CN107334786B - 双歧杆菌活菌胶囊及其在制备预防卵巢早衰药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物药技术领域，发明名称为双歧杆菌活菌胶囊及其在制备预防卵巢早衰药物中的应用，涉及一种双歧杆菌活菌胶囊及其在制备预防卵巢早衰中的应用。本发明提供技术拓展了双歧杆菌活菌胶囊的临床用途，同时也为卵巢早衰的预防提供了新的用药选择与临床诊疗方案。

Description

双歧杆菌活菌胶囊及其在制备预防卵巢早衰药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物药技术领域，特别涉及一种双歧杆菌活菌胶囊及其制药新用途。

背景技术

卵巢早衰（POF）是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前即闭经的现象。特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等。妇女的平均自然绝经年龄为50～52岁，绝经年龄存在着种族和地区分布的差异，但其绝对值相差不大。小于40岁的POF发生率为1%，小于30岁的POF发生率为1‰。原发闭经中POF占10%～28%，继发闭经中POF占4%～18%。徐苓等发现北京地区妇女POF发生率为1.8%。由此可见，POF在临床上并不少见。

一、卵巢早衰的病因

POF是一种有多种病因的综合征，在大部分的病例中病因还不明确。目前POF病因从临床上主要分为以下几个方面，各个病因都可从以上某个方面减少卵巢内卵泡池的储备或引起卵泡功能失调而导致POF。

1、遗传因素

通过对家族史的仔细分析，家族性POF的发病率在不同的人群中报道分别为4%～31%，可见遗传因素在POF中占主要地位。X染色体的异常一直被公认为是引起POF的主要病因，随着分子生物学的进展，研究者们在常染色体上也发现了越来越多的与POF相关的候选基因。

2、免疫因素

自20世纪50年代开始，研究者发现9%～40%的POF患者合并其他内分泌腺体或系统的自身免疫性疾病，如自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、糖尿病等。POF患者常合并2种或以上的自身免疫性疾病，所有伴随POF的自身免疫疾病中，甲状腺疾病是最常见原因，12%～33%的POF患者能被检测出患有甲状腺疾病。18%的POF患者中，家族中存在遗传的甲状腺疾病，第二常见的是多腺体自身免疫疾病（PAGD，Addison病合并内分泌系统功能障碍），在PGADⅠ型中，POF发病率为17%～50%，PGADⅡ型中，POF的发生率为3.6%～7%，PGADⅡ型中包括自身免疫性Addison病、甲状腺自身免疫和胰岛素依赖型糖尿病，还有其他如白斑、秃顶、慢性萎缩性胃炎、恶性贫血等，这些综合征自然病程变化多端，在发病前后都有可能出现POF的症状，如Addison病，POF通常比肾上腺症状要提早发生。

二、卵巢早衰的临床表现

1、闭经分为原发闭经和继发闭经，继发闭经发生在40岁之前。通过对大样本的POF患者的调查发现闭经之前并没有特征性的月经异常的先兆。有的人是在规律的月经后突然闭经，有的是停避孕药或分娩以后闭经，有的则在闭经之前表现为月经周期及经期的紊乱。

2、不孕部分患者因不孕就诊而发现卵巢早衰。不孕是卵巢早衰患者就诊和苦恼的主要原因。有原发不孕和继发不孕，所以建议有卵巢早衰家族史者应尽早计划怀孕。

3、低雌激素症状原发闭经者低雌激素症状（潮热和/或性交困难等）少见（22.2%），如果有也大多与既往用过雌激素替代治疗有关，继发闭经者低雌激素症状常见（85.6%）。这与低雌激素症状是由雌激素撤退引起的理论相一致。这些低雌激素症状还包括萎缩性阴道炎和尿频、尿痛等萎缩性尿道炎。

4、伴发的自身免疫性疾病的表现如Addison病、甲状腺疾病、糖尿病、红斑狼疮、类风湿性关节炎、白癜风和克隆病等。另外还有肾上腺功能不全的隐匿症状，如近期体重的减轻、食欲减退、不明确的腹部疼痛、衰弱、皮肤色素沉着加重和嗜盐。

三、卵巢早衰的诊断

1967年，Moraes-Reuhsen提出凡40岁前出现闭经、围绝经期症候群或绝经期症状，低雌激素血症和高促性腺激素血症，可诊断为卵巢早衰。1973年Goldenberg提出血FSH³40IU/L即为高促性腺激素血症。但此后多个研究证实以单次FSH>40IU/L作为卵泡衰竭的证据是错误的。所以目前全世界公认的卵巢早衰的诊断标准为：（1）年龄<40岁。（2）闭经时间≥6个月。（3）两次（间隔1个月以上）血FSH>40mIU/mL。因此，卵巢早衰的诊断不难，更主要的是尽可能的明确引起卵巢早衰的病因，以指导临床治疗。

四、卵巢早衰的治疗

1、雌孕激素替代治疗（HRT）

雌孕激素替代治疗对于年轻的POF患者来说是非常重要的，即可以缓解低雌激素症状及泌尿生殖道萎缩（为赠卵胚胎移植作准备），又可以预防远期并发症（骨质疏松、老年性痴呆症等）、结肠癌的风险降低37%。但长期HRT也有一定的风险，如子宫内膜癌和乳腺癌的发生，但研究表明孕激素每月应用时间大于10天的雌孕激素替代治疗可使子宫内膜癌的风险几乎降至零，而乳腺癌的风险略有增加，但死亡率不增高。通常采用雌、孕激素序贯联合方案。在应用HRT之前，应进行个体化的利弊权衡，并进行必要的监测和随访。

2、预防骨质疏松

除HRT外，每天保证1200mg的钙的摄入。VitD400～800IU/天，进行必要的体育锻炼，如走路、瑜珈或太极等。

3、促排卵治疗

文献有很多关于对POF患者促排卵的成功经验的报道，治疗前筛选病人的条件大多是闭经时间短、血FSH水平不太高、临床判断为卵泡型POF等。一般用HRT或GnRHa抑制内源性促性腺激素（主要是FSH）至较低水平（<20IU/L）后，予足量hMG/hCG促排卵同时B超监测，要求hMG用量大、持续时间长。降调节能使促排卵成功的理论依据是降调节后内源性FSH水平降低，颗粒细胞表面FSH受体增多，增加了卵巢的敏感性。

4、免疫治疗

因免疫因素是卵巢早衰的一个肯定病因，所以对有免疫因素证据的这部分卵巢早衰患者进行免疫抑制治疗是有效的。有多个免疫抑制治疗发生妊娠的报道。到目前为止，还没有明确的方法鉴定免疫因素在POF中的作用，也没有明确的免疫治疗的指征和规范的用药方案，而免疫抑制治疗可引起严重副作用，所以临床上并不推荐盲目应用免疫抑制剂治疗POF。

5、DHEA治疗

DHEA50%由肾上腺皮质网状带分泌，20%由卵巢分泌，30%由外周DHEAS转化而来，体内每天产生6～8mg，血浓度为3～35nmol/L，其水平随年龄增长而降低。DHEA是合成雄烯二酮、睾酮、雌二醇的重要物质，DHEA的含量高低影响这些激素的水平。

6、赠卵胚胎移植术

1984年Lutjen等报道了世界第一例卵巢早衰卵母细胞赠送获得成活新生儿，为POF患者提供了获得生育的途径。到目前为止，赠卵胚胎移植对POF患者来说仍是获得妊娠的最有效的治疗。

7、卵巢移植

2004年10月Donnez J等首次报道一例人卵巢组织冻存后自体移植使卵巢功能恢复并分娩活胎。随后几年有多个卵巢冻存和移植成功并妊娠分娩的报道。

五、双歧杆菌及其功用

双歧杆菌（Bifidobacterium）是法国巴斯德研究院的Tissier在1899年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离出来的专性厌氧菌。根据双歧杆菌独有的形态，Tissier命名为双歧芽孢杆菌，并于1924年设置了双歧杆菌属。Mitsuok等根据糖代谢和血清实验将双歧杆菌划分为16个种，随后又有多个新的种被发现。到目前为止，已鉴别和发表的双歧杆菌共有34种，其中13种来源于人、15种来源于其他温血动物、3种来源于蜜蜂、2种来源于废水、1种从乳制品中分离。双歧杆菌是健康动物肠道内的优势菌种，其数量随年龄变化呈动态变化优势，其变化与机体内许多生理病理变化关系密切。双歧杆菌被认为是人类和其他温血动物包括反刍动物肠道中的关键微生物属，也是众所周知的一种肠道益生菌。目前，双歧杆菌已经成为人体健康的重要指标之一，有关双歧杆菌的微生态制剂的研究成为一大热点，并广泛应用于食品、保健和医疗等领域。有关双歧杆菌调节肠道菌群、抗肿瘤、降胆固醇以及延缓衰老的功能性研究更是国内外科研人员致力研究的重点。

现有研究表明，双歧杆菌具有调节肠道菌群、降胆固醇、抗肿瘤、延缓衰老、能促进某些矿物质如钙、铁、镁、锌等的吸收、改善乳糖不耐症、促进体内营养物质的消化吸收、促进蛋白吸收、保护肝脏等的功能。

在延缓衰老的研究中，研究证明双歧杆菌能明显增加血液中超氧化物歧化酶（SOD）的含量及其生物活性，有效促进机体内超氧化自由基发生歧化、封闭和降解，加速体内自由基的清除，将体内有害物质毒性降低90％，抑制血浆脂质过氧化反应，延缓机体衰老。双歧杆菌作为益生菌，脂磷壁酸（Lipoteichoicacid，LTA）是双歧杆菌发挥生理功能最重要的表面分子。双歧杆菌及其LTA具有全身性免疫赋活及延缓衰老的作用。Klotho基因是发现的一种新型与人类衰老密切相关的基因，王跃等利用Klotho基因缺陷的小鼠模拟出一系列与人类衰老相似的表型变化，以此来研究双歧杆菌LTA抗氧化作用，发现在D-半乳糖致小鼠衰老的同时给予双歧杆菌LTA，小鼠肾脏组织SOD活性明显升高，MDA含量明显下降，Klotho mRNA和蛋白表达均得到了增强，表明LTA可影响Klotho基因表达，同时增强肾脏组织的抗氧化能力，证实双歧杆菌LTA可以提高机体的抗氧化能力，延缓机体衰老。双歧杆菌LTA，还可延缓H₂O₂诱导的细胞衰老，Gorbunova等认为H₂O₂诱导的细胞衰老主要是由于DNA损伤引起。对DNA损伤所引起的反应细胞阻滞于G1期，双歧杆菌LTA则能够明显逆转细胞周期调节因子的变化，增强细胞周期的正向调节并抑制细胞周期的负向调节，从而发挥延缓细胞衰老的作用。

发明人在承担黑龙江省博士后基金二等资助项目——功能益生菌筛选及其诱导细胞凋亡机制研究（项目编号：LBH-Z15018）的医学实验、试验与实践中偶然发现，对原发性卵巢早衰患者给予双歧杆菌活菌胶囊预防，取得显著疗效。在进行规范、科学、严谨的临床试验与药效学实验后，得到了本发明的技术方案。

本发明的双歧杆菌活菌胶囊来源于市售或采用《医药化工》杂志1985年第16卷第4期上刊登的论文《双歧杆菌活菌胶囊制备和药理的研究》中所记载的方法制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种双歧杆菌活菌胶囊。

本发明的另一目的是提供双歧杆菌活菌胶囊在制备预防卵巢早衰、原发性卵巢早衰、卵巢囊肿、慢性肠炎、肠易激综合症、肠痉挛药物中的应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种双歧杆菌活菌胶囊在制备预防卵巢早衰药物中的应用。

所述的双歧杆菌活菌胶囊在制备预防卵巢早衰药物中的应用，该双歧杆菌活菌胶囊为双歧杆菌活菌胶囊片剂、双歧杆菌活菌胶囊胶囊、双歧杆菌活菌胶囊注射剂。

一种双歧杆菌活菌胶囊在制备预防原发性卵巢早衰药物中的应用。

一种双歧杆菌活菌胶囊在制备预防卵巢囊肿药物中的应用。

一种双歧杆菌活菌胶囊在制备预防慢性肠炎药物中的应用。

一种双歧杆菌活菌胶囊在制备预防肠易激综合症药物中的应用。

一种双歧杆菌活菌胶囊在制备预防肠痉挛药物中的应用。

附图说明：

附图1：空白对照组卵巢组织形态学特征（光学显微镜，×200）

附图2：免疫模型组卵巢组织形态学特征（光学显微镜，×200）

附图3：治疗组卵巢组织形态学特征（光学显微镜，×200）

附图4：预防组卵巢组织形态学特征（光学显微镜，×200）

具体实施方式：

实施例1：双歧杆菌活菌胶囊预防卵巢早衰的实验研究

1 材料

1.1 动物

10～12周龄雌性Wistar小鼠，体重18～22g，黑龙江中医药大学动物中心提供。动物合格证号：医动字第1024－03号。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。

1.2 药物与试剂

双歧杆菌活菌胶囊，由丽珠集团丽珠制药厂生产，国药准字S10960040。猪卵透明带（PZP），由沈阳市计划生育研究所制备。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（IFA），由上海源叶生物科技有限公司生产；雌二醇（E₂）放射免疫药盒，由天津九鼎医学生物工程有限公司生产；羊抗小鼠标记辣根过氧化酶IgG、底物TMB，由上海朗顿生物科技有限公司生产；3H-TdR，由上海创赛科技有限公司生产；ELISA试剂盒，由北京方程佰金科技有限公司生产。

2 方法

2.1 动物造模

每只小鼠两后脚掌和皮下多点注射PZP 10μg加CFA混合乳化液；每次免疫间隔12天，并且以PZP与IFA等量乳化加强免疫2次。缓冲液PBS代替PZP免疫作为正常空白对照组。

2.2 分组及给药

将第1次免疫后的小鼠随机分为3组，每组12只。

免疫模型组：不用药物。

POF预防组：在第1次免疫之前12天前就开始灌服双歧杆菌活菌胶囊内容物，在第1次免疫之后，继续灌服双歧杆菌活菌胶囊内容物，剂量为1g/10g。

POF治疗组：从第3次免疫后，开始灌服双歧杆菌活菌胶囊内容物，剂量为1g/10g。

另设正常空白对照组，12只。

2.3 生殖内分泌指标

在第3次免疫后12天摘眼球取血，并颈椎脱位处死小鼠，测定血清E₂含量。

2.4 免疫功能指标，同上法处死小鼠，留取脾脏、卵巢和血清。

2.4.1 自身免疫性卵巢炎组织形态学观察

收集的卵巢经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，在光学显微镜下计数黄体及各个时期滤泡数量。

2.4.2 血清抗透明带（ZP）抗体测定

ELISA方法测定。

2.5 统计学分析

计量资料行均数t检验；计数资料行χ²检验。

结果

3.1 灌服药物后生殖内分泌改变

3.1.1 各组E₂含量比较

实验结果，见表1。

表1 各组血清E₂含量比较 （±s）

注：与免疫模型组比较，**P<0.01；

实验结果显示，与免疫模型组比较，预防组E₂含量显著升高，有极显著性差异（P<0.01）。治疗组E₂含量与免疫模型组比较，也有一定的上升，但没有显著升高，不具有显著性差异（P＞0.05）。

3.1.2 自身免疫性卵巢组织炎形态学分析

实验结果，见表2。

表2 各组小鼠卵巢滤泡及黄体计数比较 （个，±s）

注：与免疫模型组比较，**P<0.01

实验结果显示，预防组黄体数目明显增加，与免疫模型组比较，具有极显著性差异（P<0.01）；生长滤泡受到破坏，但滤泡数量明显多于免疫模型组，与免疫模型组比较，具有极显著性差异（P<0.01）。而治疗组黄体数目也有一定的增加，但与免疫模型组比较，不具有著性差异（P＞0.05）；治疗组滤泡数量虽然略多于免疫模型组，但与免疫模型组比较，也不具有显著性差异（P＞0.05）。

光学显微镜下，免疫模型组见发育卵泡及成熟卵泡数明显减少，颗粒细胞排列紊乱，卵巢间质可见淋巴细胞浸润。预防组可见较多的生长卵泡和成熟细胞。而治疗组发育卵泡数较免疫模型组略有增加，但不明显。见附图1、附图2、附图3、附图4。

3.2免疫学改变

3.2.1各组血清抗ZP抗体效价比较

实验结果，见表3。

表 3 各组血清抗ZP抗体效价比较 （±s）

注：与免疫模型组比较，**P<0.01

实验结果显示，与免疫模型组比较，预防组抗ZP抗体效价明显下降，具有极显著性差异（P<0.01）。表明预防组抗体水平比免疫模型组明显降低。治疗组抗ZP抗体效价也有一定的下降，但下降幅度较低，与免疫模型组比较，不具有著性差异（P＞0.05）。

结论

双歧杆菌活菌主要通过抑制特异性免疫损伤作用，可以使卵巢内残存的少量的滤泡能得以保护，进而逐步恢复部分卵巢功能，但此功能仅仅在预防方面有一定作用，在卵巢功能已经造成衰竭后，双歧杆菌活菌在治疗卵巢衰竭方面则基本上是无效的。

实施例2：双歧杆菌活菌胶囊治疗卵巢嚢肿的实验研究

1材料

1.1试验动物

SPF级健康成年雌性wistar大鼠48只，二月龄，体重（200±10)g，黑龙江中医药大学动物中心提供。动物合格证号：医动字第1024－03号。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。

1.2药物及制备

双歧杆菌活菌胶囊，由丽珠集团丽珠制药厂生产，国药准字S10960040。制成每毫升含1g的药液，置冰箱内4°C保存。

阳性对照药：桂枝茯苓胶囊：江苏康缘药业股份有限公司生产，制成每毫升含1g的药液，置冰箱内4°C保存。

1.3主要试剂

10%水合氯醛、10%芥子油、石蜡油、注射用生理盐水、医用碘伏。手术器械一套。

1.4主要器材

冰冻切片机：沈阳誉德电子仪器公司专业生产。性激素试剂盒：上海瓦兰生物科技有限公司生产；IL-6ELISA：武汉博士德生物工程有限公司生产。全自动化学发光仪：北京科美生物技术有限公司生产。

方法

2.1试验分组

动物随机分为4组，每组12只。分别为正常组、模型组、桂枝茯苓胶囊组、双歧杆菌活菌胶囊组。

2.2造模方法

参照人民卫生出版社的《实用妇产科学》所述方法，致备大鼠“卵巢囊肿”模型，采用10%水合氯醛腹腔（0.5/100g）注射麻醉后，使大鼠呈仰卧位，固定于解剖台上，下腹正中剃去鼠毛并常规消毒，于下腹正中作1.3cm长且垂直方向的切口，切口下端上方0.5cm处为耻骨联合，在此处分离组织和包绕的脂肪团，经膀胱后侧找到输卵管，顺着输卵管壶腹部找出左侧卵巢，按0.1mL10%的芥子油（95%的芥子油用石蜡油稀释）注入卵巢，用软蜡将注射针眼封住，防止药液外溢。分层缝合手术切口，最后消毒切口，将白鼠放回笼中。一般注射芥子油2.5h后会造成脏器的急性充血水肿，出现炎症反应形成囊肿。在注射2.5h后摘取大鼠左侧卵巢，经10%甲醛固定48h、酒精梯度脱水后，进行15μm的冰冻切片制作，进行HE染色。在低倍镜下观察两组卵巢的形态，可看到注射芥子油后大鼠的卵巢明显的充血、水肿。以卵巢囊肿>10mm为造模成功。

2.3给药方法

造模成功各组随机分配完成即开始给药。双歧杆菌活菌胶囊组灌服双歧杆菌活菌胶囊，相当于含药物50g•kg^-1•d^-1；桂枝茯苓胶囊组灌服等容积的桂枝茯苓胶囊混悬液；正常组和模型组灌以等容积的生理盐水。各组均按0.5mL•10g^-1•d^-1灌胃。1次/d，连续5周。

2.4取材方法

分组完成后，即将大鼠断尾取血，放入标记清楚的EP管中。灌胃5周后采用同样方法取血。来测定每组处理前后大鼠血液中IL-6和、雌二醇、孕酮的含量。

2.5统计学处理

所测得数据采用统计软件SPSS 11.0进行分析，计量资料采用（±s)进行统计描述。经方差齐性检验后，各组之间进行方差F分析。组间比较用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

结果

实验结果见表4。与正常对照组比较，模型组中的IL-6和、雌二醇、孕酮的含量明显升高（P<0.05）。经桂枝茯苓胶囊治疗后，与模型组比较，IL-6、雌二醇、孕酮在大鼠血液中的含量均有所降低（P<0.05）；经双歧杆菌活菌胶囊治疗后，与模型组比较，IL-6、雌二醇、孕酮在大鼠血液中的含量略有降低，但无显著性差异（P＞0.05）。

表4治疗前后各组大鼠血清中IL-6、雌二醇、孕酮的含量（pg/mL)

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

4 结论

本实验研究显示，双歧杆菌活菌胶囊不能减轻卵巢囊肿病灶炎性粘连及纤维化，对卵巢囊肿生长没有明显的抑制作用，不能明显促使囊肿萎缩。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种双歧杆菌活菌在制备预防卵巢早衰药物中的应用。

2.根据权利要求1所述双歧杆菌活菌在制备预防卵巢早衰药物中的应用，其特征在于所述双歧杆菌活菌在制备预防原发性卵巢早衰药物中的应用。

3.根据权利要求1所述双歧杆菌活菌在制备预防卵巢早衰药物中的应用，其特征在于所述药物为双歧杆菌活菌胶囊或双歧杆菌活菌散。