should be constant from the viewpoint of the supply of nutrients and oxygen and the discharge of waste products. is desirable, it is possible to pass through a narrow part such as a syringe needle more smoothly, and it is advantageous for cell growth and detachment if the cross-sectional shape of the cavity portion of the groove is more smoothly curved. For these reasons, a shape close to a circle or an ellipse is preferable.
  • the length of the string-like aggregate is not limited, and if it is excessively long, it may be appropriately cut when applied to a living body.
  • Preferred dimensions for application to a living body include, for example, a total length L1 of about 20 ⁇ m to 200 mm, preferably about 20 ⁇ m to 40 mm, more preferably about 1 mm to 40 mm, even more preferably about 5 mm to 40 mm.
  • An example of a length suitable for the length of the gauge needle is about 10 mm to 20 mm.
  • total length L1 are not the most preferred range or value, and are not intended to be the size of the device, allowable groove length, number of cells required, ducts of instruments for transplantation ( For example, a preferable range or value can be appropriately selected according to the length of the injection needle.
  • the outer diameter d1 is about 10 ⁇ m (outer diameter corresponding to about one cell) to about 300 ⁇ m (outer diameter corresponding to the inner diameter of a 24-gauge needle), preferably about 20 ⁇ m to 300 ⁇ m, more preferably 100 ⁇ m or more. About 250 ⁇ m can be mentioned.
  • outer diameter d1 are also not intended to have only one most preferred range or value, but may vary depending on the size of the device, the allowable internal diameter of the groove cavity, the number of cells required, and the size of the instrument for implantation.
  • a preferable range and value can be appropriately selected according to the inner diameter of the duct (for example, injection needle).
  • the inner diameter of the injection needle used is preferably about 10 to 300 ⁇ m.
  • the outer diameter d1 of the string-like aggregate that can preferably move inside the injection needle is, for example, 80 to 95%, preferably about 90%, of the inner diameter of the injection needle. Therefore, in such a case, the outer diameter d1 of the string-like aggregate is exemplified as a preferable size range of about 100 ⁇ m to 270 ⁇ m.
  • the preferred length L1 of the string-like aggregate is about 20 ⁇ m to 200 mm, preferably about 20 ⁇ m to 40 mm, from the viewpoint of being effective for transplantation and suitable for the length of the injection needle. More preferably, it is about 1 mm to 40 mm, more preferably about 5 mm to 40 mm, and an example of a length suitable for the length of a 24 gauge needle is about 10 mm to 20 mm. Therefore, a preferred ratio (L1/d1) when sending the string-like aggregates with an injection needle is 40 to 200, preferably about 80 is exemplified. Also, the number of cells at that time is exemplified as about 1.5 ⁇ 10 5 to 4.5 ⁇ 10 5 .
  • the string-like aggregate of the present invention can be characterized by the ratio (L1/d1) between the overall length L1 and the outer diameter d1 of the trunk. Therefore, the string-like aggregate of the present invention may have a feature that the ratio (L1/d1) between the total length L1 and the outer diameter d1 of the body is 2 to 1,000.
  • L1/d1 may be usually 2 to 1,000, but 5 to 1,000, 10 to 1,000, 20 to 1,000, 50 to 1,000, 10 to 200, 20 to 200, 50-200, 2-100, 5-100, 10-100, 20-100, or 50-100.
  • the string-like aggregates of the present invention can be further characterized by their cross-sectional shape.
  • the cross-sectional shape of the string-like aggregates is not particularly limited, and is usually irregular, but a shape close to a circle or an ellipse is preferable. Accordingly, the cord-like aggregates of the present invention may further have the characteristic of being circular or elliptical in cross-sectional shape.
  • the cavity portion within the groove of the device preferably has a cross-sectional shape and length corresponding to the shape of the string-like aggregates described above.
  • the cross-sectional shape of the cavity portion is the shape of the cross section when the cavity portion is cut perpendicularly to the longitudinal direction of the groove.
  • the cross-sectional shape of the cavity portion can be determined as appropriate in further consideration of cell culture properties, releasability, and the like. , U-shape, V-shape, and the like.
  • the bent portion (corner) of the above-mentioned rectangle or V shape facilitates the operation of taking out the string-like aggregate using tweezers or a syringe needle
  • the cross-sectional shape of the string-like aggregate is a shape close to a circle. It is preferable to be rounded because it is more preferable to
  • the radius of curvature of the rounded corners is not particularly limited, but a preferable value is about half the outer diameter d1 of the string-like aggregate (for example, a radius of about 5 ⁇ m to 150 ⁇ m).
  • the width W1 of the cavity portion shown in FIG. 4(b) is preferably the same as the outer diameter d1 of the string-like aggregate.
  • the groove has a cavity portion 121 at its bottom and an upper portion 122 above the cavity portion.
  • the cross-sectional shape of is such that the width widens from the bottom side toward the opening side.
  • the cross-sectional shape of the entire groove is V-shaped, and the deepest portion thereof is rounded as the cavity portion described above. With such a V-shaped cross-sectional shape, the cells seeded in a suspension state are guided into the cavity portion at the bottom, which facilitates the seeding operation. Aggregates come out more easily, making it easier to take them out.
  • the depth of the entire groove (B1 shown in FIG. 4(b)) is not particularly limited, but is preferably about 5 to 5000 ⁇ m (dimension about 5 mm shorter than the depth of a general Petri dish), more about 5 to 1600 ⁇ m. preferable.
  • the depth of the cavity portion (dimension b1 shown in FIG. 4(b)) is preferably about 5 to 300 ⁇ m, more preferably about 5 to 250 ⁇ m, as a dimension corresponding to the outer diameter d1 of the string-like aggregates to be formed. .
  • the inclination angle of the inner wall is preferably about 1 to 90 degrees, and about 40 to 70 degrees. more preferred.
  • the cross-sectional shape of the entire groove can be appropriately determined according to the amount of cell suspension required for culture, etc., the number of cells, the size of the container to be accommodated, and the like.
  • the groove length is preferably the same as the length of the stringy aggregates to be formed, but may be longer.
  • the upper portion of the cross-sectional shape of the groove may be a straight line as shown in FIG. 4(b), or as shown in FIG. 5(b), the width increases from the bottom toward the opening. It may be a curved curve. Such a curve can also be interpreted as a straight V-shaped opening with rounded edges as shown in FIG. 4(b).
  • a plurality of (five in the example shown) grooves 120 are arranged in parallel stripes on the upper surface 110a of the base member 110.
  • the number of grooves is not particularly limited, and may be appropriately determined together with the size of the base member according to the scale of production, from experimental use to commercial use.
  • the upper portion of the cross-sectional shape of the groove 120 is a curved line that widens from the bottom side toward the opening side, and the upper surface of the base member. or adjacent openings are smoothly connected.
  • boundary lines between adjacent grooves and boundary lines 130 between grooves and the upper surface 110a of the base member 110 are represented by dashed lines for easy understanding.
  • the culture may be performed by injecting the culture solution and cells only into the grooves, or the entire device may be immersed in the culture solution and the cells may be seeded and cultured. .
  • the entire device is immersed in a culture solution and then cells are seeded, it is less likely that the seeded cells will accumulate on the plane between the grooves, and more cells will fall into the grooves, which is preferable.
  • the material of the base member (that is, the material of the device) is not particularly limited, and is preferably a material that is suitable for cell culture, such as metal or polymer, and is inexpensive and easy to manufacture.
  • Glass and various polymer materials eg, polystyrene, polycarbonate, acrylic, silicone, cycloolefin polymer (COP: Cyclo Olefin Polymer), etc.
  • COP Cyclo Olefin Polymer
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the manufacturing method of the device may be appropriately determined according to the material, and includes plastic deformation by pressing, resin molding using a mold, cutting, 3D printing, subtractive groove formation on the upper surface of the base member, and the upper surface of the base member.
  • plastic deformation by pressing, resin molding using a mold, cutting, 3D printing, subtractive groove formation on the upper surface of the base member, and the upper surface of the base member may be appropriately determined according to the material, and includes plastic deformation by pressing, resin molding using a mold, cutting, 3D printing, subtractive groove formation on the upper surface of the base member, and the upper surface of the base member.
  • Various methods such as additive grooving, laser processing, etc. are available.
  • the material of the base member is PDMS
  • a mold having a convex mold corresponding to the shape of the groove is used, and PDMS having fluidity before curing is poured into the mold (or brought into contact with the convex mold). ) and curing the PDMS in that state to obtain a molded article (the device).
  • PDMS is cured by heating at 80° C. for about 3 hours to become PDMS.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a preferred manufacturing method of the mold.
  • projections 220 serving as convex-shaped cores corresponding to the shape of the grooves are formed on one surface 210a of the mold substrate 210. , is formed according to the center-to-center pitch of the grooves.
  • FIGS. 6(a) and 6(b) projections 220 serving as convex-shaped cores corresponding to the shape of the grooves are formed on one surface 210a of the mold substrate 210. , is formed according to the center-to-center pitch of the grooves.
  • a polymer raw material for example, PDMS
  • PDMS polymer raw material having fluidity before curing
  • a V-shaped convex mold 240 is obtained.
  • the cross-sectional shape of the coating layer 230 is shaped as shown in FIG.
  • a V-shaped convex shape corresponding to the shape of the groove is formed.
  • the parts (the mold substrate 210 having the protrusions 220) shown in FIGS. ), a mold 200 having a V-shaped convex mold 240 as shown in FIG.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view illustrating how the device is molded using the mold described above.
  • a molding die 200 is placed on the bottom of a molding container (not shown), or the molding die 200 is surrounded by a wall member to form a molding container.
  • a polymer raw material having fluidity before curing is poured therein, and the polymer raw material is cured in that state to obtain a molded product (the device) 100 .
  • the molded product is released from the mold 200 to obtain the device 100.
  • FIG. FIG. 8(a) is a photographic view showing the substrate surface of the mold manufactured in the example of the present invention.
  • FIG. 8(b) is a photographic view showing the substrate surface of the mold manufactured in the embodiment of the present invention, which is molded using the mold shown in FIG. 8(a).
  • a protrusion 220 is provided on the surface.
  • the present invention also provides a method for producing retinal pigment epithelial cells aggregated in a string-like form (hereinafter referred to as the production method of the present invention).
  • the production method of the present invention includes the following steps. (1) Seeding retinal pigment epithelial cells a1 suspended in a liquid medium in grooves 120 of device 100 of the present invention, as illustrated in FIG. 9(a). (2) As illustrated in FIG. 9(a), a step of culturing retinal pigment epithelial cells a1 to form retinal pigment epithelial cell string-like aggregates A1 (in the figure, one string-like aggregate is separated from the groove (shown as being removed).
  • step (1) retinal pigment epithelial cells suspended in a medium are seeded into the grooves of the device of the present invention.
  • the liquid medium in which the retinal pigment epithelial cells are suspended in step (1) can be prepared using a medium commonly used for culturing animal cells as a basal medium.
  • basal media include BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 Medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, or a mixed medium thereof can be used for culturing animal cells.
  • the medium used in culture may be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • a serum-containing medium as used herein means a medium containing unadjusted or unpurified serum.
  • the serum concentration of the serum-containing medium includes media containing unadjusted or unpurified serum, usually 5% or less, preferably 3% or less.
  • the medium contains fatty acids or lipids, amino acids (e.g., non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, 1-monothioglycerol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc. You may
  • a serum-free medium as used herein means a medium that does not contain unadjusted or unpurified serum.
  • media containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components are also included in serum-free media as long as they do not contain unadjusted or unpurified serum.
  • Serum-free media may contain serum replacement.
  • serum substitutes include those containing albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, or equivalents thereof as appropriate.
  • serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO98/30679. A commercially available product may be used as a serum substitute.
  • Such commercially available serum substitutes include, for example, Knockout TM Serum Replacement (manufactured by Life Technologies; currently ThermoFisher; hereinafter sometimes referred to as KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Life Technologies), Glutamax TM ( Life Technologies), B27 (manufactured by Life Technologies), N2 supplement (manufactured by Life Technologies), and ITS supplement (manufactured by Life Technologies).
  • KSR Knockout TM Serum Replacement
  • Chemically-defined Lipid concentrated manufactured by Life Technologies
  • Glutamax TM Life Technologies
  • B27 manufactured by Life Technologies
  • N2 supplement manufactured by Life Technologies
  • ITS supplement manufactured by Life Technologies
  • the serum-free medium used for culture appropriately contains fatty acids or lipids, amino acids (e.g., non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc. may contain.
  • amino acids e.g., non-essential amino acids
  • vitamins e.g., growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc.
  • the medium in which the retinal pigment epithelial cells are suspended in step (1) may further contain a ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor is not limited as long as it inhibits the action of Rho kinase (ROCK).
  • Rho kinase (ROCK) was found as a serine/threonine kinase located downstream of the small G-protein Rho.
  • the Rho/ROCK signaling pathway is involved in various cellular functions such as the actin cytoskeleton and cell adhesion. In the subculture of iPS cells, it is necessary to disperse the cells, and it is known that these stem cells undergo cell death due to apoptosis when cultured in a dispersed state.
  • Rho/ROCK signaling pathway is involved in apoptosis caused by dispersion, and the addition of ROCK inhibitors suppresses apoptosis (apoptosis inhibitory effect). Furthermore, it has been reported that addition of a ROCK inhibitor during cryopreservation of cells increases cell viability after thawing (cell viability improving effect). Based on these reports, ROCK inhibitors have been added during iPS cell growth culture.
  • regenerative medicine products usually use a basal medium such as a balanced salt solution or DMEM/F12 medium and do not contain exogenous components.
  • the string-like aggregates when the string-like aggregates are produced using a ROCK inhibitor at an appropriate concentration, the string-like aggregates become more stable, and the transplantation of the RPE cell string-like aggregates becomes more stable. It was found that it has a new action of promoting engraftment and cell growth in the body.
  • the ROCK inhibitor may be any molecule as long as it has the same or substantially the same action as the newly discovered action (promoting action for formation of a string-like aggregate). "Substantially homogeneous” indicates that their actions are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same. Therefore, it is preferable that the above effects are equivalent, but the degree of these effects (eg, about 0.1 to about 10 times, preferably about 0.5 to about 2 times) may be different.
  • the action can be measured according to a method known per se.
  • ROCK inhibitors include, for example, Y-27632 dihydrochloride, Y-27632, Fasudil Hydrochloride, Chroman 1, SLx-2119, HSD1590, GSK269962A hydrochloride, Exoenzyme C3, clostridium botulinum, Ripasudil, Afuresertib, Thiazovivin, GSK269962A, RKI -1447, Y-33075, GSK429286A, AT13148, H-1152 dihydrochloride, Y-33075 dihydrochloride, LX7101, SAR407899, ROCK-IN-2, Afuresertib hydrochloride, Hydroxyfasudil, GSK180736A, BDP5290, SR-3677, CCG-22010, D1010, D1014 Rho-Kinase-IN-1, SAR407899 hydrochloride, ROCK inhibitor-2, ZINC00881524, H-1152, Hydroxy
  • a ROCK inhibitor can be produced by a method known per se. Moreover, a ROCK inhibitor can also be used by purchasing a commercially available product.
  • Y-27632 can be purchased from Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and the like.
  • Ripasudil is commercially available under trade names such as Glanatec (registered trademark) (Kowa) and Fasudil Hydrochloride under trade names such as Eryl (registered trademark) (Asahi Kasei Pharma).
  • the concentration of the ROCK inhibitor contained in the medium is not particularly limited as long as it allows RPE cells to form string-like aggregates in the grooves of the device of the present invention, but it is usually 0 ⁇ M to 20 ⁇ M, preferably 2 ⁇ M to 10 ⁇ M. If the concentration of the ROCK inhibitor is too high, the aggregates of the present invention aggregate too hard, which may affect the spreading of cells after transplantation.
  • step (2) the retinal pigment epithelial cells seeded in step (1) are cultured.
  • the density of the retinal pigment epithelial cells cultured in the grooves is not particularly limited as long as the retinal pigment epithelial cells form string-like aggregates in the grooves of the device of the present invention, but is usually 2.5 ⁇ 10 3 . cells/mL or more, preferably 2.5 ⁇ 10 3 cells/mL to 5 ⁇ 10 5 cells/mL, more preferably 1 ⁇ 10 5 cells/mL to 2 ⁇ 10 5 cells/mL. If the density of cells in the groove is higher than this, the outer diameter of the trunk of the formed string-like aggregates will increase, and the cells will not spread after transplantation, and the transplanted cells will form multi-layers at the surgical site. There are concerns such as
  • the culturing time of the retinal pigment epithelial cells in step (2) is not particularly limited as long as retinal pigment epithelial cell string-like aggregates are obtained in step (2), but usually 1 to 30 days, preferably 2 days. ⁇ 7 days. Whether the culture period is longer or shorter than this, there is a concern that the aggregates of the present invention will be released from the device of the present invention during medium exchange.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (2) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30°C to about 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • the string-like aggregates of retinal pigment epithelial cells of the present invention obtained as described above can be used to treat diseases caused by damage to retinal tissue, for example, diseases caused by damage to retinal pigment epithelium. Useful for transplant medicine. Accordingly, the present invention provides a therapeutic agent for diseases based on retinal pigment epithelial disorders, including retinal pigment epithelial cell string-like aggregates (therapeutic agent of the present invention).
  • the therapeutic agent of the present invention comprises an effective amount of string-like aggregates of retinal pigment epithelial cells and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • String-like aggregates of retinal pigment epithelial cells contained in the therapeutic agent of the present invention include those produced by the production method of the present invention.
  • a physiological aqueous solvent can be used as a pharmaceutically acceptable carrier. If necessary, in transplantation medicine, the medicine containing the tissue or cells to be transplanted may be blended with commonly used preservatives, stabilizers, reducing agents, tonicity agents, and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention can be produced as a suspension by suspending string-like aggregates of retinal pigment epithelial cells in an appropriate physiological aqueous solvent. If necessary, a cryopreservative may be added, cryopreserved, thawed before use, washed with buffer, and used for transplantation medicine.
  • the string-like aggregate of retinal pigment epithelial cells of the present invention can be used as a therapeutic drug for diseases based on retinal pigment epithelial damage, or to replenish the relevant atrophy/damage site in a state of retinal pigment epithelium atrophy or damage. can be used. Replenishing the retinal pigment epithelium by transplanting the retinal pigment epithelial cell string-like aggregates of the present invention to patients with diseases based on damage to the retinal pigment epithelium or conditions of retinal pigment epithelium atrophy or damage that require transplantation. Thus, diseases based on disorders of the retinal pigment epithelium, or conditions of atrophy or damage to the retinal pigment epithelium can be treated.
  • diseases based on disorders of the retinal pigment epithelium and diseases accompanied by atrophy or damage of the retinal pigment epithelium include ophthalmic diseases such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and retinal pigment epithelium tears.
  • the content of the string-like aggregates of retinal pigment epithelial cells in the therapeutic agent of the present invention is determined by the suspension injected into the disease site, that is, the defect site of the retinal pigment epithelium in macular degeneration or retinitis pigmentosa (for example, 50 ⁇ 500 ⁇ L, preferably 100-300 ⁇ L) is not particularly limited as long as a therapeutically effective amount of retinal pigment epithelial cell string-like aggregates containing RPE cells is contained, for example, RPE cells are 100 to 20,000 cells
  • a suspension of string-like aggregates of retinal pigment epithelial cells can be injected at 1,000 to 10,000 cells/ ⁇ L, preferably 1,000 to 10,000 cells/ ⁇ L.
  • the therapeutic agent of the present invention does not involve difficulty in controlling cells at the transplantation site, such as the suspension of RPE cells, and the transplanted cells form an epiretinal membrane (ERM) in the vitreous body. Nor do I let you.
  • the therapeutic agent of the present invention does not require time and cost to prepare the sheet, and does not require invasive surgical procedures involving large incisions.
  • the therapeutic agent of the present invention can be administered for macular degeneration (e.g. age macular degeneration, retinitis pigmentosa, etc.), mammals having retinal diseases such as retinitis pigmentosa (e.g., humans, mice, rats, etc., preferably humans) by subretinal injection to transplant can be done.
  • macular degeneration e.g. age macular degeneration, retinitis pigmentosa, etc.
  • mammals having retinal diseases such as retinitis pigmentosa (e.g., humans, mice, rats, etc., preferably humans) by subretinal injection to transplant
  • a medium for transplanting the therapeutic agent of the present invention a medium obtained by diluting a viscoelastic substance (Shelgun, Viscoat, etc.) 4- to 8-fold with OptiMEM can be used.
  • the medium for transplantation the string-like aggregates of retinal pigment epithelial cells of the present invention can be smoothly aspirated and discharged.
  • Example 1 Fabrication of PDMS-based culture device for fabrication of hiPSC-RPE ligamentous aggregates
  • the fabrication process of this device is summarized. First, a mold for this device was fabricated by 3D printing using polylactic acid (PLA) filaments. After cutting the 3D-printed mold and applying PDMS to adjust the shape of the groove, a release agent (Novec1720, manufactured by Sumitomo 3M) was applied on the mold.
  • PLA polylactic acid
  • PDMS and a curing agent for PDMS (Cypot 184W/C) (manufactured by Dow Corning Toray) were mixed at a ratio of 10:1, poured onto a 3D-printed mold, and degassed for about 1 hour. The 3D printed mold and PDMS mixture was then placed in an oven at 80°C for 3 hours. The cured PDMS was recovered from the 3D printed mold and trimmed. When the radius of curvature of the groove bottom was measured with a confocal scanning laser microscope (KEYENCE, VK-8710), it was R 0.2 mm (Fig. 10).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • episomal vectors (pCE-hOCT3/4, pCE-hSK, pCE-hUL, pCE-mp53DD, pCXB-EBNA1 purchased from Addgene) were electroporated into PBMCs followed by iPSC-like colonies were picked (Okita et al., 2011). After several passages, the inventors performed PCR analysis using DNA extracted from iPSC-like cells and confirmed that no residual episomal vector could be detected with plasmid-specific primers. The 201B7 and 253G1 hiPSC lines (Nakagawa et al., 2008; Takahashi et al., 2007) were obtained from the RIKEN BioResource Center.
  • a modified Fucci 201B7 strain (201B7modFucci) was generated in our laboratory. Briefly, tFucci (CA) 2 / pCSII-EF vector (Gift from Dr. A. Miyawaki; 30/120)-P2A-mVenus region was excised and ligated into the pAVS1-Nst-CAG-DEST vector obtained from Addgene (Plasmid #80489).
  • 201B7 was transformed into a modified Fucci construct encoding a gRNA designed to target the AAVS1 locus and a Cas9 vector (Addgene Plasmid #62988) using DNA-in CRISPR delivery medium (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, Md.). was co-transfected with (Oceguera-Yanez et al., 2016). After transfection, mVenus-positive 201B7 colonies were dissociated, passaged, and colonies derived from single clones were picked. hiPSC-RPE cells were differentiated using the SFEBq method (Kuwahara et al., 2015, 2019; Nakano et al., 2012).
  • 450 ⁇ M monothioglycerol, 30 nM SAG, 20 ⁇ M Y-27632 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and penicillin-streptomycin were suspended in a growth factor-free chemically defined medium (gfCDM) and plated on PrimeSurface 96V (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). 1.5 nM BMP4 was added on day 6 and half of the gfCDM was replaced every 3 days.
  • gfCDM growth factor-free chemically defined medium
  • cells were plated in an Ultra Low Culture Dish (Corning Incorporated) using DMEM/F12-Glutamax medium containing 1% N2 supplement (Life Technologies), 3 ⁇ M CHIR99021 (Stemgent, Cambridge), and 5 ⁇ M SU5402. ). From day 22 onwards, cells contain 1% N2 supplement, 10% fetal bovine serum (Biosera), 0.5 ⁇ M retinoic acid (sigma), 0.1 mM taurine (sigma), and 1x antibiotic antimycotic (gibco). Cultured in DMEM/F12-Glutamax medium (Life Technologies).
  • pigmented colonies were picked and coated with iMatrx511 in a 1:1 mixed medium of "RPE adhesion medium” and “RPE maintenance medium” (hereafter, “mixed medium”). were plated in 12-well plates.
  • RPE adhesion medium contains DMEM/F-12 (Sigma-Aldrich), 10% fetal bovine serum (SAFC Biosciences Inc.), gentamicin solution (Sigma-Aldrich), "RPE maintenance medium” contains DMEM-low Glucose (Sigma-Aldrich), 30% F-12 (Sigma-Aldrich), 2% L-glutamine solution (Sigma-Aldrich), 2% B-27 TM supplement (50X) (Thermo Fisher Scientific Inc.), and gentamicin solution (Sigma-Aldrich). Once the cells had attached, the medium was changed to RPE maintenance medium containing 10 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the cell culture medium was spread in RPE maintenance medium, and the cells were stocked at -150°C using STEM-CELL BANKER (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.).
  • the stock cells were thawed and seeded in mixed medium, followed by a medium change to RPE maintenance medium supplemented with 10 ng/mL bFGF and 0.5 ⁇ M SB431542, changing the medium every few days until the cells were used. exchanged.
  • Differentiated RPE cells from the 253G1 line were prepared as described by Kitahata et al., 2019.
  • hiPSC-RPE cells were cultured for 2 weeks, cells were harvested, and 15 ⁇ l RPE maintenance medium containing the optimal concentration of Y-27632 (concentrations indicated in each experiment) were used to irrigate each cell.
  • RPE maintenance medium containing the optimal concentration of Y-27632 (concentrations indicated in each experiment) were used to irrigate each cell.
  • Each groove of the PDMS-based culture device was seeded with the number of cells indicated in the experiment.
  • PCR for RPE marker genes Total RNA was extracted from cells using RNeasy Micro Kit (Qiagen), and cDNA was synthesized using SuperScript III Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen). Table 2 shows the sequences of primers for RPE markers (BEST1, RPE65, CRALBP) and housekeeping gene (GAPDH). PCR reaction was performed using Blend Taq-Plus- (TOYOBO Co., Ltd.). Thermal cycle conditions were as follows. 32 cycles of 180 seconds at 94°C, denaturation at 94°C for 30 seconds, priming at 58°C for 30 seconds, extension at 72°C for 60 seconds were performed, followed by one cycle at 72°C for 60 seconds.
  • VEGF and PEDF VEGF and PEDF ELISAs were performed according to the manufacturer's protocols for the VEGF Human ELISA Kit (Life Technologies) and Human PEDF ELISA Kit (Biovendor), respectively.
  • the graft was slowly injected into the detached retinal bleb using a 50 ⁇ l microsyringe (Hamilton, 1705LT).
  • a perfluorocarbon liquid Alcon, 8065900111 was then injected over the detachment to compress and adhere the retina, followed by fluid-gas exchange.
  • Twisted aggregates formed with 4.5 ⁇ 10 5 cells and 1.5 ⁇ 10 5 cells were then plated into wells. Both starting cell numbers of stranded aggregates showed expansion of RPE cells on non-coated plates from stranded aggregates, and stranded aggregates formed with 1.5x105 cells were still in their initial shape after 2 weeks. They lost their initial shape faster compared to the string-like aggregates formed with 4.5x105 cells, which retained the majority (Figs. 13A and 12D). Therefore, we fixed the starting cell number at 1.5-2 ⁇ 10 5 cells. Fragmentation of the stranded aggregates (1.5 ⁇ 10 5 cells) resulted in the loss of most of the initial stranded aggregate morphology (FIG.
  • Twisted aggregates formed with 10 ⁇ M Y-27632 were easily detached after being placed on non-coated wells, compared to those formed with 2-2.5 ⁇ M Y-27632, compared to 24 It took longer to adhere to the well plate and delayed expansion (FIGS. 14B and C).
  • the optimal Y-27632 concentration for adhesion/spreading assay is also 5 ⁇ M for hiPSC(201B7modFucci)-string-like aggregates, and the optimal Y-27632 concentration for the desired adhesion/spreading effect differs depending on the cell line used, and needs to be optimized. Met. (FIGS. 14D and E). Cells expanded from stringy aggregates of both hiPSC lines displayed the characteristic pigmentation and cobblestone-like appearance of RPE cells and expressed ZO-1 and MITF (FIGS. 15-1B and C).
  • RPE-specific marker genes BEST1, RPE65, RLBP1
  • PCR reaction
  • Fig. 15-1D RPE cells were observed to expand from cord-like aggregates in a monolayer on the plate (Fig. 15-1E).
  • the total number of cells 14 days after placing the stranded aggregates on the plate was measured using 2 ⁇ 10 5 hiPSC-RPE cells. Compared to the initial cell number in the formed day 2 stringy aggregates.
  • hiPSC-RPE secreted VEGF and PEDF to the same extent compared to cells originally used for stranded aggregate formation.
  • strand aggregates or suspension cells were placed or seeded on top of the scratched area, respectively, and monitored using Incucyte for filling or replacement by "implanted" RPE cells (Fig. 11B). ).
  • pre-existing RPE treated with MMC gradually expanded and migrated, slowly reducing the defect area.
  • Transplanted RPE cells in suspension rapidly occupied the defect area.
  • VEGF secretion decreased significantly after scratching and then increased in all groups up to 28 days later.
  • VEGF secretion was almost the same as before MMC treatment.
  • PEDF secretion decreased after scratching in transplanted group.
  • ligamentous aggregate transplantation PEDF secretion decreased once after scratching, but after 28 days there was no difference from before MMC treatment.
  • Example 2 Fabrication of COP-based culture device for fabricating string-like aggregates of hiPSC-RPE Cyclo Olefin Polymer (COP) plate (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) was machined to a length of 20 mm, a width of 1 mm, and a depth of 1 mm. A COP-based culture device with 2 mm deep grooves (R 0.5 mm at groove bottom) was fabricated ( Figure 19).
  • COP Cyclo Olefin Polymer
  • hiPSC-derived RPE cells The M8 hiPSC line (Riken) was differentiated by the SFEBq method, and the QHJI01s04 hiPSC line (Kyoto University) was differentiated by the method described in N Engl J Med 2017;376:1038-46.
  • HiPSC-derived RPE cells (hiPSC-RPE) were prepared by induction, and the cells were stocked at -150°C in the same manner as in Example 1.
  • HiPSC-RPE cells M8 strain, QHJI01s04 strain
  • a COP-based culture device at 2x10 5 cells with 10 ⁇ l maintenance medium containing 5 ⁇ M Y-27632. was sown in each furrow of Formation of string-like aggregates was confirmed after 2 days.
  • a transplant material for retinal pigment epithelial cells that can be easily controlled at the transplant site while being prepared in a short period of time at low cost and using a non-invasive method for transplantation.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2021-078154 (filing date: April 30, 2021) filed in Japan, the entire contents of which are incorporated herein.
  • Device 110 Base member 110a: Top surface of base member 111: First base portion 112: Second base portion 120: Groove 121: Cavity portion of groove 122: Top of groove 130: Groove and top surface of base member Boundary line 200: Mold 210: Mold substrate 210a: One surface of mold substrate 220: Projection 230: Coating layer 240: V-shaped convex mold a1: Retinal pigment epithelial cell A1: String-like aggregate b1: Depth of cavity portion B1: Depth of entire groove d1: Outer diameter of body of string-like aggregate L1: Overall length of string-like aggregate W1: Width of cavity portion W2: Width of opening of groove X1: Width of groove Cutting line ⁇ 1 extending in the direction: inclination angle of the inner wall of the groove

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)

Abstract

本発明は、短時間、低コストで準備でき、かつ非侵襲的な移植の方法でありながら、その移植部位において容易に制御可能な網膜色素上皮細胞の移植材料、および該移植材料の製造方法を提供する。

Description

網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬
　本発明は、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬に関するものである。
　眼疾患に対する細胞ベースの再生療法のためにES/iPSC由来の網膜色素上皮細胞（RPE）を使用することは、過去10年間、眼科の臨床分野で大きな関心事の一つであった（非特許文献１）。これらの臨床研究により、この治療アプローチの安全性は、いくつかの可能性のある有効性を伴って明らかになった。これまでのところ、これらの臨床研究では、細胞懸濁液を用いたアプローチとRPEシートを用いたアプローチの2つのアプローチがあり、いずれも長所と短所がある。細胞懸濁液を用いた移植は、チューブからすぐに使える、または短期間の培養による細胞ストックを利用することができ、小さな外科的侵襲で移植することができるが、移植部位において細胞の配置の制御は困難であり、移植された細胞はしばしば硝子体の中に網膜上膜（ERM）を形成することがある（非特許文献１、２）。対照的に、RPEシートは、移植シートが狙い通りに正確な方法で配置されたことを目視で確認することができるが、シートの準備には時間、コスト、および強膜および神経網膜の大きな切開を伴う侵襲的な外科的処置が必要である（非特許文献３）。従って、短時間、低コストで準備でき、かつ移植の方法が非侵襲的でありながら、その移植部位においてを容易に制御可能な網膜色素上皮細胞の移植材料を提供するという課題が依然として未解決のままであった。
Sugita, S et al., (2020) J. Clin. Med. 9, 2217. Schwartz, S.D. et al., (2015) Lancet 385, 509-516. Lyndon da Cruz et al., Nature Biotechnology Advance Online Publication, published online 19 March 2018.
　本発明が解決しようとする課題は、短時間、低コストで準備でき、かつ非侵襲的な移植の方法でありながら、その移植部位において容易に制御可能な網膜色素上皮細胞の移植材料、および該移植材料の製造方法である。
　本発明者らは、網膜下に容易に注入できるひも状凝集体のRPE細胞であっても、小さなシート移植と同様に一定の面積をカバーするように拡大できると仮説立てた。近年、微小組織の形態学的なメカニズムとして、表面被覆性、組織収縮性、および接着力の関係が報告されている（Yamashita, T. et al., (2016). Acta Biomater. 45, 85-97.）。発明者らは、接着力と収縮力のバランスがとれた細胞が、曲率の小さい凹面上にスフェロイド状の組織を自発的に生成したことを確認し、この知見をもとに、凹面の下端の曲率を検討し、曲率が小さい溝面が細胞から帯状の組織を生成させることを見出した。小組織の作製には基本的にフォトリソグラフィーなどの特殊な技術が必要であったが、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ソフトリソグラフィーと簡易三次元（3D）印刷を組み合わせた作製技術を導入し、この組織工学的アプローチを広く可能にした。本発明では、細い溝を有するPDMSベースの培養デバイスを作製し、hiPSC-RPE細胞がひも状凝集体を形成できるかどうかを検討した。そして、ディッシュ上にプレーティングしたひも状凝集体からhiPSC-RPE細胞が拡大し、拡大したhiPSC-RPE細胞がひも状凝集体形成前と同様のRPE特性を呈することができるかどうかを確認した。また、ひも状凝集体を形成したhiPSC-RPEが動物の目に実質的に注入できるかどうかを検証した。
　すなわち、本発明は以下に関する。
〔１〕網膜色素上皮細胞のひも状凝集体。
〔２〕全長／胴体の外径の比率が2～1,000という特徴を有する、上記〔１〕に記載のひも状凝集体。
〔３〕横断面形状が円形または楕円形という特徴を有する、上記〔２〕に記載のひも状凝集体。
〔４〕網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のひも状凝集体。
〔５〕上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のひも状凝集体を製造するためのデバイスであって、
　ベース部材を有し、
　該ベース部材は、１以上の溝が設けられた上面を有し、
　該溝は、播種される網膜色素上皮細胞をひも状凝集体へと培養するための型として、ひも状凝集体の長さと幅とを持ったキャビティ部分を有している、
前記デバイス。
〔６〕前記溝が、該溝の底部としてキャビティ部分を有し、かつ、該キャビティ部分の上に位置する上部を有し、該上部が前記溝の開口を有している、上記〔５〕に記載のデバイス。
〔７〕前記溝の横断面形状がＶ字形状であり、該Ｖ字形状の最深部が丸みを帯びている、上記〔５〕または〔６〕に記載のデバイス。
〔８〕下記の工程を含む、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体の製造方法；
　(1)上記〔５〕～〔７〕のいずれかに記載のデバイスの溝内に液体培地に懸濁された網膜色素上皮細胞を播種する工程、
　(2)前記溝内において、網膜色素上皮細胞を培養し、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を形成させる工程。
〔９〕培地がROCK阻害剤を含む、上記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕ROCK阻害剤が、Y-27632である、上記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕溝内において培養される網膜色素上皮細胞の密度が、2.5x103細胞/mL～5x105細胞/mLである、上記〔８〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕網膜色素上皮細胞の培養期間が、1日～7日である、上記〔８〕～〔１１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１３〕上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を含有する、医薬組成物。
〔１４〕上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を含有する、網膜色素上皮の障害に基づく疾患の治療薬。
　本発明によれば、短時間、低コストで準備でき、かつ移植の方法が非侵襲的でありながら、その移植部位において容易に制御可能な網膜色素上皮細胞の移植材料を製造することが可能となる。
図１は、本発明のデバイスの構造と、それを用いたひも状凝集体の製造方法を説明する斜視図である。同図では、溝をわかりやすく説明するためにベース部材の上面に１条の溝が設けられた態様を示しており、また、溝の横断面（溝をその長手方向に垂直に切断したときの断面）を示すべく、溝の全長の一部だけを示している。図１（ａ）は、溝内に網膜色素上皮細胞が液体培地（図示せず）と共に播種された状態を示している。図１（ｂ）は、播種された網膜色素上皮細胞が溝内においてひも状凝集体へと成長した状態を示している。 図２は、溝とキャビティ部分の形状を例示する図である。 図３は、溝とキャビティ部分の好ましい態様の一例を示す図である。 図４は、ひも状凝集体の各部の寸法、本発明のデバイスの構成、該ひも状凝集体とデバイスとの関係を説明するための模式図である。図４（ａ）は、説明のために、ひも状凝集体の全体の形状を単純化して示した図である。図４（ｂ）は、溝内で形成されたひも状凝集体と溝との寸法関係の一例を示す図である。 図５は、本発明のデバイスの好ましい態様例を示す図である。図５（ａ）は、当該デバイス全体を示す斜視図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）に示すデバイスを、溝の幅方向に延びる切断線Ｘ１－Ｘ１に沿って、該デバイスの厚さ方向に切断したときの断面図である。切断面へのハッチングは省略している。 図６は、本発明のデバイスを製造するための成形型の一例を示す図であり、該成形型の製造方法の一例を示す図でもある。図６（ｂ）は、図６（ａ）に示す型部品の斜視図である。図６（ｄ）は、図６（ｃ）に示す型の斜視図である。 図７は、本発明のデバイスの製造工程の一例を示す断面図であって、図６（ｃ）、（ｄ）に示した成形型を用いて当該デバイスを樹脂成形している様子を模式的に示している。 図８は、本発明の実施例において実際に製作した成形型を示す写真図（図８（ａ））、および、該成形型によって実際に成形された当該バイスを示す写真図（図８（ｂ））である。 図９は、本発明によるひも状凝集体の製造方法を示す模式図である。図９（ａ）は、図５に示したデバイスの溝に網膜色素上皮細胞を播種した状態（液体培地は図示せず）を示しており、図９（ｂ）は、溝内で形成されたひも状凝集体を該溝から取り出している様子を模式的に示している。 図１０は、PDMS溝構造体の測定結果を示す。A:長さ19.5mm、高さ1.6mmのフィンが5枚あるPDMSコーティング金型の写真。B：長さ19.5mm、幅1mm、深さ1.6mmの5本の溝を有する溝構造測定用PDMSベースの培養デバイスの写真。C：溝底のレーザー顕微鏡による測定画像。D:PDMSをベースとした培養デバイスの溝形状を測定したもの。各測定項目の平均値は、底面曲率半径0.21mm、溝幅1.16mm、溝深さ1.60mm。 図１１は、ひも状凝集体が損傷したRPE欠損領域を置換するに伴って機能の一部を回復したことを示す。A：in vitro疾患モデルと移植の実験スケジュール。病理的なRPEの変性/障害状況は、RPE細胞をMMCで処理し、傷を作ることで模倣し、次いで、hiPSC-RPE細胞懸濁液またはひも状凝集体(201B7modFucci株）のいずれかを欠損領域上にプレーティングすることによって、移植工程をin vitroで模倣した。B:RPE欠損領域上のプレーティングされたhiRPE細胞の拡大は、201B7-Fucci hiPSC株のG0-G1細胞周期における細胞によるmCherry発現によってモニターされた。最初に傷がついた領域と対照ウェルの欠損領域を点線で示す。B’：パネルは、スクラッチ後のRPE欠損領域と、RPE細胞懸濁液またはひも状凝集体からのRPE細胞拡大による再充填領域を示す。C：ひも状凝集体から拡大したRPE細胞は、境界に沿ってmCherryの発現が増加した常駐RPEに接触すると、拡大が停止するように思われた。D:既存のMMC処理されたRPEと新たにプレーティングされたRPEの間の境界は、mCherryの発現とRPE細胞の大きさ（矢印）によって合理的に識別された。MMC処理されたRPEは、一般的にひも状凝集体から拡大されたRPEよりも大きかった。ZO-1の発現は、常駐MMC処理された集団と新たにプレーティングされた/拡大されたRPE細胞の各集団内の細胞間で観察され、また、境界部の細胞間でも観察された。E及びF：開始時（-d3）、MMC後（-d2）、スクラッチ後（-d1）、およびhiPSC-RPE細胞またはひも状凝集体（n=3）のプレーティングの有無後における、各ウェルにおけるPEDFとVEGFの分泌。VEGFとPEDFの両方の分泌は、MMC処理とスクラッチ後に減少した。RPE細胞の補給なしでは、PEDFは減少し続けたが、懸濁液またはひも状凝集体のいずれかで、RPE細胞の補給では、PEDFは、より急速に得られた。 図１２は、ひも状凝集体形成の最適化を示す。A:10μM Y-27632 (シート培地、混合培地、維持培地)の3種類の培地を用いて、hiPSC-RPE細胞を金型の溝にプレーティングした。B:金型内でのひも状凝集体の外観（混合培地、維持培地）。C:hiPSC-RPE細胞を溝に4.5x105、1.5x105、5x105でプレーティングし、3日と7日間インキュベートした。D:150000個または450000個で形成されたひも状凝集体を19日間プレート上に置いたときの外観。150000細胞数で形成されたひも状凝集体は、450000個で形成されたひも状凝集体に比べて、初期の形状が急速に失われ、19日後には初期形状がほとんど失われていた。スケールバー、200μm。 図１３は、ひも状凝集体形成に及ぼす開始細胞数とY-27632濃度の影響を示す。A:150000個または450000個のRPE細胞で形成された4日目のひも状凝集体をディッシュ上に置き、翌日と14日後に撮影した外観。各ひも状凝集体からRPE細胞が拡大し、15000個の細胞で形成されたひも状凝集体は14日後に形状を失ったが、450000個の細胞で形成されたひも状凝集体は初期の形状を維持していた。A’:断片化されたひも状凝集体は、細胞が拡大した後、ほとんど初期の形状を失った。B:RPE(2×105)を播種した後の2日目のひも状凝集体の外観。C：10μMまたは2.5μM Y-27632のいずれかで形成されたひも状凝集体の断面図。エズリンおよびラミニンの発現は断片化されているが、細胞間ではZO-1が発現しており、頂端-基底極性は区別されていない。右のパネルは、RPEシートのコントロール染色を示す。D,E,F,G：2.5μM Y-27632で形成されたひも状凝集体は、10μM Y-27632で形成されたものと比較して、プレートへの接着性が高く、より多くの面積をカバーし、より速くプレート上で拡大し始めた（D、E：2日目ひも状凝集体、F、G：3日目ひも状凝集体）。 図１４は、ひも状凝集体形成のためのY-27632濃度の最適化を示す。A：異なるY-27632濃度下でのひも状凝集体形成。B:２日目のひも状凝集体（M8株）を24ウェルプレートにプレーティングし、hiPSC-RPE細胞によるカバー領域の拡大をモニターした。2-2.5 μMのY-27632を添加したひも状凝集体が最もプレートへの接着性が高く、ウェル上に置いたときに平らに付着する傾向があった。C：hiPSC-RPE細胞（M8株）の拡大。各ウェルにひも状凝集体を配置した後の被覆領域（各Y-27632濃度に対してn=6）。D：２日目のひも状凝集体（201B7modFucci株）を24ウェルプレートに配置し、hiPSC-RPE細胞による被覆領域の拡大をモニターした。2-2.5 μM Y-27632を添加したひも状凝集体は、プレートに一貫して接着性があり、ウェル上に配置したときにフラットに付着する傾向があった。E：hiPSC-RPE細胞（201B7modFucci株）の拡大。各ウェルにひも状凝集体を配置した後の被覆領域（各Y-27632濃度に対してn=2）。 図１５-１は、異なるhiPSC株（M8および201B7modFucci L）を用いたひも状凝集体形成の再現性を示す。A：別のhiPSC株を用いてひも状凝集体を同様に形成したが、各株ごとにY-27632の最適化が必要であった。201B7modFucci株はひも状凝集体を安定して形成するために5μM Y-27632を必要とした。B:各M8と201B7modFucci株で形成されたひも状凝集体は、プレート上に付着し、よく拡大され、RPEの特徴的な石畳のような外観と色素沈着を呈した。C:ひも状凝集体から拡大したRPE細胞は、タイトジャンクションマーカーZO-1およびRPEマーカーMiTFを発現した。D：ひも状凝集体形成前のhiPSC-RPE細胞、ひも状凝集体のRPE細胞、および各hiPSC株由来のひも状凝集体から拡大後の細胞によるRPEマーカー遺伝子発現。E：ひも状凝集体から単層にRPE細胞が遊走、増殖した。 図１５-２は、異なるhiPSC株（M8および201B7modFucci L）を用いたひも状凝集体形成の再現性を示す。F:ひも状凝集体のRPE細胞の細胞数とひも状凝集体より拡大したRPE細胞の細胞数。G：ひも状凝集体から拡大したRPE細胞はVEGFとPEDFを分泌した。スケールバー、50μm(C,E)。 図１６は、ヌードラットにおけるひも状凝集体移植を示す。A：ひも状凝集体移植後のヌードラット眼の眼底写真。B：ひも状凝集体移植後93日目のヌードラット眼の眼底写真。SLO-OCTにより移植部位に強いRPE様シグナルが観察された。C：移植後の眼のヘマトキシリンエオジン染色。D：ヒト核抗原（HuNu）は色素シート状の層のみが陽性であった。E：移植されたRPEは、極性マーカーであるヒト特異的エズリンとコラーゲンタイプIVで示されるように、ウェル配向を示した。スケールバー、50μm(B)20μm(E)。 図１７は、24Gの静脈内カニューレに装填されたひも状凝集体を示す。 図１８は、２つのウサギの目へのひも状凝集体の移植を示す。移植手術中のひも状凝集体の実用的な取り扱いについて、2つのウサギの目（AとB）で試験を行った。上：ひも状凝集体の装填。中央：ひも状凝集体を網膜出血部の内側にゆっくりと注入した。網膜切開部位は白色の矢印で示される。下：注入されたひも状凝集体。 図１９は、COP溝構造体を示す。 図２０は、OptiMEMで4-７倍に希釈した粘弾性物質からなる媒体中に浮遊したひも状凝集体をカニューレで吸引する瞬間を示す写真である。Bar;1mm 図２１は、サルの眼球へのひも状凝集体の移植を示す。
１．網膜色素上皮細胞のひも状凝集体
　本発明は、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体（以下、本発明のひも状凝集体）を提供する。
　本発明において網膜色素上皮細胞（以下、RPE細胞と記載することもある）とは、網膜色素上皮を構成する上皮細胞、及びその前駆細胞をいう。網膜色素上皮細胞であるかは、例えば、細胞マーカー（RPE65、CRALBP、MERTK、BEST1等）の発現や、細胞の形態（細胞内のメラニン色素沈着、多角形で扁平な上皮様の細胞形態、多角形のアクチン束の形成等）等により確認できる。また、網膜色素上皮細胞の前駆細胞とは、網膜細胞への分化誘導が方向づけられた細胞を意味し、当該前駆細胞であるかは、細胞マーカー（Mitf（色素上皮細胞、色素上皮前駆細胞）、Pax6（色素上皮前駆細胞）、Rx（網膜前駆細胞）、OTX2（網膜前駆細胞）、RPE65（色素上皮細胞）、BEST1（色素上皮細胞））の発現等により確認できる。また網膜色素上皮細胞の機能評価は、例えばサイトカイン（VEGFやPEDF等）の分泌能や貪食能等を指標にして確認できる。これらの機能評価および確認操作は、当業者であれば適宜条件を設定して実施することが可能である。
　RPE細胞は、RPE細胞を保有する任意の動物（例えば、ヒト）から得ることができるし、多能性幹細胞から自体公知の方法により分化誘導することにより得ることもできるが、十分量のまたは疾患により適切な細胞供給が可能であるという点で多能性幹細胞から分化誘導された細胞がより好ましい。多能性幹細胞としては、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であれば、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ntES細胞）、精子幹細胞（GS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、iPS細胞である。多能性幹細胞の由来は特に制限されず、例えば、下記のいずれかの多能性幹細胞の樹立が報告されている任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、マウス、ラット等、最も好ましくはヒトがあげられる。
　iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006), Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO2007/069666）。
　本明細書中で使用する体細胞なる用語は、卵子、卵母細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児の体細胞、新生児の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D,et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　iPS細胞からRPE細胞を分化誘導することができる（例えば、Neurosci. Lett., 458: 126-131, 2009; PLoS One, 8: 409-412, 2011）。あるいは、WO2015/053375、WO2015/053376、WO2015/125941、WO2017/043605等に記載の方法を用いることもできる。
　本発明のひも状凝集体はRPE細胞同士の接着によって形成される。この場合、細胞同士が接着するとは、本発明のひも状凝集体においてRPE細胞とRPE細胞が面接着することをいう。細胞と細胞が面接着(plane attachment）するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1％以上、好ましくは3％以上、より好ましくは5％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばDiI）による染色や、細胞接着因子（例えば、E-cadherinやN-cadherin）の免疫染色により、観察できる。
２．網膜色素上皮細胞のひも状凝集体の製造用デバイス
　本発明はまた、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を製造するためのデバイス（以下、本発明のデバイス、または、当該デバイス）を提供する。
　図１に示すように、本発明のデバイスは、該デバイスの本体部分であるベース部材１１０を有する。該ベース部材１１０の上面１１０ａには、１以上の溝１２０が設けられている。図１では、説明のために１つの溝だけが設けられているように描かれているが、好ましい態様では、後述するように、複数の溝が隣り合うように配置され、かつ、溝と溝との間に上面（平面）が存在しないように、溝の横断面形状がＶ字形状とされる。該溝１２０は、形成すべきひも状凝集体の長さと、該ひも状凝集体の外径に対応する幅とを持ったキャビティ部分を有している。図１の例では、溝１２０の底の部分がキャビティ部分である。該キャビティ部分は、該キャビティ部分内に播種される網膜色素上皮細胞がひも状凝集体へと成長し得る凹状の型である。この構成によって、図１（ａ）に示すように当該デバイスの溝１２０内に液体培地（図示せず）と共に網膜色素上皮細胞ａ１を適切な量だけ播種し培養を行うと、図１（ｂ）に示すように、キャビティ部分の長さと幅に対応した形状を持ったひも状凝集体Ａ１が得られる。当該デバイスによって得られたひも状凝集体は、キャビティ部分に沿って滑らかに成形された胴体面（図１（ｂ）のひも状凝集体Ａ１の下側の面）と、自由に成長して盛り上がった面（図１（ｂ）のひも状凝集体Ａ１の上側の面）とを有するものとなる。
（ベース部材）
　ベース部材の全体的な形状や寸法は、特に限定はされず、製造すべきひも状凝集体を形成し得るキャビティ部分を１以上形成し得る上面を有する形状や寸法が利用可能である。無駄な場所を取らず、製造が容易であり、凝集体製造時の取り扱いが容易であるという点から板状が好ましい形状として例示される。図５（ａ）の例では、ベース部材１１０の全体的な形状が円板状である。ベース部材が板状である場合の外周形状は、円形（即ち、円板状）に限定されず、正方形や長方形などであってもよい。円板状は、一般的に円形である市販のシャーレ内にデッドスペースを生じさせず配置し得る点では好ましい形状である。また、用途に応じて、外周を取り囲む壁部、側方に張り出して延びるフランジ、取り扱いのための取っ手部、裏面側に設けられる脚部、キャビティを特定する記号（文字、数字、ＱＲコード(登録商標)など）の印字・刻印（凹または凸）・ラベルの貼付、培養されたひも状凝集体の長さを知るための寸法目盛りの印字・刻印・ラベルの貼付、などの種々の付帯的な部分が、一体的な成形にてまたは別個のパーツの取り付けによって、設けられていてもよい。
（溝とキャビティ部分）
　図２（ａ）に示すように、溝１２０全体がキャビティ部分であってもよいし、図２（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に示すように、溝１２０の底部がキャビティ部分１２１であり、キャビティ部分上に上部１２２を有する構造であってもよい。図２（ａ）に示す態様では、ひも状凝集体が溝の開口から外へはみ出して盛り上がっていてもよい。
　図２（ｂ）～（ｄ）に例示するように、溝１２０の内部構造が、底部としてのキャビティ部分１２１と、その上に位置する上部１２２とを有する構造である場合、キャビティ部分１２１と上部１２２は、これらの図の例のように、互いに一体的に形成されたものであってもよいし、図２（ｅ）や図３に例示するように、互いに上下２つに分離可能（別個の部品を組み合わせたもの）であってもよい。図２（ｅ）の態様は、図２（ｄ）の態様を改変したものであるが、図２（ｂ）、（ｃ）など、種々の溝におけるキャビティ部分と上部とを分離可能としてもよい。また、分離の境界面は、キャビティ部分と上部との境界面に必ずしも一致する必要はなく、キャビティ部分と上部とが一体的に形成され、上部が上下２つに分離し得る構造であってもよい。このような上下２つに分離可能な構造であれば、図３（ｂ）に例示するように、キャビティ部分１２１だけを露出させることができ、培養後のひも状凝集体Ａ１をより容易に取り出すことができる。また、このような上下２つに分離可能な構造であれば、深い溝を形成する必要がなく、溝のプロフィールの自由度も大きくなるという製造上の利点もある。
　図３は、キャビティ部分と上部を分離可能にするためのデバイスの具体的な態様例を示す図である。この態様では、図３（ａ）に組み立てた状態として示すように、ベース部分１１０が、第１のベース部分１１１とその上に配置される第２のベース部分１１２とを有して構成される。図３（ｂ）に分離した状態として示すように、第２のベース部分１１２は、第１のベース部分１１１から取り外すことができるようになっている。第１のベース部分１１１には溝１２０のキャビティ部分１２１が設けられ、第２のベース部分１１２には溝１２０の上部１２２が設けられている。図には示していないが、第１のベース部分１１１と第２のベース部分１１２には、これらが互いに所定の位置関係（即ち、１つのキャビティ部分１２１と１つの上部１２２とが一致して、１つの溝１２０を形成する位置関係）において接続されるように、位置決め構造が付与されることが好ましい。そのような位置決め構造は、特に限定はされず、例えば、位置決め用の凸部とそれを受け入れる位置決め用凹部、互いにずれることなく嵌り合う外周形状（円柱と丸穴以外の形状）など、従来公知の位置決め構造を適宜に採用することができる。
　ベース部分１１０が上記のように複数のパーツ（例えば、第１のベース部分１１１と第２のベース部分１１２）に分離可能である場合、それぞれのパーツの材料は互いに異なっていてもよい。例えば、キャビティが設けられる第１のベース部分１１１には、ひも状凝集体を好ましく育成し得る生体適合性（GCP:Good Clinical Practice対応）を有し、かつ、ひも状凝集体をキャビティから容易に剥離し取り出すことができるよう、細胞が付着しにくい材料を用いることが好ましい（このような材料は、第２のベース部分１１２にも用いてよい）。また、第１のベース部分１１１と第２のベース部分１１２の両方には、滅菌処理が可能な材料（例えば、オートクレーブ加熱が可能な耐熱性、ガンマ線照射が可能な耐放射線性、ＥＯＧ滅菌適合性を有する材料）、安価で加工が容易な材料を用いることが好ましい。
（ひも状凝集体の形状）
　キャビティ部分の形状を説明するために、ひも状凝集体の形状をここで説明する。
　本発明において、ひも状凝集体とは、ひも状を形成するようにRPE細胞が無作為に細長く凝集した凝集体であって、生体内の網膜色素上皮のように明瞭な頂端と基底の極性を持たなくてもよく、移植の際に針またはチューブ状の移植用チップなどにより効率よく目的とする細胞数が一塊として出し入れができる程度の強度を有する凝集体であるかぎり特に制限されない。また、本発明において、ひも状凝集体の「ひも状」とは、公知の細胞塊や細胞シートに見られる形状と比べて、明らかに長手方向を持った細長い形状、即ち、ある１つの方向に長く延びた形状である。この細長い形状は、図４（ａ）に説明のためのモデルとして示すように、該ひも状凝集体を直線状にした場合の全長Ｌ１と胴体の外径ｄ１との比率（Ｌ１／ｄ１）が、２以上、より好ましくは５以上、さらに好ましくは１０以上、さらにより好ましくは２０以上、特に好ましくは５０以上であるような形状である。前記のような比率（Ｌ１／ｄ１）、とりわけ前記の下限の比率２を持った形状であれば、単なる細胞塊よりも方向（即ち、ひも状凝集体としての長手方向）を規定できる。即ち、配向性が重視される組織においては、予め適切に方向を規定する事によって、より望ましい組織が得られるという効果がある。
　また、前記のような比率を持ったひも状凝集体であれば、一つの細長い構造体として、該ひも状凝集体をシリンジ針の内部を通過させて搬送でき、また、一度の操作で広範囲に効率的に細胞を搬送・配置できる、といった効果がより顕著に得られ、しかも、公知の細胞シートでは通過させることが困難であった狭小部（例えば、微小な貫通孔など）を通過させることができるため、生体への侵襲性を抑制できるという効果がより顕著に得られる。
　比率（Ｌ１／ｄ１）が、前記下限２を下回ると、前記の効果は顕著ではなくなる。また、比率（Ｌ１／ｄ１）の上限は、特に限定はされず、例えば、当該ひも状凝集体を移植すべき対象部位の面積よりも長い全長Ｌ１であっても、適宜に切断すればよい。当該デバイスの溝が過剰に長くなることを避ける点や、移植する細胞数から計算される凝集体の寸法、搬送上の制限（例えば、シリンジ針の長さ）といった点からは、比率（Ｌ１／ｄ１）の上限は、１０００程度、より好ましくは２００程度、特に好ましくは１００程度が例示される。
　前記した比率（Ｌ１／ｄ１）の下限と上限は、例えば、比率（Ｌ１／ｄ１）＝２～１０００、５～１０００、１０～１０００、２０～１０００、５０～１０００、１０～２００、２０～２００、５０～２００、２～１００、５～１００、１０～１００、２０～１００、または、５０～１００のように、該比率の範囲を定めるために自由に選択して組み合わせることができる。本発明の実施例において製作したデバイスによって得られたひも状凝集体における比率（Ｌ１／ｄ１）は、２～１００程度であった。該比率の下限は、凝集体が「ひも状」という形であるために必要な最低限の値であるが、該比率の上限は特に限定はされず、培養設備のスペース上の制限や、外径ｄ１の範囲、細胞移植に適した長さへの分断の手間などに応じて、該比率の上限を適宜に決定することができる。
（ひも状凝集体の胴体の外径ｄ１）
　当該デバイスを用いてひも状凝集体を作製した場合、該ひも状凝集体の横断面形状（該ひも状凝集体をその長手方向に垂直に切断したときの断面の形状）は、図２（ａ）～（ｄ）に例示するように、培養時の下側部分がキャビティ部分に沿った形状となり、上側部分が自由に増殖した形状となる。よって、ひも状凝集体の胴体の外径ｄ１は、測定する方向によって不定である。このような外径ｄ１は、複数の方向について測定した外径の値の平均値を採用してもよいが、図４（ｂ）に例示するように、ひも状凝集体をキャビティ部分で成長した状態のままでデバイスと共に観察し（即ち、図４（ｂ）の上方から溝内を観察し）、そのときに見える胴体の幅寸法を、該ひも状凝集体の外径ｄ１として採用することが便利である。また、このような観察では、該ひも状凝集体がキャビティ部分に沿って直線状となるので、全長Ｌ１を容易に測定できる。
（ひも状凝集体の横断面形状）
　ひも状凝集体の横断面形状は、特に限定はされず、通常、不定形であるが、栄養分・酸素の供給、老廃物の排出の観点から組織表面から組織内部への距離が一定であることが望ましい点、また、シリンジ針等の狭小部をよりスムーズに通過し得るという点、溝のキャビティ部分の横断面形状がより滑らかに湾曲している方が細胞の増殖や剥離に有利である点などからは、円形や楕円形に近い形状が好ましい。
（生体に適用する際のひも状凝集体の寸法例）
　上記したように、ひも状凝集体の長さに制限はなく、過度に長い場合は、生体に適用する際に適宜に切断してよい。生体に適用する際の好ましい寸法としては、例えば、全長Ｌ１が２０μｍ～２００ｍｍ程度、好ましくは２０μｍ～４０ｍｍ程度、より好ましくは、１ｍｍ～４０ｍｍ程度、さらに好ましくは、５ｍｍ～４０ｍｍ程度が例示され、２４ゲージ針の長さに適合した長さの一例として、１０ｍｍ～２０ｍｍ程度が挙げられる。これらの全長Ｌ１の値は、最も好ましい範囲や値が１つだけ存在するというものではなく、デバイスの規模、許容される溝の長さ、必要な細胞数、移植のための器具の管路（例えば、注射針）の長さなどに応じた好ましい範囲や値を適宜に選択することができる。
　また、外径ｄ１については、１０μｍ程度（細胞１個程度に対応する外径）～３００μｍ程度（２４ゲージ針の内径に対応する外径）、好ましくは、２０μｍ～３００μｍ程度、より好ましくは１００μｍ～２５０μｍ程度が挙げられる。これらの外径ｄ１の値もまた、最も好ましい範囲や値が１つだけ存在するというものではなく、デバイスの規模、許容される溝のキャビティの内径、必要な細胞数、移植のための器具の管路（例えば、注射針）の内径などに応じた好ましい範囲や値を適宜に選択することができる。
　注射針を眼球に穿刺し、当該ひも状凝集体を、該注射針を通して眼底領域などの目的のサイトに送り込んで移植する場合、使用する注射針の好ましい内径は１０～３００μｍ程度である。その場合に、注射針内を好ましく移動し得るひも状凝集体の外径ｄ１は、例えば、該注射針の内径の８０～９５％、好ましくは９０％程度である。よって、このような場合には、ひも状凝集体の外径ｄ１は、１００μｍ～２７０μｍ程度が好ましい寸法範囲として例示される。そして、その場合のひも状凝集体の好ましい長さＬ１は、移植に効果的でありかつ注射針の長さに適合した長さである点から、２０μｍ～２００ｍｍ程度、好ましくは２０μｍ～４０ｍｍ程度、より好ましくは、１ｍｍ～４０ｍｍ程度、さらに好ましくは、５ｍｍ～４０ｍｍ程度が例示され、２４ゲージ針の長さに適合した長さの一例として、１０ｍｍ～２０ｍｍ程度が例示される。よって、注射針によってひも状凝集体を送る場合の好ましい比率（Ｌ１／ｄ１）は、４０～２００、好ましくは８０程度が例示される。また、そのときの細胞数は、１．５×１０５～４．５×１０５程度が例示される。
　以上の通り、本発明のひも状凝集体は、上述の全長Ｌ１と胴体の外径ｄ１との比率（Ｌ１／ｄ１）によって特徴付けることができる。従って、本発明のひも状凝集体は、全長Ｌ１と胴体の外径ｄ１との比率（Ｌ１／ｄ１）が、２～１,０００、であるという特徴を有してよい。また、Ｌ１／ｄ１は、通常、２～１,０００であってよいが、５～１,０００、１０～１,０００、２０～１,０００、５０～１,０００、１０～２００、２０～２００、５０～２００、２～１００、５～１００、１０～１００、２０～１００、または、５０～１００であってもよい。
　本発明のひも状凝集体は、横断面形状によってさらに特徴付けることができる。上記の通り、ひも状凝集体の横断面形状は、特に限定はされず、通常、不定形であるが、円形や楕円形に近い形状が好ましい。従って、本発明のひも状凝集体は、横断面形状が円形または楕円形であるという特徴をさらに有してよい。
（キャビティ部分の横断面形状）
　当該デバイスの溝内のキャビティ部分は、上記したひも状凝集体の形状に応じた横断面形状と長さを有することが好ましい。キャビティ部分の横断面形状とは、該キャビティ部分を溝の長手方向に垂直に切断したときの断面の形状である。該キャビティ部分の横断面形状は、また、細胞培養性、離型性などをさらに考慮して適宜に決定することができ、好ましい横断面形状として、円弧状、半円状、上部が開いた矩形、Ｕ字形、Ｖ字形などが例示される。前記の矩形やＶ字形における折れ曲がった部分（コーナー）は、ピンセットやシリンジ針などを用いてひも状凝集体を取り出す操作が容易である点や、ひも状凝集体の横断面形状を円形に近い形状とする方が好ましい点などから、丸みを帯びていることが好ましい。該コーナーの丸みの曲率半径は、特に限定はされないが、ひも状凝集体の外径ｄ１の半分程度（例えば、半径５μｍ～１５０μｍ程度）が好ましい値として挙げられる。また、図４（ｂ）に示すキャビティ部分の幅Ｗ１は、ひも状凝集体の外径ｄ１と同じであることが好ましい。
（溝の好ましい態様）
　好ましい態様では、図２（ｃ）、（ｄ）、図４（ｂ）に示すように、溝は、その底部がキャビティ部分１２１であり、該キャビティ部分上に上部１２２を有し、該上部１２２の横断面形状は、底側から開口側へ向かうにつれて幅が広がっていく形状である。溝全体の横断面形状はＶ字状であり、その最深部が上記したキャビティ部分として丸みを帯びている。このようなＶ字状の横断面形状によって、懸濁液の状態にて播種される細胞が底部のキャビティ部分内へと導かれ、播種の操作も容易になり、また、溝内からひも状凝集体が出やすくなり、取り出す操作が容易になる。
　溝全体の深さ（図４（ｂ）に示すＢ１）は、特に限定はされないが、５～５０００μｍ程度（一般的なシャーレの深さよりも５ｍｍ程度短い寸法)が好ましく、５～１６００μｍ程度がより好ましい。
　キャビティ部分の深さ（図４（ｂ）に示す寸法ｂ１）は、形成されるべきひも状凝集体の外径ｄ１に応じた寸法として、５～３００μｍ程度が好ましく、５～２５０μｍ程度がより好ましい。
　溝の開口部の幅（図４（ｂ）に示すＷ２）は、特に限定はされないが、５６０μｍ（２４ゲージ針の外径）～５０００μｍ（１ｍＬピペットチップの先端径）程度が好ましく、１０００μｍ～３０００μｍ程度（デバイスの大体の値)がより好ましく、１５００μｍ～２５００μｍ程度がより好ましい。
　溝全体の横断面形状が上記のようなＶ字状である場合、その内壁の傾きの角度（図４（ｂ）に示すθ１）は、１～９０度程度が好ましく、４０～７０度程度がより好ましい。溝全体の横断面形状は、培養等に必要な細胞懸濁液の量、細胞の数、収納する容器のサイズなどに応じて、適宜に決定することができる。
　溝の長さは、形成されるべきひも状凝集体の長さと同じであることが好ましいが、より長くてもよい。
　溝の横断面形状における上部は、図４（ｂ）に示すような直線であってもよいし、図５（ｂ）に示すように、底側から開口側へ向かうにつれて幅がより広がっていくように湾曲する曲線であってもよい。このような湾曲は、図４（ｂ）に示すような直線的なＶ字状の開口部分のエッジに丸みがついたものと解することもできる。
（溝の配置パターン）
　好ましい態様では、図５に示すように、ベース部材１１０の上面１１０ａには、複数（図の例では５本）の溝１２０が平行縞状をなすように配置される。これにより、１回の培養で複数のひも状凝集体が得られるので、生産効率が向上する。溝の数は特に限定はされず、実験用途から商業用まで、生産の規模に応じて、ベース部材のサイズと共に適宜に決定してよい。図５（ａ）、（ｂ）に示す例では、溝１２０の横断面形状における上部が、底側から開口側へ向かうにつれて幅がより広がっていくように湾曲する曲線であり、ベース部材の上面や隣の開口と滑らかに接続されている。図５（ｂ）では、隣り合った溝同士の境界線や、溝とベース部材１１０の上面１１０ａとの境界線１３０を、分かりやすいように一点鎖線で表している。
　複数の溝を平行縞状をなすように配置する場合、好ましい態様では、図５に示すように、互いに隣合った溝同士を隔てる壁部が、該ベース部材の上面に平面部分を持たず、互いに隣合った溝の開口同士が互いに接触する。このような構成は、溝全体の横断面形状がＶ字状である場合に好ましく達成される。このような構成によって、溝をより密に配置することができる。当該デバイスを用いて培養を行う場合、溝内だけに培養液と細胞を注入して培養を行ってもよいし、当該デバイス全体を培養液に浸漬して細胞を播種し培養を行ってもよい。当該デバイス全体を培養液に浸漬し、その後で細胞を播種する場合、播種される細胞が溝同士の間の平面に堆積するといったことが生じ難く、より多くの細胞が溝内に落ちるので好ましい。
（ベース部材の材料）
　ベース部材の材料（即ち、当該デバイスの材料）は、特に限定はされず、金属やポリマーなど、細胞培養に適した材料であってかつ安価で製造が容易な材料が好ましく、従来より細胞培養用の容器の材料として用いられている、ガラスや種々のポリマー材料（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル、シリコーン、シクロオレフィンポリマー（COP: Cyclo Olefin Polymer）など）が好ましいものとして挙げられる。これらのなかでも、シリコーンの一種であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、型を用いた成形が容易、オートクレーブによる加熱が可能、柔軟性がある、耐薬品性が高い、微細加工プロセスに適用可能といった利点を有するので、より好ましい材料として例示される。
（当該デバイスの製造方法）
　当該デバイスの製造方法は、材料に応じて適宜に決定してよく、プレスによる塑性変形、型を用いた樹脂成形、切削、３Ｄ印刷、ベース部材の上面に対するサブトラクティブな溝形成、ベース部材の上面に対するアディティブな溝加工、レーザー加工など、種々の方法が利用可能である。
　ベース部材の材料がＰＤＭＳである場合には、溝の形状に対応する凸状型を有する成形型を用い、硬化前の流動性を持ったＰＤＭＳを該成形型に流し込み（または凸状型に接触させ）、その状態で該ＰＤＭＳを硬化させて成形品（当該デバイス）を得るという製造方法が好ましい。ＰＤＭＳは、例えば、８０℃、３時間程度の加熱によって硬化し、ＰＤＭＳとなる。
（成形型の好ましい製造方法）
　成形型の好ましい製造方法の一例を示す。図６は、成形型の好ましい製造方法の一例を示す図である。
　該製造方法の例では、先ず、図６（ａ）、（ｂ）に示すように、型基板２１０の一方の面２１０ａに、溝の形状に対応する凸状型のコアとなる突起体２２０が、溝の中心間ピッチに応じて形成される。
　次に、図６（ｃ）、（ｄ）に示すように、前記の突起体２２０を覆うように、流動性を持った硬化前のポリマー原料（例えば、ＰＤＭＳ）を塗布し、硬化させて、Ｖ字状の凸状型２４０を得る。ここで、ポリマー原料を塗布する際に、該ポリマー原料の流動性、粘性、表面張力などを利用して、図６（ｃ）に示すように、該コーティング層２３０の横断面形状を、成形すべき溝の形状に対応したＶ字状の凸状型の形状にする。これにより、単純な形状のコアからＶ字状の凸状型が簡単に得られる。
　液状のポリマー原料を、図６（ｃ）に示すようなＶ字状にコントロールする条件としては、例えば、２５度における粘度３．５（Ｐａ・ｓ）程度の硬化前のＰＤＭＳで前記突起体を覆うように塗布し、室温（２３～２７℃程度）で真空デシケータ内で脱泡しながら３０分静間置後、８０℃、３時間で硬化するといった条件が例示される。
　本発明の実施例では、図６（ａ）、（ｂ）に示す部品（突起体２２０を備えた型基板２１０）を、３Ｄプリンターによって作製したが（材料は、ポリ乳酸（ＰＬＡ樹脂）である）、図６（ｃ）に示すようなＶ字状の凸状型２４０を備えた成形型２００を３Ｄプリンターによって作製してもよく、さらに表面を仕上げてもよい。
　図７は、上記した成形型を用いて当該デバイスを成形している様子を例示する断面図である。図７（ａ）に示すように、成形用の容器（図示せず）内の底面に成形型２００を配置し、または、成形型２００の周囲を壁部材で取り囲んで成形用の容器を成形し、そこに硬化前の流動性を持ったポリマー原料を流し込み、その状態で該ポリマー原料を硬化させることで、成形品（当該デバイス）１００を得る。次に、図７（ｂ）に示すように、成形型２００から成形品を剥離し、当該デバイス１００を得る。図８（ａ）は、本発明の実施例において製作した成形型の基板面を示す写真図であり、型基板２１０の一方の主面に突起体２２０が設けられている。また、図８（ｂ）は、図８（ａ）の成形型を用いて成形された本発明の実施例において製作した成形型の基板面を示す写真図であり、型基板２１０の一方の主面に突起体２２０が設けられている。
３．網膜色素上皮細胞のひも状凝集体の製造方法
　本発明はまた、ひも状に凝集した網膜色素上皮細胞の製造方法（以下、本発明の製造方法）を提供する。本発明の製造方法は、以下の工程を含む。
(1)図９（ａ）に例示するように、本発明のデバイス１００の溝１２０に液体培地に懸濁された網膜色素上皮細胞ａ１を播種する工程。
(2)図９（ａ）に例示するように、網膜色素上皮細胞ａ１を培養し、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体Ａ１を形成させる工程（図では、１つのひも状凝集体が溝から取り出される様子を示している）。
　工程(1)においては、本発明のデバイスの溝に培地に懸濁された網膜色素上皮細胞を播種する。
　工程(1)において網膜色素上皮細胞が懸濁される液体培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。培養において用いられる培地は、血清含有培地であっても、血清不含培地であってもよい。
　本明細書において血清含有培地とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。血清含有培地の血清濃度は無調整又は未精製の血清を、通常、５％以下、好ましくは、３％以下含む培地が挙げられる。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　本明細書において血清不含培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り血清不含培地に含まれる。
　血清不含培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’チオールグリセロール等、またはこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTM Serum Replacement（Life Technologies社製；現ThermoFisher：以下、KSRと記すこともある。）、Chemically-defined Lipid concentrated（Life Technologies社製）、GlutamaxTM（Life Technologies社製）、B27（Life Technologies社製）、N2サプリメント（Life Technologies社製）、ITSサプリメント（Life Technologies社製）が挙げられる。
　培養で用いる血清不含培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　工程(1)において網膜色素上皮細胞が懸濁される培地は、さらにROCK阻害剤を含んでいてもよい。
　本発明においてROCK阻害剤とは、Rhoキナーゼ（ROCK）の作用を阻害する物質であれば制限されない。Rhoキナーゼ（ROCK）は、低分子量Gタンパク質Rhoの下流に位置するセリン/スレオニンキナーゼとして見出された。Rho/ROCKシグナル伝達経路は、アクチン細胞骨格や細胞接着など様々な細胞機能に関わっている。iPS細胞の継代培養では細胞を分散させる必要があるが、これらの幹細胞は分散させた状態で培養するとアポトーシスにより細胞死を起こすことが知られている。分散により起こるアポトーシスには、Rho/ROCKシグナル伝達経路が関わっており、ROCK阻害剤を添加することによりアポトーシスが抑制される（アポトーシス抑制作用）ことが報告されている。さらに、細胞を凍結保存する際にROCK阻害剤を添加すると、解凍後の細胞生存率が上がることが報告されている（細胞生存率改善作用）。これらの報告より、iPS細胞の増殖培養時にROCK阻害剤が添加されるようになった。一方、再生医療用製品には、平衡塩類溶液やDMEM/F12培地等の基本培地を使用し、外来性の成分は含めないのが通常であったところ、本発明者らは、上記の作用に加えて、後述する実施例の通り、適切な濃度のROCK阻害剤を用いてひも状凝集体の作製を行うと、ひも状凝集体がより安定し、さらにRPE細胞のひも状凝集体の移植先での生着と細胞の生えだしを促進するという新たな作用を有することを見出した。
　本発明において、ROCK阻害剤は、新たに見出された上記の作用（ひも状凝集体形成促進作用）と同質または実質的に同質な作用を有する限り、どのような分子であってもよい。「実質的に同質」とは、それらの作用が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、前記作用は同等であることが好ましいが、これらの作用の程度（例えば、約0．1～約10培、好ましくは約0．5～約2倍）は異なっていてもよい。前記作用の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。そのようなROCK阻害剤としては、例えば、Y-27632 dihydrochloride、Y-27632、Fasudil Hydrochloride、Chroman 1、SLx-2119、HSD1590、GSK269962A hydrochloride、Exoenzyme C3, clostridium botulinum、Ripasudil、Afuresertib、Thiazovivin、GSK269962A、RKI-1447、Y-33075、GSK429286A、AT13148、H-1152 dihydrochloride、Y-33075 dihydrochloride、LX7101、SAR407899、ROCK-IN-2、Afuresertib hydrochloride、Hydroxyfasudil、GSK180736A、BDP5290、SR-3677、CCG-222740、CMPD101、Rho-Kinase-IN-1、SAR407899 hydrochloride、ROCK inhibitor-2、ZINC00881524、H-1152、Hydroxyfasudil hydrochloride、Fasudil、ROCK2-IN-2、Verosudil、SB-772077B dihydrochloride、GSK-25、CRT0066854 hydrochloride、Ripasudil free base、ROCK-IN-1等が挙げられ、好ましくは、Y-27632 dihydrochloride、Y-27632が挙げられる。
　ROCK阻害剤は、自体公知の方法により製造することができる。また、ROCK阻害剤は、市販品を購入して使用することもできる。例えば、Y-27632は富士フイルム和光純薬株式会社などから購入することができる。また、Ripasudilはグラナテック（登録商標）（Kowa）、Fasudil Hydrochlorideはエリル（登録商標）（旭化成ファーマ）等の商品名で市販されている。
　培地に含まれるROCK阻害剤の濃度は、本発明のデバイスの溝においてRPE細胞にひも状凝集体を形成させる限り特に制限されないが、通常、0μM～20μM、好ましくは、2μM～10μMである。ROCK阻害剤の濃度が高すぎると本発明の凝集体が硬く凝集しすぎて、移植後の細胞の広がりに影響を与える懸念がある。
　工程(2)においては、工程(1)で播種された網膜色素上皮細胞を培養する。
　工程(2)において、溝内において培養される網膜色素上皮細胞の密度は、本発明のデバイスの溝において網膜色素上皮細胞がひも状凝集体を形成する限り特に制限されないが、通常、2.5x103細胞/mL以上、好ましくは、2.5x103細胞/mL～5x105細胞/mL、より好ましくは、1x105細胞/mL～2x105細胞/mLである。これ以上溝内における細胞の密度が高い場合、形成されるひも状凝集体の胴体の外径が大きくなり、移植後の細胞が広がらないこと、術部において移植された細胞がマルチレイヤーを形成するなどの懸念がある。
　工程（2）における網膜色素上皮細胞の培養時間は、工程（2）によって網膜色素上皮細胞のひも状凝集体が得られる限り特に限定されないが、通常、１日間～30日間、好ましくは、2日間～7日間である。培養期間がこれより長くても短くても、本発明の凝集体が、培地交換の際に本発明のデバイスから離型してしまう懸念がある。
　工程(2)における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
４．網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬
　以上の通りにして得られる本発明の網膜色素上皮細胞のひも状凝集体は、網膜組織の障害に基づく疾患、例えば、網膜色素上皮の障害に基づく疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を含む、網膜色素上皮の障害に基づく疾患の治療薬（本発明の治療薬）を提供する。
　本発明の治療薬は、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体の有効量、及び医薬として許容される担体を含む。本発明の治療薬に含まれる網膜色素上皮細胞のひも状凝集体は、本発明の製造方法によって製造されたものが挙げられる。
　医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることが出来る。必要に応じて、移植医療において、移植する組織や細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
　本発明の治療薬は、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を、適切な生理的な水性溶媒に浮遊させることにより、浮遊液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して、凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いても良い。
　網膜色素上皮の障害に基づく疾患の治療薬として、或いは、網膜色素上皮の萎縮や損傷状態において、該当する萎縮/損傷部位を補充するために、本発明の網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を用いることが出来る。移植を必要とする、網膜色素上皮の障害に基づく疾患、又は網膜色素上皮の萎縮や損傷状態の患者に、本発明の網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を移植し、網膜色素上皮を補充することにより、網膜色素上皮の障害に基づく疾患、又は網膜色素上皮の萎縮や損傷状態を治療することが出来る。網膜色素上皮の障害に基づく疾患や網膜色素上皮の萎縮や損傷状態を伴う疾患としては、例えば、眼科疾患である加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、網膜色素上皮裂孔等が挙げられる。
　本発明の治療薬における網膜色素上皮細胞のひも状凝集体の含有量は、疾患部位、即ち、黄斑変性症や網膜色素変性症における網膜色素上皮の欠損部位に注入される浮遊液（例えば、50～500μL、好ましくは100～300μL）中に、治療上有効な量のRPE細胞を含む網膜色素上皮細胞のひも状凝集体が含まれる限り特に制限はないが、例えば、RPE細胞が100～20,000細胞/μL、好ましくは1,000～10,000細胞/μLとなるように網膜色素上皮細胞のひも状凝集体の浮遊液を注入することができる。本発明の治療薬は、RPE細胞の懸濁液のような移植部位における細胞の制御に困難性を伴うことがなく、かつ移植された細胞が硝子体の中に網膜上膜（ERM）を形成させることもない。また、本発明の治療薬は、RPEシートのようにシートの準備に時間、コストが掛かることがなく、大きな切開を伴う侵襲的な外科的処置が必要ということもない。
本発明の治療薬は、適当なシリンジ及び針を含む移植用デバイス（例えば、MedOne0(登録商標) Poly Tip(登録商標) Cannula 25g/31g等）を用いて、例えば、黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症等）、網膜色素変性症等の網膜疾患を有する哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット等、好ましくはヒト）の網膜下に注入することにより、移植することができる。本発明の治療薬を移植する際に使用する媒体として、粘弾性物質（シェルガン、ビスコートなど）をOptiMEMで4-8倍希釈した媒体を利用することができる。移植用媒体の利用により、本発明の網膜色素上皮細胞のひも状凝集体の吸引および吐出を円滑に実施できる。
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実験手順
　すべての動物実験プロトコルは、理化学研究所バイオシステムダイナミクスリサーチ（BDR）センターの動物ケア委員会の承認を受け、現地のガイドラインおよび眼および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に準拠して実施された。hiPS細胞は、理化学研究所バイオシステムダイナミクスリサーチ（BDR）センターの倫理委員会の承認を得て、ボランティアからインフォームド コンセントを得て作製した。
実施例１
hiPSC-RPEのひも状凝集体作製のためのPDMSベース培養デバイスの作製
　長さ19.5mm、幅1mm、深さ1.6mmの溝を有するPDMSベースの培養デバイスを作製した。このデバイスの作製プロセスをまとめた。まず、ポリ乳酸（PLA)フィラメントを用いた3Dプリントにより、本デバイス用の金型を作製した。3Dプリントされた金型を削り、溝の形状を調整するためにPDMSを塗布した後、離型剤（Novec1720、住友スリーエム社製）を金型上に塗布した。PDMSとPDMS用硬化剤（サイポット184W/C）（ダウコーニング東レ社製）を10:1の割合で混合し、3Dプリントされた金型上に流し込み、約１時間脱気した。次いで、3Dプリントされた金型とPDMSの混合物を80℃のオーブンに３時間入れた。硬化したPDMSを3Dプリントされた金型から回収し、トリミングした。溝底の曲率半径を共焦点走査型レーザー顕微鏡（KEYENCE、VK-8710）で測定したところ、R 0.2mmであった（図１０）。
ヒトiPSC（hiPSC）およびhiPSC由来RPE細胞（hiPSC-RPE）の調製
　健康なボランティアの末梢血単核球（PBMCs）に6つのリプログラミング因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28、およびp53カルボキシ末端ドミナントネガティブフラグメント）を導入することにより、本発明者らの研究室でM8ヒトiPSC株を樹立した。簡単に言えば、エピソームベクター（Addgeneから購入したpCE-hOCT3/4、pCE-hSK、pCE-hUL、pCE-mp53DD、pCXB-EBNA1）をPBMCにエレクトロポレーションし、その後、以前に記載したようにiPSC様コロニーを摘出した（Okitaら、2011）。数回の継代後、本発明者らは、iPSC様細胞から抽出したDNAを用いてPCR解析を行い、プラスミド特異的プライマーでエピソームベクターの残存が検出できないことを確認した。
　201B7株と253G1 hiPSC株（Nakagawa et al., 2008年；Takahashi et al., 2007年）を理研バイオリソースセンターから入手した。細胞周期のG1期および細胞体全体を可視化するために、改変Fucci 201B7株(201B7modFucci)を発明者らの研究室で作製した。簡単に説明すると、tFucci(CA)2/pCSII-EFベクター(A. Miyawaki先生からの贈与；https://cfm.brc.riken.jp/lentiviral-vectors/plasmid-list/)からmCherry-hCdt1(30/120)-P2A-mVenus領域を切り出し、Addgene(Plasmid #80489)から取得したpAAVS1-Nst-CAG-DESTベクターにライゲーションした。201B7を、DNA-in CRISPR送達培地（MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD）を用いて、AAVS1遺伝子座を標的とするように設計されたgRNAをコードする改変FucciコンストラクトおよびCas9ベクター（Addgene Plasmid #62988）と共トランスフェクションした（Oceguera-Yanezら、2016）。トランスフェクション後、mVenus陽性201B7コロニーを解離し、継代し、単一クローン由来のコロニーを摘出した。
　hiPSC-RPE細胞をSFEBq法（Kuwahara et al., 2015、2019；Nakano et al., 2012）を用いて分化させた。手短に言えば、分化誘導の前日に5μM SB431542(Sigma-Aldrich)および300nM SAG(Enzo Life Sciences, Inc)をiPS細胞に添加した。0日目に、iPS細胞を、IMDM:F12(1:1、Life Technologies)、10% Knockout Serum Replacement (KSR)、1% Chemically Defined Lipid Concentrate（Life Technologies）、30w/v % BSA（脂肪酸フリー）、450μMモノチオグリセロール、30nM SAG、20μM Y-27632（富士フイルム和光純薬株式会社）およびペニシリン-ストレプトマイシンを増殖因子フリーの化学的に定義された培地(gfCDM)に懸濁させ、PrimeSurface 96V(住友ベークライト株式会社)中で培養した。6日目に1.5nM BMP4を添加し、gfCDMの半量を3日ごとに交換した。18日目には、細胞を1% N2サプリメント（Life Technologies）、3μM CHIR99021（Stemgent, Cambridge）、および5μM SU5402を含むDMEM/F12-Glutamax培地を用いてUltra Low Culture Dish（Corning Incorporated）（Corning Incorporated）中に移した。22日目以降は、細胞は、１％N2サプリメント、10％ウシ胎児血清(Biosera)、0.5μMレチノイン酸(sigma)、0.1mMタウリン(sigma)、および1x抗生物質 抗真菌薬（gibco）を含むDMEM/F12-Glutamax培地（Life Technologies）中で培養した。
　30日目から60日目までの間に、色素性コロニーをピックアップし、「RPE接着培地」および「RPE維持培地」の1:1混合培地（以下、「混合培地」）中、iMatrx511でコートされた12ウェルプレートにプレートした。「RPE接着培地」は、DMEM/F-12(Sigma-Aldrich)、10％ウシ胎児血清（SAFC Biosciences Inc.)、ゲンタマイシン溶液(Sigma-Aldrich)を含み、「RPE維持培地」は、DMEM-低グルコース(Sigma-Aldrich)、30% F-12(Sigma-Aldrich)、2% L-グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）、2% B-27TMサプリメント（50X）（Thermo Fisher Scientific Inc.）、およびゲンタマイシン溶液（Sigma-Aldrich社）を含む。一旦、細胞が付着した後、培地を10ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むRPE維持培地に交換した。1度継代しで細胞培養液をRPE維持培地中に広げて、STEM-CELL BANKER（Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.）を用いて-150℃で細胞をストックした。
　各実験では、ストックした細胞を解凍し、混合培地に播種した後、10ng/mL bFGFおよび0.5μM SB431542を補充したRPE維持培地に培地を交換し、細胞が使用されるまで数日ごとに培地を交換した。253G1株から分化させたRPE細胞は、Kitahata et al., 2019に記載したように調製した。
ひも状凝集体の作製
　解凍後、hiPSC-RPE細胞を2週間培養し、細胞を集めて、最適濃度のY-27632を含む15μl RPE維持培地（各実験で示された濃度）を用いて、各実験で記載された細胞数でPDMSベースの培養デバイスの各溝に播種した。
プレートされたひも状凝集体からのRPEの拡張面積の解析
　ひも状凝集体をデバイスの溝から離型し、混合培地を入れた非コート24ウェルプレート（Corning Incorporated）上に、ひも状凝集体を播種し、ひも状凝集体接着後（２～３日後）にRPE維持培地（bFGFおよびSB431542を含む）に交換した。培養中のディッシュをIncuCyte Zoomシステム（Essen BioScience）を用いて撮影した。得られた画像データから、拡張した細胞を手動でFijiを用いてマーキングし、拡張した面積を測定した。
免疫組織化学
　培養したひも状凝集体または細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温にて１５分間固定した。移植した眼を4℃の4%パラホルムアルデヒドで1時間固定し、固定後角膜を除去した。凍結切片用サンプルは、30%スクロースに1日以上浸漬し、OCTコンパウンド（Sakura Finetek Japan Co., Ltd.）で凍結し、厚さ10μmのクライオ切片を作製した。サンプルは、リン酸緩衝生理食塩水中の0.2% Triton X -100で30分間透過させ、Blocking One（Nacalai Tesque）で室温にて1時間ブロッキングし、抗体希釈液（Dako）で希釈した一次抗体で4℃で一晩インキュベートした。使用した抗体は表１に記載した。二次抗体を室温で１時間処理し、共焦点顕微鏡（LSM700；Carl Zeiss）および蛍光顕微鏡（BZ-X810;KEYENCE）を用いて画像を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
RPEマーカー遺伝子のPCR
　RNeasy Micro Kit（Qiagen）を用いて細胞からTotal RNAを抽出し、SuperScript III Reverse Transcriptase Kit（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した。RPEマーカー（BEST1、RPE65、CRALBP)およびハウスキーピング遺伝子(GAPDH)のプライマーの配列を表２に示す。PCR反応は、Blend Taq -Plus-（TOYOBO Co.,Ltd.）を用いて行った。サーマルサイクル条件は以下の通りであった。94℃で1サイクル180秒、94℃で30秒変性、58℃で30秒プライミング、72℃で60秒伸長の32サイクルを行い、その後72℃で60秒の1サイクルを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
In vitro RPE傷害モデル
　24ウェルプレートでのコンフルエントで培養したRPE細胞に6μg/mLのMitomycinC（kyowa hakko KIRIN）で処理し、翌日にRPE細胞の一部を約6mm幅のセルスクレーパーを用いて引っ掻いて除去した。細胞懸濁液（2x105）またはひも状凝集体を、RPEの傷ついた部分の上または中にプレーティング（「移植」）した。細胞を0.5mlの培地で維持し、培地交換前に24時間インキュベーションして、各介入のタイミングでELISAのために細胞を回収した。実験計画のスケジュールおよび培地収集のタイミングを図１１Ａに示す。
VEGFおよびPEDFのELISA
　VEGFおよびPEDFのELISAは、それぞれVEGF Human ELISA Kit（Life Technologies）およびHuman PEDF ELISA Kit（Biovendor）の製造者プロトコルに従って行った。
ラットの眼への移植
　免疫不全F344/NJc1-rnu/rnu雌ヌードラット（6週齢）をCLEA Japanより入手した。使い捨てマイクロピペット（Drummond、1-000-0500）をマイクロピペットプラー（Sutter、P-97/IVF Puller）で引き、マイクログラインダー（Narishige、EG-400）を用いて先端を切断し、研いだ。その後、マイクロピペットを電極ハンドル6.3mm(WPI, 2505)上の電極ホルダー(WPI, MPH310)に取り付けて、10μlマイクロシリンジ(Hamilton, 1701LT)に延長チューブを用いて結合させた。5％イソフルランの吸入によって動物を麻酔し、0.4％トロピカミドで瞳孔を散瞳した。ひも状凝集体をマイクロピペットに装填し、ひも状凝集体を網膜下に移植した。
ウサギの眼への移植
　kbl:JWウサギ（9週齢）をオリエンタル酵母工業株式会社（東京）から入手した。動物は、60mg/kgのケタミンと10mg/kgのキシラジンの筋肉内注射により麻酔した。後部硝子体剥離を伴うルーチンの硝子体手術の後、ひも状凝集体を、特注のフラットカット25G鈍針を内芯とする24ゲージの留置針カニューレ（TOP、SS-6）に装填した。局所網膜剥離をPolyTipカニューレ25g/38g（MedOne、25g/38g）で作製後、移植片を50μlマイクロシリンジ（Hamilton、1705LT）を用いて剥離網膜ブレブにゆっくりと注入した。次いで、パーフルオロカーボン液体（Alcon, 8065900111）を、剥離の上に注入して、網膜を圧迫し、付着させ、次いで、流体-ガス交換を行った。
結果
ひも状凝集形態hiPSC-RPEの調製
　PDMSベースの培養デバイスを用いたひも状凝集体調製のスキームをまとめた。まず、ヒトiPSC-RPE細胞（253G1株）を「RPE維持培地」、「RPE細胞シート培地（10％ウシ胎児血清を含むF10培地）」、または10μM Y-27632を含む「混合培地」に懸濁し、各溝に播種した。シート培地ではひも状凝集体が崩れやすいように見えたが、維持培地および混合培地ではひも状凝集体構造がよく保持されていた（図１２ＡおよびＢ）。次に、異なる数の細胞（4.5×105、1.5×105、5×104）を播種し、前者2条件でひも状凝集体を形成できることを観察した（図１２Ｃ）。実施例では、4.5x105細胞で播種したhiPSC-RPEを溝から剥離し、24Gの静脈内カニューレに装填した。
ひも状凝集体に対するY-27632濃度の最適化
　次に、4.5x105細胞と1.5x105細胞で形成されたひも状凝集体をウェルにプレートした。両方の開始細胞数のひも状凝集体は、ひも状凝集体から非コーティングプレート上のRPE細胞の拡大を示し、1.5x105細胞で形成されたひも状凝集体は、2週間後にまだ初期形状の大部分を保持していた4.5x105細胞で形成されたひも状凝集体と比較して、初期形状をより早く失った（図１３Ａおよび図１２Ｄ）。そこで、発明者らは、開始細胞数を1.5-2x105細胞に固定した。ひも状凝集体（1.5x105細胞）を断片化すると、初期のひも状凝集体形態の大部分が失われた（図１３Ａ’）。
　発明者らの予備実験（図１４Ａ）では、Y-27632の濃度は、より高い濃度ではひも状凝集体がより引き締まる方向に、ひも状凝集体の質感に影響を与えるように思われた。発明者らは、ひも状凝集体形成におけるY-27632の濃度0、1、2、2.5および10μMを試験した。hiPSC-RPEs（M8株）は、2μM以上の濃度でひも状凝集体の形態を形成することができたが、0および1μMのY-27632では、ひも状凝集体はうまく形成されなかった。10μMのY-27632で形成されたひも状凝集体は、非コーティングウェル上に置いた後に容易に剥離し、2-2.5μMのY-27632で形成されたひも状凝集体と比較して、24ウェルプレート上に付着するのに時間がかかり、拡大が遅れた（図１４ＢおよびＣ）。
　次に、発明者らは、Y-27632の2.5μMまたは10μMのいずれかで作製したひも状凝集体を直接比較した（図１３Ｂ－Ｇ）。2.5μMのY-27632で形成されたひも状凝集体は平坦で緩んでいるように見えた。一方、10μMのY-27632で形成されたひも状凝集体はより緊密に見えた（図１３Ｂ）。
　ひも状凝集体切片をギャップジャンクションマーカーZ0-1、極性マーカーEzrin(頂端)とラミニンとコラーゲン型IV(基底)に関して染色した(図１３Ｃ)。両条件において、ギャップジャンクションマーカーZO1が細胞間で発現しており、基底マーカーであるラミニンは細胞表面全体に分布し、頂端マーカーであるEzrinは、断片化された細胞塊の表面に局在しているように見えた。別の基底マーカーであるコラーゲンIVが明確に発現しておらず、細胞の極性がこれらのひも状凝集体では明確に決定づけられていない。
　次いで、2日目（図１３ＤおよびＥ）および3日目（図１３ＦおよびＧ）のひも状凝集体を用いて、2.5および10μM Y-27632で形成されたひも状凝集体間で、非コーティングウェルへのプレートした後の細胞の拡大を比較した。2.5μMのY-27632で形成されたひも状凝集体は、設置後早期からプレートに付着し、拡大し始める傾向があった。一方、10μMのY-27632で形成されたひも状凝集体はコイル様になりがちで、沈静化し、拡大を開始するまでの数日間は動き回っていた。
別のhiPSC-RPE株を用いたひも状凝集体形成の再現性
　本発明者らは、別のhiPSC株が同様にひも状凝集体を形成できるかどうかを試験した。本発明者らは、201B7modFucci株を用いてRPEの分化を誘導し、hiPSC(M8)-RPEと比較した。hiPSC(201B7modFucci)-RPEもhiPSC(M8)-RPEと同様にひも状凝集体を形成したが、201B7modFucci株は安定にひも状凝集体を形成するために5μM以上のY-27632濃度を必要とした(図１５-１Ａ)。接着/拡大アッセイに最適なY-27632濃度もhiPSC(201B7modFucci)-ひも状凝集体では5μMであり、用いる細胞株により目的とする接着/拡大効果に最適なY-27632濃度は異なり適正化が必要であった。(図１４ＤおよびＥ)。両方のhiPSC株のひも状凝集体から拡大された細胞は、RPE細胞の特徴的な色素沈着および玉石様の外観を示し、ZO-1およびMITFを発現した（図１５-１ＢおよびＣ）。RPE特異的マーカー遺伝子（BEST1、RPE65、RLBP1)の発現もまた、ひも状凝集体形成前、ひも状凝集体形成中、およびひも状凝集体からの拡大後のhiPSC-RPEの各段階でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により確認された（図１５-１Ｄ）。RPE細胞は、プレート上で単層状にひも状凝集体から拡大することが観察された（図１５-１Ｅ）。ひも状凝集体からの拡大がRPEの増殖を伴うかどうかを見るために、プレート上にひも状凝集体を置いてから１４日後の細胞の総数を、2×105 hiPSC-RPE細胞を用いて形成された2日目のひも状凝集体における初期細胞数と比較した。拡大した細胞と残りのひも状凝集体の細胞の合計数は平均で5.28×105であり、これはday-2ひも状凝集体の平均細胞数(1.36×105)の約4倍であり、このことはRPEの増殖がひも状凝集体からの細胞拡大にも寄与したことを示している(day 2ひも状凝集体n=4; hiPSC(M8)-ひも状凝集体n=6からの拡大; hiPSC(201B7modFucci)-ひも状凝集体n=6からの拡大) (図１５-２Ｆ)。同時点で一緒にした拡大した細胞と残りのひも状凝集体によるVEGFとPEDFの分泌を試験した（ひも状凝集体を置いてから14日後）。
　拡大したhiPSC-RPEは、元々ひも状凝集体形成に使用された細胞と比較して、VEGFおよびPEDFを同じ程度分泌した。(hiPSC(M8)-RPE n=6およびhiPSC(201B7modFucci)-RPE n=6; 対照として両株のひも状凝集体形成前RPE細胞。ｎ＝４）（図１５-２Ｇ）。
細胞懸濁液またはひも状凝集体によるin vitro RPE損傷モデルへの模倣hiPSC-RPE移植によるRPEの置換
　ひも状凝集体または細胞の移植がどのように損傷したREEを補償することができるかを調査するために、発明者らは、図１１Ａに示すようにRPE損傷した環境でのhiPSC-RPE移植のin vitroモデルを設計した。簡単に言えば、非コーティング24ウェルプレート中のhiPSC-RPE(M8株)培養物をMMCで処理し、細胞の増殖を抑制し、翌日にウェルの中央部をスクラッチした。翌日、ひも状凝集体または懸濁細胞(201B7modFucci株)をそれぞれ、スクラッチされた部分の上に配置または播種し、「移植」されたRPE細胞による充填または置換についてIncucyteを用いてモニターした（図１１Ｂ）。
　コントロールウェル（非供給ウェル）では、MMC処理済みの既存のRPEが徐々に拡大、遊走し、欠損領域をゆっくりと減少させた。懸濁液中の移植されたRPE細胞は、急速に欠損領域を占有した。ひも状凝集体を用いた場合、既存のRPEと接触するまでRPEはひも状凝集体から拡大したが、接触阻害によりひも状凝集体からの細胞拡大は停止したようであった。欠損領域および移植されたRPEによって占有された領域の平均を、図１１Ｂ'（ひも状凝集体および懸濁液；ｎ＝５、コントロール；ｎ＝３）において、インビトロ移植後１日目、７日目、および２８日目で計測し定量的に示した。ひも状凝集体では、既存のRPEと移植されたRPEの間の境界線は、移植された201B7modFucci細胞によるmCherryの発現およびRPE細胞のサイズによって合理的に同定された；MMC処理された、非分裂性のRPEは、一般に、移植されたRPEから拡大されたものよりも大きかった（図１１Ｃ）。ギャップジャンクションマーカーZO-1は、興味深いことに、2つの集団の境界線（図１１Ｄ）を横切って妨害することなく、既存および移植されたRPE集団の両方の全体にわたって観察された。
　さらに、VEGF（図１１Ｅ）およびPEDF（図１１Ｆ）の分泌もまた、各ウェルにおけるRPE全体の機能を推定するためのパラメータとしてモニターした。VEGFの分泌は、スクラッチ後に有意に減少し、そこから28日後までは全群で増加した。細胞懸濁液移植では、VEGF分泌はMMC治療前とほぼ同等であった。移植群ではスクラッチ後にPEDF分泌が減少した。
ひも状凝集体移植では一旦スクラッチ後にPEDF分泌が減少したが、28日後にはMMC処理前と差がなく、細胞移植ではスクラッチ後から有意に増加したが、細胞置換なしではPEDF分泌は減少し続けた（コントロールn=4、ひも状凝集体n=8、RPE細胞n=7）。
ヌードラットへのひも状凝集体移植
　次に本発明者らは、2.5μMまたは10μMのY-27632で2x105細胞から形成したひも状凝集体をアルビノヌードラットに移植し、手術時の操作性と移植後の移植片の生存率を試験した。移植したひも状凝集体は、宿主眼の正常なRPE上に網膜下（n=10, 10μM Y-27632、n=11, 2.5μM Y-27632）に安定して移植することに成功した。健康なRPEの存在は、移植されたひも状凝集体の拡大を阻害するように思われたが、ひも状凝集体は、予期せぬ腫瘍形成または移植片の損失なしに10ヶ月まで安定的に生存した（図１６Ａおよび表３）。
　光干渉断層撮影イメージング法（Envisu R2200 VHR, Bioptigen, Inc.）による断面図は、移植片表面に明確なRPE様反射を提示した（図１６Ｂ）。同一眼の組織学的解析では、ひも状凝集体の色素細胞層にヒトマーカーKu80/XRCC5陽性を提示した（図１６ＣおよびＤ）。これらの細胞は、明らかに頂端（エズリン）および基底（コラーゲン型IV）マーカーを発現し、移植後に正しい極性を示していた（図１６Ｅ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
ウサギの目へのひも状凝集体注射
　最後に、ウサギ2眼を用いて、臨床現場でのひも状凝集体移植の手術手技の実用性を確認した。24Gの静脈内カニューレにひも状凝集体を装填した（図１７）。通常の硝子体手術の後、網膜剥離を行い、良好な視覚コントロールの下、網膜出血部にひも状凝集体を注入することに成功した（図１８）。
実施例２
hiPSC-RPEのひも状凝集体作製のためのCOPベース培養デバイスの作製　シクロオレフィンポリマー（COP: Cyclo Olefin Polymer）プレート（日本ゼオン(株)製）を切削加工して長さ20mm、幅1mm、深さ2mmの溝を有するCOPベースの培養デバイス（溝底のR 0.5mm）を作製した（図１９）。
hiPSC由来RPE細胞（hiPSC-RPE）の調製
　M8 hiPSC株（理研）はSFEBq法により、QHJI01s04 hiPSC株（京大）はN Engl J Med 2017;376:1038-46に記載された方法により、それぞれ分化誘導してhiPSC由来RPE細胞（hiPSC-RPE）を調製し、実施例１と同様の方法により-150℃で細胞をストックした。
ひも状凝集体の作製　解凍後２週間培養したhiPSC-RPE細胞(M8株、QHJI01s04株)を回収後、5 μMのY-27632を含む10μl維持培地と共に2x105の細胞数でCOPベースの培養デバイスの各溝に播種した。２日後にひも状凝集体が形成されることを確認した。
解凍直後の細胞を利用したひも状凝集体の作製
　解凍直後のhiPSC-RPE細胞をCOPベース培養デバイスの各溝に播種し、２日後にひも状凝集体を形成することができた。従って、細胞の解凍からひも状凝集体の形成までの時間を２日にまで短縮することが可能となった。
ひも状凝集体の凍結保存
　作製後のひも状凝集体が含まれる培地をSTEMCELLBANKERに置換し、クライオチューブに入れて-80℃に一時保存した後、-150℃で凍結保存を行った。4ヶ月後にひも状凝集体を解凍し、混合培地に浮遊させ、ディッシュへプレートした。プレートされたひも状凝集体はディッシュに付着し、拡大することを確認した。
ウサギまたはサルの眼への移植
　ひも状凝集体は25g/31g、25g/33g、25g/38gのPolyTip カニューレ（MedOne社）で吸引、吐出できることを確認した。媒体としてOptiMEMで4-７倍希釈した粘弾性物質（シェルガン、ビスコートなど）を用いると、滑らかにひも状凝集体を吸引または吐出することができた（図２０）。これらを用いて、実際にウサギ及びサルの網膜下へ38g MedOneカニューレを用いて剥離を作製後、25g/31gおよび25g/33gカニューレにてひも状凝集体を挿入できることを確認した。また、同様に、サルの眼球で剥離を作製後、約2μlの媒体で長さ20mmのhiPSC-RPE細胞のひも状凝集体を吸引、網膜剥離部位に挿入、術後の眼底においてもひも状凝集体の生着を眼底観察で確認した（図２１）。
　発明によれば、短時間、低コストで準備でき、かつ移植の方法が非侵襲的でありながら、その移植部位において容易に制御可能な網膜色素上皮細胞の移植材料を製造することが可能となる。本出願は、日本で出願された特願2021-078154（出願日：2021年4月30日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
１００：デバイス
１１０：ベース部材
１１０ａ：ベース部材の上面
１１１：第１のベース部分
１１２：第２のベース部分
１２０：溝
１２１：溝のキャビティ部分
１２２：溝の上部
１３０：溝とベース部材の上面との境界線
２００：成形型
２１０：型基板
２１０ａ：型基板の一方の面
２２０：突起体
２３０：コーティング層
２４０：Ｖ字状の凸状型
ａ１：網膜色素上皮細胞
Ａ１：ひも状凝集体
ｂ１：キャビティ部分の深さ
Ｂ１：溝全体の深さ
ｄ１：ひも状凝集体の胴体の外径
Ｌ１：ひも状凝集体の全長
Ｗ１：キャビティ部分の幅
Ｗ２：溝の開口部の幅
Ｘ１：溝の幅方向に延びる切断線
θ１：溝の内壁の傾きの角度

Claims (14)

  1. 　網膜色素上皮細胞のひも状凝集体。
  2. 　全長／胴体の外径の比率が2～1,000という特徴を有する、請求項１に記載のひも状凝集体。
  3. 　横断面形状が円形または楕円形という特徴を有する、請求項２に記載のひも状凝集体。
  4. 　網膜色素上皮細胞が多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載のひも状凝集体。
  5. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のひも状凝集体を製造するためのデバイスであって、
    　ベース部材を有し、
    　該ベース部材は、１以上の溝が設けられた上面を有し、
    　該溝は、播種される網膜色素上皮細胞をひも状凝集体へと培養するための型として、ひも状凝集体の長さと幅とを持ったキャビティ部分を有している、
    前記デバイス。
  6. 　前記溝が、該溝の底部としてキャビティ部分を有し、かつ、該キャビティ部分の上に位置する上部を有し、該上部が前記溝の開口を有している、請求項５記載のデバイス。
  7. 　前記溝の横断面形状がＶ字形状であり、該Ｖ字形状の最深部が丸みを帯びている、請求項５に記載のデバイス。
  8. 　下記の工程を含む、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体の製造方法；
    (1)請求項５に記載のデバイスの溝内に液体培地に懸濁された網膜色素上皮細胞を播種する工程、
    (2)前記溝内において、網膜色素上皮細胞を培養し、網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を形成させる工程。
  9. 　培地がROCK阻害剤を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　ROCK阻害剤が、Y-27632である、請求項９に記載の方法。
  11. 　溝内において培養される網膜色素上皮細胞の密度が、2.5x103細胞/mL～5x105細胞/mLである、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　網膜色素上皮細胞の培養期間が、1日～7日である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を含有する、医薬組成物。
  14. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の網膜色素上皮細胞のひも状凝集体を含有する、網膜色素上皮の障害に基づく疾患の治療薬。
PCT/JP2022/019293 2021-04-30 2022-04-28 網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬 WO2022230977A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023517622A JPWO2022230977A1 (ja) 2021-04-30 2022-04-28
CN202280031558.9A CN117597433A (zh) 2021-04-30 2022-04-28 视网膜色素上皮细胞的条状聚集体、用于制造其的装置和制造方法、以及含有该条状聚集体的治疗药物
CA3218400A CA3218400A1 (en) 2021-04-30 2022-04-28 Cord-like aggregates of retinal pigment epithelial cells, device and production method for producing same, and therapeutic agent comprising said cord-like aggregates
AU2022266430A AU2022266430A1 (en) 2021-04-30 2022-04-28 Cord-like aggregates of retinal pigment epithelial cells, device and production method for producing same, and therapeutic agent comprising said cord-like aggregates
EP22795890.7A EP4331673A1 (en) 2021-04-30 2022-04-28 Cord-like aggregates of retinal pigment epithelial cells, device and production method for producing same, and therapeutic agent comprising said cord-like aggregates

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021078154 2021-04-30
JP2021-078154 2021-04-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022230977A1 true WO2022230977A1 (ja) 2022-11-03

Family

ID=83848576

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/019293 WO2022230977A1 (ja) 2021-04-30 2022-04-28 網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4331673A1 (ja)
JP (1) JPWO2022230977A1 (ja)
CN (1) CN117597433A (ja)
AU (1) AU2022266430A1 (ja)
CA (1) CA3218400A1 (ja)
TW (1) TW202305112A (ja)
WO (1) WO2022230977A1 (ja)

Citations (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998030679A1 (en) 1997-01-10 1998-07-16 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
JP2003503021A (ja) * 1999-06-17 2003-01-28 ユニバーシティ オブ ウェールズ カレッジ オブ メディスン スフェロイドの調製
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2008118820A2 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
WO2009007852A2 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc Multipotent/pluripotent cells and methods
WO2009032194A1 (en) 2007-08-31 2009-03-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Wnt pathway stimulation in reprogramming somatic cells
WO2009058413A1 (en) 2007-10-29 2009-05-07 Shi-Lung Lin Generation of human embryonic stem-like cells using intronic rna
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009075119A1 (ja) 2007-12-10 2009-06-18 Kyoto University 効率的な核初期化方法
WO2009079007A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
WO2009091659A2 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant rna agents
WO2009101084A1 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
WO2009102983A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
WO2009117439A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009126655A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of a small molecule modulator
WO2009157593A1 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010009015A2 (en) 2008-07-14 2010-01-21 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/arid3a function
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
WO2010033906A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
WO2010050626A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells
WO2010056831A2 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2010068955A2 (en) 2008-12-13 2010-06-17 Dna Microarray MICROENVIRONMENT NICHE ASSAY FOR CiPS SCREENING
WO2010098419A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Kyoto University Novel nuclear reprogramming substance
WO2010102267A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Ipierian, Inc. Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
WO2010111409A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Pluripotent stem cells
WO2010111422A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
WO2010124290A2 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
JP2011525376A (ja) * 2008-06-24 2011-09-22 ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリ 自己集合性多細胞体、および前記多細胞体を用いて３次元の生物構造体を作製する方法
WO2015053375A1 (ja) 2013-10-09 2015-04-16 株式会社ヘリオス 網膜色素上皮細胞の製造方法
US20150168378A1 (en) * 2013-12-13 2015-06-18 TheraOptix, Inc. Retinal pigment epithelial primary cell culture system producing subcellular deposits
WO2015125941A1 (ja) 2014-02-21 2015-08-27 株式会社ヘリオス 眼疾患治療剤、そのスクリーニング方法または網膜色素上皮細胞移植に伴う拒絶反応の予測方法
WO2017043605A1 (ja) 2015-09-08 2017-03-16 大日本住友製薬株式会社 網膜色素上皮細胞の製造方法
JP2017532974A (ja) * 2014-10-29 2017-11-09 コーニング インコーポレイテッド ３ｄ細胞凝集体の生成及び培養のための装置及び方法
JP2020202785A (ja) * 2019-06-17 2020-12-24 株式会社サイフューズ 細胞立体構造体及びその製造方法
WO2021045122A1 (ja) * 2019-09-02 2021-03-11 株式会社ニチレイバイオサイエンス 網膜色素上皮細胞の三次元組織集合物の凍結体を製造する方法
JP2021078154A (ja) 2014-12-24 2021-05-20 キヤノン株式会社 ズーム制御装置、撮像装置、ズーム制御装置の制御方法、ズーム制御装置の制御プログラム

Patent Citations (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998030679A1 (en) 1997-01-10 1998-07-16 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
JP2003503021A (ja) * 1999-06-17 2003-01-28 ユニバーシティ オブ ウェールズ カレッジ オブ メディスン スフェロイドの調製
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2008118820A2 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
WO2009007852A2 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc Multipotent/pluripotent cells and methods
WO2009032194A1 (en) 2007-08-31 2009-03-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Wnt pathway stimulation in reprogramming somatic cells
WO2009058413A1 (en) 2007-10-29 2009-05-07 Shi-Lung Lin Generation of human embryonic stem-like cells using intronic rna
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009075119A1 (ja) 2007-12-10 2009-06-18 Kyoto University 効率的な核初期化方法
WO2009079007A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
WO2009091659A2 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant rna agents
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
WO2009101084A1 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
WO2009102983A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2009117439A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
WO2009126655A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of a small molecule modulator
WO2009126251A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2009126250A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through rna interference
JP2011525376A (ja) * 2008-06-24 2011-09-22 ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリ 自己集合性多細胞体、および前記多細胞体を用いて３次元の生物構造体を作製する方法
WO2009157593A1 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010009015A2 (en) 2008-07-14 2010-01-21 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/arid3a function
WO2010033906A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
WO2010050626A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells
WO2010056831A2 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2010068955A2 (en) 2008-12-13 2010-06-17 Dna Microarray MICROENVIRONMENT NICHE ASSAY FOR CiPS SCREENING
WO2010098419A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Kyoto University Novel nuclear reprogramming substance
WO2010102267A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Ipierian, Inc. Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
WO2010111409A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Pluripotent stem cells
WO2010111422A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
WO2010124290A2 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
WO2015053375A1 (ja) 2013-10-09 2015-04-16 株式会社ヘリオス 網膜色素上皮細胞の製造方法
WO2015053376A1 (ja) 2013-10-09 2015-04-16 株式会社ヘリオス 網膜色素上皮細胞の純化方法
US20150168378A1 (en) * 2013-12-13 2015-06-18 TheraOptix, Inc. Retinal pigment epithelial primary cell culture system producing subcellular deposits
WO2015125941A1 (ja) 2014-02-21 2015-08-27 株式会社ヘリオス 眼疾患治療剤、そのスクリーニング方法または網膜色素上皮細胞移植に伴う拒絶反応の予測方法
JP2017532974A (ja) * 2014-10-29 2017-11-09 コーニング インコーポレイテッド ３ｄ細胞凝集体の生成及び培養のための装置及び方法
JP2021078154A (ja) 2014-12-24 2021-05-20 キヤノン株式会社 ズーム制御装置、撮像装置、ズーム制御装置の制御方法、ズーム制御装置の制御プログラム
WO2017043605A1 (ja) 2015-09-08 2017-03-16 大日本住友製薬株式会社 網膜色素上皮細胞の製造方法
JP2020202785A (ja) * 2019-06-17 2020-12-24 株式会社サイフューズ 細胞立体構造体及びその製造方法
WO2021045122A1 (ja) * 2019-09-02 2021-03-11 株式会社ニチレイバイオサイエンス 網膜色素上皮細胞の三次元組織集合物の凍結体を製造する方法

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMINLI S ET AL., STEM CELLS, vol. 26, 2008, pages 2467 - 2474
FENG B ET AL., NAT CELL BIOL., vol. 11, 2009, pages 197 - 203
HAN J ET AL., NATURE, vol. 463, 2010, pages 1096 - 100
HENG JC ET AL., CELLSTEM CELL, vol. 6, 2010, pages 167 - 74
HUANGFU D ET AL., NAT BIOTECHNOL., vol. 26, 2008, pages 1269 - 1275
ICHIDA JK ET AL., CELLSTEM CELL, vol. 5, 2009, pages 491 - 503
J. YU ET AL., SCIENCE, vol. 318, 2007, pages 1917 - 1920
K. TAKAHASHI ET AL., CELL, vol. 131, 2007, pages 861 - 872
K. TAKAHASHIS. YAMANAKA, CELL, vol. 126, 2006, pages 663 - 676
KIM JB ET AL., NATURE, vol. 461, 2009, pages 649 - 643
LYNDON DA CRUZ ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, 19 March 2018 (2018-03-19)
LYSSIOTIS CA ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 106, 2009, pages 8912 - 8917
MAEKAWA M ET AL., NATURE, vol. 474, 2011, pages 225 - 9
MALI P ET AL., STEM CELLS, vol. 28, 2010, pages 713 - 720
N ENGL J MED, vol. 376, 2017, pages 1038 - 46
NAKAGAWA, M. ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 26, 2008, pages 795 - 797
NEUROSCI. LETT., vol. 458, 2009, pages 126 - 131
PLOS ONE, vol. 8, 2011, pages 409 - 412
R.L. JUDSON ET AL., NAT. BIOTECH., vol. 27, 2009, pages 459 - 461
SCHWARTZ, S.D. ET AL., LANCET, vol. 385, 2015, pages 509 - 516
SUGITA, S ET AL., J. CLIN. MED., vol. 9, 2020, pages 2217
YAMASHITA, T. ET AL., ACTA BIOMATER., vol. 45, 2016, pages 85 - 97
ZHAO Y ET AL., CELLSTEM CELL, vol. 3, 2008, pages 132 - 135

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022266430A1 (en) 2023-12-14
CA3218400A1 (en) 2022-11-03
TW202305112A (zh) 2023-02-01
EP4331673A1 (en) 2024-03-06
CN117597433A (zh) 2024-02-23
JPWO2022230977A1 (ja) 2022-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240148784A1 (en) Methods of producing human rpe cells and pharmaceutical preparations of human rpe cells
CN111164205B (zh) 包含视网膜组织的细胞聚集体及其制造方法
JP7150281B2 (ja) 連続的な上皮を含む網膜組織の成熟化方法
ES2971677T3 (es) Método para la producción de tejido retiniano
WO2019054514A1 (ja) 網膜組織の製造方法
JPWO2013051722A1 (ja) 角膜内皮細胞の製造方法
US20200277571A1 (en) Method for amplifying cone photoreceptors or rod photoreceptors using dorsalization signal transmitter or ventralization signal transmitter
WO2022230977A1 (ja) 網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬
US20240216440A1 (en) String-like aggregates of retinal pigment epithelial cells, device and production method for producing same, and therapeutic agent comprising said string-like aggregates
CN113766937B (zh) 包含神经视网膜、视网膜色素上皮细胞和水凝胶的复合体及其制造方法
WO2022239868A1 (ja) 網膜組織の製造方法
JP2024520423A (ja) 弱接着細胞を収容するための二次マトリックスを有する生分解性組織スキャフォールド
JP2024520424A (ja) 黄斑、中心および末梢網膜色素上皮細胞を生成する方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22795890

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023517622

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280031558.9

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3218400

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18558065

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022266430

Country of ref document: AU

Ref document number: AU2022266430

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022795890

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022795890

Country of ref document: EP

Effective date: 20231130

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022266430

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20220428

Kind code of ref document: A