CN103655615A - 一种人干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明为一种人干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物中的用途。由包含离体的人干细胞和生理盐水组成的所述干细胞组合物配置成的体积为10~80ml的干细胞悬液，每份所述干细胞悬液中含有的人干细胞的数量为1~8×10⁸个。本发明可通过静脉注射和血管介入进行卵巢早衰或子宫疾病的治疗。静脉输入安全可靠，操作性强，副作用小，干细胞可以通过血液循环到达细胞受损部位；血管介入疗法相对于手术治疗损伤小，可避免血管搭桥手术中可能出现的各种副损伤及并发症，该疗法起效快，可直接作用于病变部位，建立侧支循环，恢复血供。

Description

一种人干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物用途，进一步地说，是涉及一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物中的用途。

背景技术

卵巢和子宫是女性生殖系统的重要组成部分。子宫是产生月经和孕育胎儿的器官，位于骨盆腔中央，在膀胱与直肠之间。卵巢是位于子宫两侧的一对卵圆形的生殖器官，位于子宫底的后外侧，与盆腔侧壁相接。卵巢除借助卵巢系膜固定于子宫阔韧带外，还借卵巢悬韧带和卵巢固有韧带与盆腔侧壁及子宫相连。卵巢有两种主要功能：一为产生卵子并排卵，体现其生殖功能；另一为合成并分泌性激素，如雌激素、孕激素、雄激素等20多种激素和生长因子，控制着人体骨骼、免疫、生殖、神经等九大系统的400多个部位，维持这些器官的青春和活力。

卵巢早衰及多种子宫疾病如子宫内膜癌、子宫炎、宫颈糜烂、子宫肌瘤这些疾病给患者带来了很大的痛苦，现有技术的治疗方法主要包括：

1．激素替代疗法（HRT）：口服和直接置放。

其缺点是：用量精确，长期依赖，需医生指导用药。

2．免疫治疗：查明有抗体因素存在者可行免疫治疗。

其缺点是：对其他原因所致的卵巢早衰无效。

3．手术治疗主要有两种：

1）对于因卵巢血管因素导致卵巢营养缺失而发生的POF者应尽前尽早行血管搭桥手术，如将卵巢动脉与肠系膜下动脉或肾动脉等吻合，恢复卵巢血管供应。

2）对于已处于POF晚期或由于各种原因导致卵巢缺如者，可行卵巢移植术。

而手术治疗的缺点是：术中易发生副损伤及术后并发症，患者痛苦较大。

发明内容

本发明的目的，就是为了克服现有技术的缺陷，提供一种人干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物中的用途。

关于本文中有关干细胞的相关术语定义如下：

1.干细胞组合物（201210017987.9专利产品）：为专利（201210017987.9）中提到的2-4mm厚的油状干细胞层（详见干细胞制备过程）；

2.干细胞悬液：为该油状干细胞层经生理盐水清洗及稀释后得到的悬液，定容为10-80ml；

3.干细胞悬液的稀释液：由于悬液中的干细胞数量多，易吸附成团，以免静滴时不能通过滤网，因此静滴前需再用100ml的生理盐水进一步稀释，即干细胞悬液的稀释液，此时的总容量为110-180ml。

注：自始至终，干细胞的数量并未发生变化，即溶质为定量，只是增加了生理盐水的量，即溶剂为变量，因此溶液的量也随之变化，即有了三种不同的称呼。若不同，也只是溶液的密度不同，由于起效成分为干细胞，因此生理盐水的多少并不会影响治疗的效果。

干细胞是一类具有自我更新，高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，被医学界称为“万用细胞”。本发明就是基于干细胞具有的细胞替代作用，将干细胞植入体内后，能自动识别并移行至细胞损伤部位，然后分裂增殖成新的细胞，替代受损或病变细胞行使其功能。

干细胞移植可治疗原始生殖细胞缺乏或正常卵巢生殖细胞的耗损加速而导致的特发性卵巢早衰；治疗针对于卵巢血供障碍所致的卵巢萎缩，干细胞可于病变部位周围建立侧支循环，恢复卵巢血运，营养早衰的卵巢，并逐渐恢复其功能。

另外，治疗针对于多种子宫疾病如子宫内膜癌、子宫炎、宫颈糜烂、子宫肌瘤这些疾病，由于干细胞具有增殖和定向分化的能力，当干细胞被趋化至子宫损伤局部后（如内膜基底层），其中部分细胞分泌大量小分子物质，趋化受体干细胞，可促进细胞增殖并定向分化，完成内膜结构和功能的修复。而且干细胞能释放多种生物活性物质，如可以释放膜微粒，趋化并调节周围细胞的功能活性，唤醒处于休眠期的组织细胞，促进其发挥其生物学特性；另由于其具有的免疫调节作用，可增强人体的免疫机能和修复受损的免疫系统，降低机体炎症反应，从而治疗各种免疫因素及感染所致的子宫疾病。

本发明的人干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物中的用途是这样实现的：

本发明所述干细胞组合物为用生理盐水清洗及稀释人造血干细胞后得到干细胞悬液，每份所述干细胞组合物含有的人干细胞的数量为（1~8）×10⁸个；

所述的人干细胞选自人类骨髓、脐带血或外周血干细胞、其中优选脐带血干细胞，即按照本申请人的申请号为201210017987.9、名称为“一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法”中的干细胞分离方法步骤（3）得到的“存在于整个离心管中间位置的约（2-4）mm厚的油状干细胞层”；

每份所述干细胞组合物经（10-80）ml生理盐水定容后，干细胞在干细胞悬液中的个数密度为（0.125~8）×10⁷个/ml。

人干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰的的用途中，可以采用下列方法之一实现：

1.静脉输入法：通过体表浅静脉进行静脉点滴注射；

2.血管介入法：血管介入的位点为一侧股动脉。

其中，

1.所述的静脉输入法的步骤为：

（1）用100ml生理盐水稀释干细胞悬液得到总容量为110-180ml用于静脉输入的干细胞悬液的稀释液；

（2）通过静脉点滴的方法进行细胞治疗：

先用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲管；

接着开始静脉点滴注射输入干细胞悬液的稀释液，保持20-30滴/分钟，半小时后无不良反应可增加到30-50滴/分钟，细胞输入过程中每15分钟轻轻晃动装有所述干细胞悬液的稀释液的细胞保存袋一次；

细胞输入完毕后用0.9%的氯化钠溶液20ml冲入细胞保存袋中轻轻晃动，再用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲净即可将输液器中细胞冲净，得到的冲洗液也同样注入患者体内，以保证细胞输入的数量；

静滴时将细胞液摇匀，避免细胞贴壁。

2.所述的血管介入法的步骤为：

（1）血管介入的位点为一侧股动脉；

（2）血管介入直接用干细胞悬液；

（3）血管介入路径为：从股动脉入路，导丝沿髂内动脉前支走行，进入子宫动脉，子宫动脉在此处分为输卵管支和卵巢支，将导丝送入卵巢支，卵巢支又与卵巢动脉支吻合于子宫阔韧带内，此处即为所述干细胞悬液的注入位置。

另外，人干细胞组合物在制备用于治疗子宫疾病的药物中的用途中，所述的用途采用下列方法之一实现：

1.静脉输入法：通过体表浅静脉进行静脉点滴注射；

2.血管介入法：血管介入位点为子宫动脉与子宫动脉阴道支；

3.经阴道后穹窿穿刺注射。

其中，

1.所述的静脉输入法的步骤为：

（1）用100ml生理盐水稀释干细胞悬液得到总容量为110-180ml用于静脉输入的干细胞悬液的稀释液；

（2）通过静脉点滴的方法进行子宫疾病的治疗；

先用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲管，开始输入细胞时保持20-30滴/分钟，半小时后无不良反应可增加到30-50滴/分钟；

细胞输入过程中每15分钟轻轻晃动装有所述干细胞悬液的稀释液的细胞保存袋一次；

细胞输入完毕后用0.9%的氯化钠溶液20ml冲入细胞保存袋中轻轻晃动，输入完毕后再用0.9%的氯化钠溶液将输液器中细胞冲净，得到的冲洗液也同样注入患者体内，以保证细胞输入数量；

静滴时将细胞液摇匀，避免细胞贴壁。

当用所述干细胞组合物用于治疗子宫疾病选择静脉输入治疗时，由于干细胞具有增殖和定向分化的能力，当干细胞被趋化至子宫损伤局部后（如内膜基底层），其中部分细胞分泌大量小分子物质，趋化受体干细胞，可促进细胞增殖并定向分化，完成内膜结构和功能的修复。而且干细胞能释放多种生物活性物质，如可以释放膜微粒，趋化并调节周围细胞的功能活性，唤醒处于休眠期的组织细胞，促进其发挥其生物学特性；另由于其具有的免疫调节作用，可增强人体的免疫机能和修复受损的免疫系统，降低机体炎症反应，从而治疗各种免疫因素及感染所致的子宫疾病。同时静脉输入安全可靠，操作性强，副作用小，干细胞可以通过血液循环到达细胞受损部位。

2.所述的血管介入法的步骤为：

（1）血管介入直接用干细胞悬液；

（2）血管介入路径为：从股动脉入路，导丝沿髂内动脉前支走行，进入子宫动脉，到达阴道上部的子宫动脉阴道支，子宫动脉与子宫动脉阴道支皆为所述干细胞悬液的注入位置。

3.所述的经阴道后穹窿穿刺注射法的步骤为：

（1）患者排空膀胱，取膀胱截石位，外阴常规消毒，铺巾；

（2）阴道检查了解子宫、附件情况，注意阴道后穹窿是否膨隆；

（3）阴道窥器充分暴露宫颈及阴道后穹窿并消毒；

（4）宫颈钳钳夹宫颈后唇，向前提拉，充分暴露阴道后穹窿，再次消毒；

（5）用22号长针头接5~10ml注射器，在后穹窿中央距离阴道后壁与宫颈后唇交界处稍下方平行宫颈管刺入，当针穿过阴道壁，有落空感（进针深约2cm）后即可缓慢推注，注射完毕后拔出针头，此时穿刺点如有活动性出血，可用棉球压迫片刻；血止后取出阴道窥器。

以上所述的治疗卵巢早衰或治疗子宫疾病血管介入法的具体步骤还包括：

1，术前准备：局部备皮、静脉碘过敏试验等同一般血管造影；术前快速补液、输血、抗休克治疗；向病人家属交代病情变化，以及介入治疗的必要性，方法，疗效及可能出现的不良反应，并在手术同意书上签字；

2，介入操作：采用1%-2%利多卡因溶液进行局麻，手术刀片破皮1-2mm，蚊式钳钝式分离皮下组织；常规穿刺一侧股动脉行Seldinger穿刺，具体穿刺点为腹股沟韧带下1.5-2.0cm处；缓慢回撤穿刺针，直至血液无阻力自针尾喷出动脉；选择5F或6F血管鞘，将导丝沿股动脉送入，若导丝远端走行正确，可退出穿刺针，沿导丝送入血管鞘，撤出导丝及扩张鞘管；以三通装置抽吸血管鞘并弃去抽吸物，用肝素盐水冲洗鞘管后备用；经鞘管送入相应的导管，导入干细胞悬液；然后退出导管，逐层缝合股动脉及切口，缝合时注意严密止血；

3，术后处理：检查各项生命体征，检查足背动脉搏动，穿刺点需用弹性胶布或绷带进行加压包扎，并加沙袋压迫，患者卧床6-24小时。补液等其他治疗同一般术后处理；尽量避免应用抗生素，以免影响干细胞起效。

介入疗法相对于手术治疗损伤小，可避免血管搭桥手术中可能出现的各种副损伤及并发症，该疗法起效快，可直接作用于病变部位，建立侧支循环，恢复卵巢血供。

本发明所述的人干细胞为按照本申请人的申请号为201210017987.9，名称为“一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法”的方法制得，即：

首先制备人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液：

所述的干细胞样本密度分离液分别由1号液、2号液和3号液组成，按照重量百分比计，其各自组份的含量为：

1号液为稀释剂，选自下列水溶液之一：0.1-30%氯化钠注射液和0.1-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液、或者0.1-30%的pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1%-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液；

2号液为沉淀剂，选自0.1-30%羟乙基淀粉水溶液或0.1-30%甲基纤维素水溶液；

3号液为分层液，其为密度为1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺水溶液。

在实施中，

所述的脑蛋白水解物为选自下列产品之一：国药准字H20052182国药准字H20003386、国药准字H20003384或国药准字H20003385；

所述的脑蛋白水解物的组分含量优选为0.3-20%；

所述的水溶液的水为灭菌注射用水。

更具体地说，

所述1号液的氯化钠注射液组分含量可以为0.3-12%、优选0.5-2%、更优选为0.9%；

所述1号液的磷酸盐缓冲液的pH可以为7.1-7.4优选7.2-7.4、更优选为7.4；

所述的脑蛋白水解物组分含量可以为0.8-15%、优选1.5-4.5%、更优选为3%；

所述2号液的羟乙基淀粉组分含量为0.5-18%、优选1.5-12%、更优选为6%；

所述2号液的甲基纤维素组分含量为0.2-8%、优选0.3-5%、更优选为0.5%；

所述3号液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为1.01-1.088g/ml、优选1.035-1.08g/ml、更优选为1.075g/ml。

在具体操作中，

所述的1号液在超滤条件下除菌，2～3号液可以在100-130℃、优选105-120℃的温度下，灭菌10-50、优选15-20分钟。

然后是使用上述的干细胞样本密度分离液提取人类骨髓、脐带血或外周血分离干细胞的分离方法，所述的方法包括：

（1）将采集、抗凝后的骨髓、脐带血或外周血样品加入到含有1号液稀释剂的大容量培养液瓶中，得到稀释样品；

（2）在步骤（1）的稀释样品中加入2号液沉淀剂混匀，静置，待分层后吸取上层细胞液离心浓缩后得到浓缩样品；

（3）将步骤（2）的浓缩样品铺到3号液上层，然后离心分离，得到干细胞层。

在具体操作中：

所述步骤（1）的骨髓、脐带血或外周血样品的采集、抗凝、稀释均需在无菌条件下完成，其采集、抗凝方法分别为：

骨髓血采集：采用髂后上棘，局麻骨穿方法，使用采髓针采集骨髓，采集骨髓用的针管中先抽取1-1.5ml枸橼酸钠抗凝液，再抽取骨髓与枸橼酸钠抗凝液合计为5ml，依次方法采集，收集采集的骨髓注入无菌瓶中，得到骨髓血预处理样品；

脐带血的采集：在产妇胎盘脱落后，使用单包含枸橼酸钠抗凝液的采血袋，将其采血袋上的针头插入脐静脉中，一边采集一边轻轻晃动采血袋，使抗凝液与脐带血充分结合，得到脐带血预处理样品；

外周血采集：对被采血者手臂进行消毒，使用含有枸橼酸钠抗凝液的采血袋，将采血袋上的针头插入手臂静脉采集过程中慢慢摇动采血袋，使抗凝液与外周血充分结合，得到外周血预处理样品；

在所述步骤（1）中，经采集、抗凝后的骨髓血、脐带血或外周血预处理样品与1号液的体积比为1:1，得到稀释样品；

在所述的步骤（2）中，稀释样品与2号液的体积比为2:1，再经过摇匀1-8分钟，放置3分钟-3小时，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以500-4000转/分钟离心1-20分钟，搜集下层细胞液，得到浓缩样品；

将步骤（3）得到浓缩样品用生理盐水稀释后铺在号液3液上，以500-4000转/分钟离心1-60分钟，收集存在于整个离心管中间位置的约2-4mm厚的油状干细胞层；

将收集的干细胞层用生理盐水清洗1-5次，再用生理盐水稀释至临床使用体积10-80ml即可。

综上所述，本发明的优点在于：

1.临床使用安全，内毒素﹤1EU，符合国家药典规定的注射用标准。

2.获取的细胞悬液体积小，可按医生的需求配成临床治疗所需剂量。

3.静脉输入安全可靠，操作性强，治疗损伤小，副作用小，干细胞可以通过血液循环到达细胞受损部位。

4.介入疗法相对于手术治疗损伤小，可避免血管搭桥手术中可能出现的各种副损伤及并发症，该疗法起效快，可直接作用于病变部位，建立侧支循环，恢复卵巢血供。

5.另外使用本申请人的申请号为201210017987.9、名称为“一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法”的方法制得的人造血干细胞，还具备以下优势

（1）含有多种细胞因子，能够使干细胞快速准确的到达受损部位，并辅助其发挥生物学活性；

（2）细胞数量大，特别是由人脐带血分离提取的纯化干细胞，每份脐带血（80ml左右）分离出的干细胞数量皆可达到10⁸以上；

（3）细胞种类全，分离全部的红细胞，血小板，血浆物质，去除部分成熟白细胞，淋巴细胞，纯化有核细胞，保留所有干细胞；

（4）细胞活性强，采自人体新鲜活细胞，经分离纯化后获取干细胞。细胞活性达96%以上。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

实施例1

用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的干细胞悬液的制备。

无菌纱布蘸75%的酒精，擦拭所有操作过程中所需物品及操作台。（本操作中所涉及消毒步骤皆用75%酒精的无菌纱布擦拭，以下简称消毒）

1，将50mL含有枸橼酸钠的脐带血血袋消毒，导入50mL1号液瓶中。将50mL 2号液全部倒入1号液瓶中，盖紧瓶盖，充分摇匀。将1号液瓶置于超净台，松动瓶盖后静置20-30min，待分层。12支离心管拆封，备用。

2，取3号液，消毒外壁，开盖，用新移液管取25ml3号液置于50ml新离心管中，一共移取3次，得到3支有试剂3号液的离心管，备用。

3，取步骤1静置20-30min后的试剂1号液瓶中的上层液，用移液管移取分别置于离心管中每只45ml，盖紧盖置于离心机中设置速度为2500转时间为5分钟温度为5℃。从离心机中取出离心管，消毒，开盖，弃上清液。

4，取新移液管，移取0.9%NaCl分别加入到离心管中至10ml处，摇匀，得细胞混合液备用。取步骤2下装有3号液的离心管，缓慢加入刚刚制备的细胞混合液，保持细胞混合液悬浮于3号液表面，加至45ml，轻放至试管架，即得到3支具有分层液的离心管，置于离心机中，设置速度为1800转，时间为30分钟，温度为5℃。

5，从离心机中轻取出离心管，保持液面平稳，消毒，开盖，用一次性胶头滴管吸取离心管中间的絮状液体，收集置三支新离心管中，用移液管加入0.9%NaCl至45ml处，摇匀，配平，离心，设置速度为2000转时间为5分钟温度为5℃（注：第一次清洗）。

6，取出具有细胞液的离心管，消毒，开盖，弃上清液后，用注射器先加入少量0.9%NaCl，摇匀后吸取至一支试管内，加入0.9%NaCl至45ml处，再摇匀，配平，离心，速度为1800转，时间为5分钟温度为5℃（注：第二次清洗）。

7，取出具有细胞液的离心管，消毒，开盖，弃上清液，用注射器先加入少量0.9%NaCl，摇匀后加入0.9%NaCl至45ml处，再摇匀，配平，离心，设置速度为1600转时间为5分钟温度为5℃（第三次清洗）。

8，取出具有细胞液的离心管，消毒，开盖，弃上清液后加入0.9%NaCl至所需要稀释刻度处摇匀，用微量定量移液器取10ul用于细胞计数，其余细胞液密封，置于冰桶内待用。

实施例2

药理实验，脐带血干细胞悬液的一般药理学实验

1材料

1.1动物：KM小鼠体质量18~22g，雌雄各半。健康杂种家犬，体重12~18kg，雌雄皆用。动物饲养于SPF级实验动物实验室条件下，室内温度19～22℃，相对湿度40%～50%，给予全价颗粒饲料，自由摄食、饮水。

1.2药物：人类脐带血干细胞悬液，其中干细胞含量为8×10⁷个/ml。

1.3上海欣曼公司SYS-G型小鼠自主活动测频仪，美国BIOPAC公司RM-6000型多导生理记录仪。

2试验方法

2.1对精神神经系统的影响

2.1.1对小鼠一般外观行为的影响：取小鼠80只，随机分为四组，每组20只，雌雄各半，给药组分设0.5、1.0、2.0ul/kg三个剂量组，对照组给予5%葡萄糖注射液，均按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药，给药后10min，观察小鼠的一般行为表现，步态、姿势、肌肉紧张度、瞳孔变化、流涎、二便、皮毛等，同对照组比较，了解受试药对动物的影响。

2.1.2对小鼠协调运动的影响：分组及给药同前，采用倾斜板法，于给药前及给药后10min、30min及60min各进行一次测定，计算各组小鼠从木板上跌落的百分率，按简化直接法统计。

2.1.3对小鼠自主活动的影响：小鼠80只，分组及给药同前，于尾静脉注射给药后10min，置小鼠于自发活动测定仪中，稳定5min后，测定10min内自主活动次数，用组间t检验进行统计处理。

2.2对呼吸系统及心血管系统的影响

家犬6只，雌雄各半，用戊巴比妥钠30mg/kg，静脉注射麻醉后，背位固定，分离右颈总动脉，插管连接TP-101型压力转换能以多导生理记录仪记录收缩压，舒张压及平均动脉压；以针形电极刺入四肢皮下记录Ⅱ导联心电图，以立位转换能器连接胸骨记录呼吸频率及幅度。实验设0.5、1.0、2.0ul/kg三个剂量组，对照组用5%葡萄糖注射液，给药容积为1ml/kg，由股静脉插管给药，注射速度为30s，分别在静脉注射给药后1、2、5、10、15、20及30min时记录上述各项指标，观察脐带血干细胞悬液对呼吸，心电及血压的作用，用t检验法进行用药前后显著性检验分析。

3结论

3.1对小鼠一般行为表现的影响：实验各组动物在用药后60min内的一般行为，步态、肌紧张度、活动、饮食、皮毛及二便，均无显著变化，未见有瞳孔大小改变，竖毛、倦伏、流涎等异常症状，同对照组相比，差异无统计学意义。

3.2对协调运动的影响：各组动物于给药前及给药后各观测点的跌落率均为0，表明在实验所用0.5、1.0、2.0ul/kg剂量下对小鼠协调运动无明显影响。

3.3对小鼠自主活动的影响：脐带血干细胞悬液各剂量组对小鼠自主活动的影响见表1。

表1对小鼠自主活动的影响

注：与对照组比较P＞0.05。

从表1结果可见：实验组1.0、2.0ul/kg剂量时，活动次数略有减少，但同对照组比较，差异并无统计学意义，表明脐带血干细胞悬液对小鼠自主活动无明显影响。

3.4对呼吸系统的影响：静脉注射各剂量后，分别在不同时间点描记呼吸频率及幅度的变化，结果见表2。

表2对麻醉犬呼吸频率及幅度的影响

注：对照组和实验组与用药前比较P均＞0.05。

从表2结果可见：用药组在0.5、1.0ul/kg剂量时静脉注射对麻醉犬各时间点的呼吸频率及幅度均无明显作用，在2.0ul/kg剂量时，频率及幅度均略有增加，但同对照组相比，差异无统计学意义。表明脐带血干细胞悬液对犬的呼吸系统无显著影响。

3.5对心血管系统的影响：结果见表3、4。

表3对麻醉犬平均动脉压的影响(KPa)

注：与用药前比较P＞0.05。

表4对麻醉犬心率的影响（次/min）

注：与用药前比较P＞0.05。

表3、4结果表明：脐带血干细胞悬液静脉注射1.0、2.0ul/kg时，对麻醉犬的心率计平均动脉压无明显作用，同对照组及用药前相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)，表明脐带血干细胞悬液在本剂量时无心血管刺激作用。

表5对麻醉犬Ⅱ导联心电图（ECG）的影响

从表5结果可见：静脉注射脐带血干细胞悬液0.5、1.0、2.0ul/kg计量时，对麻醉犬心电图无明显作用，其各波间隔时间及电压振幅均在正常范围内波动，用药前后及用药组同对照组相比，均未发现差异有统计学意义，表明脐带血干细胞悬液在本实验所用剂量下，对麻醉犬的心电图无影响。

4结论

脐带血干细胞悬液的临床用药途径多为静脉滴注。故在本实验研究中，采用了与临床用药途径相同的静脉给药方式。当剂量分别为0.5、1.0、2.0ul/kg时，对小鼠的一般行为、协调运动及自主活动均无明显作用，表明本品对神经系统无明显影响。0.5、1.0及2.0ul/kg剂量时，对麻醉犬的呼吸次数和呼吸幅度无影响，对麻醉犬的血压亦无明显影响。在0.5、1.0及2.0ul/kg剂量时，对麻醉犬的心率、收缩压、舒张压及平均动脉压皆无明显影响。表明脐带血干细胞悬液静脉滴注的安全性较高。

实施例3

脐带血干细胞悬液的急性毒性实验

一、材料

A．啮齿类动物组：SD大鼠，周龄6~9周，体重180~240g

1、实验组：大鼠60只（雌雄比例1:1）

2、空白对照组：大鼠20只（雌雄比例1:1）

B．非啮齿类动物组：Beagle犬，月龄6~10个月，体重8~15kg。

1、实验组：犬30只（雌雄比例1:1）

2、空白对照组：犬10只（雌雄比例1:1）

C．药物：人类脐带血干细胞悬液，其中干细胞的含量为8×10⁷个/ml。

二、方法

1、给药途径：静脉注射

2、给药剂量（起始剂量，中间剂量，最大剂量）：

A组：a、大鼠2.5ml/kg b、大鼠5.0ml/kg c、大鼠10.0ml/kg

B组：a、犬1.25ml/kg b、犬2.5ml/kg c、犬5.0ml/kg

三、观察方法

给药后2h同时观察各组观察动物反应，以后每天上、下午各观察一次，连续观察15天。

指标：观察一般指标（见下表6），动物死亡情况，体重变化。

表6急性毒性实验结果

注：1.实验组大鼠偶发呼吸急促(1/20)，给药后30min出现，持续2min。

2.实验组大鼠自发活动增多（3/20），表现为神经系统兴奋状态，给药后3~15天间歇性出现。

3.实验组Beagle犬自发活动增多（2/20），表现为神经系统兴奋状态，给药后7~14天间歇性出现。

4.空白对照组大鼠出现困倦（2/20），表现为偶尔昏睡，正常饲养第8~13天间歇性出现。

5.空白对照组Beagle犬出现困倦（1/20），表现为偶尔昏睡，正常饲养第9~11天间歇性出现。

6.实验组Beagle犬出现小微血管扩张（1/20），表现为舌、耳、结膜、阴囊发红，体热等。给药后5~13天出现。

四、实验结果

参与实验的大鼠及Beagle犬在实验周期内皆未出现死亡，体重稍有增加，大鼠平均增加10~15g，犬平均增加400~900g，实验组与空白对照组相比无明显差别。除最大剂量组及空白对照组出现阳性表现外，其余各组均为出现有意义的阳性体征，现以表格形式记录如下，症状阳性表现用“+”表示，阴性表现用“—”表示，并记录了阳性表现的出现比例及起始时间（详见下表及注释）。实验结束后对全部实验动物进行大体解剖，其组织器官的体积，颜色，质地均未见异常。

五、结论

1、最高剂量下，A组实验组大鼠偶发的呼吸急促，且持续时间很短，考虑可能与该大鼠心肺功能不全有关。A组实验组3只大鼠及B组实验组2只犬在给药后分别出现了间歇性的自发活动增加，探究，梳理毛发，运动增加，考虑是由于干细胞增殖，增加了神经细胞的数量，刺激中枢神经系统使其表现为兴奋状态。另有A组空白对照组2只大鼠及B组空白对照组1只犬出现昏睡状态，但易警醒而恢复正常活动，睡眠中枢短暂受到抑制，考虑可能与饲养环境较封闭，运动减少，通风不良有关。B组实验组1只犬出现体表微血管扩张，微循环加快，考虑为心输出量增加，或局部环境温度过高所致。

2、由起始剂量到中间剂量均未出现有意义的阳性表现，说明脐带血干细胞悬液作用于动物的安全性高，最高剂量下偶发中枢神经兴奋，说明其不良反应少，受试物安全范围为大鼠0~5.0ml/kg，犬0~2.5ml/kg，毒性反应小，对心脑肺等重要器官基本无不良影响，并且短时间内可恢复正常。

实施例4

脐带血干细胞悬液长期毒性实验

1材料

1.1动物：采用SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量80～90g。动物饲养于SPF级实验动物实验室条件下，室内温度19～22℃，相对湿度40%～50%，每笼6只动物，给予鼠全价颗粒饲料，自由摄食、饮水。

1.2药物：人类脐带血干细胞悬液，其中干细胞的含量为8×10⁷个/ml。

2方法

2.1分组与给药

将脐带血干细胞悬液每日上午以最大剂量2.0ul/kg尾静脉注射给药1次，对照组注射等剂量的蒸馏水，每周称1次体重并记录摄食量，根据体重的变化重新计算给药量。根据急性毒性试验、药效学试验结果确定脐带血干细胞悬液高剂量组2.0ul/kg、中剂量组1.0ul/kg、低剂量组0.5ul/kg。

2.2观察指标

2.2.1一般观察给药期间，观察动物的外观，行为活动，饮食、粪便及被毛的情况，并记录体质量(每周称重1次)、进食量、进水量。

2.2.2血液学检查采用美国雅培CD-1200型全自动血球记数仪，测定红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、红细胞压积容量(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、淋巴细胞数目(LYM)、单核细胞数目(MID)、粒细胞数目(GRA)、红细胞分布宽度(RDW)、血红蛋白(HGB)。

2.2.3血液生化检测采用日本日立7610型自动仪，测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、总胆红素(TB)等。

2.2.4系统尸解及脏器系数全面细致观察每只动物的脏器，并称量每只动物的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑等，并计算脏器系数。

3结果

3.1脐带血干细胞悬液对大鼠血液学指标的影响结果见表7～8。

3.2脐带血干细胞悬液对大鼠血液生化学指标的影响结果见表9～10。

3.3脐带血干细胞悬液对大鼠脏器系数的影响结果见表11。

表7脐带血干细胞悬液对给药180d末期大鼠血液学指标的影响

表8脐带血干细胞悬液对停药15d后大鼠血液学指标的影响

表9脐带血干细胞悬液对给药180d末期大鼠血液生化学指标的影响

表10脐带血干细胞悬液对停药15d后大鼠血液生化学指标的影响

表11脐带血干细胞悬液对给药180d末期大鼠脏器系数的影响

4结论

大鼠长期毒性实验以3个剂量(即2.0，1.0，0.5ul/kg)连续给药6个月及停药2周后，对大鼠一般状况、体质量增长无明显影响;血液学指标及血液生化学指标均在正常范围内，对大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器重量，脏器系数与对照组比较均无显著差异，并对大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、子宫等重要脏器进行组织检查也未见明显病理改变。故本实验结果提示脐带血干细胞悬液在大鼠6个月长期毒性实验中，未发现明显的毒性反应及延迟性毒性反应，可以安全地应用于临床。

实施例5

脐带血干细胞悬液静脉注射对血管刺激性、溶血、过敏性实验

1材料

1.1人类脐带血干细胞悬液，其中干细胞的含量为8×10⁷个/ml。

；5%葡萄糖注射液；甲醛；白蛋白；牛血清白蛋白；白百破三联疫苗；伊文思兰。

1.2受试动物日本大耳白家兔，体重2～3kg，雌雄兼用；荷兰豚鼠，体重200～250g，雄性。SD大鼠，体重180～220g，雄性。

2方法

2.1血管刺激性实验

实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22～24℃，湿度40%～60%，取家兔3只，右侧耳缘静脉以无菌操作方法注射量为8.3ml/kg（注：由于该系列实验涉及到受试物的耐受性，因此选用干细胞悬液范围中的最大浓度进行试验。）的脐带血干细胞悬液，左侧耳缘静脉注射等体积5%葡萄糖注射液，1次/d，连续给药5d。上述两组均分别于末次给药后96h，肉眼观察注射部位有无红肿、充血等刺激现象，处死动物，以耳缘静脉注射点至向心方向，连续取3段血管连同周围组织，每段1cm，用10％甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切5μm薄片，HE染色，光镜下做组织学检查，另一侧对照血管也同法处理。

2.2溶血实验

2.2.12％兔红细胞混悬液制备取健康家兔1只，自心脏取血约20ml，置于三角瓶中，用玻璃棒搅拌，除去纤维蛋白，然后将血移入刻度离心管内，加入生理盐水10ml，混匀后离心5min（2000～2500r/min），去除上清液，再加生理盐水混匀离心，反复洗涤3～4次，至上清液无色透明，将所得红细胞按其容积用生理盐水稀释成2%的混悬液。

2.2.2方法取干净试管7支，编号排列于试管架上，按配比量依次加入2%兔红细胞混悬液和生理盐水，混匀后，置于37℃恒温箱中30min，然后于1-5管中加入不同量的干细胞悬液,分别为1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6号管中加入1ml生理盐水，7号管中加入1ml溶血素。（第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管），摇匀，置37℃恒温箱中进行温育，观察15，30，45min，1，2，3，24h有无溶血及凝集情况。

结果判定：

全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留。

部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留。

无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。

凝集：虽不溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不能分散。

2.3全身主动过敏实验

实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22～24℃，湿度40%～60%，取48只健康雄性豚鼠，随机分成5％葡萄糖注射液组、阳性药物组（白蛋白组）、脐带血干细胞悬液大剂量组、小剂量组，每组12只。分别给各组豚鼠隔日腹腔注射5％葡萄糖注射液、白蛋白25mg/kg，脐带血干细胞悬液4，16ul/kg，体积为0.5ml，共注射3次，然后每组内分成两批，于第1次给药后14d及21d分别静脉注射5％葡萄糖注射液、白蛋白50mg/kg，脐带血干细胞悬液16，64ul/kg，体积为1ml，观察豚鼠在静脉注射后30min内有无表12中的躁动、搔鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、甚至死亡等过敏反应症状。

表12过敏反应症状

2.4被动皮肤过敏实验

2.4.1大鼠含IgE的抗血清制备取4只健康雄性SD大鼠，按注射剂大鼠同种被动皮肤过敏试验的要求，分别腹腔注射5%葡萄糖注射液、牛血清白蛋白25mg/kg，脐带血干细胞悬液4，16ul/kg，同时腹腔注射白百破三联疫苗1ml/只，隔日1次、共3次。11d后眼眶取血，分离血清，－20℃保存，备用。

2.4.2大鼠同种被动皮肤过敏反应实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22～24℃，湿度40%～60%，取16只健康雄性SD大鼠，随机分为5%葡萄糖组、阳性组（牛血清白蛋白组）、脐带血干细胞悬液大剂量组和小剂量组。分别在各组大鼠背中线两侧距脊柱约1.5cm处备皮，4cm×4cm。

取上述含IgE的抗血清，用5%葡萄糖注射液按1∶2，1∶4，1∶8，1∶16比例分别稀释成4个稀释度，将稀释的抗血清按逆时针方向（左上-左下-右下-右上）皮内注射于大鼠背部预先备皮部位，每一稀释度注射一个点，每点注射0.1ml。致敏24h后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0.8％伊文思兰染料共1ml，进行激发。30min后处死各组大鼠，测量皮肤内层的蓝色反应斑直径，直径大于5mm者判定为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和。

3结果

3.1血管刺激性实验：给药组3只家兔耳缘静脉注射部位均未见红肿、充血等刺激现象。光镜病理组织学检查：脐带血干细胞悬液给药组和5％葡萄糖对照组家兔耳缘静脉注射部位血管结构完整，血管内皮细胞无肿胀、变性、坏死，管壁无炎细胞浸润，管腔内无血栓形成。

3.2溶血性实验：在0.25～3h及24h内除第7管（阳性对照管）溶液呈现澄明红色，其余6管均末见澄明红色，且红细胞全部下沉，上层液体无色澄明，经振摇后红细胞能均匀分散。表明脐带血干细胞悬液无溶血及无凝集作用。

3.3全身主动过敏实验：5％葡萄糖注射液组、脐带血干细胞悬液大、小剂量组在静脉给药30min后，豚鼠活动正常，未出现1～20级反应症状，判定为过敏反应阴性。而阳性药组豚鼠出现痉挛、抽搐、休克死亡，判定为过敏反应极强阳性。

3.4被动皮肤过敏实验：脐带血干细胞悬液大、小剂量组、5％葡萄糖注射液组大鼠背部皮肤均未见蓝色反应斑点。阳性组注射部位皮肤均不同程度的出现蓝色斑点反应，其中1∶16处有3例出现蓝斑，1∶8处有4例出现蓝斑，1∶4与1∶2处6例均出现蓝斑，蓝斑直径均大于5mm，判定为阳性反应。结果表明：脐带血干细胞悬液无同种被动皮肤致敏作用。

4结论

本实验采用的方法简便、准确、可靠，4项指标检测脐带血干细胞悬液均未出现阳性结果，说明脐带血干细胞悬液对血管无刺激性，无溶血作用，全身主动过敏反应阴性，无同种被动皮肤致敏作用。表明脐带血干细胞悬液安全性好，可供临床应用。

实施例6

效果实施例，治疗模式动物的效果

脐带血干细胞治疗环磷酰胺所致大鼠卵巢功能损伤的实验研究

实验目的：

观察脐带血干细胞移植对环磷酰胺（CTX）造成损伤的大鼠卵巢功能的影响。

实验材料：

1、药品：环磷酰胺注射液，脐带血干细胞悬液，其中干细胞的含量为3×10⁷个/ml，10%水合氯醛，生理盐水。

2、器材：大鼠手术台，手术剪，手术镊，注射器（1ml,2ml），头皮静脉注射针头，台式磅秤，棉球。

3、动物：正常成年雌性大鼠100只。

1）实验组：成年雌性大鼠50只（经CTX成功建模的雌性大鼠50只，予干细胞移植）。

2）正常对照组：正常成年雌性大鼠20只。

3）模型对照组：成年雌性大鼠20只（经CTX建模的雌性大鼠20只，不予干细胞移植）。

实验方法：

1、实验动物麻醉：全部大鼠称重，腹腔注射10%水合氯醛0.3ml/100g麻醉。

2、CTX建模：经刘惠芬等（刘惠芬等，环磷酰胺对大鼠卵巢功能的影响【J】.中山大学学报（医学科学报）.2009.A04.99-102）研究证明，CTX75mg/kg单次腹腔注射给药可有效造成大鼠卵巢功能的损害。随机抽取80只正常成年雌性大鼠，每只腹腔注射CTX75mg/kg建模。再抽取20只正常成年雌性大鼠，每只腹腔注射生理盐水75mg/kg作为正常对照组。相同环境下正常喂养，给予标准光照（14h光照，10h黑夜），全价颗粒饲料喂养，自由摄食，室温20℃~25℃，相对湿度45%~55%。如上喂养2周，分别观察动情周期，测定血清雌二醇（E2）、孕激素（P），评估卵巢功能。

3、分组：选取其中建模成功的70只大鼠，随机分为实验组（卵巢注射组25只，尾静脉注射组25只）和模型对照组（20只）；正常对照组大鼠（20只）全部予以保留。

4、干细胞悬液注射：

实验组：①卵巢注射组：建模完成后,麻醉大鼠后开腹行双侧卵巢注射脐带血干细胞悬液0.5ml/100g；②尾静脉注射组：建模完成后,自尾静脉注射脐带血干细胞悬液0.5ml/100g。正常对照组及模型对照组注射生理盐水0.5ml/100g。

观察方法：

1、阴道细胞涂片检查：每日早8时进行阴道脱落细胞检查，了解动情周期。

2、血清学检测：在建模前及建模完成后第15d、30d、45d剪尾取血检测E2、FSH的水平。全血经2500r/min离心15分钟，取血清入-20℃冰箱冷冻保存，溶化后用放射免疫测定技术检测血清雌二醇（E2）和卵泡刺激激素（FSH）水平。

实验结果：

一、阴道细胞涂片检查

1、正常对照组：可见正常的动情周期（平均周期为4~5d）。

2、模型对照组：无规则周期性变化，周期紊乱，可见动情周期缩短甚至消失，出现持续的动情周期（最短2.74天，最长9.52天）。

3、实验组：干细胞悬液注射30天后有37%的大鼠恢复了正常的动情周期（平均动情周期为4.68d）。

二、血清学检查

1、各组大鼠E2水平变化情况：建模前各组大鼠的E2基础浓度对比无统计学差异（P＞0.05）；建模完成后15d，模型对照组的E2水平为（18.38±1.03）ng/L，卵巢注射组为（22.17±0.56）ng/L，尾静脉注射组为（23.24±1.39）ng/L。两个实验组的E2水平均高于模型对照组（P＜0.01），但两种治疗途径比较则无差异。建模完成后15d-45d内，两个实验组的E2水平均高于模型对照组，比较均有统计学意义（P＜0.01），但该两组的E2水平在各时间点比较均无统计学意义（P＞0.05）。此外,在整个观察期间，无论是模型对照组、还是2个实验组的E2水平均有逐渐恢复的趋势，同组间各时间点的E2水平比较均有统计学意义(P＜0.01)。

2、各组大鼠FSH变化情况：建模前各组大鼠FSH基础浓度对比无统计学差异(P＞0.05)。建模完成后15d,模型对照组FSH水平为(26.98±1.23)m1U/ml,卵巢注射组为(23.36±0.81)m1U/ml,尾静脉注射组为(25.34±0.72)m1U/ml,卵巢注射组与模型组比较差异有显著性(P＜0.05),但尾静脉注射组与模型组比较差异无显著性(P＞0.05)。建模完成后30d,模型对照组FSH水平为(24.80±1.21)mIU/ml,卵巢注射组为(22.06±1.09)mIU/ml,尾静脉注射组为(21.54±1.03)mIU/ml,经统计学分析,三组比较差异有显著性(P＜0.05),2个实验组比较差异无显著性(P＞0.05)。此外,在整个观察期间,模型对照组、卵巢注射组,尾静脉注射组的FSH水平均有逐渐恢复的趋势,同组间各时间点的FSH水平比较均有统计学意义(P＜0.01)。

结论

1、卵巢的主要功能为生殖繁育后代及分泌性激素。生殖功能与卵泡的成熟程度密切相关，而FSH的主要作用即促进卵泡的发育和成熟，增加卵巢体积。在卵巢所分泌的性激素中，E2的活性最强，也是卵巢产生的主要激素之一，对维持雌性动物的生殖功能及第二性征有重要作用。因此协同监测FSH和E2的水平可以反映雌性大鼠的卵巢功能。当成年雌性大鼠与雄性大鼠分开时，会反复出现规律的非妊娠的生殖活动，表现为卵泡生长，排卵和妊娠前期变化的重复过程，这种现象叫做动情周期。该过程中会出现一系列的性激素的变化，因此动情周期可以反应大鼠的卵巢功能。根据阴道细胞涂片结果可见，脐带血干细胞可恢复部分雌性大鼠的动情周期，由血清学检查可见，脐带血干细胞可以有效恢复E2和FSH水平。脐带血干细胞可以在CTX损伤的大鼠卵巢中存活及迁移，能改善建模后大鼠的性激素水品，有效恢复大鼠的卵巢功能。

2、本实验采用两种给药途径，分别为卵巢注射与尾静脉注射。由实验结果分析可见，两种给药途径所得到的效果基本相同。卵巢注射组大鼠的FSH恢复较快，与脐带血干细胞直接作用于病变位置相关，能更快实现干细胞的迁移及归巢作用。而静脉注射则更为微创，对病体的损伤较少，可多次进行注射，对于临床上耐受力差患者的干细胞移植治疗更有意义。

实施例7-10用于治疗人类患者的过程及获得效果

实施例7

在的实施7方案中，所述疾病、障碍或病状是医源性卵巢功能退化，患者于35岁因卵巢生殖细胞瘤切除左侧卵巢，术后遗留的右侧卵巢功能逐渐退化，术后5年，逐渐出现月经周期紊乱，经量稀少，阴道干燥，性欲下降，乳房萎缩下垂，面部色斑等症状，性激素水平低下，血清雌二醇78pmol/L，孕酮3.5nmol/L。经静脉注射移植脐带血干细胞悬液的稀释液3次（每月一次），用量分别为：35ml的干细胞浓度为5.5×10⁵个/ml干细胞悬液、50ml的干细胞浓度为4.2×10⁵个/ml干细胞悬液、40ml的干细胞浓度为4.0×10⁵个/ml干细胞悬液,3个月后该患者月经周期逐渐规律，5-7天/28-30天，经量较前明显增多，性欲恢复，乳房下垂和面部色斑等症状皆有所缓解，血清E2值为363.35pmol/L，血清P值为32.9nmol/L，经自体对比可见，脐带血干细胞能修复受损的卵巢细胞，激活周围组织细胞，恢复患者卵巢功能。

实施例8

在实施8方案中，所述疾病、障碍或病状是子宫因素所致的不孕症，患者37岁，慢性子宫内膜炎3年，月经不规则，下腹有坠胀感，白带增多，子宫增大，有触痛，子宫旁周围组织增厚压痛阳性。静脉注射脐带血干细胞悬液的稀释液一次，用量为60ml的干细胞浓度为3.9×10⁵个/ml干细胞悬液,45天后自觉下腹坠胀感消失，白带正常，查子宫无明显触痛，周围组织无压痛。3个月后，查血β-hCG增高，彩超提示宫内妊娠，活胎，推算末次月经时间，诊断为早孕45天。

实施例9

实施方案9为特发性的卵巢早衰，无明确致病因素导致的继发性闭经，患者41岁，表现为卵巢萎缩，进行性月经稀少，并伴有潮热，烦躁等更年期症状。经静脉滴注脐带血干细胞悬液的稀释液一次，用量为75ml的干细胞浓度为5.6×10⁵个/ml干细胞悬液,2个月后，以上症状明显缓解。

实施例10

在实施方案10中，所述疾病、障碍或病状是化疗所致的卵巢功能衰竭，患者乳腺癌术后化疗半年，严重损伤卵巢功能，丧失原始卵泡和发育卵泡，卵巢及子宫血管硬化，表现为月经不调，无排卵型月经，经量稀少，关节痛，骨质疏松等。经静脉滴注脐带血干细胞悬液的稀释液一次，用量为55ml的干细胞浓度为4.8×10⁵个/ml干细胞悬液,3个月后，以上症状皆有所改善。

Claims (10)

1.一种人干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物中的用途，其特征在于：

所述干细胞组合物为用生理盐水清洗及稀释人干细胞后得到干细胞悬液，每份所述干细胞组合物含有的人干细胞的数量为（1~8）×10⁸个；

所述的人干细胞选自人类骨髓、脐带血或外周血干细胞，即按照本申请人的申请号为201210017987.9、名称为“一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法”中的干细胞分离方法步骤（3）得到的“存在于整个离心管中间位置的约（2-4）mm厚的油状干细胞层”；

每份所述干细胞组合物经（10-80）ml生理盐水定容后，干细胞在干细胞悬液中的个数密度为（0.125~8）×10⁷个/ml。

2.根据权利要求1所述的在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的用途，其特征在于，所述的用途采用下列方法之一实现：

1.静脉输入法：通过体表浅静脉进行静脉点滴注射；

2.血管介入法：血管介入的位点为一侧股动脉。

3.根据权利要求2所述的在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的用途，其特征在于，所述的静脉输入法的步骤为：

（1）用100ml生理盐水稀释干细胞悬液得到总容量为110-180ml用于静脉输入的干细胞悬液的稀释液；

（2）通过静脉点滴的方法进行细胞治疗：

先用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲管；

接着开始静脉点滴注射输入干细胞悬液的稀释液，保持20-30滴/分钟，半小时后无不良反应可增加到30-50滴/分钟，细胞输入过程中每15分钟轻轻晃动装有所述干细胞悬液的稀释液的细胞保存袋一次；

细胞输入完毕后用0.9%的氯化钠溶液20ml冲入细胞保存袋中轻轻晃动，再用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲净即可将输液器中细胞冲净，得到的冲洗液也同样注入患者体内，以保证细胞输入的数量；

静滴时将细胞液摇匀，避免细胞贴壁。

4.根据权利要求2所述的在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的用途，其特征在于，所述的血管介入法的步骤为：

（1）血管介入的位点为一侧股动脉；

（2）血管介入直接用干细胞悬液；

（3）血管介入路径为：从股动脉入路，导丝沿髂内动脉前支走行，进入子宫动脉，子宫动脉在此处分为输卵管支和卵巢支，将导丝送入卵巢支，卵巢支又与卵巢动脉支吻合于子宫阔韧带内，此处即为所述干细胞悬液的注入位置。

5.根据权利要求1所述的在制备用于治疗子宫疾病的药物中的用途，其特征在于，所述的用途采用下列方法之一实现：

1.静脉输入法：通过体表浅静脉进行静脉点滴注射；

2.血管介入法：血管介入位点为子宫动脉与子宫动脉阴道支；

3.经阴道后穹窿穿刺注射。

6.根据权利要求5所述的在制备用于治疗子宫疾病的药物中的用途，其特征在于，所述的静脉输入法的步骤为：

（1）用100ml生理盐水稀释干细胞悬液得到总容量为110-180ml用于静脉输入的干细胞悬液的稀释液；

（2）通过静脉点滴的方法进行子宫疾病的治疗；

先用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲管，开始输入细胞时保持20-30滴/分钟，半小时后无不良反应可增加到30-50滴/分钟；

细胞输入过程中每15分钟轻轻晃动装有所述干细胞悬液的稀释液的细胞保存袋一次；

细胞输入完毕后用0.9%的氯化钠溶液20ml冲入细胞保存袋中轻轻晃动，输入完毕后再用0.9%的氯化钠溶液将输液器中细胞冲净，得到的冲洗液也同样注入患者体内，以保证细胞输入数量；

静滴时将细胞液摇匀，避免细胞贴壁。

7.根据权利要求5所述的在制备用于治疗子宫疾病的药物中的用途，其特征在于，所述的血管介入法的步骤包括：

（1）血管介入直接用干细胞悬液；

（2）血管介入路径为：从股动脉入路，导丝沿髂内动脉前支走行，进入子宫动脉，到达阴道上部的子宫动脉阴道支，子宫动脉与子宫动脉阴道支皆为所述干细胞悬液的注入位置。

8.根据权利要求2或5所述的在制备用于治疗卵巢早衰或治疗子宫疾病的药物中的用途，其特征在于，所述的血管介入法的步骤还包括：

1，术前准备：局部备皮、静脉碘过敏试验等同一般血管造影；术前快速补液、输血、抗休克治疗；向病人家属交代病情变化，以及介入治疗的必要性，方法，疗效及可能出现的不良反应，并在手术同意书上签字；

2，介入操作：采用1%-2%利多卡因溶液进行局麻，手术刀片破皮1-2mm，蚊式钳钝式分离皮下组织；常规穿刺一侧股动脉行Seldinger穿刺，具体穿刺点为腹股沟韧带下1.5-2.0cm处；缓慢回撤穿刺针，直至血液无阻力自针尾喷出动脉；选择5F或6F血管鞘，将导丝沿股动脉送入，若导丝远端走行正确，可退出穿刺针，沿导丝送入血管鞘，撤出导丝及扩张鞘管；以三通装置抽吸血管鞘并弃去抽吸物，用肝素盐水冲洗鞘管后备用；经鞘管送入相应的导管，导入干细胞悬液；然后退出导管，逐层缝合股动脉及切口，缝合时注意严密止血；

3，术后处理：检查各项生命体征，检查足背动脉搏动，穿刺点需用弹性胶布或绷带进行加压包扎，并加沙袋压迫，患者卧床6-24小时；补液等其他治疗同一般术后处理；尽量避免应用抗生素，以免影响干细胞起效。

9.根据权利要求5所述的在制备用于治疗子宫疾病的药物中的用途，其特征在于，所述的经阴道后穹窿穿刺注射法的步骤为：

（1）患者排空膀胱，取膀胱截石位，外阴常规消毒，铺巾；

（2）阴道检查了解子宫、附件情况，注意阴道后穹窿是否膨隆；

（3）阴道窥器充分暴露宫颈及阴道后穹窿并消毒；

（4）宫颈钳钳夹宫颈后唇，向前提拉，充分暴露阴道后穹窿，再次消毒；

（5）用22号长针头接5~10ml注射器，在后穹窿中央距离阴道后壁与宫颈后唇交界处稍下方平行宫颈管刺入，当针穿过阴道壁，有落空感后即可缓慢推注，注射完毕后拔出针头，此时穿刺点如有活动性出血，可用棉球压迫片刻；血止后取出阴道窥器。

10.根据权利要求1～7之一或9的人干细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰或子宫疾病的药物中的用途，其特征在于：

所述的人干细胞为人类脐带血干细胞；

所述的用途采用静脉输入法方法实现。