CN114561342A - Nad信号通路激动剂在体外胚胎培养中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种体外培养胚胎细胞的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：(i)在存在NAD信号通路激动剂的条件下，将受精卵细胞或其衍生物进行体外培养。在受精卵细胞或其衍生物的培养过程中，通过添加NAD信号通路激动剂，能够有效地提高体外培养胚胎的质量，例如发育潜能。

Description

NAD信号通路激动剂在体外胚胎培养中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及NAD信号通路激动剂在体外胚胎培养中的应用。

背景技术

在人类体外受精与胚胎移植治疗(俗称“试管婴儿”)中，早期的不成熟卵子、成熟卵子、精子、受精卵、早期胚胎都需要在特定的培养系统里孵育。目前的培养温度、湿度、氧气含量等物理环境基本完善且恒定，但卵子体外成熟培养液、受精卵培养液和早期胚胎培养液虽然有商业制作和应用，但远远没有完善和成熟，还没有达到医疗期望。造成的突出问题是：40％-60％的人类胚胎发生早期发育阻滞现象，大部分胚胎在发育早期就停止发育，进而死亡，造成“试管婴儿”治疗效率低下，特别是大于35岁年龄妇女和卵巢功能提前下降的年轻妇女(小于35岁)。

因此，体外培养胚胎的手段仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术的技术问题至少之一。有鉴于此，本发明提出了一种能够有效进行体外培养胚胎的手段。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

本发明的发明人在对“试管婴儿”的深入研究过程中，意外发现在卵子、精子或者胚胎的培养过程中，通过在培养基中添加NAD信号通路激动剂，尤其是NR能够有效地提高卵子、精子或者胚胎的质量，例如发育潜能。由此，本发明提出了一种能够提高“试管婴儿”的成功率，从而，能够有效地推动行业发展，为人类“试管婴儿”治疗做出有效的贡献。

由此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种体外培养胚胎细胞的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：(i)在存在NAD信号通路激动剂的条件下，将受精卵细胞或其衍生物进行体外培养。

如前所述，本发明的发明人发现在受精卵细胞或其衍生物的培养过程中，通过添加NAD信号通路激动剂，能够有效地提高体外培养胚胎的质量，例如发育潜能。

本发明的发明人在多年的研究中，发现在受精卵体外过程中，人类胚胎阻滞现象多发生在6-8细胞期。在卵子受精后，母源基因调控发展为胚胎自身基因调控，该转变通常需要合子基因组激活(ZGA)，从母源物质的降解一直到胚胎基因组的激活，这个过程被称为母本到胚胎的转变。在这个转变过程中，胚胎中基因的转录和表达经历了一系列巨大变化，包括受精后再程序化、基因组激活、去甲基化和再甲基化、X染色体失活等，容易受各种因素影响造成胚胎发育障碍。

小鼠、猪等哺乳动物的早期胚胎发育阻滞现象目前取得了一定进展，在鼠牛羊等哺乳动物胚胎体外培养发育研究中发现胚胎发育阻滞与某些基因的沉默以及线粒体异常有关，而在治疗方面目前主要集中在抗氧化机制领域。另外通过输卵管细胞共培养，改良培养液等方法也能改善胚胎发育阻滞。而对人类胚胎体外发育阻滞的研究尚处于初步阶段。造成早期胚胎发育阻滞的原因比较多样，卵母细胞代谢异常、ATP含量下降、转录异常、核浆发育不同步、卵子多倍体形成等变化而影响卵母细胞质量，也有精子质量欠佳的因素等等。

现有的精子、卵子和胚胎培养液，成份主要为水、各种电解质、平衡盐、能量物质如丙酮酸钠、葡萄糖、生长因子等等。市场上有各种各样的培养液，有的是序贯培养，即是在不同的发育阶段，营养成份稍有差异。有的是一步法培养，各种营养物质在添加在一个培养液里以满足整个不同发育阶段的需求。各种培养液体虽然有差异，有不同的配方，但都没有解决早期胚胎发育的直接能量供应问题，是造成早期胚胎发育阻滞或者发育不良的主要原因。目前在卵子的体外成熟、卵子培养、胚胎培养、精子孵育阶段等各个环节，添加了不同的能量物质(如丙酮酸钠、葡萄糖)和细胞因子等等。但这些物质的添加并没有明显促进胚胎发育，但远远没有帮助胚胎继续发育，没有缓解或者解决胚胎发育阻滞问题，也没有建立优化理想的卵子、精子、胚胎培养的完善培养液体。发明人通过研究，意外发现主要原因是卵子、精子、胚胎缺乏直接利用丙酮酸钠、葡萄糖等能量物质的能力。

根据本发明的实施例，所述NAD信号通路激动剂包括NR、NMN或其功能类似物。

当然，本领域技术人员能够理解的是，上述NAD信号通路激动剂还可以包括上述NR、NMN或其功能类似的前体化合物或者药物上可以接受的盐等衍生物。烟酰胺核糖(NR)是维生素B3的衍生物，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的前体底物。摄入后可以增加NAD水平，参与细胞100多个代谢活动，明显提高细胞活性(精子、卵子和早期胚胎)。

根据本发明的实施例，优选所述NAD信号通路激动剂为NR，烟酰胺核糖Nicotinamide Riboside(NR)是维生素B3的衍生物，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的前体。NR具有下列化合物结构：

本发明的发明人惊奇地发现，添加NR的效果明显优于直接添加NMN，究其原因，可能是因为NR作为NMN的前体化合物其理化性质(例如pH)更适于体外受精卵细胞衍生物例(如早期胚胎的生长)，并且在NR被细胞摄入后能够快速转化成NAD从而发挥NAD信号通路激动剂的作用，从而促进早期胚胎的发育。

根据本发明的实施例，所述受精卵细胞衍生物包括发育不良胚胎。尤其是，根据本发明的实施例，所述发育不良胚胎处于一细胞到囊胚期(种植前)胚胎期。本发明的发明人意外地发现，通过使发育不良胚胎与NAD信号通路激动剂接触，尤其是NR进行接触，使处于囊胚期之前的胚胎能够有效地如提高体外培养胚胎的质量，例如发育潜能，从而挽救宝贵的胚胎资源，提高试管婴儿的成功率。

根据本发明的实施例，在步骤(i)中，所述体外培养是通过将所述受精卵细胞或其衍生物置于第一培养液中进行的，所述第一培养液含有浓度为1mM的NR。根据本发明的实施例，可以采用的NR浓度为0.5～10mM，例如0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10mM，其中，优选1mM。

根据本发明的实施例，在步骤(i)之前，进一步包括：(i-a)在体外使精子细胞与卵子细胞在受精培养液中接触，以便获得所述受精卵细胞，所述受精培养液中含有含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

根据本发明的实施例，所述精子细胞和所述卵子细胞是以冷冻液的形式在解冻液中解冻的，所述解冻液中含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

根据本发明的实施例，所述冷冻液中含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

根据本发明的实施例，在与所述精子细胞接触之前，将所述卵子细胞在卵子孵育液中进行孵育4-48小时，所述孵育液中含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

根据本发明的实施例，所述卵子细胞是通过将不成熟卵子在成熟化培养液中培养得到的，所述成熟化培养液含有浓度为1mM的所述信号通路激动剂。

根据本发明的实施例，在与所述卵子细胞接触之前，利用精子清洗液对所述精子细胞进行清洗，所述精子清洗液含有浓度1mM为的所述NAD信号通路激动剂。

根据本发明的实施例，在步骤(i)中，利用胚胎培养液对分裂期胚胎进行培养，所述胚胎培养液含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂，以便获得囊胚；以及，利用囊胚培养液对所述囊胚进行培养，所述囊胚培养液含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

在本发明的第二方面，本发明提出了NAD信号通路激动剂在制备培养液中的用途，所述培养液用于下列的至少之一：培养受精卵细胞；洗涤精子细胞；对不成熟卵子进行成熟化培养；对卵子和精子细胞进行受精处理；对卵子或精子细胞进行冷冻处理；对卵子或精子细胞进行解冻处理；培养分裂期胚胎；和培养囊胚。

换句话说，本发明还提出了用于下列至少之一的培养基：培养受精卵细胞；洗涤精子细胞；对不成熟卵子进行成熟化培养；对卵子和精子细胞进行受精处理；对卵子或精子细胞进行冷冻处理；对卵子或精子细胞进行解冻处理；培养分裂期胚胎；和培养囊胚。

通过采用上述培养基，能够有效地提高体外培养胚胎的质量，例如发育潜能，从而在受精卵体外过程中，避免或者缓解人类胚胎阻滞现象。具体的，通过在各个环节加入烟酰胺核糖NMN相关化合物，能够提高精子、卵子、胚胎发育潜能。整体提高人类“试管婴儿”20-30％。

附图说明

图1显示了根据本发明一个实施例的胚胎的显微镜照片。其中NR表示在培养过程中添加NR，NR-表示在培养过程中未添加NR；

图2显示了根据本发明一个实施例中NR组的胚胎的显微镜照片。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所描述的实施例是示例性的。需要说明的是，如无特别说明，在本文中所使用的试剂均为市售可得的。在下面实施例中没有明确列出的操作手段或者条件，也均为本领域中公知的，或者参考文献可以获知的。

按照下列配方配置培养液：

1、人不成熟卵子体外成熟培养液，添加1mM NR

2、人精子洗涤液，添加1mM NR

3、人卵子孵育液、受精液，添加1mM NR

4、人卵子、精子冷冻和解冻液，分别添加1mM NR

5、人分裂期胚胎培养，添加1mM NR

6、人囊胚培养液，添加1mM NR

具体的，

1、取卵受精用培养液

1)卵子冲洗培养液：取G-MOPS PLUS(添加1mM NR)于14ml圆底试管(Falcon352001)中，按照每人5ml培养液的使用量，置37℃培养箱中平衡过夜。

2)受精培养液及受精皿：取G-IVF PLUS(添加1mM NR)于14ml圆底试管(Falcon352001)中，按照每人3ml培养液的使用量，置37℃5％CO2培养箱中平衡过夜。每个受精培养皿(3037)中加入1mlG-IVF PLUS，同时覆盖矿物油500ul；于外圈加入1mlG-IVFPLUS(清洗用)。

2、卵裂培养液及卵裂培养皿

卵裂培养液及培养微滴：按需取G-1PLUS(添加1mM NR)于14ml圆底试管(Falcon352001)中，置37℃CO2培养箱中平衡过夜。每人准备若干个培养皿(Falcon3001)(视卵多少而定)，用移液器在培养皿(Falcon 3001)中制作10个20μl的培养微滴，覆盖矿物油(ART-4008)3ml。置37℃、5％CO2培养箱中平衡。注意：制做微滴时枪尖避免接触管壁及皿底，及时盖油。

3、移植培养液及囊胚培养液：取G-2PLUS(添加1mM NR)于14ml圆底试管(Falcon352001)中，置37℃5％CO2培养箱中平衡过夜。

1)移植皿：临用时在培养皿(Falcon 3037)中加入中心区域1ml,外周区域1ml(清洗用)，置37℃、5％CO2培养箱中平衡。

2)囊胚培养皿：在培养皿(Falcon 3001)中制作10个20μl微滴，覆盖矿物油(ART-4008)3ml，置37℃、5％CO2培养箱中平衡。

需要说明的是，在本文中所采用的体外培养时间均不超过14天，例如不超过10天、不超过8天、不超过6天；其中，本申请中胚胎的体外培养时间不超过8天，具体地，本申请中囊胚体外培养时间为5-6天。

实施例1卵子成熟化培养

对女性受试者进行促排卵，监控其卵泡尺寸，待卵泡直径达到6～12毫米时，通过B超进行穿刺获取未成熟卵子。

取卵当日，按照“IVF-ET实验室程序和实验室准备”常规准备好3037授精皿，并在皿盖和底部分别标记病人的姓名及病历号，放入三气培养箱平衡。捡卵开始时，实验室捡卵操作者和护士共同核对病人的三证。在取卵期间，男方进入取精室采精。取卵前，将一定量的圆底Falcon 2001试管置放在37℃恒温试管架内预热。备5-10个捡卵皿(Falcon 3003)置在超净工作台内，37℃预热。3001皿中加入2-3ml预热的G-MOPS PLUS(含有1mM的NR)，置于超净工作台37℃热台备用。临床将含有冲洗液和卵泡液的试管放入恒温试管架内。实验室尽快将试管内的液体倒入捡卵皿中，在显微镜下识别出卵冠丘复合体(Oocyte/CumulusComplex，OCCC)。将OCCC移入标有患者信息的G-MOPS PLUS皿中，暂置于IVF工作站恒温平台。捡卵结束后，迅速将OCCC移入体外受精液(G-IVF PLUS，含有1mM的NR)双井皿的外圈中吹打数次，尽可能去除血液及残留的G-MOPS PLUS受精后，将OCCC转入皿中央圈内，立即将含有OCCC的皿放入培养箱内。一般情况下，每个皿至多放入20个OCCC。于37℃，5％CO2的环境中培养24-48小时后，对卵子进行成熟度评价，发现未成熟卵的成熟率与未添加NR的培养基相比得到显著的提高。

实施例2洗涤人类精子

传统的睾丸精子获取后，置于含有1mM NR的Modified-HTF(Irvine Scientificcompany)中，再置5％CO2箱培养培养10小时～24小时，发现，睾丸获取后的精子样本以及外周精液中的弱精子运动能力明显提高。

实施例3精子冷冻和解冻

每100mL人精液冷冻保护剂中含有下列物质：

葡萄糖1.5g，柠檬酸三钠二水1.3g，甘油20ml，NR 1mM，卵黄20ml，二甲基亚砜0.1mL，余量为双蒸水。

将人精液冷冻保护剂与精液按照1:3体积比混合后，加入试管，使用程控降温仪冷冻，设定冷冻程序如下：(1)20℃平衡5分钟；(2)从20℃降至-2℃，冷冻速率-1℃/min；(3)从-2℃降至-30℃，冷冻速率-7.2℃/min；(4)从-30℃降至-90℃，冷冻速率-30℃/min。

在冷冻后，对冷冻的人类精子进行复苏，并且评价精子冻融复苏后的活力和精子的冷冻复苏率，采用指标为前向运动能力的精子百分率。发明人发现，在冷冻和解冻复苏液中添加NR，能够有效地提高精子复苏的复苏率。

实施例4受精培养

获卵后，在受精皿内授精，授精体积为1ml，按照每卵1万条精子的比例进行授精。简言之，精子按照密度梯度离心法分离和清洗，并按照密度和活力计算出授精所需要的体积。使用eppendorf枪头授精。从培养箱内取出含有卵母细胞的皿，双人核对皿和精子悬液试管上的病人信息，小心地吸取上游精子悬液，然后将受精皿放回培养箱。记录授精时间、操作者和证。

研究发现，在受精培养液中添加NR能够有效地提高正常受精率。

实施例5胚胎培养

在该实施例中，将发育不良胚胎(处于S期之前)加入到胚胎培养液中(含有1mM NR的HTF或G-1，使用前将胚胎培养液于37℃，6％CO2，5％O2培养箱内过夜平衡)，发现，发育不良的胚胎有良好的胚胎继续发育表现，具体的，在已经完成的11例病人中发现，加入NR后，停滞发育的胚胎，表现出继续发育的能力：6/13＝46％，不同程度的继续发育能了，即从发育缓慢几乎停滞的胚胎，发育成了桑葚胚或者早期囊胚。不加NR的情况下，胚胎继续发育的几率<10％。图1显示了根据本发明一个实施例的胚胎的显微镜照片。其中NR表示在培养过程中添加NR，NR-表示在培养过程中未添加NR。其中，多次“试管婴儿”治疗失败的病人，经过NR添加培养液孵育后，有好的囊胚形成，得以怀孕。

实施例6人囊胚培养

将D3的胚胎转移到G-2PLUS囊胚培养微滴(含有1mM NR)中继续培养，将囊胚培养皿放入三气培养箱中继续培养。D5、D6天观察胚胎发育情况。囊胚评级：目前采用Gardner的囊胚评分系统对囊胚进行评分，其中评分标准主要包括3个指标：囊胚腔的大小，内细胞团的大小以及滋养外胚层细胞。基于上述评分标准，发现添加NR与未添加NR相比，囊胚的评分显著更高。

实例7：人胚胎培养结果

在该实施例中，选择同期高龄(42岁及以上)多次试管婴儿种植失败病人，再次取卵后，然后分为NR组和Control组两组后，分别依次经过授精和受精卵培养后，再分别于胚胎培养液中进行培养，其中，NR组和Control组的区别仅在于，NR组的胚胎培养液含有1mM的NR、Control组的胚胎培养液不含NR。胚胎培养结果如表1所示，NR组的胚胎的显微镜照片如图2所示，结果证实NR有明显提高囊胚形成率的作用，尤其能够明显提高高龄多次试管婴儿种植失败病人的囊胚形成率。

表1NR组和Control组的囊胚形成率

	囊胚形成率
		NR组	8/22(36.36％)
Control组	0/30(0％)

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (14)

1.一种体外培养胚胎细胞的方法，其特征在于，包括：

(i)在存在NAD信号通路激动剂的条件下，将受精卵细胞或其衍生物进行体外培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NAD信号通路激动剂包括NR、NMN或其功能类似物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受精卵细胞衍生物包括发育不良胚胎。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发育不良胚胎处于囊胚期。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(i)中，所述体外培养是通过将所述受精卵细胞或其衍生物置于第一培养液中进行的，所述第一培养液含有浓度为1mM的NR。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(i)之前，进一步包括：

(i-a)在体外使精子细胞与卵子细胞在受精培养液中接触，以便获得所述受精卵细胞，所述受精培养液中含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述精子细胞和所述卵子细胞是以冷冻液的形式在解冻液中解冻的，所述解冻液中含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述冷冻液中含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在与所述精子细胞接触之前，将所述卵子细胞在卵子孵育液中进行孵育4～48小时，所述孵育液中含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述卵子细胞是通过将不成熟卵子在成熟化培养液中培养得到的，所述成熟化培养液含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在与所述卵子细胞接触之前，利用精子清洗液对所述精子细胞进行清洗，所述精子清洗液含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(i)中，利用胚胎培养液对分裂期胚胎进行培养，所述胚胎培养液含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂，以便获得囊胚；

以及，

利用囊胚培养液对所述囊胚进行培养，所述囊胚培养液含有浓度为1mM的所述NAD信号通路激动剂。

13.NAD信号通路激动剂在制备培养液中的用途，所述培养液用于下列的至少之一：

培养受精卵细胞；

洗涤精子细胞；

对不成熟卵子进行成熟化培养；

对卵子和精子细胞进行受精处理；

对卵子或精子细胞进行冷冻处理；

对卵子或精子细胞进行解冻处理；

培养分裂期胚胎；和

培养囊胚。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述NAD信号通路激动剂包括NR、NMN及其衍生物。

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