CN111235096B - 牛卵母细胞体外成熟方法和所用的成熟液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛卵母细胞体外成熟方法和所用的成熟液，具体地说，本发明成熟培养液的组成为：发情牛血清、碳酸氢钠、EGCG、Hepe、雌二醇、牛卵泡液、黄体生成素、半胱氨酸、卵泡刺激素、TCM‑199。本发明提供的牛卵母细胞体外成熟的方法包括如下步骤：提供卵母细胞；使所述卵母细胞移入成熟培养液滴中，进行体外成熟培养22～24h。本发明方法可以显著地改善卵母细胞的生物学性能，例如卵母细胞成熟过程中卵丘扩展性能、卵母细胞第一极体的排出性能、卵母细胞成熟及成熟质量、卵母细胞受精能力、卵母细胞的核成熟和早期胚胎发育能力等方面显著更优异。

Description

牛卵母细胞体外成熟方法和所用的成熟液

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及卵母细胞体外成熟的方法，尤其是涉及一种改进的牛卵母细胞体外成熟的方法。通过本发明方法可以明显地提高牛卵母细胞体外成熟的性能，例如可以显著地提高卵丘扩展指数、卵母细胞体外成熟率、卵裂率和囊胚率。进一步的，本发明还涉及本发明改进的牛卵母细胞体外成熟的方法中使用的体外成熟液。

背景技术

卵母细胞体外受精是指通过对精子进行特殊处理，并且使卵母细胞受精这一过程。体外受精的完成需要一个有利于精子和卵子存活与代谢的培养系统。体外受精是体外胚胎生产的基础。目前，胚胎体外生产技术发展快速，主要应用于各种家畜、异国品种、野生动物、濒危动物的繁殖。众多科学研究者对体外胚胎生产拥有高度的热情，并且形成了规模化生产。与其他哺乳动物相比，牛的体外胚胎生产效率较低。这其中，体外成熟与体外受精是体外胚胎生产的两大关键部分。

大量优质的成熟卵母细胞是体外受精和胚胎移植的基础。卵母细胞体外成熟技术开始于上个世纪30年代，到了60年代发展较快，主要研究动物是小鼠和绵羊。1978年Newcomb等获得了首例试管动物，牛卵母细胞体外成熟后进行体内受精所出生。近年来，随着哺乳动物胚胎工程技术的深入研究以及商业性胚胎移植技术的飞速发展，卵母细胞体外成熟技术显得越来越重要。

有诸多影响卵母细胞体外成熟的因素。例如，卵母细胞的来源、成熟培养液及添加物、成熟培养条件等等。

在卵母细胞的来源方面，动物种类、年龄和卵巢质量是重要因素之一，哺乳动物种类不同，成熟的表现和成熟质量不一样；牛、羊卵母细胞体外成熟的效果要比马和猪的好。黄牛的卵母细胞体外成熟以及早期胚胎发育状况都比水牛的好，这可能与在体外能收集到更多优质的黄牛GV期卵母细胞有关。同种动物年龄和机体状况，特别是性机能和卵巢状况不同，每个卵巢所收集到卵母细胞的数量和质量也有显著差异。无黄体的卵巢卵母细胞与有黄体卵巢卵母细胞相比，获得更高的成熟率。采卵季节亦是重要因素之一，卵母细胞的发育潜力与季节有关。繁殖季节山羊卵母细胞体外培养较非繁殖季节得到更高的成熟率，温度过高和过低都影响卵母细胞的质量和体外成熟率。采卵方式亦是重要因素之一，采卵方式主要有抽吸法和切割法两种，抽吸法更适合牛卵母细胞的收集以及有利于卵母细胞成熟。切割法适合个别体积小的卵巢，尤其是体积小的动物。

多酚类物质又被称为茶轿质、茶单宁，是含有多个羟基的酚类化合物，在干茶叶中的含量为20％～30％，总称为茶多酚(TP)。多种儿茶素(C)是黄烷醇类的一种，在茶多酚中比重最大，占TP总量的60％～80％，具有非常强的抗氧化作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是儿茶素中含量最多的一种单体，占儿茶素的50％～60％。

茶多酚是具有多个活性羟基(-OH)的酚类化合物，所以非常容易发生氧化还原反应而形成O-醌类。黄烷醇作为茶多酚中含量最多的活性成分，其分子结构中的两个羟基团和1位氧能够使6位和8位碳原子产生强烈的亲核性，最终形成C-C或C-O骨架而使黄烷醇发生氧化聚合。其主要通过以下四个机制：①因EGCG可以降低游离铁和铁离子的含量，是一种很强的金属离子螯合剂；②EGCG可以与超氧阴离子自由基、羟自由基发生反应，形成DNA碎片和造成其它细胞内分子的损伤；③EGCG能够终止脂质过氧化链的反应，改变基因表达，造成DNA断裂；④增强多种与氧化还原反应相关的酶的活性，如酯还原酶、谷胱甘肽-S-转移酶等。

EGCG占儿茶素含量的50％～60％,是高效抗氧化剂。EGCG是酯型儿茶素单体，分子式为C22H18O11，其相对分子质量为：458.38kDa。EGCG化学性质稳定，随着pH值降低，稳定性增加。EGCG能够清除健康细胞内的自由基，抵抗ROS对各器官细胞造成损伤，其抗氧化性大于一般的维生素类抗氧化剂。EGCG能够防止细胞损害和DNA断裂。EGCG作为植物源性抗氧化剂，具有预防心脏病，抗肿瘤，抗突变，抗衰老等一系列生物学活性，经常饮用绿茶可以预防和治疗肥胖病。医学上，EGCG还用于恶性肿瘤，冠心病、高血脂症等的辅助治疗。

EGCG因其特殊结构，可以与活性氧发生反应形成二聚体，因而可以减少不饱和脂肪酸与活性氧的氧化还原反应。因此，EGCG比单酚羟基类或非酚类抗氧化剂表现出更高的自由基清除率。

有研究表明，武夷茶TP可以降低油脂的酸价(AV)。还有研究表明茶多酚及其单体对ROS的清除作用非常强，一定范围内浓度增加而增强，甚至高达98％，效果显著高于维生素类抗氧化剂。有研究证实EGCG可以清除机体细胞内ROS,增强机体对抗氧化应激的能力。还有试验表明，EGCG有利于保持机体氧化系统的平衡，可以逆转在海马上由铅引起的细胞过氧化损伤。医学上，EGCG逐渐在重金属慢性中毒的治疗中发挥重要作用。

此外，EGCG能抑制癌细胞生存需要的信号传递，与其他抗氧化剂相互作用降低某些致癌物质的活性，减少有害自由基对机体造成损伤。有日本学者于1987年测定出EGCG具有抑制皮肤黏膜潜在致癌剂十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)与其受体结合的作用(即佛波醇酯受体调制)，该试验的原理是使用[3H]标记TPA，利用TPA能够与细胞膜上TPA受体特异性结合的特性。随后又通过了一个两级化学致癌实验，证明了EGCG能够抑制皮肤肿瘤。

在体外成熟过程中，体外操作会使配子接触更多的氧，配子自身和环境中的氧自由基会抑制卵母细胞的成熟。同时，卵母细胞在体外培养过程中往往处于抗氧化系统失衡状态。因此，在卵母细胞体外成熟培养液中添加外源抗氧化剂是很重要的。有研究在牛卵母细胞的体外成熟研究中添加了绿茶多酚，研究其对卵母细胞成熟、受精的影响。试验结果显示TP的添加量为15μmol/L时MII期卵母细胞内的GSH含量最高(p<0.05)。结果表明，在体外培养时添加15μmol/L的绿茶多酚提高了卵母细胞发育到MII期的比率和囊胚发育率。有研究表明EGCG对母体热应激引起的卵母细胞破坏具有一定的保护作用，促进了小鼠的胚胎发育。有研究者在小鼠实验中发现，成熟液中添加20μmol/L的EGCG促进了卵母细胞的成熟和后期胚胎发育。有研究表明在体外成熟液中添加15μmol/L的EGCG，促进了山羊卵母细胞体外并且降低了卵母细胞中谷胱甘肽氧化速度。

活性氧是精子氧化反应的副产物，正常情况下，精子内氧化剂与抗氧化剂处于平衡状态。当细胞内ROS水平高于生理剂量时，ROS就会腐蚀精子膜表面的多元不饱和脂肪酸，对精子造成氧化损伤。EGCG清除氧自由基的能力很强，能够保护细胞免受损伤和防止DNA断裂。近年来，EGCG对哺乳动物精子的研究不断深入。有研究发现在猪IVF过程中，EGCG的添加量为10μg/mL效果最佳，可以有效减少过氧化氢的产生。

卵母细胞体外胚胎生产技术可以通过有效地利用牛卵母细胞，加快牛繁殖速率，还可以加快优良品种的扩繁。卵子体外成熟质量、精子受精能力作为体外胚胎生产的核心技术，对胚胎高效生产起着非常重要的作用。然而，氧化应激是制约卵子成熟质量、精子受精能力的主要因素之一。尽管已有研究例如李敏玲(南方农业学报，2016，47(3)：478-482)的文献探讨EGCG对牛卵母细胞体外成熟率的影响，以及通过测定成熟过程中一些氧化因子的含量，探讨EGCG对卵子成熟可能的影响机制，并且据信通过使用EGCG能够改进卵母细胞体外成熟率。然而EGCG的使用仍然有改进的必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进牛卵母细胞体外成熟的方法，期待该种方法能够获得一种或多种技术效果。已经出人意料的发现，在本发明方法条件下能够呈现出人意料的技术效果，本发明基于此类发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种牛卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供卵母细胞；

(2)卵母细胞的体外成熟：使所述卵母细胞移入成熟培养液滴中，进行体外成熟培养，培养条件为100％湿度、38.5℃、5％CO2，体外成熟培养22～24h。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述卵母细胞是照包括如下步骤的牛活体采卵方法采集得到的：

i、取卵前的超排处理

筛选两侧卵巢上直径2～8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为2～5岁；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.5μg/kg牛体重；

ii、活体采卵

在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：

(ii1)术前准备：调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg)，收集管中注入5ml左右吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20％利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；

(ii2)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；

(ii3)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；

iii、卵母细胞的检出

将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数(采卵数)，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目(可用卵数)：卵母细胞的细胞质均匀、COCs包裹有不少于两层卵丘细胞，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中牛活体采卵方法中所用的FSH制剂组成为：卵泡刺激素(35μg/ml)、雌三醇(FSH：雌三醇＝100：15)、泊洛沙姆188(浓度0.4mg/ml)。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中供体牛为中国黄牛(南阳)。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中供体牛为日本和牛。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中成熟培养液的组成为：10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中发情牛血清(ESC)是照包括如下步骤的方法制备得到的：采血品种为雌性牛，选择处于发情状态的个体，进行颈静脉采血，用50mL灭菌的一次性离心管倾斜30～45°沿管壁收集；在采血当地常温静置，待观察到血样凝固后可以送回实验室，避免阳光照射，室温静置4～6h，可以观察到分层，上层析出部分血清，避免晃动；12h后离心并收集血清；血清被置于56℃水浴中灭活30min，用一次性15mL离心管根据每次用量分装；每次使用解冻一小管，避免反复冻融，造成血清质量下降。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中牛卵泡液(BFF)是照包括如下步骤的方法制备得到的：取屠宰的牛卵巢，用手术剪剪去卵巢周围其他的组织，卵巢用酒精清洗一遍，再用生理盐水清洗2～3遍，抽取卵泡液；接着快速离心卵泡液数十秒，吸取上层清亮的卵泡液，过滤除菌，根据每次用量进行分装，-80℃冰箱冻存卵泡液；每次使用解冻适量，避免反复冻融。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其还包括如下步骤(3)：

(3)卵母细胞体外受精：提前4～6h将F液放入培养箱中平衡；冷冻精液采用上游法处理后，吸取上层1mL液体，常温下离心；离心后立即弃去上清约800～900μL，放回培养箱中孵育5～10min，使用前用移液枪轻轻混匀精液；每个受精液滴放置15～20枚经体外成熟培养的卵母细胞，添加12～15μL精液使每个受精液滴中精子密度达到(1.0～1.5)x10⁶个/mL，然后将受精液滴放入39℃、5％CO2和100％湿度的培养箱中孵育20～22h，以进行体外受精培养。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述F液即受精液的成分为：Tyrode’s液(经过改良)、1mg/mL的葡萄糖、20μg/mL的肝素钠、0.6％的BSA(牛血清白蛋白)。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其还包括如下步骤(4)：

(4)受精卵的体外培养：受精20～22h后，用受精液清洗精子以除去转移合子过程中附带的其他液体；用C液洗涤受精卵，然后移入颗粒细胞单层中进行培养；培养条件为5％CO2、100％湿度和38.5℃，培养时间为48小时。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述C液即胚胎培养液的成分为：54％Tyrode’s液(经过改良)、10％FBS(胎牛血清)和36％TCM-199液，使用前在培养箱预平衡1～2h。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述颗粒细胞单层是照如下方式进行培养的：用胚胎培养液离心洗涤卵母细胞上被吹打下来的颗粒细胞；每个培养皿中做8个20μL的颗粒细胞微滴，覆盖矿物油，用玻璃细针把杂质去除，置于培养箱中培养。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中成熟培养液中还包含辛酸钠和聚乙烯醇。例如其中还包括20mg/L辛酸钠、5mg/L聚乙烯醇。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中成熟培养液中还包含辛酸钠和聚维酮K30。例如其中还包括20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中成熟培养液的组成为：20mg/L辛酸钠、5mg/L聚乙烯醇、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中成熟培养液的组成为：20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其包括如下步骤：

(1)提供卵母细胞，其是通过牛活体采卵获得的，所述牛活体采卵包括如下步骤：

i、取卵前的超排处理

筛选两侧卵巢上直径2～8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为2～5岁；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.5μg/kg牛体重；

ii、活体采卵

在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：

(ii1)术前准备：调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg)，收集管中注入5ml左右吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20％利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；

(ii2)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；

(ii3)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；

iii、卵母细胞的检出

将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数(采卵数)，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目(可用卵数)：卵母细胞的细胞质均匀、COCs包裹有不少于两层卵丘细胞，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围；

(2)卵母细胞的体外成熟：使所述卵母细胞移入成熟培养液滴中，进行体外成熟培养，培养条件为100％湿度、38.5℃、5％CO2，体外成熟培养22～24h；(例如，所述成熟培养液的组成为：10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％；例如，所述成熟培养液任选的还包含：20mg/L辛酸钠、5mg/L聚乙烯醇；或者，例如，所述成熟培养液任选的还包含：20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30)；

(3)卵母细胞体外受精：提前4～6h将F液放入培养箱中平衡；冷冻精液采用上游法处理后，吸取上层1mL液体，常温下离心；离心后立即弃去上清约800～900μL，放回培养箱中孵育5～10min，使用前用移液枪轻轻混匀精液；每个受精液滴放置15～20枚经体外成熟培养的卵母细胞，添加12～15μL精液使每个受精液滴中精子密度达到(1.0～1.5)x10⁶个/mL，然后将受精液滴放入39℃、5％CO2和100％湿度的培养箱中孵育20～22h，以进行体外受精培养；

(4)受精卵的体外培养：受精20～22h后，用受精液清洗精子以除去转移合子过程中附带的其他液体；用C液洗涤受精卵，然后移入颗粒细胞单层中进行培养；培养条件为5％CO2、100％湿度和38.5℃，培养时间为48小时。

进一步的，本发明第二方面提供了一种成熟培养液，其组成为：10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的成熟培养液，其中还包含辛酸钠和聚乙烯醇。例如其中还包括20mg/L辛酸钠、5mg/L聚乙烯醇。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的成熟培养液，其中还包含辛酸钠和聚维酮K30。例如其中还包括20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的成熟培养液，其组成为：20mg/L辛酸钠、5mg/L聚乙烯醇、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的成熟培养液，其组成为：20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

根据本发明任一方面和/或任一实施方案，其还具有如实施例所述任一技术特征和/或技术方案。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明人出人意料地发现，对成熟培养液进行改良后，可以显著地改善卵母细胞的生物学性能，例如卵母细胞成熟过程中卵丘扩展性能、卵母细胞第一极体的排出性能、卵母细胞成熟及成熟质量、卵母细胞受精能力、卵母细胞的核成熟和早期胚胎发育能力等方面显著更优异，这一发现是现有技术根本无法预期的。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。例如本发明所用FSH和LH可以容易地从北京比威克生物技术公司购得。

实施例1：牛活体采卵

参照本发明人团队的方法(CN110251660A，中国专利申请号2019106516223，Y19032)进行牛活体采卵，具体如下：

1、取卵前的超排处理

筛选两侧卵巢上直径2～8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为2～5岁；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.5μg/kg牛体重；

2、活体采卵

在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：

(21)术前准备：调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg)，收集管中注入5ml左右吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20％利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；

(22)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；

(23)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；

3、卵母细胞的检出

将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数(采卵数)，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目(可用卵数)：卵母细胞的细胞质均匀、COCs包裹有不少于两层卵丘细胞，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围。根据试验动物数计算每头动物的头均采卵数(个)和头均可用卵数(个)。

FSH制剂：卵泡刺激素(35μg/ml)、雌三醇(FSH：雌三醇＝100：15)、泊洛沙姆188(浓度0.4mg/ml)。

供体牛：中国黄牛(南阳)。

实施例2：牛卵母细胞的体外成熟

通过在体外成熟液中添加EGCG(10μmol/L)并参考李敏玲文献方法考察牛卵母细胞的体外成熟，以成熟率和卵丘扩展等指标考察本发明方法学性能，用体外受精法和孤雌激活法两种方法考察卵母细胞成熟后的发育能力，以期提高牛胚胎体外培养效率、改善发育质量。如未特别说明，操作所涉及的牛为中国(南阳)黄牛。

1、材料

(1)冷冻精液(南阳黄牛，细管)由公司自存。TCM-199购自GIBCO公司、Dulbecco’sPBS购自GIBCO公司、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司、新生牛血清(NBS)购自GIBCO公司、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)购自成都普瑞法公司且HPLC纯99.6％；其余未列明的生化试剂/试药均购自Sigma-Aldrich公司。

(2)卵巢保存液：添加了青霉素、链霉素和Mg2+、K+、Ca2+的生理盐水。

(3)洗卵液(H液)：主要成分为TCM-199，添加3％NBS、5mmol/L的NaHCO3和20mmol/L的Hepes，使用前放入水浴锅。

(4)成熟培养液(M液)：其基础液的主要成分为TCM-199，添加10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG和5mmol/L的Hepe；试验当天早上在基础液中添加1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸和10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)。简而言之，成熟培养液(M液)的组成为：10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

(5)受精液(F液)：成分为Tyrode’s液(经过改良)、1mg/mL的葡萄糖、20μg/mL的肝素钠、0.6％的BSA(牛血清白蛋白)。

(6)胚胎培养液(C液)：成分为54％Tyrode’s液(经过改良)、10％FBS(胎牛血清)和36％TCM-199液，使用前在培养箱预平衡1～2h。

配制培养液的水源为Milli-Q水，经过亚沸水蒸馏后制成超纯水被使用，链霉素和青霉素都被添加于所有培养液，但是浓度不一样，分别为：100mg/L和60mg/L。液体配制好需在10分钟内测定pH值，H液、M液、C液中液体pH值均为7.2～7.4，F液pH值则稍高，为7.5～7.8。工作液需过滤除菌，因为胚胎培养需要无菌环境，孔径0.22μm的微孔滤膜被用于过滤，用封口胶密封，标记后存放于4℃冰箱中。所有盛装溶液的玻璃瓶、离心管均无菌处理。

(7)发情牛血清(ESC)的制备：采血品种为雌性牛，选择处于发情状态的个体，进行颈静脉采血，用50mL灭菌的一次性离心管倾斜30～45°沿管壁收集。在采血当地常温静置，待观察到血样凝固后可以送回实验室，避免阳光照射，室温静置4～6h，可以观察到分层，上层析出部分血清，避免晃动。12h后离心并收集血清。血清被置于56℃水浴中灭活30min，用一次性15mL离心管根据每次用量分装。每次使用解冻一小管，避免反复冻融，造成血清质量下降。

(8)牛卵泡液(BFF)的制备：

取屠宰的牛卵巢，用手术剪剪去卵巢周围其他的组织，卵巢用酒精清洗一遍，再用生理盐水清洗2～3遍，抽取卵泡液；接着快速离心卵泡液数十秒，吸取上层清亮的卵泡液，过滤除菌，根据每次用量进行分装，-80℃冰箱冻存卵泡液。每次使用解冻适量，避免反复冻融。

2、试验方法

(1)颗粒细胞单层的培养：用胚胎培养液离心洗涤从实施例1所得卵母细胞上被吹打下来的颗粒细胞；每个培养皿中做8个20μL的颗粒细胞微滴，覆盖矿物油，用玻璃细针把杂质去除，置于培养箱中培养。

(2)卵母细胞的体外成熟：将实施例1活体采卵所得卵母细胞移入成熟培养液滴中(55μL/滴)，进行体外成熟培养，培养条件为100％湿度、38.5℃、5％CO2，体外成熟培养22～24h。

(3)卵丘扩展的评定及卵母细胞成熟的判定：卵丘扩展的评定及卵丘扩展指数(Cumulus Expansion Index，CEI)的计算参照Fagbohun和Downs[Fagbohun C F，Downs SM.Maturation of the mouse oocyte-cumulus cell complex:stimulation by lectins[J].Biology of reproduction,1990,42(3):413-423]的报道。卵丘扩展分为5个级别：0级，卵丘没有扩展，卵母细胞贴到培养皿底部；1级，只有最外层的1～2层卵丘细胞扩展；2级，外层的卵丘细胞呈放射状扩展，观察到整个COCs较蓬松；3级，放射冠部分不扩展，其余的均扩展；4级，全部卵丘细胞扩展。CEI＝[(0级卵母细胞个数×0)+(1级卵母细胞个数×1)+(2级卵母细胞个数×2)+(3级卵母细胞个数×3)+(4级卵母细胞个数×4)]/卵母细胞总个数。卵母细胞成熟的判定标准为第一极体排出。体外成熟的牛卵母细胞用移液枪轻轻吹打除去所有的卵丘细胞，在体视显微镜下观察第一极体。

(4)体外受精：提前4～6h将F液放入培养箱中平衡。冷冻精液采用上游法处理(即，冷冻精液细管于38.5℃水中左右划动，看到里面的精液流动即可，灭菌后先剪开细管无棉塞的一段，后剪开有棉塞的一端，使精液紧靠管壁流入离心管底部。精液随后被加入F液底部，避免产生气泡，在培养箱中倾斜45度角孵育，30～60min后，活力高的精子会上游至上层液体)后，吸取上层1mL液体，常温下离心；离心后立即弃去上清约800～900μL，放回培养箱中孵育5～10min，使用前用移液枪轻轻混匀精液；每个受精液滴放置15～20枚经体外成熟培养的卵母细胞，添加12～15μL精液使每个受精液滴中精子密度达到(1.0～1.5)x10⁶个/mL，然后将受精液滴放入39℃、5％CO2和100％湿度的培养箱中孵育20～22h，以进行体外受精培养。

(5)孤雌激活：卵母细胞体外成熟22～24h后，用枪头轻轻吹打去除大部分卵丘细胞。激活条件为：5μmol/L离子霉素(Ion)5min，2mmol/L的6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)4h。经C液洗涤2次后移入颗粒单层细胞中共培养。培养条件为39℃、5％CO2和100％湿度。

(6)受精卵的体外培养：受精20～22h后，用受精液清洗精子以除去转移合子过程中附带的其他液体；用C液洗涤受精卵或者激活处理后的卵母细胞3次，然后移入颗粒细胞单层中进行培养；培养条件为5％CO2、100％湿度和38.5℃。

(7)早期胚胎发育潜力评定：假定的受精卵或经激活培养后的卵母细胞移入颗粒细胞单层中培养到第2d(IVF或孤雌激活当天记为第0d，即48h)，检查受精卵或孤雌胚胎的分裂情况。分裂率＝分裂的卵子个数/授精的卵母细胞总数或孤雌激活的卵母细胞总数。囊胚率＝囊胚数/授精或孤雌激活的卵母细胞总数。

试验数据均采用SPSS Statistics 17软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)。表示方式为：平均数±标准误(Mean±SE)。

3、试验结果

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，观察记录每个卵母细胞卵丘扩展等级，并计算卵丘扩展指数。重复5次试验，统计的卵子总数为217个，结果：卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.43±0.06。结果表明，卵母细胞成熟过程中卵丘扩展性能良好。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，GV期发育到MII期的标志是第一极体排出，以第一极体的排出率作为判定卵母细胞的成熟的标准。重复5次试验，结果(统计的卵子总数为233个)：成熟率(％±S.E.)＝58.52±1.73。结果表明，卵母细胞第一极体的排出性能良好。

(3)卵母细胞体外受精后，将假定的受精卵移入颗粒细胞单层中培养，统计卵裂率、囊胚发育率，重复5次试验，结果(统计的卵子授精总数为197个)：卵裂率(％±S.E.)＝57.26±2.84、囊胚发育率(％±S.E.)＝25.37±2.03。结果表明，卵母细胞成熟良好、卵母细胞的成熟质量良好、卵母细胞的受精能力良好。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，卵母细胞孤雌激活后，将孤雌激活胚胎移入颗粒细胞单层中培养，统计卵裂率、囊胚发育率，重复5次试验，结果(统计的卵子激活总数为213个)：卵裂率(％±S.E.)＝65.38±3.87、囊胚发育率(％±S.E.)＝30.41±1.87。结果表明，卵母细胞的核成熟良好、早期胚胎发育能力良好。

实施例3：牛卵母细胞的体外成熟

参照实施例1和实施例2进行，不同的仅是实施例2所用成熟培养液(M液)的组成为：20mg/L辛酸钠、5mg/L聚乙烯醇、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

参考实施例2的试验过程，结果如下：

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为221个，卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.81±0.09**。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为235个，成熟率(％±S.E.)＝69.33±2.13**。

(3)卵母细胞体外受精后，统计的卵子授精总数为214个，卵裂率(％±S.E.)＝71.32±3.45**、囊胚发育率(％±S.E.)＝31.22±2.83**。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，统计的卵子激活总数为204个，卵裂率(％±S.E.)＝73.44±5.12**、囊胚发育率(％±S.E.)＝39.24±2.26**。

注：本实施例的**，表示与实施例2之“3、试验结果”部分的相应指标数据之间存在显著性差异，p<0.05。

实施例4：牛卵母细胞的体外成熟

参照实施例3进行，不同的仅是不用辛酸钠，结果如下：

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为187个，卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.47±0.05。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为216个，成熟率(％±S.E.)＝58.17±1.65。

(3)卵母细胞体外受精后，统计的卵子授精总数为176个，卵裂率(％±S.E.)＝57.83±2.57、囊胚发育率(％±S.E.)＝24.86±2.11。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，统计的卵子激活总数为223个，卵裂率(％±S.E.)＝65.02±3.44、囊胚发育率(％±S.E.)＝29.86±1.92。

实施例5：牛卵母细胞的体外成熟

参照实施例3进行，不同的仅是不用聚乙烯醇，结果如下：

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为194个，卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.51±0.08。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为217个，成熟率(％±S.E.)＝57.34±1.52。

(3)卵母细胞体外受精后，统计的卵子授精总数为202个，卵裂率(％±S.E.)＝58.11±2.43、囊胚发育率(％±S.E.)＝25.84±1.84。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，统计的卵子激活总数为183个，卵裂率(％±S.E.)＝64.84±4.02、囊胚发育率(％±S.E.)＝31.36±1.58。

根据实施例3～5与实施例2的结果差异，可以理解，在成熟培养液中添加辛酸钠和聚乙烯醇后可以显著地改善卵母细胞的生物学性能，例如卵母细胞成熟过程中卵丘扩展性能、卵母细胞第一极体的排出性能、卵母细胞成熟及成熟质量、卵母细胞受精能力、卵母细胞的核成熟和早期胚胎发育能力等方面显著更优异，这一发现是现有技术根本无法预期的。

实施例11：牛卵母细胞的体外成熟

参照实施例3进行，不同的仅是将成熟培养液中的5mg/L聚乙烯醇用2.5mg/L聚维酮K30替代，结果如下：

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为195个，卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.78±0.09**。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为226个，成熟率(％±S.E.)＝71.16±2.02**。

(3)卵母细胞体外受精后，统计的卵子授精总数为219个，卵裂率(％±S.E.)＝70.26±3.14**、囊胚发育率(％±S.E.)＝30.41±2.79**。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，统计的卵子激活总数为219个，卵裂率(％±S.E.)＝72.63±4.86**、囊胚发育率(％±S.E.)＝40.36±2.03**。

注：本实施例的**，表示与实施例2之“3、试验结果”部分的相应指标数据之间存在显著性差异，p<0.05。

实施例12：牛卵母细胞的体外成熟

参照实施例11进行，不同的仅是不用辛酸钠，结果如下：

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为146个，卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.50±0.07。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为211个，成熟率(％±S.E.)＝58.02±1.77。

(3)卵母细胞体外受精后，统计的卵子授精总数为189个，卵裂率(％±S.E.)＝58.43±2.38、囊胚发育率(％±S.E.)＝24.25±2.46。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，统计的卵子激活总数为207个，卵裂率(％±S.E.)＝64.74±3.31、囊胚发育率(％±S.E.)＝29.58±2.55。

实施例13：牛卵母细胞的体外成熟

基本上参考实施例3的方法进行试验，不同的是主要是两点：成熟培养液中的5mg/L聚乙烯醇用2.5mg/L聚维酮K30替代，并且卵母细胞是通过离体采卵方式获得的。具体方法如下：

1、材料

(1)冷冻精液(南阳黄牛，细管)由公司自存。TCM-199购自GIBCO公司、Dulbecco’sPBS购自GIBCO公司、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司、新生牛血清(NBS)购自GIBCO公司、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)购自成都普瑞法公司且HPLC纯99.6％；其余未列明的生化试剂/试药均购自Sigma-Aldrich公司。

(2)卵巢保存液：添加了青霉素、链霉素和Mg2+、K+、Ca2+的生理盐水。

(3)洗卵液(H液)：主要成分为TCM-199，添加3％NBS、5mmol/L的NaHCO3和20mmol/L的Hepes，使用前放入水浴锅。

(4)成熟培养液(M液)：其基础液的主要成分为TCM-199，添加20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG和5mmol/L的Hepe；试验当天早上在基础液中添加1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸和10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)。简而言之，成熟培养液(M液)的组成为：20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。

(5)受精液(F液)：成分为Tyrode’s液(经过改良)、1mg/mL的葡萄糖、20μg/mL的肝素钠、0.6％的BSA(牛血清白蛋白)。

(6)胚胎培养液(C液)：成分为54％Tyrode’s液(经过改良)、10％FBS(胎牛血清)和36％TCM-199液，使用前在培养箱预平衡1～2h。

配制培养液的水源为Milli-Q水，经过亚沸水蒸馏后制成超纯水被使用，链霉素和青霉素都被添加于所有培养液，但是浓度不一样，分别为：100mg/L和60mg/L。液体配制好需在10分钟内测定pH值，H液、M液、C液中液体pH值均为7.2～7.4，F液pH值则稍高，为7.5～7.8。工作液需过滤除菌，因为胚胎培养需要无菌环境，孔径0.22μm的微孔滤膜被用于过滤，用封口胶密封，标记后存放于4℃冰箱中。所有盛装溶液的玻璃瓶、离心管均无菌处理。

(7)发情牛血清(ESC)的制备：采血品种为雌性牛，选择处于发情状态的个体，进行颈静脉采血，用50mL灭菌的一次性离心管倾斜30～45°沿管壁收集。在采血当地常温静置，待观察到血样凝固后可以送回实验室，避免阳光照射，室温静置4～6h，可以观察到分层，上层析出部分血清，避免晃动。12h后离心并收集血清。血清被置于56℃水浴中灭活30min，用一次性15mL离心管根据每次用量分装。每次使用解冻一小管，避免反复冻融，造成血清质量下降。

(8)牛卵泡液(BFF)的制备：

取屠宰的牛卵巢，用手术剪剪去卵巢周围其他的组织，卵巢用酒精清洗一遍，再用生理盐水清洗2～3遍，抽取卵泡液；接着快速离心卵泡液数十秒，吸取上层清亮的卵泡液，过滤除菌，根据每次用量进行分装，-80℃冰箱冻存卵泡液。每次使用解冻适量，避免反复冻融。

(9)卵母细胞：

将新鲜南阳黄牛的卵巢用手术剪剪去卵巢周围其他的组织，卵巢用酒精清洗一遍，生理盐水清洗2～3遍；后置于生理盐水中浸泡，并且水浴锅中保温待使用，抽取对象为直径约2～8mm的卵巢卵泡，在体视显微镜下观察，挑选包裹有不少于两层卵丘细胞的COCs，用洗卵液洗3次，再用体外成熟液洗2次，得到卵母细胞。

2、试验方法

(1)颗粒细胞单层的培养：用胚胎培养液离心洗涤从实施例1所得卵母细胞上被吹打下来的颗粒细胞；每个培养皿中做8个20μL的颗粒细胞微滴，覆盖矿物油，用玻璃细针把杂质去除，置于培养箱中培养。

(2)卵母细胞的体外成熟：将本实施例之“1、材料”之“(9)卵母细胞”离体采卵所得卵母细胞移入成熟培养液滴中(55μL/滴)，进行体外成熟培养，培养条件为100％湿度、38.5℃、5％CO2，体外成熟培养22～24h。

(3)卵丘扩展的评定及卵母细胞成熟的判定：卵丘扩展的评定及卵丘扩展指数(Cumulus Expansion Index，CEI)的计算参照Fagbohun和Downs[Fagbohun C F，Downs SM.Maturation of the mouse oocyte-cumulus cell complex:stimulation by lectins[J].Biology of reproduction,1990,42(3):413-423]的报道。卵丘扩展分为5个级别：0级，卵丘没有扩展，卵母细胞贴到培养皿底部；1级，只有最外层的1～2层卵丘细胞扩展；2级，外层的卵丘细胞呈放射状扩展，观察到整个COCs较蓬松；3级，放射冠部分不扩展，其余的均扩展；4级，全部卵丘细胞扩展。CEI＝[(0级卵母细胞个数×0)+(1级卵母细胞个数×1)+(2级卵母细胞个数×2)+(3级卵母细胞个数×3)+(4级卵母细胞个数×4)]/卵母细胞总个数。卵母细胞成熟的判定标准为第一极体排出。体外成熟的牛卵母细胞用移液枪轻轻吹打除去所有的卵丘细胞，在体视显微镜下观察第一极体。

(4)体外受精：提前4～6h将F液放入培养箱中平衡。冷冻精液采用上游法处理(即，冷冻精液细管于38.5℃水中左右划动，看到里面的精液流动即可，灭菌后先剪开细管无棉塞的一段，后剪开有棉塞的一端，使精液紧靠管壁流入离心管底部。精液随后被加入F液底部，避免产生气泡，在培养箱中倾斜45度角孵育，30～60min后，活力高的精子会上游至上层液体)后，吸取上层1mL液体，常温下离心；离心后立即弃去上清约800～900μL，放回培养箱中孵育5～10min，使用前用移液枪轻轻混匀精液；每个受精液滴放置15～20枚经体外成熟培养的卵母细胞，添加12～15μL精液使每个受精液滴中精子密度达到(1.0～1.5)x10⁶个/mL，然后将受精液滴放入39℃、5％CO2和100％湿度的培养箱中孵育20～22h，以进行体外受精培养。

(5)孤雌激活：卵母细胞体外成熟22～24h后，用枪头轻轻吹打去除大部分卵丘细胞。激活条件为：5μmol/L离子霉素(Ion)5min，2mmol/L的6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)4h。经C液洗涤2次后移入颗粒单层细胞中共培养。培养条件为39℃、5％CO2和100％湿度。

(6)受精卵的体外培养：受精20～22h后，用受精液清洗精子以除去转移合子过程中附带的其他液体；用C液洗涤受精卵或者激活处理后的卵母细胞3次，然后移入颗粒细胞单层中进行培养；培养条件为5％CO2、100％湿度和38.5℃。

(7)早期胚胎发育潜力评定：假定的受精卵或经激活培养后的卵母细胞移入颗粒细胞单层中培养到第2d(IVF或孤雌激活当天记为第0d，即48h)，检查受精卵或孤雌胚胎的分裂情况。分裂率＝分裂的卵子个数/授精的卵母细胞总数或孤雌激活的卵母细胞总数。囊胚率＝囊胚数/授精或孤雌激活的卵母细胞总数。

试验数据均采用SPSS Statistics 17软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)。表示方式为：平均数±标准误(Mean±SE)。

3、试验结果

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，观察记录每个卵母细胞卵丘扩展等级，并计算卵丘扩展指数。重复5次试验，统计的卵子总数为168个，结果：卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.87±0.07**。结果表明，卵母细胞成熟过程中卵丘扩展性能良好。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，GV期发育到MII期的标志是第一极体排出，以第一极体的排出率作为判定卵母细胞的成熟的标准。重复5次试验，结果(统计的卵子总数为214个)：成熟率(％±S.E.)＝72.24±2.16**。结果表明，卵母细胞第一极体的排出性能良好。

(3)卵母细胞体外受精后，将假定的受精卵移入颗粒细胞单层中培养，统计卵裂率、囊胚发育率，重复5次试验，结果(统计的卵子授精总数为184个)：卵裂率(％±S.E.)＝69.83±2.58**、囊胚发育率(％±S.E.)＝33.15±1.86**。结果表明，卵母细胞成熟良好、卵母细胞的成熟质量良好、卵母细胞的受精能力良好。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，卵母细胞孤雌激活后，将孤雌激活胚胎移入颗粒细胞单层中培养，统计卵裂率、囊胚发育率，重复5次试验，结果(统计的卵子激活总数为187个)：卵裂率(％±S.E.)＝74.51±3.27**、囊胚发育率(％±S.E.)＝39.53±1.58**。结果表明，卵母细胞的核成熟良好、早期胚胎发育能力良好。

注：本实施例的**，表示与实施例2之“3、试验结果”部分的相应指标数据之间存在显著性差异，p<0.05。

根据以上实施例的结果差异，可以理解，在成熟培养液中添加辛酸钠和聚维酮K30后可以显著地改善卵母细胞的生物学性能，例如卵母细胞成熟过程中卵丘扩展性能、卵母细胞第一极体的排出性能、卵母细胞成熟及成熟质量、卵母细胞受精能力、卵母细胞的核成熟和早期胚胎发育能力等方面显著更优异，这一发现是现有技术根本无法预期的。

实施例21：牛卵母细胞的体外成熟

参照实施例1和实施例2进行，不同的仅是精子和卵母细胞采自日本和牛，结果如下：

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为165个，卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.33±0.06。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为206个，成熟率(％±S.E.)＝53.15±1.85。

(3)卵母细胞体外受精后，统计的卵子授精总数为185个，卵裂率(％±S.E.)＝51.52±2.41、囊胚发育率(％±S.E.)＝23.42±2.53。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，统计的卵子激活总数为232个，卵裂率(％±S.E.)＝62.15±3.53、囊胚发育率(％±S.E.)＝27.62±2.03。

实施例22：牛卵母细胞的体外成熟

参照实施例21进行，不同的仅是所用成熟培养液(M液)的组成为：20mg/L辛酸钠、5mg/L聚乙烯醇、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。，结果如下：

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为184个，卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.77±0.08**。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为196个，成熟率(％±S.E.)＝70.32±1.93**。

(3)卵母细胞体外受精后，统计的卵子授精总数为215个，卵裂率(％±S.E.)＝69.42±2.86**、囊胚发育率(％±S.E.)＝29.64±2.86**。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，统计的卵子激活总数为206个，卵裂率(％±S.E.)＝74.36±3.11**、囊胚发育率(％±S.E.)＝38.41±2.16**。

注：本实施例的**，表示与实施例21之相应指标数据之间存在显著性差异，p<0.05。

实施例23：牛卵母细胞的体外成熟

参照实施例21进行，不同的仅是所用成熟培养液(M液)的组成为：20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30、10％ECS(发情牛血清)、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1μg/mL的E2(雌二醇)、3％BFF(牛卵泡液)、10μg/mL的LH(黄体生成素)、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL的FSH(卵泡刺激素)、TCM-199加至100％。，结果如下：

(1)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为192个，卵丘扩展指数CEI(％±S.E.)＝2.83±0.07**。

(2)卵母细胞体外成熟培养22～24h后，统计的卵子总数为175个，成熟率(％±S.E.)＝69.73±1.84**。

(3)卵母细胞体外受精后，统计的卵子授精总数为202个，卵裂率(％±S.E.)＝70.64±2.56**、囊胚发育率(％±S.E.)＝30.61±2.48**。

(4)对MII期牛卵母细胞进行孤雌激活处理，统计的卵子激活总数为215个，卵裂率(％±S.E.)＝72.25±2.87**、囊胚发育率(％±S.E.)＝39.73±2.64**。

注：本实施例的**，表示与实施例21之相应指标数据之间存在显著性差异，p<0.05。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种成熟培养液，其组成为：20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30、10%发情牛血清、26.2mmol/L的NaHCO3、10µmol/L的EGCG、5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1µg/mL雌二醇、3%牛卵泡液、10µg/mL黄体生成素、100µmol/L半胱氨酸、10µg/mL卵泡刺激素、TCM-199加至100%。

2.一种牛卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供卵母细胞，其是照包括如下步骤的牛活体采卵方法采集得到的：

i、取卵前的超排处理

筛选两侧卵巢上直径2~8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为2~5岁；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.5μg/kg牛体重；

ii、活体采卵

在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：

(ii1)术前准备：调试设备至工作状态，吸卵真空泵的压力为50-90mmHg，收集管中注入5ml吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20%利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；

(ii2)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；

(ii3)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；

iii、卵母细胞的检出

将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目即可用卵数：卵母细胞的细胞质均匀、COCs包裹有不少于两层卵丘细胞，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围；

(2)卵母细胞的体外成熟：使所述卵母细胞移入成熟培养液滴中，进行体外成熟培养，培养条件为100%湿度、38.5°C、5%CO2，体外成熟培养22~24h；

其中，所述成熟培养液的组成为：20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30、10%发情牛血清、26.2mmol/L的NaHCO3、10µmol/L的EGCG、5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1µg/mL雌二醇、3%牛卵泡液、10µg/mL黄体生成素、100µmol/L半胱氨酸、10µg/mL卵泡刺激素、TCM-199加至100%。

3.根据权利要求2的方法，其中牛活体采卵方法中所用的FSH制剂组成为：卵泡刺激素35μg/ml、雌三醇、0.4mg/ml泊洛沙姆188；其中卵泡刺激素：雌三醇=100：15。

4.根据权利要求2的方法，其中供体牛为中国黄牛。

5.根据权利要求2的方法，其中供体牛为日本和牛。

6.根据权利要求2的方法，其中发情牛血清是照包括如下步骤的方法制备得到的：采血品种为雌性牛，选择处于发情状态的个体，进行颈静脉采血，用50mL灭菌的一次性离心管倾斜30~45°沿管壁收集；在采血当地常温静置，待观察到血样凝固后送回实验室，避免阳光照射，室温静置4~6h，可以观察到分层，上层析出部分血清，避免晃动；12h后离心并收集血清；血清被置于56°C水浴中灭活30min，用一次性15mL离心管根据每次用量分装；每次使用解冻一小管，避免反复冻融，造成血清质量下降。

7.根据权利要求2的方法，其中牛卵泡液是照包括如下步骤的方法制备得到的：取屠宰的牛卵巢，用手术剪剪去卵巢周围其他的组织，卵巢用酒精清洗一遍，再用生理盐水清洗2~3遍，抽取卵泡液；接着快速离心卵泡液数十秒，吸取上层清亮的卵泡液，过滤除菌，根据每次用量进行分装，-80°C冰箱冻存卵泡液；每次使用解冻适量，避免反复冻融。

8.根据权利要求2的方法，其还包括如下步骤(3)：

(3)卵母细胞体外受精：提前4~6h将F液放入培养箱中平衡；冷冻精液采用上游法处理后，吸取上层1mL液体，常温下离心；离心后立即弃去上清800~900µL，放回培养箱中孵育5~10min，使用前用移液枪轻轻混匀精液；每个受精液滴放置15~20枚经体外成熟培养的卵母细胞，添加12~15µL精液使每个受精液滴中精子密度达到(1.0~1.5)x10⁶个/mL，然后将受精液滴放入39°C、5% CO2和100%湿度的培养箱中孵育20~22h，以进行体外受精培养；所述F液即受精液的成分为：经过改良的Tyrode’s液、1mg/mL葡萄糖、20µg/mL肝素钠、0.6%牛血清白蛋白。

9.根据权利要求2的方法，其还包括如下步骤(4)：

(4)受精卵的体外培养：受精20~22h后，用受精液清洗精子以除去转移合子过程中附带的其他液体；用C液洗涤受精卵，然后移入颗粒细胞单层中进行培养；培养条件为5%CO2、100%湿度和38.5°C，培养时间为48小时；所述C液即胚胎培养液的成分为：54%经过改良Tyrode’s液、10%胎牛血清和36% TCM-199液，使用前在培养箱预平衡1~2h。

10.根据权利要求9的方法，所述颗粒细胞单层是照如下方式进行培养的：用胚胎培养液离心洗涤卵母细胞上被吹打下来的颗粒细胞；每个培养皿中做8个20µL的颗粒细胞微滴，覆盖矿物油，用玻璃细针把杂质去除，置于培养箱中培养。

11.根据权利要求2的方法，其包括如下步骤：

(1)提供卵母细胞，其是通过牛活体采卵获得的，所述牛活体采卵包括如下步骤：

i、取卵前的超排处理

筛选两侧卵巢上直径2~8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为2~5岁；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.5μg/kg牛体重；

ii、活体采卵

在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：

(ii1)术前准备：调试设备至工作状态，吸卵真空泵的压力为50-90mmHg，收集管中注入5ml吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20%利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；

(ii2)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；

(ii3)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；

iii、卵母细胞的检出

将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目即可用卵数：卵母细胞的细胞质均匀、COCs包裹有不少于两层卵丘细胞，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围；

(2)卵母细胞的体外成熟：使所述卵母细胞移入成熟培养液滴中，进行体外成熟培养，培养条件为100%湿度、38.5°C、5%CO2，体外成熟培养22~24h；所述成熟培养液的组成为：20mg/L辛酸钠、2.5mg/L聚维酮K30、10%发情牛血清、26.2mmol/L的NaHCO3、10µmol/L的EGCG、5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1µg/mL雌二醇、3%牛卵泡液、10µg/mL黄体生成素、100µmol/L半胱氨酸、10µg/mL卵泡刺激素、TCM-199加至100%；

(3)卵母细胞体外受精：提前4~6h将F液放入培养箱中平衡；冷冻精液采用上游法处理后，吸取上层1mL液体，常温下离心；离心后立即弃去上清800~900µL，放回培养箱中孵育5~10min，使用前用移液枪轻轻混匀精液；每个受精液滴放置15~20枚经体外成熟培养的卵母细胞，添加12~15µL精液使每个受精液滴中精子密度达到(1.0~1.5)x10⁶个/mL，然后将受精液滴放入39°C、5% CO2和100%湿度的培养箱中孵育20~22h，以进行体外受精培养；

(4)受精卵的体外培养：受精20~22h后，用受精液清洗精子以除去转移合子过程中附带的其他液体；用C液洗涤受精卵，然后移入颗粒细胞单层中进行培养；培养条件为5%CO2、100%湿度和38.5°C，培养时间为48小时。