CN107308200A - 用于治疗宫颈癌的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供用于治疗宫颈癌的组合物及其应用,所述组合物包含脐血提取物、艾草提取物和生理盐水。利用组合物进行回输治疗,趋向性至癌症细胞部位,杀伤癌细胞并修复受损组织,同时,改善人体内部环境,达到治疗宫颈癌的目的。本发明通过脐血提取物结合中医药能对宫颈癌进行有效控制,治疗安全有效,无痛苦。
Description
技术领域
本发明通常涉及医药技术领域,具体地涉及用于治疗宫颈癌的组合物及其应用。
背景技术
宫颈癌是人体最常见的癌瘤之一,不但在女性生殖器官癌瘤中占首位,而且是女性各种恶性肿瘤中最多见的癌瘤。虽然浸润性宫颈癌的发生率有所下降,但早期宫颈癌发生率的增加,特别是年轻化趋势十分明显,对女性身心构成了严重的危害,因此宫颈癌相关治疗的研究具有重要意义。
宫颈癌对女性健康构成很大的威胁,主要表现为以下几点:
1、引起女性不孕的产生:宫颈炎造成的“有菌”白带和阴道碱环境都不利精子的生存和游动,严重的宫颈炎还会影响性生活。长期不治、或久治不愈的宫颈炎被认为是宫颈癌发病的一个因素。
2、严重影响生理生活:由于子宫位于女性的腹部,是一个介于膀胱和直肠之间,中空的器官。宫颈位于子宫的下半部的一个较窄的部份,子宫颈的开口通到女性阴道。它的功能是月经流出的信道,也是阴道微生物及空气进入女性子宫的屏障,能抵挡性生活时受到刺激引起炎症反应。
3、对子宫造成致命损伤:子宫是受精卵发育成长的地方,在治疗过程中宫颈癌患者因为种种原因,有时候不得不割掉子宫以达到保全生命的目的,这从另一方面无情剥夺了女性作为母亲的权利,甚至陷入绝望之境。
4、导致身体多部位的病变:宫颈癌能够直接导致腰腹酸痛、阴道出血及白带恶臭,这是最直接的表现。此外,复发部位的差异性也导致了细枝末节的千差万别,如下腹部或盆壁会出现肿块,下肢会水肿,患者可出现尿频、尿急、尿痛、血尿等症。
传统的宫颈癌治疗方法有手术治疗、放射治疗和药物治疗。这些方法具有诸多不利影响。例如,手术治疗近期疗效明确,但肿瘤易转移,并且手术直接损伤较大。放射治疗对于某些对放射线敏感的肿瘤细胞疗效确切,但对放射线不敏感的肿瘤细胞疗效则不确切,并且放射线可损伤人体正常细胞,副反应明显。化疗的疗效有限,疗程较长,且化学药物对正常细胞产生毒害损害、骨髓抑制、胃肠道反应、重要脏器损害等毒副反应明显,多疗程使用后可出现耐药。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明的发明人研究了新的治疗方法—脐血提取物协同中医药有效治疗宫颈癌。本发明人发现,癌症究其根本是由于人体免疫缺陷造成的,而包含脐血提取物和艾草提取物的组合物通过血液循环系统进入人体,可以促进自身免疫细胞的生成,从而特异性杀伤癌细胞。有利于大量的干细胞也会“归巢”到病灶部位,自动修复受损伤的细胞、组织、器官,从而达到根除癌细胞,修复机体的疗效。同时运用中药艾草提取物调理人体内环境,形成不利于癌细胞生长的环境。基于此完成了本发明。
本发明提供用于治疗宫颈癌的组合物,其包含脐血提取物、艾草提取物和生理盐水。
优选地,其中所述脐血提取物和所述艾草提取物质量份数之比为3-6:1。
优选地,所述艾草提取物包含按照质量份计的,10-30份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、10-30份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、10-30份的木犀草素、10-30份的3,4’,5,7-四羟基黄酮、5-40份的α-香树脂醇、5-30份的β-香树脂醇和20-30份的24-亚甲基环木菠萝烷酮。
优选地,其中所述艾草提取物在所述组合物中的浓度为25-60μg/mL。
优选地,所述组合物中脐血提取物通过包括下述步骤的方法获得:
将脐带血样品与细胞稀释剂接触的步骤;
随后加入细胞沉淀剂的步骤;
待分层后取出上层细胞液离心浓缩获得沉淀,随后将所述沉淀铺到分层剂上层,离心分离得到中间位置的油状物质的步骤。
优选地,所述细胞稀释剂为0.1-30%氯化钠注射液和0.1-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液,或者0.1-30%的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1%-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液。
优选地,所述细胞沉淀剂为0.1-30%羟乙基淀粉水溶液或0.1-20%甲基纤维素水溶液。
优选地,所述分层剂为包含密度为1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺的水溶液。
优选地,所述脐血提取物中不包含红细胞。
优选地,所述治疗是指病症的减轻、缓和、愈合和/或消除。
有益效果:
本发明所述的提供用于治疗宫颈癌的组合物,利用所述组合物进行回输治疗,组合物进入受试者体内,趋向性至宫颈癌细胞位置处,对宫颈癌细胞进行杀伤,并主动分裂繁殖,修复受损的细胞、组织和器官,同时,改善人体内部环境,从而达到根除癌细胞,修复机体的疗效。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例所述的用于治疗宫颈癌的组合物对宫颈癌病例进行治疗后的阴道镜检图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限值以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
本发明中,名词术语既包括单数形式,也包括复数形式,除非上下文另行明确指出。本发明中所述的“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况,更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。
本发明中,所述“脐血”是指哺乳动物(例如,人类)胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。优选地,胎盘和脐带可从动物体分离后经冷冻保存。更优选地,胎盘和脐带为从动物体分离的新鲜胎盘和脐带。更优选地,胎盘和脐带为从动物例如人体分离后1-12小时,优选1-5小时之内的胎盘和脐带。新鲜的胎盘和脐带具有更多高活性的物质。因此,本发明的脐带血优选为新鲜胎盘和脐带中的血液。
本发明中,所述“脐血提取物”是指包含脐血成分的液体。优选地,包含利用一定提取方法从脐血中提取的物质。示例性地所述提取方法包括将脐带血样品与细胞稀释剂接触的步骤;随后加入细胞沉淀剂的步骤;待分层后取出上层细胞液离心浓缩获得沉淀,随后将所述沉淀铺到分层剂上层,离心分离得到中间油状物的步骤。
优选地,本发明脐血提取物不采取冻存、复苏、体外培养扩增的步骤。因为冻存后复苏后,会有部分活性成分失活,其数量过少不满足临床疗效(数目要求达到108),此时需要进一步的体外处理步骤。体外处理存在如下缺陷:
a、体外细胞生长所处的微环境与体内不同,因此处理后的细胞部分功能缺失。比如:心肌细胞没有收缩功能;神经细胞无传导功能。
b、提取物中细胞传代复制后活性减弱,接近于终端细胞。
c、培养成本增高。
d、提取物中细胞多次复制后存在变异问题。
e、体外扩增培养传代的代数不容易控制。
f、体外培养过程中感染机率增大。
因此,脐血提取物在分离后需及时回输,以保证最好的临床疗效。
本发明中,所述稀释剂为下列水溶液之一:0.1-30%氯化钠注射液和0.1-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液、或者0.1-30%的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1%-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液;优选地,所述稀释剂为0.1-15%氯化钠注射液和0.1-10%的脑蛋白水解物组成的水溶液;更优选地,所述稀释剂为0.1-3%氯化钠注射液和0.1-5%的脑蛋白水解物组成的水溶液;进一步地,所述稀释剂为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.8%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%、2.7%或3%氯化钠注射液和0.1%、0.5%、0.7%、0.9%、1.5%、1.8%、2.1%、2.7%、3%、3.7%、4.2%、4.7%或5%的脑蛋白水解物组成的水溶液;优选地,所述稀释剂0.1-30%的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1%-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液;优选地,所述稀释剂为0.1-15%的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1%-10%的脑蛋白水解物组成的水溶液;更优选地,所述稀释剂为0.1-3%的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1%-5%的脑蛋白水解物组成的水溶液;进一步地,所述稀释剂为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.8%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%、2.7%或3%的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1%、0.5%、0.7%、0.9%、1.5%、1.8%、2.1%、2.7%、3%、3.7%、4.2%、4.7%或5%的脑蛋白水解物组成的水溶液。
本发明中,所述脑蛋白水解物为选自下列产品之一:国药准字H20052182、国药准字H20003386、国药准字H20003384或国药准字H20003385。
本发明中,所述沉淀剂为0.1-30%羟乙基淀粉水溶液或0.1-20%甲基纤维素水溶液。优选地,所述沉淀剂包为1-10%羟乙基淀粉水溶液或0.3-1.5%甲基纤维素水溶液。更优选地,所述沉淀剂为3-7%羟乙基淀粉水溶液或0.3-1%甲基纤维素水溶液。进一步地,所述沉淀剂为3%、4%、5%、6%或7%的羟乙基淀粉水溶液,进一步地,所述沉淀剂为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、或1%的甲基纤维素水溶液。
本发明中,所述分层剂包含密度为1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺的水溶液。优选地,液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为1.01-1.088g/ml、优选1.035-1.08g/ml、更优选为1.075g/ml。
本发明中,将所述稀释样品与所述沉淀剂按体积1:1混合。
本发明中,将所述稀释样品与所述沉淀剂按体积2:1混合。
本发明中,将所述稀释样品和所述沉淀剂按照体积2:1混合后,摇匀1-8分钟,静置3分钟-180分钟,待分层后吸取上层细胞液,分装至50ml离心管中,以500-4000转/分钟,离心1-20分钟,弃上清液得到所述浓缩样品。
本发明中,用生理盐水稀释所述浓缩样品,将稀释后的所述浓缩样品铺设在所述分层剂上,以500-4000转/分钟转速,离心1-60分钟,收集脐血提取物,进一步地所述脐血提取物位于所述离心管中间位置的2-4mm厚的油状细胞层。
进一步地,所述方法还包括,将所述脐血提取物用生理盐水清洗1-5次。
本发明中,所述“艾草提取物”是指利用下述方法从艾草中提取的物质。所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为25-60μg/mL。进一步地,所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为30-45μg/mL。更进一步地,所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为30、32、35、37、40、42或45μg/mL
本发明中,所述“艾草提取物”主要包含挥发油、黄酮类、三萜类衍生物、微量元素、鞣质、绿原酸、朝鲜蓟酸、脂肪酸、鞣酸和多糖等化合物。进一步地,所述挥发油主要包括单萜类化合物、单萜类衍生物、倍单萜类化合物及其衍生物;进一步地,所述挥发油包括叶脑、松油醇、α-侧柏烯、蒎烯、崁烯、香桧烯、1-辛烯-3-醇、对-聚伞花素、1,8-桉叶素、γ-松油烯、樟脑、龙脑、萜品烯-4-醇、α-松油醇、丁香酚、反-丁香酚、顺-β-合欢烯草烯、β-芹子烯、丁香烯氧化物、六氢金欢基丙酮基棕榈酸等。进一步地,所述黄酮类主要包括黄酮和黄酮醇化合物,进一步地,所述黄酮类主要包括游离黄酮,更进一步地,所述黄酮类包括5,7-二羟基-6,3,4-三甲氧基黄酮、5-羟基-6,7,3,4四甲氧基黄酮、5,7,4’-三羟基-6,3’-二甲氧基黄酮、5,3,7,3’,4-五羟基黄酮、5,7,4’-三羟基黄酮、芹菜素、木犀草素和单乃芬等。进一步地,所述三萜类化合物包括α-及β-香树脂醇、无羁萜、α-及β-香树脂醇的乙酸酯、羽扇烯酮、粘霉烯酮、羊齿烯酮、24-亚甲基环木菠萝烷酮、西米杜鹃醇和3β-甲氧基-9β、19-环羊毛甾-23(E)烯-25,26-二醇等。进一步地,所述微量元素包含金属锡(Sr)、铬(Cr)、钴(Co)、镍(Ni)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、铁(Fe)、钠(Na)、钾(K)、钙(Ca)和镁(Mg)。
本发明中,所述的“艾草提取物”是利用水蒸气蒸馏法、大孔树脂吸附法、溶剂萃取法、微波萃取法和/或超临界流体萃取法从艾草中提取的。进一步地,所述大孔径树脂吸附法是以大孔吸附试着XDA-1吸附艾草提取液中的所述艾草合物,所述的超临界流体萃取法,是用临界二氧化碳萃取技术萃取艾草中的所述艾草提取物。更进一步地,将艾草叶放置于蒸馏烧瓶中,用40-60%的乙醇溶解摇匀,静止20-40分钟;用微波炉解冻档处理1-3分钟;将蒸馏烧瓶放置在55-70℃恒温水浴中回流2小时,趁热抽滤弃去滤渣。然后滤液转入分液漏斗中,用石油醚萃取滤液中的叶绿素、胡萝卜素和脂溶性脂类等杂质。弃去上层液,保留下层液。重复萃取2-5次,直至滤液颜色无色是,将滤液转入容量瓶中,用30-50%的乙醇除去多糖、蛋白质等可溶性杂质。每2mL去杂溶液加入12.5mL的30-50%的乙醇和1mL NaNO2,5-10分钟后,按照每2mL去杂溶液对应0.8mL6%的Al(NO3)3的比例加入Al(NO3)3,5-10分钟后,按照每2mL去杂溶液对应3.5mL10%NaOH的比例加入NaOH,震荡混匀,获取所述艾草提取物。
优选地,所述艾草提取物包含按照质量份计的,10-30份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、10-30份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、10-30份的木犀草素、10-30份的3,4’,5,7-四羟基黄酮、5-40份的α-香树脂醇、5-30份的β-香树脂醇和20-30份的24-亚甲基环木菠萝烷酮,或者由上述物质组成。
本发明的组合物可以根据本领域常规方法胃肠外施用,例如通过注射进入损伤区域以及注射进入脑脊液例如腰椎穿刺术和实质注射(parenchymal injection)、静脉或动脉。优选地,其可以通过直接注射施用。另外,可以使用DouglasKondziolka(DouglasKondziolka,Pittsburgh,1998)的临床方法将本发明的组合物施用给损伤区域。特别地,将对象的颅骨切开一个直径1cm的孔,将于HBSS(Hank’s平衡盐溶液)中的组合物的悬浮液通过长针注射器和立体定位架而注射进该孔。
所述组合物的典型剂量范围从1×105到8×107细胞/kg体重/注射,优选从5×105到8×106细胞/kg体重/注射,其可以单剂量或分份剂量施用。另外,应理解实际施用给某个患者的有效成分的量应根据多种相关因素包括被分化增殖的神经细胞的量、选择的施用途径和个体患者的体重、年龄和性别确定。例如,用量为,45ml的脐血提取物浓度为6.2×107个/ml组合物悬液,50ml的脐血提取物浓度为5.7×107个/ml组合物悬液,55ml的脐血提取物浓度为4.9×107个/ml组合物悬液,60ml的脐血提取物浓度为8×107个/ml组合物悬液,58ml的脐血提取物浓度为7.5×107个/ml组合物悬液,61ml的脐血提取物浓度为5.8×107个/ml组合物悬液,60ml的脐血提取物浓度为5.7×107个/ml组合物悬液。
实施例
实施例1
一种用于治疗宫颈癌的组合物,其包含脐血提取物、艾草提取物和生理盐水,其中,中所述脐血提取物中不包含红细胞。
将所述脐血提取物、所述艾草提取和所述生理盐水按照体积比为3:1:1的比例混合,制得所述的用于促进细胞损伤修复的组合物。
上述方案中,所述艾草提取物包含按照质量份计的,10份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、10份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、10份的木犀草素、10份的3,4’,5,7-四羟基黄酮、5的α-香树脂醇、5份的β-香树脂醇和20份的24-亚甲基环木菠萝烷酮。
实施例2
一种用于治疗宫颈癌的组合物,其包含脐血提取物、艾草提取物和生理盐水,其中,中所述脐血提取物中不包含红细胞。
将所述脐血提取物、所述艾草提取和所述生理盐水按照体积比为4:1:2的比例混合,制得所述的用于促进细胞损伤修复的组合物。
上述方案中,所述艾草提取物包含按照质量份计的,30份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、30份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、30份的木犀草素、30份的3,4’,5,7-四羟基黄酮、40份的α-香树脂醇、30份的β-香树脂醇和30份的24-亚甲基环木菠萝烷酮。
实施例3
一种用于治疗宫颈癌的组合物,其包含脐血提取物、艾草提取物和生理盐水,其中,中所述脐血提取物中不包含红细胞。
将所述脐血提取物、所述艾草提取和所述生理盐水按照体积比为5:1:1.5的比例混合,制得所述的用于促进细胞损伤修复的组合物。
上述方案中,所述艾草提取物包含按照质量份计的,20份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、20份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、20份的木犀草素、20份的3,4’,5,7-四羟基黄酮、30份的α-香树脂醇、15份的β-香树脂醇和25份的24-亚甲基环木菠萝烷酮。
实施例4
一种用于治疗宫颈癌的组合物,其包含脐血提取物、艾草提取物和生理盐水,其中,中所述脐血提取物中不包含红细胞。
将所述脐血提取物、所述艾草提取和所述生理盐水按照体积比为6:1:2的比例混合,制得所述的用于促进细胞损伤修复的组合物。
上述方案中,所述艾草提取物包含按照质量份计的,25份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、15份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、15份的木犀草素、15份的3,4’,5,7-四羟基黄酮、25份的α-香树脂醇、25份的β-香树脂醇和20份的24-亚甲基环木菠萝烷酮。
试验例1药理实验
1材料
1.1动物:KM小鼠体质量18~22g,雌雄各半。健康杂种家犬,体重12~18kg,雌雄皆用。动物饲养于SPF级实验动物实验室条件下,室内温度19~22℃,相对湿度40%~50%,给予全价颗粒饲料,自由摄食、饮水。
1.2药物:实施例1的组合物,其中干细胞含量为8×107个/ml。
1.3上海欣曼公司SYS-G型小鼠自主活动测频仪,美国BIOPAC公司RM-6000型多导生理记录仪。
2试验方法
2.1对精神神经系统的影响
2.1.1对小鼠一般外观行为的影响:取小鼠80只,随机分为四组,每组20只,雌雄各半,给药组分设0.5、1.0、2.0ul/kg三个剂量组,对照组给予5%葡萄糖注射液,均按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药,给药后10min,观察小鼠的一般行为表现,步态、姿势、肌肉紧张度、瞳孔变化、流涎、二便、皮毛等,同对照组比较,了解受试药对动物的影响。
2.1.2对小鼠协调运动的影响:分组及给药同前,采用倾斜板法,于给药前及给药后10min、30min及60min各进行一次测定,计算各组小鼠从木板上跌落的百分率,按简化直接法统计。
2.1.3对小鼠自主活动的影响:小鼠80只,分组及给药同前,于尾静脉注射给药后10min,置小鼠于自发活动测定仪中,稳定5min后,测定10min内自主活动次数,用组间t检验进行统计处理。
2.2对呼吸系统及心血管系统的影响
家犬6只,雌雄各半,用戊巴比妥钠30mg/kg,静脉注射麻醉后,背位固定,分离右颈总动脉,插管连接TP-101型压力转换能以多导生理记录仪记录收缩压,舒张压及平均动脉压;以针形电极刺入四肢皮下记录Ⅱ导联心电图,以立位转换能器连接胸骨记录呼吸频率及幅度。实验设0.5、1.0、2.0ul/kg三个剂量组,对照组用5%葡萄糖注射液,给药容积为1ml/kg,由股静脉插管给药,注射速度为30s,分别在静脉注射给药后1、2、5、10、15、20及30min时记录上述各项指标,观察本发明组合物对呼吸,心电及血压的作用,用t检验法进行用药前后显著性检验分析。
3结论
3.1对小鼠一般行为表现的影响:实验各组动物在用药后60min内的一般行为,步态、肌紧张度、活动、饮食、皮毛及二便,均无显著变化,未见有瞳孔大小改变,竖毛、倦伏、流涎等异常症状,同对照组相比,差异无统计学意义。
3.2对协调运动的影响:各组动物于给药前及给药后各观测点的跌落率均为0,表明在实验所用0.5、1.0、2.0ul/kg剂量下对小鼠协调运动无明显影响。
3.3对小鼠自主活动的影响:本发明组合物各剂量组对小鼠自主活动的影响见表1。
表1对小鼠自主活动的影响
注:与对照组比较P>0.05。
从表1结果可见:实验组1.0、2.0ul/kg剂量时,活动次数略有减少,但同对照组比较,差异并无统计学意义,表明本发明组合物对小鼠自主活动无明显影响。
3.4对呼吸系统的影响:静脉注射各剂量后,分别在不同时间点描记呼吸频率及幅度的变化,结果见表2。
表2对麻醉犬呼吸频率及幅度的影响
注:对照组和实验组与用药前比较P均>0.05。
从表2结果可见:用药组在0.5、1.0ul/kg剂量时静脉注射对麻醉犬各时间点的呼吸频率及幅度均无明显作用,在2.0ul/kg剂量时,频率及幅度均略有增加,但同对照组相比,差异无统计学意义。表明本发明组合物对犬的呼吸系统无显著影响。
3.5对心血管系统的影响:结果见表3、4。
表3对麻醉犬平均动脉压的影响(KPa)
注:与用药前比较P>0.05。
表4对麻醉犬心率的影响(次/min)
注:与用药前比较P>0.05。
表3、4结果表明:本发明组合物悬液静脉注射1.0、2.0ul/kg时,对麻醉犬的心率计平均动脉压无明显作用,同对照组及用药前相比,差异均无统计学意义(P>0.05),表明本发明组合物在本剂量时无心血管刺激作用。
表5对麻醉犬Ⅱ导联心电图(ECG)的影响
从表5结果可见:静脉注射本发明组合物0.5、1.0、2.0ul/kg计量时,对麻醉犬心电图无明显作用,其各波间隔时间及电压振幅均在正常范围内波动,用药前后及用药组同对照组相比,均未发现差异有统计学意义,表明本发明组合物在本实验所用剂量下,对麻醉犬的心电图无影响。
4结论
本发明组合物的临床用药途径多为静脉滴注。故在本实验研究中,采用了与临床用药途径相同的静脉给药方式。当剂量分别为0.5、1.0、2.0ul/kg时,对小鼠的一般行为、协调运动及自主活动均无明显作用,表明本品对神经系统无明显影响。0.5、1.0及2.0ul/kg剂量时,对麻醉犬的呼吸次数和呼吸幅度无影响,对麻醉犬的血压亦无明显影响。在0.5、1.0及2.0ul/kg剂量时,对麻醉犬的心率、收缩压、舒张压及平均动脉压皆无明显影响。表明本发明组合物静脉滴注的安全性较高。
试验例2急性毒性实验
1、材料
A.啮齿类动物组:SD大鼠,周龄6~9周,体重180~240g
1.1实验组:大鼠60只(雌雄比例1:1)
1.2空白对照组:大鼠20只(雌雄比例1:1)
B.非啮齿类动物组:Beagle犬,月龄6~10个月,体重8~15kg。
1.1实验组:犬30只(雌雄比例1:1)
1.2空白对照组:犬10只(雌雄比例1:1)
C.药物:实施例2的组合物,其中干细胞的含量为8×107个/ml。
2、方法
2.1给药途径:静脉注射
2.2给药剂量(起始剂量,中间剂量,最大剂量):
A组:a、大鼠2.5ml/kg b、大鼠5.0ml/kg c、大鼠10.0ml/kg
B组:a、犬1.25ml/kg b、犬2.5ml/kg c、犬5.0ml/kg
3、观察方法
给药后2h同时观察各组观察动物反应,以后每天上、下午各观察一次,连续观察15天。
指标:观察一般指标(见下表6),动物死亡情况,体重变化。
表6急性毒性实验结果
注:3.1实验组大鼠偶发呼吸急促(1/20),给药后30min出现,持续2min。
3.2实验组大鼠自发活动增多(3/20),表现为神经系统兴奋状态,给药后3~15天间歇性出现。
3.3实验组Beagle犬自发活动增多(2/20),表现为神经系统兴奋状态,给药后7~14天间歇性出现。
3.4空白对照组大鼠出现困倦(2/20),表现为偶尔昏睡,正常饲养第8~13天间歇性出现。
3.5空白对照组Beagle犬出现困倦(1/20),表现为偶尔昏睡,正常饲养第9~11天间歇性出现。
3.6.实验组Beagle犬出现小微血管扩张(1/20),表现为舌、耳、结膜、阴囊发红,体热等。给药后5~13天出现。
4、实验结果
参与实验的大鼠及Beagle犬在实验周期内皆未出现死亡,体重稍有增加,大鼠平均增加10~15g,犬平均增加400~900g,实验组与空白对照组相比无明显差别。除最大剂量组及空白对照组出现阳性表现外,其余各组均为出现有意义的阳性体征,现以表格形式记录如下,症状阳性表现用“+”表示,阴性表现用“—”表示,并记录了阳性表现的出现比例及起始时间(详见下表及注释)。实验结束后对全部实验动物进行大体解剖,其组织器官的体积,颜色,质地均未见异常。
5、结论
5.1最高剂量下,A组实验组大鼠偶发的呼吸急促,且持续时间很短,考虑可能与该大鼠心肺功能不全有关。A组实验组3只大鼠及B组实验组2只犬在给药后分别出现了间歇性的自发活动增加,探究,梳理毛发,运动增加,考虑是由于干细胞增殖,增加了神经细胞的数量,刺激中枢神经系统使其表现为兴奋状态。另有A组空白对照组2只大鼠及B组空白对照组1只犬出现昏睡状态,但易警醒而恢复正常活动,睡眠中枢短暂受到抑制,考虑可能与饲养环境较封闭,运动减少,通风不良有关。B组实验组1只犬出现体表微血管扩张,微循环加快,考虑为心输出量增加,或局部环境温度过高所致。
5.2由起始剂量到中间剂量均未出现有意义的阳性表现,说明本发明组合物作用于动物的安全性高,最高剂量下偶发中枢神经兴奋,说明其不良反应少,受试物安全范围为大鼠0~5.0ml/kg,犬0~2.5ml/kg,毒性反应小,对心脑肺等重要器官基本无不良影响,并且短时间内可恢复正常。
试验例3长期毒性实验
1材料
1.1动物:采用SPF级SD大鼠,雌雄各半,体质量80~90g。动物饲养于SPF级实验动物实验室条件下,室内温度19~22℃,相对湿度40%~50%,每笼6只动物,给予鼠全价颗粒饲料,自由摄食、饮水。
1.2药物:实施例2的组合物,其中干细胞的含量为8×107个/ml。
2方法
2.1分组与给药
将本发明的组合物每日上午以最大剂量2.0ul/kg尾静脉注射给药1次,对照组注射等剂量的蒸馏水,每周称1次体重并记录摄食量,根据体重的变化重新计算给药量。根据急性毒性试验、药效学试验结果确定本发明组合物的高剂量组2.0ul/kg、中剂量组1.0ul/kg、低剂量组0.5ul/kg。
2.2观察指标
2.2.1一般观察给药期间,观察动物的外观,行为活动,饮食、粪便及被毛的情况,并记录体质量(每周称重1次)、进食量、进水量。
2.2.2血液学检查采用美国雅培CD-1200型全自动血球记数仪,测定红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、红细胞压积容量(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、淋巴细胞数目(LYM)、单核细胞数目(MID)、粒细胞数目(GRA)、红细胞分布宽度(RDW)、血红蛋白(HGB)。
2.2.3血液生化检测采用日本日立7610型自动仪,测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、总胆红素(TB)等。
2.2.4系统尸解及脏器系数全面细致观察每只动物的脏器,并称量每只动物的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑等,并计算脏器系数。
3结果
3.1本发明组合物对大鼠血液学指标的影响结果见表7-8。
3.2本发明组合物对大鼠血液生化学指标的影响结果见表9-10。
3.3本发明组合物对大鼠脏器系数的影响结果见表11。
表7本发明组合物对给药180d末期大鼠血液学指标的影响
表8本发明组合物对停药15d后大鼠血液学指标的影响
表9本发明组合物对给药180d末期大鼠血液生化学指标的影响
表10本发明组合物对停药15d后大鼠血液生化学指标的影响
表11本发明组合物对给药180d末期大鼠脏器系数的影响
4结论
大鼠长期毒性实验以3个剂量(即2.0,1.0,0.5ul/kg)连续给药6个月及停药2周后,对大鼠一般状况、体质量增长无明显影响;血液学指标及血液生化学指标均在正常范围内,对大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器重量,脏器系数与对照组比较均无显著差异,并对大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、子宫等重要脏器进行组织检查也未见明显病理改变。故本实验结果提示本发明组合物在大鼠6个月长期毒性实验中,未发现明显的毒性反应及延迟性毒性反应,可以安全地应用于临床。
试验例4静脉注射对血管刺激性、溶血、过敏性实验
1材料
1.1实施例3组合物,其中干细胞的含量为8×107个/ml。
5%葡萄糖注射液;甲醛;白蛋白;牛血清白蛋白;白百破三联疫苗;伊文思兰。
1.2受试动物日本大耳白家兔,体重2~3kg,雌雄兼用;荷兰豚鼠,体重200~250g,雄性。SD大鼠,体重180~220g,雄性。
2方法
2.1血管刺激性实验
实验开始前,动物预先饲养1周以观察其活动表现,动物室温度22~24℃,湿度40%~60%,取家兔3只,右侧耳缘静脉以无菌操作方法注射量为8.3ml/kg(注:由于该系列实验涉及到受试物的耐受性,因此选用最大浓度进行试验。)的组合物,左侧耳缘静脉注射等体积5%葡萄糖注射液,1次/d,连续给药5d。上述两组均分别于末次给药后96h,肉眼观察注射部位有无红肿、充血等刺激现象,处死动物,以耳缘静脉注射点至向心方向,连续取3段血管连同周围组织,每段1cm,用10%甲醛溶液固定,常规脱水,石蜡包埋,切5μm薄片,HE染色,光镜下做组织学检查,另一侧对照血管也同法处理。
2.2溶血实验
2.2.1 2%兔红细胞混悬液制备取健康家兔1只,自心脏取血约20ml,置于三角瓶中,用玻璃棒搅拌,除去纤维蛋白,然后将血移入刻度离心管内,加入生理盐水10ml,混匀后离心5min(2 000~2 500r/min),去除上清液,再加生理盐水混匀离心,反复洗涤3~4次,至上清液无色透明,将所得红细胞按其容积用生理盐水稀释成2%的混悬液。
2.2.2方法取干净试管7支,编号排列于试管架上,按配比量依次加入2%兔红细胞混悬液和生理盐水,混匀后,置于37℃恒温箱中30min,然后于1-5管中加入不同量的组合物,分别为1ml,2ml,3ml,4ml,5ml,6号管中加入1ml生理盐水,7号管中加入1ml溶血素。(第6管为阴性对照管,第7管为阳性对照管),摇匀,置37℃恒温箱中进行温育,观察15,30,45min,1,2,3,24h有无溶血及凝集情况。
结果判定:
全溶血:溶液澄明红色,管底无细胞残留。
部分溶血:溶液澄明红色或棕色,管底有少量红细胞残留。
无溶血:红细胞全部下沉,上层液体无色澄明。
凝集:虽不溶血,但出现红细胞凝集,振摇后不能分散。
2.3全身主动过敏实验
实验开始前,动物预先饲养1周以观察其活动表现,动物室温度22~24℃,湿度40%~60%,取48只健康雄性豚鼠,随机分成5%葡萄糖注射液组、阳性药物组(白蛋白组)、本发明组合物大剂量组、小剂量组,每组12只。分别给各组豚鼠隔日腹腔注射5%葡萄糖注射液、白蛋白25mg/kg,本发明组合物4,16ul/kg,体积为0.5ml,共注射3次,然后每组内分成两批,于第1次给药后14d及21d分别静脉注射5%葡萄糖注射液、白蛋白50mg/kg,本发明组合物16,64ul/kg,体积为1ml,观察豚鼠在静脉注射后30min内有无表12中的躁动、搔鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、甚至死亡等过敏反应症状。
表12过敏反应症状
2.4被动皮肤过敏实验
2.4.1大鼠含IgE的抗血清制备取4只健康雄性SD大鼠,按注射剂大鼠同种被动皮肤过敏试验的要求,分别腹腔注射5%葡萄糖注射液、牛血清白蛋白25mg/kg,本发明组合物4,16ul/kg,同时腹腔注射白百破三联疫苗1ml/只,隔日1次、共3次。11d后眼眶取血,分离血清,-20℃保存,备用。
2.4.2大鼠同种被动皮肤过敏反应实验开始前,动物预先饲养1周以观察其活动表现,动物室温度22~24℃,湿度40%~60%,取16只健康雄性SD大鼠,随机分为5%葡萄糖组、阳性组(牛血清白蛋白组)、大剂量组和小剂量组。分别在各组大鼠背中线两侧距脊柱约1.5cm处备皮,4cm×4cm。
取上述含IgE的抗血清,用5%葡萄糖注射液按1∶2,1∶4,1∶8,1∶16比例分别稀释成4个稀释度,将稀释的抗血清按逆时针方向(左上-左下-右下-右上)皮内注射于大鼠背部预先备皮部位,每一稀释度注射一个点,每点注射0.1ml。致敏24h后,各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0.8%伊文思兰染料共1ml,进行激发。30min后处死各组大鼠,测量皮肤内层的蓝色反应斑直径,直径大于5mm者判定为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和。
3结果
3.1血管刺激性实验:给药组3只家兔耳缘静脉注射部位均未见红肿、充血等刺激现象。光镜病理组织学检查:本发明组合物给药组和5%葡萄糖对照组家兔耳缘静脉注射部位血管结构完整,血管内皮细胞无肿胀、变性、坏死,管壁无炎细胞浸润,管腔内无血栓形成。
3.2溶血性实验:在0.25~3h及24h内除第7管(阳性对照管)溶液呈现澄明红色,其余6管均末见澄明红色,且红细胞全部下沉,上层液体无色澄明,经振摇后红细胞能均匀分散。表明脐本发明组合物无溶血及无凝集作用。
3.3全身主动过敏实验:5%葡萄糖注射液组、本发明组合物大、小剂量组在静脉给药30min后,豚鼠活动正常,未出现1~20级反应症状,判定为过敏反应阴性。而阳性药组豚鼠出现痉挛、抽搐、休克死亡,判定为过敏反应极强阳性。
3.4被动皮肤过敏实验:本发明组合物大、小剂量组、5%葡萄糖注射液组大鼠背部皮肤均未见蓝色反应斑点。阳性组注射部位皮肤均不同程度的出现蓝色斑点反应,其中1∶16处有3例出现蓝斑,1∶8处有4例出现蓝斑,1∶4与1∶2处6例均出现蓝斑,蓝斑直径均大于5mm,判定为阳性反应。结果表明:本发明组合物无同种被动皮肤致敏作用。
4结论
本实验采用的方法简便、准确、可靠,4项指标检测本发明组合物均未出现阳性结果,说明本发明组合物对血管无刺激性,无溶血作用,全身主动过敏反应阴性,无同种被动皮肤致敏作用。表明本发明组合物安全性好,可供临床应用。
试验例5本发明组合物治疗宫颈癌的效果例
以中国医科大学附属盛京医院某女性病例为例,其2013年治疗前检查结果如表13-15所示。
表13组织病理学诊断报告
表14人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测(导流杂交、捕获法,宫颈拭子)
表15宫颈液基细胞偿(TCT)检查报告
使用本发明实施例1中的组合物对该病例进行定期定量用药。经过治疗后,病理学检查相关生理功能指标正常,患者自觉症状消除。参见图1和表16。
表16人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测(导流杂交、捕获法,宫颈拭子)
本发明的组合物通过修复免疫系统缺陷,特异性杀伤癌细胞,并修复机体受损细胞、组织、器官,结合中药艾草成分的辅助治疗,改善人体内环境,创造一个不利于癌细胞生长的体内环境,整个治疗过程安全有效,无任何毒副反应,可以在临床上广泛推广,对于宫颈癌治疗具有很大科研价值和临床意义。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
Claims (10)
1.一种用于治疗宫颈癌的组合物,其包含脐血提取物、艾草提取物和生理盐水。
2.根据权利要求1所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述脐血提取物和所述艾草提取物质量份数之比为3-6:1。
3.根据权利要求2所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述艾草提取物包含按照质量份计的,10-30份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、10-30份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、10-30份的木犀草素、10-30份的3,4’,5,7-四羟基黄酮、5-40份的α-香树脂醇、5-30份的β-香树脂醇和20-30份的24-亚甲基环木菠萝烷酮。
4.根据权利要求1所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述艾草提取物在所述组合物中的浓度为25-60μg/mL。
5.根据权利要求1所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述组合物中脐血提取物通过包括下述步骤的方法获得:
将脐带血样品与细胞稀释剂接触的步骤;
随后加入细胞沉淀剂的步骤;
待分层后取出上层细胞液离心浓缩获得沉淀,随后将所述沉淀铺到分层剂上层,离心分离得到中间位置的油状物质的步骤。
6.根据权利要求5所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述细胞稀释剂为0.1-30%氯化钠注射液和0.1-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液,或者0.1-30%的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1%-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液。
7.根据权利要求5所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述细胞沉淀剂为0.1-30%羟乙基淀粉水溶液或0.1-20%甲基纤维素水溶液。
8.根据权利要求5所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述分层剂为包含密度为1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺的水溶液。
9.根据权利要求1至8任一项所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述脐血提取物中不包含红细胞。
10.根据权利要求1至8任一项所述的用于治疗宫颈癌的组合物,其中所述治疗是指病症的减轻、缓和、愈合和/或消除。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20171103 |