CN110251660A - 改进的牛活体采卵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改进的牛活体采卵方法。具体地说，一方面，本发明涉及一种FSH制剂，其是包含牛促卵泡素浓度为25～50μg/ml的水溶液。另一方面，本发明涉及FSH在制备用于牛活体采卵的制剂中的用途。所述牛活体采卵包括如下步骤：取卵前的超排处理、活体采卵、卵母细胞的检出。使用本发明方法进行牛活体采卵具有如说明书所述优异的技术效果，例如能够获得大比例的可用卵母细胞数。

Description

改进的牛活体采卵方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种改进的牛活体采卵方法，尤其是一种改进的牛活体超排采卵的方法，通过本发明方法能够获取显著更大量的卵母细胞数。
背景技术
活体超排采卵，亦称超排采卵、超数排卵、超排等，该方法已应用于畜牧行业数十年，其基本原理是通过注射FSH(本领域通常亦称为follicle-stimulating hormone、卵泡刺激素、促卵泡素等)促使卵巢超量排放卵母细胞，进而提高畜牧育种的效率。超排采卵技术是利用外源激素，刺激动物在一个排卵周期排出比正常情况下更多的成熟卵子的技术，它和卵子收集技术是体外受精等胚胎工程研究的前提和基础。灵长类的超数排卵研究最早是在人上开展的。1970年，英国妇科学家StePtoe及胚胎学家Edwards开始人超数排卵、体外受精和胚胎移植的研究工作。1976年第一例输卵管妊娠成功。1978年StePtoe等报道了世界首例试管婴儿诞生。在非人灵长类，1973年，Gould等首先报道了岩石猴体外受精发育到卵裂。随后，在黑猩猩(Gould等，1983)，猕猴(Bavister等，1984)，狒狒(Kuehl等，1984)，食蟹猴(Bamaeede等，1984)，绒猴(Lopata等，1988)等均有报道。
活体超排采卵是JIVET(Juvenile In Vitro Embryo Transfer/Technology)技术即幼畜胚胎体外生产技术的有益补充，JIVET是集幼畜超数排卵与采卵、卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植等技术为一体的生物高新技术体系。JIVET技术不仅可以极大提高动物的繁殖潜能，而且还可以缩短世代间隔，加速遗传改良进程。
牛是对人类的生产和发展提供非常强大的助力的动物，最初人们驯服野牛进行饲养是为了食肉增加营养，后来人们发现牛可以耕地，因此成为农民的帮手，促进了经济的发展和社会的进步，到了现代人们又发现牛乳是一种物美价廉且供给稳定的奶制品来源。因此饲养肉牛和奶牛成为一个非常重要的产业。但是牛相对于其它的牲畜，其生育能力有限，由此制约了畜牧业的快速发展。由此人们采用超排卵技术来促进牛的排卵数量。研究表明初生母牛有99％的有腔卵泡因发生闭锁而退化，只有1％的有腔卵泡在排卵时排出。闭锁卵泡就是因为未获取足够数量的促性腺激素所致。为此，我们可以利用超过体内正常量的外源性激素，来拯救99％的将要闭锁的卵泡，使其成为优势卵泡，而发育成熟、排卵，即在家畜发情的一定时期，注射FSH类的激素制剂，使其大量的卵泡不闭锁退化而进行正常发育、成熟，在排卵前LH类激素和前列腺素来补充内源性激素的不足，以确保所有的卵泡均能成熟、破裂和排卵。
牛体外胚胎生产技术的研究源于20世纪50年代，Black等给未成年的小牛注射促性腺激素后，诱发了卵巢卵泡发育并获得发育正常的卵子，从而证明激素诱导也能使犊牛卵泡发育、排卵和受精。之后，很多学者就犊牛卵母细胞的发育能力进行了大量研究。20世纪90年代以后，人们对犊牛卵泡发育及胚胎体外培养进行了更为深入的研究。Armstrong等(1997)指出，无论是犊牛还是成年牛，卵母细胞在体外培养都能发育到囊胚，移植后都可以妊娠。Maneesh等(2000)对2～3月龄犊牛重复诱导采卵，结果指出供体牛在15月龄后繁殖性能基本正常，说明对犊牛进行激素处理、超排采卵对其发育影响不大或者没有影响。2005年Kauffold等首次报道，未经激素处理的不到2月龄的犊牛卵母细胞能够发育到囊胚，移植后产下正常犊牛。
目前，在国内有关犊牛JIVET技术的报道还较少，科农创新公司(2006)对犊牛JIVET进行了初步尝试。李瑞岐等(2009)对4～9周龄犊牛进行了超排，平均获得的卵母细胞数为25枚左右，70％(7/10)的个体对激素诱导反应良好。影响犊牛JIVET技术的因素主要包括：1、激素超排处理方法：性成熟前动物激素处理方法的建立主要以成年动物超数排卵技术为基础，虽然自然状况下性成熟前动物卵泡生长和发育的模式并不同于成年动物，但是同样能够受外源激素刺激而生长发育。Armstrong等采用GnRH、hCG、FSH+LH三种方法对犊牛进行激素处理，均获得了可用的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，但以FSH+LH方法获得的COCs数量较另外两种方法高。2、体外培养体系：Revel等对3月龄犊牛卵母细胞的体外成熟、体外受精和体外培养进行了研究，结果发现，受精率和卵裂率与成年牛差异不显著，但是，体外培养7d后囊胚率显著低于成年牛，同样妊娠率也显著低于成年牛，这说明犊牛卵母细胞中控制囊胚形成的一些关键因子可能尚未完全出现或表达。有学者指出，这可能是因为犊牛卵母细胞胞质存在缺陷造成的。3、犊牛月龄：供体犊牛月龄对激素处理后卵泡数量和胚胎发育具有较大的影响。Majerus等的试验结果显示，荷斯坦犊牛在7～11月龄时的卵母细胞与成年牛卵母细胞发育能力相当。另外，其他一些对不同品种牛的试验结果也显示，供体在接近性成熟时，卵母细胞才与成年牛卵母细胞有相似的发育能力。Presicce等指出不经激素处理的犊牛卵母细胞发育能力与供体月龄相关，激素处理后可消除这种差异，说明激素处理可减弱年龄因素的影响。4、犊牛个体差异：Maneesh等观察到供体牛间卵泡发育数量和胚胎发育能力存在很大的个体差异，个体间可用卵泡数变化范围为5～164枚，胚胎移植后，所有妊娠受体的胚胎均来自激素诱导卵泡发育好的个体。个体差异的原因有多种，不仅受外源激素处理方法的影响，而且还因内源性激素的分泌水平不同而出现差异，不同的饲养方法也可能产生不同的结果。根据个体的重量调整卵泡激素处理的剂量可以在一定程度上改善性成熟前犊牛获得的卵母细胞的数量和质量。
活体超排采卵是一项可反复从活体获取卵母细胞的技术。该技术能够扩大卵的来源，结合卵母细胞体外成熟培养(IVM)、体外受精(IVF)和早期胚胎培养(IVC)可产生大量可移植胚胎，克服从屠宰卵巢采集卵母细胞的缺点(如卵巢的收集耗时，从卵巢收集到运至实验室的间隔时间不确定，供体牛缺乏激素、健康和遗传背景资料，无法从有遗传价值的活体上获得更多的后代等)，还可作为生殖生物学领域基础研究(如卵巢功能、精子功能、内分泌特性及转基因等)的手段。
通过向动物体内补充外源性卵泡生成激素(FSH)，进而增加排卵、提高卵母细胞的发育潜能，这一技术思路已有诸多文献报道。例如，梅乾忠文献(梅乾忠，等，湖北农业科学，1991，09)进行了家兔胚胎移植的超排效果及重复采卵试验。
CN101962627A(中国专利申请号201010287746.7)建立了一种高效的犊牛体外胚胎生产的方法，包括高效的卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养技术等，尤其具体涉及一种犊牛激素超排的方法，选用9～12周龄犊牛，经阴道埋植CIDR，分别在第5d和第6d注射FSH。犊牛体外胚胎生产可以充分利用犊牛卵巢中卵母细胞作为丰富的胚源，对犊牛进行超排采卵。据信该发明将其方法与奶牛性控技术相结合，并根据育种目标，有选择地用性控X精子或Y精子进行体外受精，生产血统明确的良种奶牛胚胎；经移植后所产犊牛可以直接补充到高产奶牛核心群或者用于后备种公牛的选育。
CN1559358A(中国专利申请号200410022034.7)公开了一种肉、奶牛B超活体取卵方法，包括术前准备、卵巢及卵泡观察、取卵、卵母细胞检出和分类步骤，具体是：(1)吸卵真空泵的压力为50-90mmHg，吸卵液为含0.5-1％青-链霉素和5-10IU肝素的磷酸缓冲液，洗卵液为含5-12％BCS的磷酸缓冲液和改良的基础培养液-Hepes液；(2)采卵频率为1次/4天/头；(3)穿刺对象为所有直径≥2mm的卵泡；收集的卵母细胞采用4级分类，取1-3级的卵母细胞分装、备用；(4)对7-8岁的供体经产牛按程序在间隔3天里每天分2次肌肉注射等量的外源性FSH，总量为30-55μg；对≥14岁的老年牛按程序在取卵前4天每天按总量4∶3∶2∶1的比例肌肉注射总量为150-200μg的外源性FSH，以提高卵母细胞发育潜能。据信该发明可从活体可重复、无损伤获取卵母细胞；≥2mm直径卵泡作为穿刺对象和每4天1次的取卵频率保证了卵母细胞的质量和发育同步性；用外源性FSH诱导可提高卵母细胞的发育潜能；本方法的取卵效果佳。
CN101849861A(中国申请号：201010198677.2)公开了一种猕猴超数排卵和腹腔镜取卵方法，包括以下步骤：(1)在猕猴月经周期1-5天内开始注射人源重组的超排激素促卵泡激素(FSH)；(2)给药4天后，检测卵泡发育情况，对卵泡发育均匀、数目合适的猕猴继续给药；(3)给药8天后，注射人绒促性腺素(HCG)；(4)约36小时后，利用腹腔镜收集卵母细胞、分级、处理。据信该发明能够大幅提高了猕猴卵子的数量和质量，操作过程微创，受试动物无痛苦，也提高了猕猴利用次数/年和利用年限，增加了胚胎工程相关研究所需材料。
CN107714235A(中国申请号：201710913698.X)公开了一种利用母牛超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，依次进行药物诱导多卵泡发育工序、阴道超声取卵工序、体外受精和胚胎培养工序、胚胎移植工序和黄体支持工序以及精准的操作和严格的时间控制来进行母牛超排卵和生产体外胚胎，在阴道超声取卵工序和胚胎移植工序对母牛进行局部麻醉，使其配合进行取卵和以及受精卵着床，黄体支持工序很好的保证了母牛体内的受精卵安全的转变为牛犊，从而提高了母牛对牛犊的孕育效率，解决了目前人们根据自身的经验和感觉进行母牛超排卵母细胞生产体外胚胎，导致的外胚胎操作效率低下以及成功率不高的问题，以及提升了畜牧生产者的经济效益，具有很好的实用价值。
然而，现有方法仍然存在一些不足，尤其是卵母细胞的获取数量难以有效提高。因此，本领域技术人员仍然期待有新的方法来提高牛超排取卵工作中卵母细胞的获取数量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的牛活体采卵方法，尤其是提供一种能够提高牛超排取卵工作中卵母细胞的获取数量的方法。本发明出人意料地发现，通过本发明方法能够有效地提高牛超排取卵工作中卵母细胞的获取数量，本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种牛活体采卵方法，其包括如下步骤：
1、取卵前的超排处理
筛选两侧卵巢上直径<8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为1～15岁(例如1～10岁，例如2～5岁)；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.4～0.6μg/kg牛体重；
2、活体采卵
在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：
(21)术前准备：调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg)，收集管中注入5ml左右吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20％利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；
(22)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；
(23)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；
3、卵母细胞的检出
将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目：卵母细胞的细胞质均匀，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围。
根据本发明第一方面的方法，其中所述吸卵液是包含青霉素400IU/mL、链霉素800μg/mL和10IU肝素的磷酸钠缓冲液，其pH值为6.8，且磷酸根离子浓度为20mM。
根据本发明第一方面的方法，其中所述洗卵液是添加了3mg/mL牛血清白蛋白的BY基础培养液。
根据本发明第一方面的方法，其中所述FSH是牛促卵泡素。
根据本发明第一方面的方法，其中所述FSH制剂是包含牛促卵泡素浓度为25～50μg/ml的水溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中所述FSH制剂中还包含雌三醇。在一个实施方案中，牛促卵泡素与雌三醇的重量比为100：10～20，例如为100：15。
根据本发明第一方面的方法，其中所述FSH制剂中还包含泊洛沙姆188。在一个实施方案中，泊洛沙姆188在该FSH制剂中的浓度为0.3～0.5mg/ml，例如为0.4mg/ml。
根据本发明第一方面的方法，其中所述FSH制剂是照如下方法配制的：在无菌操作条件下，向70～80ml无菌注射用水中添加泊洛沙姆188使溶解，向其中添加FSH使溶解，接着向其中添加预先用少许乙醇溶解的雌三醇(使乙醇在FSH制剂中的浓度小于2％)，搅拌均匀得到无色澄清溶液，即得FSH制剂。
根据本发明第一方面的方法，其中所述牛例如但不限于：中国黄牛(南阳牛)、荷斯坦牛(乳牛品种)、西门塔尔牛(肉牛品种)、中国水牛(役用品种)。
进一步的，本发明第二方面提供了一种FSH制剂，其是包含牛促卵泡素浓度为25～50μg/ml的水溶液。
根据本发明第二方面的FSH制剂，其中还包含雌三醇。在一个实施方案中，牛促卵泡素与雌三醇的重量比为100：10～20，例如为100：15。
根据本发明第二方面的FSH制剂，其中还包含泊洛沙姆188。在一个实施方案中，泊洛沙姆188在该FSH制剂中的浓度为0.3～0.5mg/ml，例如为0.4mg/ml。
根据本发明第二方面的FSH制剂，其是照如下方法配制的：在无菌操作条件下，向70～80ml无菌注射用水中添加泊洛沙姆188使溶解，向其中添加FSH使溶解，接着向其中添加预先用少许乙醇溶解的雌三醇(使乙醇在FSH制剂中的浓度小于2％)，搅拌均匀得到无色澄清溶液，即得FSH制剂。
进一步的，本发明第三方面提供了FSH在制备用于牛活体采卵的制剂中的用途。
根据本发明第三方面的用途，其中所述制剂是包含牛促卵泡素浓度为25～50μg/ml的水溶液。
根据本发明第三方面的用途，其中所述制剂中还包含雌三醇。在一个实施方案中，牛促卵泡素与雌三醇的重量比为100：10～20，例如为100：15。
根据本发明第三方面的用途，其中所述制剂中还包含泊洛沙姆188。在一个实施方案中，泊洛沙姆188在该FSH制剂中的浓度为0.3～0.5mg/ml，例如为0.4mg/ml。
根据本发明第三方面的用途，其中所述制剂是照如下方法配制的：在无菌操作条件下，向70～80ml无菌注射用水中添加泊洛沙姆188使溶解，向其中添加FSH使溶解，接着向其中添加预先用少许乙醇溶解的雌三醇(使乙醇在FSH制剂中的浓度小于2％)，搅拌均匀得到无色澄清溶液，即得FSH制剂。
根据本发明第三方面的用途，其中所述牛活体采卵包括如下步骤：
1、取卵前的超排处理
筛选两侧卵巢上直径<8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为1～15岁(例如1～10岁，例如2～5岁)；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.4～0.6μg/kg牛体重；
2、活体采卵
在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：
(21)术前准备：调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg)，收集管中注入5ml左右吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20％利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；
(22)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；
(23)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；
3、卵母细胞的检出
将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目：卵母细胞的细胞质均匀，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围。
根据本发明第三方面的用途，其中所述吸卵液是包含青霉素400IU/mL、链霉素800μg/mL和10IU肝素的磷酸钠缓冲液，其pH值为6.8，且磷酸根离子浓度为20mM。
根据本发明第三方面的用途，其中所述洗卵液是添加了3mg/mL牛血清白蛋白的BY基础培养液。
根据本发明第三方面的用途，其中所述牛例如但不限于：中国黄牛(南阳牛)、荷斯坦牛(乳牛品种)、西门塔尔牛(肉牛品种)、中国水牛(役用品种)。
根据本发明的任一方面，其中所述FSH制剂中含有浓度小于2％的乙醇。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明使用的胎牛血清可以容易的从市场购得其标准化商品形式，例如可以从默沙克公司购得牛促卵泡素(FSH)，其储存条件为：2-8℃，产品货号：69-22367。
本发明出人意料地发现，使FSH与另一种激素同时，并且在注射制剂中添加适量的泊洛沙姆，可以显著地提高可用卵母细胞数量。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
下面试验中，FSH制剂的配制方法：在无菌操作条件下，向70～80ml无菌注射用水中添加泊洛沙姆188使溶解，向其中添加FSH使溶解，接着向其中添加预先用少许乙醇溶解的雌三醇(使乙醇在FSH制剂中的浓度小于2％)，搅拌均匀得到无色澄清溶液，即得FSH制剂。通过调整添加物的比例，下面试验中所用FSH制剂均照此方案配制。下面试验中，所述吸卵液是包含青霉素400IU/mL、链霉素800μg/mL和10IU肝素的磷酸钠缓冲液，其pH值为6.8，且磷酸根离子浓度为20mM。下面试验中，所述洗卵液是添加了3mg/mL牛血清白蛋白的BY基础培养液。
实施例1：牛活体采卵
1、取卵前的超排处理
筛选两侧卵巢上直径<8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为2～5岁；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.5μg/kg牛体重；
2、活体采卵
在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：
(21)术前准备：调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg)，收集管中注入5ml左右吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20％利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；
(22)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；
(23)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；
3、卵母细胞的检出
将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数(采卵数)，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目(可用卵数)：卵母细胞的细胞质均匀，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围。根据试验动物数计算每头动物的头均采卵数(个)和头均可用卵数(个)。
FSH制剂：牛促卵泡素(35μg/ml)、雌三醇(FSH：雌三醇＝100：15)、泊洛沙姆188(浓度0.4mg/ml)。
供体牛：中国黄牛，13头。
实施例2：牛活体采卵
1、取卵前的超排处理：每次注射剂量以FSH计为0.4μg/kg牛体重，其余同实施例1处理；
2、活体采卵：同实施例1处理；
3、卵母细胞的检出：同实施例1处理。
FSH制剂：牛促卵泡素(50μg/ml)、雌三醇(FSH：雌三醇＝100：10)、泊洛沙姆188(浓度0.5mg/ml)。
供体牛：荷斯坦牛(乳牛品种)，11头。
实施例3：牛活体采卵
1、取卵前的超排处理：每次注射剂量以FSH计为0.6μg/kg牛体重，其余同实施例1处理；
2、活体采卵：同实施例1处理；
3、卵母细胞的检出：同实施例1处理。
FSH制剂：牛促卵泡素(25μg/ml)、雌三醇(FSH：雌三醇＝100：20)、泊洛沙姆188(浓度0.3mg/ml)。
供体牛：西门塔尔牛(肉牛品种)，9头。
实施例4：牛活体采卵
1、取卵前的超排处理：每次注射剂量以FSH计为0.45μg/kg牛体重，其余同实施例1处理；
2、活体采卵：同实施例1处理；
3、卵母细胞的检出：同实施例1处理。
FSH制剂：牛促卵泡素(30μg/ml)、雌三醇(FSH：雌三醇＝100：13)、泊洛沙姆188(浓度0.35mg/ml)。
供体牛：中国水牛(役用品种)，13头。
实施例5：牛活体采卵
1、取卵前的超排处理：每次注射剂量以FSH计为0.55μg/kg牛体重，其余同实施例1处理；
2、活体采卵：同实施例1处理；
3、卵母细胞的检出：同实施例1处理。
FSH制剂：牛促卵泡素(40μg/ml)、雌三醇(FSH：雌三醇＝100：17)、泊洛沙姆188(浓度0.45mg/ml)。
供体牛：中国黄牛，13头。
以上实施例1-5，分别对9～13头不同种类的牛进行活体采卵，并统计其结果，具体如下：
实例 处理头数 头均采卵数/个 头均可用卵数/个 头均可用率
实施例1 13 22.8 20.1 88.1％
实施例2 11 21.6 19.3 89.3％
实施例3 9 22.4 19.7 87.9％
实施例4 13 23.2 20.5 88.4％
实施例5 13 22.2 19.4 87.4％
从表中结果可知，各实施例的头均采卵数均在21～24范围内，头均可用卵数均在19～21范围内、头均可用率均在88～90％范围内。
实施例11～15：分别参照实施例1～5进行牛活体采卵，不同的仅是，在相应实例中，FSH制剂中未添加雌三醇。实施例21～25：分别参照实施例1～5进行牛活体采卵，不同的仅是，在相应实例中，FSH制剂中未添加泊洛沙姆。实施例31～35：分别参照实施例1～5进行牛活体采卵，不同的仅是，在相应实例中，FSH制剂中雌三醇和泊洛沙姆均未添加。以上实施例11-15、实施例21-25以及实施例31-35，分别同样地对9～13头不同种类的牛进行活体采卵，并对结果进行统计，结果显示：实施例11-15的头均采卵数均在21.7～22.8个范围内，头均可用卵数均在13.4～13.9个范围内，头均可用率均在59.4％～63.8％范围内，实施例21-25的头均采卵数均在22.2～23.1个范围内，头均可用卵数均在13.7～14.2个范围内，头均可用率均在59.8％～63.4％范围内，实施例31-35的头均采卵数均在21.6～22.5个范围内，头均可用卵数均在13.6～14.1个范围内，头均可用率均在61.4％～64.7％范围内；例如，实施例11的头均采卵数22.3个、头均可用卵数13.7个、头均可用率61.4％，实施例21的头均采卵数22.9个、头均可用卵数13.8个、头均可用率60.2％，实施例31的头均采卵数21.8个、头均可用卵数13.9个、头均可用率63.8％。
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种FSH制剂，其是包含牛促卵泡素浓度为25～50μg/ml的水溶液。
2.根据权利要求1的FSH制剂，其中还包含雌三醇；例如，牛促卵泡素与雌三醇的重量比为100：10～20，例如为100：15。
3.根据权利要求1的FSH制剂，其中还包含泊洛沙姆188；例如，泊洛沙姆188在该FSH制剂中的浓度为0.3～0.5mg/ml，例如为0.4mg/ml。
4.根据权利要求1的FSH制剂，其是照如下方法配制的：在无菌操作条件下，向70～80ml无菌注射用水中添加泊洛沙姆188使溶解，向其中添加FSH使溶解，接着向其中添加预先用少许乙醇溶解的雌三醇，搅拌均匀得到无色澄清溶液，即得FSH制剂。
5.FSH在制备用于牛活体采卵的制剂中的用途。
6.根据权利要求5的用途，其中所述制剂是包含牛促卵泡素浓度为25～50μg/ml的水溶液。
7.根据权利要求5的用途，其中所述制剂中还包含雌三醇；例如，牛促卵泡素与雌三醇的重量比为100：10～20，例如为100：15。
8.根据权利要求5的用途，其中所述制剂中还包含泊洛沙姆188；例如，泊洛沙姆188在该FSH制剂中的浓度为0.3～0.5mg/ml，例如为0.4mg/ml。
9.根据权利要求5的用途，其中所述制剂是照如下方法配制的：在无菌操作条件下，向70～80ml无菌注射用水中添加泊洛沙姆188使溶解，向其中添加FSH使溶解，接着向其中添加预先用少许乙醇溶解的雌三醇，搅拌均匀得到无色澄清溶液，即得FSH制剂。
10.根据权利要求5的用途，其中所述牛活体采卵包括如下步骤：
(1)、取卵前的超排处理
筛选两侧卵巢上直径<8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为1～15岁(例如1～10岁，例如2～5岁)；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.4～0.6μg/kg牛体重；
(2)、活体采卵
在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：
(21)术前准备：调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg)，收集管中注入5ml左右吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20％利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；
(22)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；
(23)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；
(3)、卵母细胞的检出
将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目：卵母细胞的细胞质均匀，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围；
进一步的，其中所述吸卵液是包含青霉素400IU/mL、链霉素800μg/mL和10IU肝素的磷酸钠缓冲液，其pH值为6.8，且磷酸根离子浓度为20mM；
进一步的，其中所述洗卵液是添加了3mg/mL牛血清白蛋白的BY基础培养液；
进一步的，其中所述牛例如但不限于：中国黄牛(南阳牛)、荷斯坦牛(乳牛品种)、西门塔尔牛(肉牛品种)、中国水牛(役用品种)。
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