CN116103227B - 一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，通过筛选化合物诱导剂组合，首次从16‑32细胞期胚胎中捕获并稳定衍生出滋养层干细胞；诱导培养基成分：RPMI‑1640基础培养基，20%的胎牛血清、丙酮酸钠、L‑谷氨酰胺、β‑巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子‑4、肝素、XAV939、LATS‑IN‑1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白‑4、重组人激活素‑A与霉素混合溶液；本发明方法简单高效、周期短、稳定性好。

Description

一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法
技术领域
本发明涉及小鼠干细胞技术领域，具体的说是一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法。
背景技术
胚胎滋养层对于胚胎植入母体和维持胚胎的正常发育至关重要。哺乳动物胚胎在第一次谱系分化过程中首先产生了滋养外胚层（TE）和内细胞团（ICM），这一过程发生在16-32细胞阶段。在囊胚后期，内细胞团又分化为外胚层(EPI)和原始内胚层(PE)。外胚层(EPI)发育为胎儿个体，原始内胚层(PE)形成卵黄囊，而滋养外胚层（TE）主要参与胚胎着床并发育为胎膜和胎盘。胎盘作为妊娠期胎儿与母体进行营养物质和气体交换的场所，是哺乳动物妊娠期内非常重要内分泌器官。在生殖医学领域，虽然辅助生殖技术的应用帮助众多不孕不育夫妇实现了为人父母的愿望，但胚胎着床失败仍是解决不孕症的难题。在科学研究中，由于人源胚胎材料稀缺和相关伦理的约束，小鼠胚胎滋养层干细胞成为了一种重要的滋养外胚层体外研究模型，对于研究胚胎早期分化、胚胎着床以及胎盘发育等都具有重要应用价值。同时，滋养层干细胞的深入研究对于干预和治疗胚胎着床失败，反复流产以及胎盘异常等临床疾病具有重要的指导意义。
目前传统小鼠胚胎滋养层干细胞的构建是以囊胚或者早期胎盘为起始材料，构建周期长、效率较低。同时在传统构建体系中，胚胎体外衍生的细胞群中除了滋养层干细胞（CDX2为标志蛋白）外，还包含大量的原始内胚层样细胞（GATA6 为标志蛋白）和分化后的滋养层巨细胞等，是一种混合生长的状态，需要较长的时间去纯化才能完成滋养层干细胞的建系。因此，需要建立更加简单且高效的小鼠滋养层干细胞构建体系。
发明内容
为了弥补以上不足，本发明提供了一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，以解决上述背景技术中的问题。
本发明的技术方案是：
一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，包括下列步骤：
1）ICR小鼠胚胎成纤维细胞经10ug/ml浓度的丝裂霉素处理3小时，作为饲养层细胞备用；
2）配制小鼠滋养层干细胞诱导培养基，将RPMI-1640基础培养基+20%的胎牛血清，然后分别加入丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子-4、肝素、XAV939、LATS-IN-1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白-4、重组人激活素-A与霉素混合溶液；
3）收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎、E3.5囊胚与E4.5囊胚其中一种，用酸性台氏液去除透明带；
4）去除透明带后放入底部铺好饲养层细胞的孔板中，每孔放入1枚；
5）胚胎衍生物贴附在皿底的饲养层细胞上，向外缘延伸生长；
6）培养5天后，将衍生物在胰酶溶液中消化5分钟，用玻璃细针轻轻撕碎并进行传代培养；
7）传代培养2～4天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系；
8）上述培养过程中，每48小时更换一次小鼠滋养层干细胞诱导培养基。
作为优选的技术方案，所述3）中收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎，用酸性台氏液去除透明带；所述5）中16～32细胞期胚胎会在0.5～1天后贴附在皿底的饲养层细胞上，以扁平的克隆形态向外缘延伸生长。
作为优选的技术方案，所述2）中加入丙酮酸钠 11g/L, L-谷氨酰胺2mM/L,β-巯基乙醇 0.1 nM/L，重组人成纤维细胞生长因子-4 25ng/ml，肝素 1μg/ml, XAV939 3μM/L，LATS-IN-1 2μM/L，Y27632 10μM/L, 重组人骨形态发生蛋白-4 10ng/ml, 重组人激活素-A20 ng/ml,1%的霉素混合溶液。在现有培养基上加入了XAV939、LATS-IN-1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白-4、重组人激活素-A 等多种小分子化合物抑制剂，对Hippo、Wnt 、RHO-ROCK等信号通路进行多维度调控，高效诱导TE的产生，抑制ICM的产生和进一步的谱系分化，达到了对早期16-32阶段的卵裂胚胎进行高效稳定的诱导。
作为优选的技术方案，霉素混合溶液为青霉素与链霉素的混合溶液。
作为优选的技术方案，所述7）传代培养3天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系。
作为优选的技术方案，所述6）中胰酶溶液为0.05%浓度的胰酶溶液。
由于采用了上述技术方案一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，包括下列步骤：
1）ICR小鼠胚胎成纤维细胞经10ug/ml浓度的丝裂霉素处理3小时，作为饲养层细胞备用；2）配制小鼠滋养层干细胞诱导培养基，将RPMI-1640基础培养基+20%的胎牛血清，然后分别加入丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子-4、肝素、XAV939、LATS-IN-1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白-4、重组人激活素-A与霉素混合溶液；3）收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎、E3.5囊胚与E4.5囊胚其中一种，用酸性台氏液去除透明带；4）胚胎去除透明带后放入底部铺好饲养层细胞的孔板中，每孔放入1枚；5）胚胎衍生物贴附在皿底的饲养层细胞上，向外缘延伸生长；6）培养5天后，将衍生物在胰酶溶液中消化5分钟，用玻璃细针轻轻撕碎并进行传代培养；7）传代培养2～4天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系；8）上述培养过程中，每48小时更换一次小鼠滋养层干细胞诱导培养基。
本发明与现有技术相比较的优点：
1.该诱导培养体系，不仅支持更早期的16-32细胞期胚胎，也支持E3.5和E4.5囊胚，滋养层干细胞衍生效率高，结果稳定。与传统诱导培养体系相比，该诱导体系针对上述不同阶段胚胎的构建成功率均显著提高，其中16细胞期胚胎为96.00% VS 41.67%; 32细胞期胚胎为97.22% VS 46.67%; E3.5囊胚为100.00% VS 64%; E4.5囊胚为91.67% VS64.29%。
2.较传统诱导培养体系相比，该诱导体系抑制了胚胎的进一步谱系分化，既没有衍生出原始内胚层（PrE）样细胞（GATA6 阳性），也没有衍生出分化的滋养层巨细胞，使得纯化建系的过程更为简便。
3.较传统诱导培养体系相比，该诱导体系获得的滋养层干细胞形态致密且立体，自我更新能力稳定，且滋养层干细胞标志性基因Cdx2、Elf5、Ets2以及Tfap2c的表达水平显著升高。
4.该诱导培养体系构建的滋养层干细胞在体内、外的分化实验中，既可以分化为滋养层亚型细胞，也参与了植入前囊胚TE和植入后E8.5及E16.5胎盘的形成。该新型滋养层干细胞在体外和体内均具有分化为成熟滋养层细胞的潜能。综上，本发明方法简单高效、周期短、稳定性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为传统诱导体系中的32细胞期胚胎衍生物图；其中箭头指示为分化的滋养层巨细胞，A区域为ICM；比例尺为50μm；
图2为传统诱导体系中的32细胞期胚胎衍生物的免疫荧光染色图；其中A箭头指原始内胚层样细胞（GATA6阳性），B箭头指滋养层干细胞（CDX2阳性）；比例尺为20μm；
图3为本发明诱导体系中的32细胞期胚胎衍生物图；其中B区域为衍生的滋养层干细胞，A区域为ICM类似物；比例尺为50μm；
图4为本发明诱导体系中的32细胞期胚胎衍生物免疫荧光染色图；比例尺为50μm；
图5为本发明诱导体系中16-32细胞期、E3.5和E4.5胚胎衍生物及较传统诱导体系中滋养层干细胞衍生效率的对比图；右侧图中深灰色为传统诱导体系，浅灰色为本发明诱导体系；* P<0.05, ** P<0.01, 比例尺为50μm；
图6为传统滋养层干细胞与本发明滋养层干细胞中标志基因在mRNA及蛋白水平的表达差异图；其中TS为传统滋养层干细胞，NTS为该新型滋养层干细胞，比例尺为20μm；
图7为本发明滋养层干细胞具有在体外分化为滋养层亚型细胞的潜能图；其中KRT7、TPBPA、PRL以及SYNA 为滋养层亚型细胞的标志蛋白，比例尺为50μm；
图8为本发明滋养层干细胞在体内参与了植入前囊胚TE和植入后E8.5和E16.5胎盘的形成图；比例尺为50μm（左）和1mm（右）。
具体实施方式
本发明提供了一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法以解决背景技术中的问题。
一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，包括下列步骤：
1）ICR小鼠胚胎成纤维细胞经10ug/ml浓度的丝裂霉素处理3小时，作为饲养层细胞备用；
2）配制小鼠滋养层干细胞诱导培养基，将RPMI-1640基础培养基+20%的胎牛血清，然后分别加入丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子-4、肝素、XAV939、LATS-IN-1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白-4、重组人激活素-A与霉素混合溶液；
3）收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎、E3.5囊胚与E4.5囊胚其中一种，用酸性台氏液去除透明带；
4）去除透明带后放入底部铺好饲养层细胞的孔板中，每孔放入1枚；
5）胚胎衍生物贴附在皿底的饲养层细胞上，向外缘延伸生长；
6）培养5天后，将衍生物在胰酶溶液中消化5分钟，用玻璃细针轻轻撕碎并进行传代培养；
7）传代培养2～4天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系；
8）上述培养过程中，每48小时更换一次小鼠滋养层干细胞诱导培养基。
所述3）中收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎，用酸性台氏液去除透明带；所述5）中16～32细胞期胚胎会在0.5～1天后贴附在皿底的饲养层细胞上，以扁平的克隆形态向外缘延伸生长。
所述2）中加入丙酮酸钠 11g/L, L-谷氨酰胺2 mM/L,β-巯基乙醇 0.1 nM/L，重组人成纤维细胞生长因子-4 25ng/ml，肝素 1μg/ml, XAV939 3μM/L，LATS-IN-1 2μM/L，Y27632 10μM/L, 重组人骨形态发生蛋白-4 10ng/ml, 重组人激活素-A 20 ng/ml,1%的霉素混合溶液。
霉素混合溶液为青霉素与链霉素的混合溶液。
所述7）传代培养3天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系。
所述6）中胰酶溶液为0.05%浓度的胰酶溶液。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：不同时期胚胎在该新型诱导体系中衍生滋养层干细胞的效率。
1. 分别将16细胞期胚胎、32细胞期胚胎、E3.5和E4.5期囊胚用酸性台氏液去除透明带。
2. 分别放置于底部铺好饲养层细胞的96孔板中培养，每孔1枚胚胎，每48小时更换培养基。以传统诱导体系作为对照。
3. 在传统诱导体系中，16-32细胞期胚胎继续分化发育为囊胚，随后才贴附皿底生长；而在该新型诱导体系中，16-32细胞期胚胎直接贴附皿底生长，未继续分化发育为囊胚。
4. 在传统诱导体系中，16细胞期胚胎、32细胞期胚胎、E3.5和E4.5期囊胚均会衍生出分化的滋养层巨细胞和原始内胚层样细胞，但均不会发生在该新型诱导体系中。
5. 统计了在传统和该新型诱导体系中不同时期胚胎衍生滋养层干细胞的效率，其中16细胞期胚胎分别为41.67%（5/12）和96.00%（24/25）；32细胞期胚胎分别为46.67%（7/15）和97.22%（35/36）；E3.5囊胚分别为64%（16/25）和100.00%（13/13）；E4.5囊胚分别为64.29%（9/14）和91.67%（11/12）。
6. 该新型诱导培养体系，不仅支持更早期的16-32细胞期卵裂胚，也支持E3.5和E4.5囊胚，滋养层干细胞衍生效率高，结果稳定。
实施例2：检测该新型滋养层干细胞中标志性基因的表达情况。
1. 基于实施例1的构建结果，采用实时荧光定量PCR检测滋养层干细胞标志性基因Cdx2、Elf5、Ets2以及Tfap2c在该新型滋养层干细胞中的表达情况，以传统滋养层干细胞为对照。与对照组相比，Cdx2、Elf5、Ets2以及Tfap2c的表达水平显著升高。引物设计如下：
Cdx2-F：CTGGACAAGGACGTGAGCAT
Cdx2-R：ACTGCGGAGGACTGACAAAG
Elf5-F：GTCAAGACTGTCACAGCCGA
Elf5-R：TTCCCATTCCAGGATGCCAC
Ets2-F：GCCAACAGTTTTCGTGGGAC
Ets2-R：GGTGGCTTTTAAGGCTTGGC
Tfap2c-F：GAGGTGCAGAATGTGGACGA
Tfap2c-R：CCCCAAAGGGTTCTTGGTCA
2. 免疫荧光技术检测滋养层干细胞标志性蛋白CDX2和TFAP2C的表达情况，以传统滋养层干细胞为对照。与对照组相比，CDX2和TFAP2C在该新型滋养层干细胞中表达量更高。
3. 较传统滋养层干细胞相比，该新型滋养层干细胞自我更新能力稳定，更好的维持了细胞干性。
实施例3：检测该新型滋养层干细胞在体外分化为成熟滋养层细胞的潜能。
1. 基于实施例2分子水平的鉴定结果，我们通过体外分化实验检测该新型滋养层干细胞的细胞功能。
2. 将该新型滋养层干细胞置于分化培养基中随机分化，每48小时更换培养基。
3. 分化培养基成分为：RPMI-1640基础培养基 + 20 %的胎牛血清，分别加入丙酮酸钠（Sodium pyruvate，11g/L）, L-谷氨酰胺（ L- Glutamine, 2mM/L）,β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol, 0.1 nM/L)，1%的青霉素/链霉素混合溶液（Penicillin-StreptomycinSolution 100X）。
4. 收集分化培养2天和4天后的细胞进行免疫荧光检测，以KRT7、TPBPA、PRL以及SYNA 作为滋养层亚型细胞的标志蛋白。
5. 分化2天后，KRT7开始高表达；分化4天后，多数细胞开始表达TPBPA、PRL以及SYNA。
6.结果表明：该新型滋养层干细胞在体外具有分化为成熟滋养层细胞的潜能。
实施例4：检测该新型滋养层干细胞在体内分化为成熟滋养层细胞的潜能。
1. 基于实施例3体外分化实验的结果，我们通过体内分化实验检测该新型滋养层干细胞的细胞功能。
2. 将稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的新型滋养层干细胞通过显微注射的方法注入32细胞期胚胎（ICR小鼠）卵间隙内，每枚胚胎注入4-6个滋养层干细胞。放入KSOM培养基中继续培养36小时。
3. 结果发现，该新型滋养层干细胞参与了囊胚滋养外胚层（TE）的发育。
4. 同时，将注射过滋养层干细胞的嵌合囊胚移植到假孕的ICR小鼠子宫内，分别在移植后5天（约E8.5）和13天（约E16.5）时取出孕体。
5. 在E8.5和E16.5的孕体胎盘中，均可观察到绿色荧光，表明该新型滋养层干细胞参与了植入后E8.5和E16.5胎盘的形成。
6. 结果表明：该新型滋养层干细胞在体内具有分化为成熟滋养层细胞的潜能。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种小鼠滋养层干细胞的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）ICR小鼠胚胎成纤维细胞经10ug/ml浓度的丝裂霉素处理3小时，作为饲养层细胞备用；
2）配制小鼠滋养层干细胞诱导培养基，将RPMI-1640基础培养基+20%的胎牛血清，然后分别加入丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子-4、肝素、XAV939、LATS-IN-1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白-4、重组人激活素-A与霉素混合溶液；霉素混合溶液为青霉素与链霉素的混合溶液；
3）收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎、E3.5囊胚与E4.5囊胚其中一种，用酸性台氏液去除透明带；
4）胚胎去除透明带后放入底部铺好饲养层细胞的孔板中，每孔放入1枚；
5）胚胎衍生物贴附在皿底的饲养层细胞上，向外缘延伸生长；
6）培养5天后，将衍生物在胰酶溶液中消化5分钟，用玻璃细针轻轻撕碎并进行传代培养；
7）传代培养2～4天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系；
8）上述培养过程中，每48小时更换一次小鼠滋养层干细胞诱导培养基。
2.如权利要求1所述的一种小鼠滋养层干细胞的构建方法，其特征在于：所述3）中收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎，用酸性台氏液去除透明带；所述5）中16～32细胞期胚胎会在0.5～1天后贴附在皿底的饲养层细胞上，以扁平的克隆形态向外缘延伸生长。
3.如权利要求1所述的一种小鼠滋养层干细胞的构建方法，其特征在于：所述2）中加入丙酮酸钠 11g/L, L-谷氨酰胺2 mM/L,β-巯基乙醇 0.1 nM/L，重组人成纤维细胞生长因子-4 25ng/ml，肝素 1μg/ml, XAV939 3μM/L，LATS-IN-1 2μM/L，Y27632 10μM/L, 重组人骨形态发生蛋白-4 10ng/ml, 重组人激活素-A 20 ng/ml,1%的霉素混合溶液。
4.如权利要求1所述的一种小鼠滋养层干细胞的构建方法，其特征在于：所述7）传代培养3天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系。
5.如权利要求1所述的一种小鼠滋养层干细胞的构建方法，其特征在于：所述6）中胰酶溶液为0.05%浓度的胰酶溶液。
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