CN113215084B - 一种羊胎儿皮肤成纤维细胞、其分离方法与应用 - Google Patents

一种羊胎儿皮肤成纤维细胞、其分离方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羊胎儿皮肤成纤维细胞、其分离方法与应用，其中，所述成纤维细胞的保藏号为CCTCC No：C2019202。本发明在羊胎儿皮肤成纤维细胞SFSFS的分离过程中分别采用含0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液以及Ⅳ型胶原酶处理羊胎儿皮肤组织，然后用含0.01‑0.05%胰蛋白酶‑EDTA消化液处理细胞；并采用3%胎牛血清+10‑40ng/ml的h‑EGF替代10%的胎牛血清培养羊胎儿皮肤成纤维细胞，使胎牛血清使用量大大减少，降低了SFSFS培养成本和羊口疮病毒生产成本，节约了资源。本发明的细胞株能够明显提高羊口疮病毒的分离率、缩短分离时间，且分离的羊口疮病毒毒价和病毒拷贝数也更高，可以为羊口疮病毒的规模化繁殖及病毒感染致病机制研究提供工具。

Description

一种羊胎儿皮肤成纤维细胞、其分离方法与应用
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种羊胎儿皮肤成纤维细胞，本发明同时还涉及该细胞的分离方法及应用。
背景技术
羊传染性脓包皮炎（Contagious Ecthyma，CE）俗称羊口疮，是由羊口疮病毒（ORFvirus，ORFV）引起的山羊、绵羊、主要羔山羊易感的一种急性、接触性传染病，也是一种人和其他动物均可感染的人畜共患传染病。ORFV主要在内蒙、西藏、新疆、云南、甘肃、四川、宁夏等养羊业密集地区流行，近年来频繁发生于宁夏、内蒙古、新疆、西藏、山东、湖北、云南、陕西和黑龙江、青海等地区。发病羊的嘴唇、口腔黏膜、舌头和鼻孔等部位会出现菜花状增生的典型症状，严重影响其采食和生产，且羊的死亡率也逐年攀升，对养羊业造成重创，而目前控制羊口疮最有效的方法是接种疫苗，因此，从发病羊群中分离鉴定羊口疮病毒，并利用该病毒分离毒株、研制出针对地方性ORFV的有效疫苗，对于羊口疮的预防及治疗具有重要的意义。
对于预防羊口疮疫苗的制备，主要包括以下方面：第一，通过不断分离、培养牛或羊原代细胞，从中分离出羊口疮病毒，然后连续传代进行弱化，进而制备弱毒疫苗；第二、目前也有灭活疫苗研发趋势；第三，由于羊口疮病毒表面覆盖着一个形如小管、纵横交错排列的囊膜覆盖了其抗原表位，导致羊体内产生的中和抗体少，对羊的保护率也较低，鉴于这种免疫学上的特殊性，有研究者用超声波等手段将ORFV的囊膜破坏再制备羊口疮疫苗，但上述几种情况都仅限于实验室研究，并没有在生产上大规模使用。主要原因在于：分离原代细胞费时、费力，费用昂贵，原代细胞传代次数少，培养的羊口疮病毒毒价低，批内生产量小、批间重复性因原代细胞的不同也难以一致。故急需开发传代次数多，培养费用低廉，繁殖病毒滴度较高的细胞，从而为羊口疮病毒的分离、规模化繁殖、工业化生产以及病毒感染致病机制的研究提供工具。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种传代次数多、培养成本低廉、培养病毒毒价高的羊胎儿皮肤成纤维细胞。
本发明的的另一目的是提供上述羊胎儿皮肤成纤维细胞的分离方法。
本发明的再一目的是提供上述羊胎儿皮肤成纤维细胞在羊口疮病毒的规模化繁殖及病毒感染致病机制研究中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的羊胎儿皮肤成纤维细胞SFSFS，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2019年9月22日，保藏编号为CCTCCNo.C2019202。
上述羊胎儿皮肤成纤维细胞的分离方法如下：
步骤1、羊胎儿皮肤成纤维原代细胞的分离
无菌取出羊胎儿，剪一小块皮肤组织，用pH7.0、浓度为0.05mol/L的PBS冲洗数次后，无菌剪碎，然后先用Ⅳ型胶原酶消化0.5-1h，加入1%胎牛血清终止消化，离心，沉淀用含0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液37℃保温消化10-30min后加入5%胎牛血清，过滤，滤液离心，弃上清，沉淀即为羊胎儿皮肤成纤维原代细胞，用含10%胎牛血清的基础培养基重悬铺板或冻存；
步骤2、羊胎儿皮肤成纤维细胞的优选
将细胞瓶用0.5-1%的细胞附着延伸因子浸泡后，加入含10%胎牛血清的基础培养基；接种步骤1中原代细胞，长满后加入0.01-0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液处理，反复多次后得到形态均一、至少可传40代的羊胎儿皮肤成纤维细胞，命名为SFSFS。
本发明利用上述方法分离得到的羊胎儿皮肤成纤维细胞株规模化繁殖ORFV病毒，具体操作为：采用含3%胎牛血清和10-40ng/ml 的h-EGF的基础培养基培养SFSFS细胞，接种ORFV弱毒苗毒株，48-72h后收病毒。
优选地，本发明采用含3%胎牛血清和20ng/ml 的h-EGF的基础培养基培养SFSFS细胞。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了一种羊胎儿皮肤成纤维细胞SFSFS，其形态较羊胎儿皮肤成纤维原代细胞稍有改变（见图1中A和B），经细胞生长曲线、细胞毒性实验等一系列实验验证，其生物学特性没有异常（见图2），接种ORFV后，24-48h产生细胞病变，48h时原代细胞病变程度次于SFSFS细胞（见图1中C和D）。因此，无论科学研究还是生产疫苗，该细胞完全可以用于小批量或大规模生产使用。
2、本发明在细胞分离过程中采用0.01%-0.05%的消化液处理羊胎儿皮肤组织和细胞，得到的羊胎儿皮肤成纤维细胞与未用消化液处理的羊胎儿皮肤成纤维原代细胞相比，形态均一，活力旺盛，耐受力强，传代次数可由5-15代增加至40代以上（见图1中B）。
3、h-EGF是一种多功能细胞生长因子，通过与细胞膜上h-EGF受体结合发挥生理作用。研究表明：表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的细胞膜上都含有h-EGF受体。h-EGF接近细胞后与细胞膜上的h-EGF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应，使得 RNA、DNA和蛋白质的合成增加，最终促进细胞生长繁殖、加速细胞新陈代谢。h-EGF与细胞受体的结合具有高度的敏感性，只需极微量的h-EGF就可促使细胞发生上述生理生化反应。本发明利用h-EGF的上述特性，采用3%胎牛血清和10-40ng/ml的h-EGF替代10%的胎牛血清培养羊胎儿皮肤成纤维细胞，使胎牛血清使用量大大减少：使用10%胎牛血清培养羊胎儿皮肤成纤维细胞时胎牛血清成本为17元/ml，而使用3%胎牛血清和10-40ng/ml的h-EGF时，成本为5.103元/ml，大大降低了SFSFS培养成本和羊口疮病毒生产成本，节约了资源。
4、将本发明提供的SFSFS细胞用含3%胎牛血清和10-40ng/ml h-EGF的DMEM/F12培养基培养，与用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养相比，能够明显提高羊口疮病毒的分离率，其一、羊口疮病毒致SFSFS细胞株的病变时间明显缩短，因为10%胎牛血清培养的细胞接种ORFV 48h时，还有未发生病变细胞，收毒时间大概需要60h以上，而含3%胎牛血清和10-40ng/mlh-EGF的DMEM/F12培养基培养的SFSFS细胞接种ORFV48h时已经全部发生细胞病变，因此，其收毒时间约为48h（如图5）；其二、用含3%胎牛血清和10-40ng/ml h-EGF的DMEM/F12培养基培养的SFSFS细胞株分离病毒的拷贝数比用10%胎牛血清培养的SFSFS细胞提高100倍以上，CT值由24左右降低为22左右（如表1）。
附图说明
图1为0.01-0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液未处理与处理后的羊胎儿皮肤成纤维细胞及其ORFV致细胞病变图；
A为未处理原代细胞；B为SFSFS细胞；C为接种48h时，ORFV致未处理原代细胞产生病变情况；D为接种48h时，ORFV致SFSFS细胞产生病变情况；
图2为0.01-0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液消化液未处理原代细胞与SFSFS细胞不同时间点生长曲线；
图3为不同浓度h-EGF作用SFSFS细胞48h时的细胞状态；
图4为不同浓度h-EGF作用SFSFS细胞后于不同时间点的CCK-8检测结果；
图5为接种ORFV后，不同浓度h-EGF促生长的SFSFS细胞产生病变情况。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明中所有以%表示的含量均为质量百分含量，基础培养基为DMEM/F12培养基。所用羊胎儿为甘肃永昌种羊场2014年9月从新西兰引进的无角陶赛特羊的纯种繁殖后代。
材料：ORFV弱毒苗参照现有方法自制得到；Ⅳ型胶原酶（4mg/ml）、PBS自配；胎牛血清、DMEM/F12培养基购买自Thermo公司。
实施例1
分离、优选羊胎儿皮肤成纤维细胞
常规无菌取出羊胎儿，剪一小块睾丸皮肤组织，用pH7.0、浓度为0.05mol/L的 PBS冲洗数次后，无菌剪碎，然后先用Ⅳ型胶原酶（4mg/ml）消化0.5-1h，加入2ml胎牛血清，1500rpm离心10min，弃上清，沉淀加入含0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液重悬，37℃保温消化10-30min，加入5%胎牛血清终止消化，然后依次用一层、两层高压灭菌纱布、100目以及200目滤网过滤，过滤期间，不断用PBS稀释滤液，最后所得滤液以1500rpm的转速离心10min，沉淀即为羊胎儿皮肤成纤维原代细胞，用含10%胎牛血清DMEM/F12重悬铺板或冻存。
用0.5%-1%的细胞附着延伸因子（AF）浸泡细胞瓶2h后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，将上述滤液经细胞计数后以1.0x106个/ml的浓度接种于细胞瓶中，一瓶用于传代，一瓶用0.01-0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液处理，待细胞瓶中细胞长满单层后，一瓶细胞继续传代，观察细胞代次，同时接种ORFV弱毒苗毒株，测定接毒情况；一瓶细胞再用0.01-0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液处理，弃处理液，更换新鲜培养基，长满单层后继续处理，反复处理4次后，取一瓶继续传代，观察传代情况，另一瓶接种ORFV弱毒苗毒株，测定接毒情况，结果如图1-2所示。
结果显示，本发明提供的一种羊胎儿皮肤成纤维细胞SFSFS，其形态较羊胎儿皮肤成纤维原代细胞稍有改变（见图1中A和B），经细胞生长曲线、细胞毒性实验等一系列实验验证，其生物学特性没有异常（见图2），接种ORFV后，24-48h产生细胞病变，48h时原代细胞病变程度次于SFSFS细胞（见图1中C和D）。未用0.01-0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液处理的羊胎儿皮肤成纤维原代细胞最多传20代，大多5代以上细胞状态即发生变化，很难在48h内长满；采用0.01-0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液处理后的羊胎儿皮肤成纤维细胞至少可传40代（图1中B），且接种于消化液处理后的细胞上的ORFV毒价略微升高。
以上结果说明，本发明通过0.01-0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液处理细胞的方式在不影响细胞活力的条件下优选出了生长、代谢旺盛的羊胎儿皮肤成纤维细胞，从而使其传代次数进一步提升，对ORFV敏感性也相应增强，解决了现有原代细胞传代次数少的问题，命名为SFSFS。
实施例2
SFSFS细胞对不同浓度h-EGF的耐受性
细胞由于需要10%的胎牛血清才能良好生长，降低胎牛血清浓度，细胞生长会受到影响。但胎牛血清费用昂贵，难以用于工业化生产ORFV疫苗。
本实施例2在实施例1的基础上，筛选一种对SFSFS细胞无毒性，又可降低胎牛血清使用量的培养基。
将SFSFS细胞以1.0x106个/ml的浓度分别分种于含3%胎牛血清+5ng/ml h-EGF，3%胎牛血清+10ng/ml h-EGF，3%胎牛血清+20ng/ml h-EGF，3%胎牛血清+30ng/ml h-EGF，3%胎牛血清+40ng/ml h-EGF的DMEM/F12培养基中，同时设含10%和3%胎牛血清培养基的细胞为对照，培养48h，观察细胞生长情况，其结果如图3所示。
图3结果显示，培养基瓶中含10%胎牛血清的细胞状态良好，含3%胎牛血清的细胞没有长满细胞瓶，含3%胎牛血清+5ng/ml 的h-EGF的细胞不但没有长满细胞瓶，其生长状态甚至不如仅含3%胎牛血清的细胞，含3%胎牛血清+10ng/ml的h-EGF的细胞基本长满细胞瓶，含3%胎牛血清+20 ng/ml-40ng/ml的h-EGF的细胞状态均比较好。由此可见，当胎牛血清浓度降低为3%时，添加10-40ng/ml的h-EGF就可以满足SFSFS细胞的生长需要。
实施例3
不同浓度h-EGF作用SFSFS细胞后于不同时间点的CCK-8检测结果
为明确不同浓度的h-EGF于不同时间点对SFSFS细胞活力的影响，分别以10%胎牛血清，3%胎牛血清，3%胎牛血清+5ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+10ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+20ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+30ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+40ng/ml的h-EGF与DMEM/F12组成培养基，将细胞分种于96孔板，每种培养基设五个重复孔，并设置无细胞孔为阴性对照。于不同时间点，加CCK-8作用2h后，测OD450值，细胞生长曲线和毒性试验的结果如图2和图4所示。
图4结果显示，24h时，10%胎牛血清培养的SFSFS细胞状态最好；24h以后，添加h-EGF培养的细胞均呈现良好状态，细胞良好状态维持5d没有问题，甚至细胞培养至10d时，CCK-8检测OD450值仍为3.201，说明细胞活力仍然比较好。另外，h-EGF使用浓度为10-40ng/ml的培养基完全可以代替含10%胎牛血清的培养基，h-EGF浓度为5ng/ml时，有抑制细胞生长的现象。该结果与实施例2中结果相符。
实施例4
接种ORFV后，不同浓度h-EGF促生长的SFSFS细胞产生病变情况
本发明的SFSFS细胞培养成功后，其主要用途是规模化繁殖ORFV病毒。分别以10%胎牛血清，3%胎牛血清，3%胎牛血清+5ng/ml的 h-EGF，3%胎
牛血清+10ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+20ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+30ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+40ng/ml的h-EGF与DMEM/F12组成培养基培养SFSFS细胞，适应4代后，将F5代细胞以同样的培养基分别分种于17.5cm2容量的细胞瓶，48h后，接种ORFV弱毒苗毒株，同时设10%胎牛血清培养的、不接种ORFV弱毒苗毒株的细胞为阴性对照，于第48h观察致细胞病变产生情况，结果如图5所示。
图5结果表明，接种ORFV后，h-EGF促生长的细胞较未添加h-EGF促生长的细胞更易产生细胞病变，病变时间缩短，细胞聚团现象更加明显。
实施例5
实时定量 PCR验证h-EGF促生长后的细胞对ORFV的敏感性
分别以10%胎牛血清，3%胎牛血清，3%胎牛血清+5ng/ml的 h-EGF，3%胎
牛血清+10ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+20ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+30ng/ml的h-EGF，3%胎牛血清+40ng/ml的h-EGF和DMEM/F12组成培养基培养SFSFS细胞，适应4代后，接种ORFV弱毒苗毒株，每日观察，反复冻融，记作F1代。约48-72h后收病毒并利用碳酸氢钠溶液调整F1代病毒的pH值为7.6后，接种F2代，约48-72h后收病毒，反复冻融，两次收的病毒作相应标记，提取ORFV基因组DNA，用实时定量PCR检测病毒拷贝数，验证不同浓度h-EGF促生长后的细胞对ORFV的敏感性，结果如表1。
表1. 不同浓度h-EGF促生长细胞对ORFV的敏感性
表1结果显示，使用h-EGF后，病毒拷贝数有所提高，与实施例4致细胞病变情况一致。含3%胎牛血清和10-40ng/ml 的h-EGF的培养基完全可以替代含10%的胎牛血清的培养基，降低了生产成本、节省了时间、节约了资源，解决了现有原代细胞规模化繁殖ORFV病毒难的问题。
另外，使用含3%胎牛血清和不同浓度h-EGF培养基培养的SFSFS细胞连续接种ORFV两代时，含3%胎牛血清和20ng/ml的h-EGF培养基培养的细胞ORFV致病变时间最短，为48-60h，ORFV病毒达到阈值的循环数即CT值最低，为22.43，提高了病毒滴度。

Claims (4)

1.一种羊胎儿皮肤成纤维细胞SFSFS，其保藏编号为CCTCC No.C2019202。
2.如权利要求1所述的一种羊胎儿皮肤成纤维细胞在羊口疮病毒规模化繁殖中的应用。
3.如权利要求2所述的一种羊胎儿皮肤成纤维原代细胞株在羊口疮病毒规模化繁殖中的应用，其特征在于：采用含3%胎牛血清和10-40ng/ml的h-EGF的基础培养基培养SFSFS细胞，接种ORFV弱毒苗毒株，48-72h后收病毒。
4.如权利要求3所述的一种羊胎儿皮肤成纤维原代细胞株在羊口疮病毒规模化繁殖中的应用，其特征在于，采用含3%胎牛血清和20ng/ml的h-EGF的基础培养基培养SFSFS细胞。
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