CN111269879A - 一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，本发明是能够在奶山羊卵母细胞体外成熟培养过程中，通过添加合适的和合适浓度的减数分裂抑制物，先抑制卵母细胞恢复减数分裂，延长卵母细胞处于生发泡期的时间，使卵母细胞有充分的时间完成胞质成熟，然后恢复减数分裂完成核成熟，从而达到了核成熟和胞质成熟的同步化，有利于IVM卵母细胞后续发育率的提高，通过选择最合适的CNP和雌激素浓度配比，以及减数分裂的抑制时间，使卵母细胞有充分的时间完成胞质成熟，然后恢复减数分裂完成核成熟，从而达到了核成熟和胞质成熟的同步化，进而提高IVM奶山羊卵母细胞后续发育率。

Description

一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法
技术领域
本发明属于材料领域，涉及一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法。
背景技术
随着山羊体外受精、体细胞克隆和转基因等技术的发展，对山羊卵母细胞的需求日益增加。获得山羊卵母细胞的途径主要有两条，即体内冲取成熟卵母细胞和通过体外培养获得成熟卵母细胞。卵母细胞体外成熟是指从卵巢中分离未成熟卵母细胞，在体外经过适宜的条件进行培养，使卵母细胞发育成熟并具有受精能力。IVM技术不仅减少了激素使用量降低了成本，而且可提供数量较多的卵母细胞，是目前常用的获得山羊卵母细胞方法。卵母细胞的成熟包括核成熟和胞质成熟两个基本环节。卵母细胞只有细胞核和胞质二者都成熟后，才能支持正常的胚胎发育。在体内，卵泡液中的抑制因子控制卵母细胞不过早自发恢复减数分裂，而使卵母细胞经历一个相当长过程逐步获得胞质成熟。而在体外，由于脱离了卵泡液的抑制环境，卵母细胞提前自发恢复减数分裂，胞质没有充分的时间成熟，影响了后续发育能力，因此IVM获得的卵母细胞虽然数量多，但卵母细胞的后续发育率远不如体内成熟卵母细胞。为了改善IVM卵母细胞胞质成熟质量，一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法出现迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，通过比较在山羊卵母细胞IVM体系中单独添加CNP或共同添加CNP和雌激素，通过对卵母细胞核成熟、胞质成熟和卵母细胞后续发育能力的分析，筛选CNP抑制山羊卵母细胞减数分裂以达到核质同步成熟并提高IVM卵母细胞质量的合适应用条件，不仅为利用CNP提高IVM山羊卵母细胞质量提供理论和实验基础，而且将以此为依托，建立一套新的高效的奶山羊卵母细胞体外成熟培养技术体系，为奶山羊胚胎工程的产业化提供更多的高质量的卵母细胞。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，其特征在于，包括卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集、卵母细胞体外成熟培养以及卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养；
所述卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程具体如下：
1)自当地屠宰场采集卵巢；
2)将采集的卵巢放置在22℃～25℃的无菌生理盐水中，并在3h内运回实验室；
3)在含有0.1％PVA的mDPBS中收集卵丘-卵母细胞复合体；
4)将卵丘-卵母细胞复合体放置在实体显微镜下，通过实体显微镜收集有三层以上卵丘细胞且胞质均匀、形态良好的卵丘-卵母细胞复合体；
所述卵母细胞体外成熟培养过程具体如下：
1)将未成熟奶山羊卵母细胞放置在成熟培养液I中进行抑制培养抑制其减数分裂6小时；
2)将步骤一中的卵母细胞转入成熟培养液II中恢复减数分裂进行成熟培养18小时；
3)另取一组未成熟奶山羊卵母细胞，将该未成熟奶山羊卵母细胞放置在常规传统的成熟培养液中培养24小时；
4)统计未成熟卵母细胞在成熟培养液I中进行抑制培养的减数分裂抑制率以及成熟培养液II中培养的成熟率和后续发育率，将该数据与常规传统的成熟培养液进行对比，筛选出高效的奶山羊卵母细胞体外成熟培养液；
所述卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养：
1)将卵丘卵母细胞复合体移入0.1％(w/v)透明质酸酶中作用0.5min；
2)用适当口径吸管反复吹打，去除卵丘细胞；
3)选择能观察到第一极体的成熟卵母细胞；
4)将成熟卵母细胞在5μmol/Lionomycin中室温处理2min；
5)之后将步骤四中的成熟卵母细胞放置于SOF培养液中进行洗净；
6)将洗净的成熟卵母细胞放置于含2mM6-DMAPSOF中，在38.5℃以及5％CO2的条件下培养2h；
7)将步骤六中的成熟卵母细胞放置在不含6-DMAP的SOF中，在38.5℃、5％CO2以及饱和湿度条件下培养4h；
所述胚胎培养采用SOFaa培养液进行培养，其培养方法具体为：于四孔板的每个培养孔内加入500μL胚胎培养液并覆盖石蜡油，置于CO2培养箱中预平衡，将孤雌激活胚胎随机移入到四孔板的培养孔中，置于38.5℃、5％CO2以及饱和湿度的培养箱中培养，5d观察记录桑葚胚数，6～8d记录囊胚数。
进一步地，所述卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程的步骤二中的无菌生理盐水中添加有100IU/mL青霉素和0.05mg/mL硫酸链霉素。
进一步地，所述卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液内每100μL成熟培养液培养25枚卵丘卵母细胞复合体，所述卵母细胞体外成熟培养具体在38.5℃以及5％CO2环境下培养。
进一步地，所述卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液I成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液、适量100ng/ml的C型钠尿肽以及适量10nmol/L的β-雌二醇。
进一步地，所述卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液II成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、适量0.075U/mL的人绝经期促性腺激素、适量1μg/mL的β-雌二醇、适量10ng/mL的表皮细胞生长因子以及1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液。
进一步地，所述卵母细胞体外成熟培养过程中的常规传统的成熟培养液的成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、适量0.075U/mL的人绝经期促性腺激素、适量1μg/mL的β-雌二醇、适量10ng/mL的表皮细胞生长因子以及1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液。
本发明的有益效果：本发明的技术关键就是能够在奶山羊卵母细胞体外成熟培养过程中，添加合适的和合适浓度的减数分裂抑制物，先抑制卵母细胞恢复减数分裂，延长卵母细胞处于生发泡期的时间，使卵母细胞有充分的时间完成胞质成熟，然后恢复减数分裂完成核成熟，从而达到了核成熟和胞质成熟的同步化，有利于IVM卵母细胞后续发育率的提高。而CNP是卵泡发育中卵泡液天然成分，在IVM中添加CNP模拟了体内生理条件下卵母细胞减数分裂的抑制机制。CNP没有物种特异性，是一种保守的卵母细胞减数分裂抑制因子。因此，在IVM中添加CNP，可以抑制卵母细胞恢复减数分裂，延长卵母细胞处于生发泡期的时间，使卵母细胞有充分的时间完成胞质成熟，而且，CNP对减数分裂的抑制不会损伤卵母细胞，有利于IVM卵母细胞支持后续的胚胎发育。但是，CNP抑制奶山羊减数分裂恢复的时间是暂时的，通过添加不同浓度的CNP和雌激素，筛选最合适的CNP和雌激素浓度配比，以及减数分裂的抑制时间，使卵母细胞有充分的时间完成胞质成熟，然后恢复减数分裂完成核成熟，从而达到了核成熟和胞质成熟的同步化，以提高IVM奶山羊卵母细胞后续发育率是本发明的技术关键和创新点。
本发明利用来源于屠宰场的废弃卵巢，经过外成熟培养后为良种胚胎体外产业化、体细胞克隆以及转基因动物生产提供优质成熟卵母细胞是解决扩大优质奶山羊卵母细胞来源这一问题的重要途径。通过本发明建立一套高效的奶山羊卵母细胞体外成熟培养技术体系，为奶山羊胚胎工程的产业化提供更多的高质量的卵母细胞，最大限度的扩大优质卵母细胞的来源。随着奶山羊胚胎工程的产业化的快速发展，本发明的应用能为奶山羊胚胎工程的产业化提供更多的高质量的卵母细胞，加快奶山羊良种繁育体系的完善，提高奶山羊良种化程度，具有较高的经济效益和社会效益。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为不同浓度CNP对山羊卵母细胞减数分裂抑制的作用图；
图2为不同浓度雌激素对CNP介导的山羊卵母细胞减数分裂抑制作用的影响。
具体实施方式
结合图1-2通过如下实施例对本发明进行详细说明：
一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，包括卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集、卵母细胞体外成熟培养以及卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养；
卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程具体如下：
1)自当地屠宰场采集卵巢；
2)将采集的卵巢放置在22℃～25℃的无菌生理盐水中，并在3h内运回实验室；
3)在含有0.1％PVA的mDPBS中收集卵丘-卵母细胞复合体；
4)将卵丘-卵母细胞复合体放置在实体显微镜下，通过实体显微镜收集有三层以上卵丘细胞且胞质均匀、形态良好的卵丘-卵母细胞复合体；
卵母细胞体外成熟培养过程具体如下：
1)将未成熟奶山羊卵母细胞放置在成熟培养液I中进行抑制培养抑制其减数分裂6小时；
2)将步骤一中的卵母细胞转入成熟培养液II中恢复减数分裂进行成熟培养18小时；
3)另取一组未成熟奶山羊卵母细胞，将该未成熟奶山羊卵母细胞放置在常规传统的成熟培养液中培养24小时；
4)统计未成熟卵母细胞在成熟培养液I中进行抑制培养的减数分裂抑制率以及成熟培养液II中培养的成熟率和后续发育率，将该数据与常规传统的成熟培养液进行对比，筛选出高效的奶山羊卵母细胞体外成熟培养液；
卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养：
1)将卵丘卵母细胞复合体移入0.1％(w/v)透明质酸酶中作用0.5min；
2)用适当口径吸管反复吹打，去除卵丘细胞；
3)选择能观察到第一极体的成熟卵母细胞；
4)将成熟卵母细胞在5μmol/Lionomycin中室温处理2min；
5)之后将步骤四中的成熟卵母细胞放置于SOF培养液中进行洗净；
6)将洗净的成熟卵母细胞放置于含2mM6-DMAPSOF中，在38.5℃以及5％CO2的条件下培养2h；
7)将步骤六中的成熟卵母细胞放置在不含6-DMAP的SOF中，在38.5℃、5％CO2以及饱和湿度条件下培养4h；
胚胎培养采用SOFaa培养液进行培养，其培养方法具体为：于四孔板的每个培养孔内加入500μL胚胎培养液并覆盖石蜡油，置于CO2培养箱中预平衡，将孤雌激活胚胎随机移入到四孔板的培养孔中，置于38.5℃、5％CO2以及饱和湿度的培养箱中培养，5d观察记录桑葚胚数，6～8d记录囊胚数。
卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程的步骤二中的无菌生理盐水中添加有100IU/mL青霉素和0.05mg/mL硫酸链霉素。
卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液内每100μL成熟培养液培养25枚卵丘卵母细胞复合体，卵母细胞体外成熟培养具体在38.5℃以及5％CO2环境下培养。
卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液I成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液、适量100ng/ml的C型钠尿肽以及适量10nmol/L的β-雌二醇。
卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液II成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、适量0.075U/mL的人绝经期促性腺激素、适量1μg/mL的β-雌二醇、适量10ng/mL的表皮细胞生长因子以及1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液。
卵母细胞体外成熟培养过程中的常规传统的成熟培养液的成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、适量0.075U/mL的人绝经期促性腺激素、适量1μg/mL的β-雌二醇、适量10ng/mL的表皮细胞生长因子以及1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液。
实施例1：成熟培养液I中CNP浓度筛选
在一切条件相同的情况下，分成四组培养基进行操作，将四组中的成熟培养液I中的C型钠尿肽分别设为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml以及150ng/ml，培养8h，观察四组培养基中山羊卵母细胞减数分裂恢复的进程情况。
实施例2：成熟培养液I中雌激素浓度筛选
在一切条件相同的情况下，分成四组培养基进行操作，将四组中的成熟培养液I中的雌二醇分别设为0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L以及15nmol/L，培养8h，观察四组培养基中山羊卵母细胞减数分裂阻滞时间的情况。
实施例3：CNP和雌激素可协同提高奶山羊体外成熟卵母细胞成熟率
如表1所示，未成熟卵母细胞在含有100ng/ml的CNP和10nmol/L雌二醇的成熟培养液I中处理6h后，再在成熟培养液II进行体外成熟培养(6+18h组)，其卵母细胞核成熟率(75.88±3.12％)显著高于常规传统组(OM24h)(68.41±1.99％)的(P<0.05)。这表明，山羊卵母细胞经抑制培养6h再进行成熟培养18h后，卵母细胞的成熟率得到显著提高。
表1山羊卵母细胞体外成熟情况
组别 卵母细胞数 成熟卵母细胞数 卵母细胞成熟率(％)
OM24h 228 154 68.41±1.99<sup>a</sup>
6+18h 248 188 75.88±3.12<sup>b</sup>
实施例4：CNP和雌激素可协同提高奶山羊体外成熟卵母细胞后续发育能力
如表2所示，未成熟卵母细胞在含有100ng/ml的CNP和10nmol/L雌二醇的成熟培养液I中处理6h后，再在成熟培养液II进行体外成熟培养(6+18h组)，选择排出第1极体的成熟卵母细胞进行孤雌激活，并统计孤雌激活胚胎卵裂率和囊胚率。其孤雌激活胚胎卵裂率(84.24±0.66％)显著高于常规传统组(OM24h)(72.67±0.29％)(P<0.05)。孤雌激活胚胎囊胚率(44.80±1.83％)显著高于常规传统组(OM24h)(31.72±4.50％)(P<0.05)。这表明，山羊未成熟卵母细胞经抑制培养6h再进行成熟培养18h后，卵母细胞的后续发育能力及质量得到显著提高。
表2体外成熟山羊卵母细胞孤雌激活胚胎发育结果
组别 成熟卵母细胞数/枚 孤雌激活卵裂率/％ 囊胚发育率/％
OM24h 154 72.67±0.29<sup>a</sup>(112/154) 31.72±4.50<sup>a</sup>(36/112)
6+18h 188 84.24±0.66<sup>b</sup>(154/188) 44.80±1.83<sup>b</sup>(69/154)
如图1所示，在0ng/ml CNP组中山羊卵母细胞IVM培养4h后，保持GV期的比例分别只有40％。而在IVM体系中添加100ng/ml的CNP，山羊卵母细胞减数分裂恢复的进程被明显抑制，培养4h后，保持GV期的比例分别为67％。但是值得注意的是，当培养时间超过8h，CNP不再能抑制GVBD的发生，50ng/ml组，100ng/ml组，150ng/ml组与0ng/ml CNP组一样有90％以上的卵母细胞发生了GVBD。因此，CNP浓度选定为100ng/ml组。
如图2所示，在IVM体系中添加100ng/ml的CNP和10nmol/L雌二醇后，山羊卵母细胞减数分裂阻滞时间被延长至6h。因此，雌激素浓度选定为10nmol/L。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (6)

1.一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，其特征在于，包括卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集、卵母细胞体外成熟培养以及卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养；
所述卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程具体如下：
1)自当地屠宰场采集卵巢；
2)将采集的卵巢放置在22℃～25℃的无菌生理盐水中，并在3h内运回实验室；
3)在含有0.1％PVA的mDPBS中收集卵丘-卵母细胞复合体；
4)将卵丘-卵母细胞复合体放置在实体显微镜下，通过实体显微镜收集有三层以上卵丘细胞且胞质均匀、形态良好的卵丘-卵母细胞复合体；
所述卵母细胞体外成熟培养过程具体如下：
1)将未成熟奶山羊卵母细胞放置在成熟培养液I中进行抑制培养抑制其减数分裂6小时；
2)将步骤一中的卵母细胞转入成熟培养液II中恢复减数分裂进行成熟培养18小时；
3)另取一组未成熟奶山羊卵母细胞，将该未成熟奶山羊卵母细胞放置在常规传统的成熟培养液中培养24小时；
4)统计未成熟卵母细胞在成熟培养液I中进行抑制培养的减数分裂抑制率以及成熟培养液II中培养的成熟率和后续发育率，将该数据与常规传统的成熟培养液进行对比，筛选出高效的奶山羊卵母细胞体外成熟培养液；
所述卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养：
1)将卵丘卵母细胞复合体移入0.1％(w/v)透明质酸酶中作用0.5min；
2)用适当口径吸管反复吹打，去除卵丘细胞；
3)选择能观察到第一极体的成熟卵母细胞；
4)将成熟卵母细胞在5μmol/Lionomycin中室温处理2min；
5)之后将步骤四中的成熟卵母细胞放置于SOF培养液中进行洗净；
6)将洗净的成熟卵母细胞放置于含2mM6-DMAPSOF中，在38.5℃以及5％CO2的条件下培养2h；
7)将步骤六中的成熟卵母细胞放置在不含6-DMAP的SOF中，在38.5℃、5％CO2以及饱和湿度条件下培养4h；
所述胚胎培养采用SOFaa培养液进行培养，其培养方法具体为：于四孔板的每个培养孔内加入500μL胚胎培养液并覆盖石蜡油，置于CO2培养箱中预平衡，将孤雌激活胚胎随机移入到四孔板的培养孔中，置于38.5℃、5％CO2以及饱和湿度的培养箱中培养，5d观察记录桑葚胚数，6～8d记录囊胚数。
2.根据权利要求1所述的一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，其特征在于，所述卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程的步骤二中的无菌生理盐水中添加有100IU/mL青霉素和0.05mg/mL硫酸链霉素。
3.根据权利要求1所述的一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液内每100μL成熟培养液培养25枚卵丘卵母细胞复合体，所述卵母细胞体外成熟培养具体在38.5℃以及5％CO2环境下培养。
4.根据权利要求1所述的一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液I成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液、适量100ng/ml的C型钠尿肽以及适量10nmol/L的β-雌二醇。
5.根据权利要求1所述的一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液II成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、适量0.075U/mL的人绝经期促性腺激素、适量1μg/mL的β-雌二醇、适量10ng/mL的表皮细胞生长因子以及1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液。
6.根据权利要求1所述的一种高效奶山羊卵母细胞体外成熟培养液和培养方法，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养过程中的常规传统的成熟培养液的成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、适量0.075U/mL的人绝经期促性腺激素、适量1μg/mL的β-雌二醇、适量10ng/mL的表皮细胞生长因子以及1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液。
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