CN103599129A - 一种人干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明为一种人干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途。由包含离体的人干细胞和生理盐水组成的所述干细胞组合物配置成的体积为10～80ml的干细胞悬液，每份所述干细胞悬液中含有的人干细胞的数量为1～8×10⁸个。本发明可通过静脉注射进行阿尔茨海默症的治疗。静脉输入安全可靠，操作性强，副作用小，干细胞可以通过血液循环到达细胞受损部位。

Description

一种人干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种人干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物的用途，进一步地说，是涉及一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途。

背景技术

阿尔茨海默症是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。该病多起病于老年期，潜隐起病，病程缓慢且不可逆，临床上以智能损害为主。起病在65岁以前者旧称老年前期痴呆，或早老性痴呆，多有同病家族史，病情发展较快，颞叶及顶叶病变较显著，常有失语和失用。

该病通常起病隐匿，为特点性、进行性病程，无缓解，由发病至死亡平均病程约8－10年，但也有些患者病程可持续15年或以上。阿尔茨海默症的临床症状分为两方面，即认知功能减退症状和非认知性精神症状。常伴有高级皮层功能受损，如失语、失认或失用和非认知性精神症状。根据疾病的发展和认知功能缺损的严重程度，可分为轻度、中度和重度。

轻度

1、轻度语言功能受损；

2、日常生活中出现明显的记忆减退，特别是对近期事件记忆的丧失；

3、时间观念产生混淆；

4、在熟悉的地方迷失方向；

5、做事缺乏主动性及失去动机；

6、出现忧郁或攻击行为；

7、对日常活动及生活中的爱好丧失兴趣。

中度

1、变得更加健忘，特别常常忘记最近发生的事及人名；

2、不能继续独立地生活；

3、不能独自从事煮饭、打扫卫生或购物等活动；

4、开始变得非常依赖；

5、个人自理能力下降，需要他人的协助，如上厕所、洗衣服及穿衣等；

6、说话越来越困难；

7、出现无目的的游荡和其他异常行为；

8、在居所及驻地这样熟悉的地方也会走失；

9、出现幻觉。

重度

1、不能独立进食；

2、不能辨认家人、朋友及熟悉的物品；

3、明显地语言理解和表达困难；

4、在居所内找不到路；

5、行走困难；

6、大、小便失禁；

7、在公共场合出现不适当的行为；

8、行动开始需要轮椅或卧床不起。

阿尔茨海默症给患者带来了很大的痛苦，现有技术的治疗方法主要包括：

1.改善胆碱神经传递药物

老年痴呆的一个主要原因是胆碱不足，导致患者记忆减退、定向力丧失、行为和个性改变等。因此，具有增强胆碱能作用的药物在老年痴呆症的治疗方面发挥了重要作用。目前常用的4种是乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括他克林，安理申，艾斯能，加兰他敏（另外一种是N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，盐酸美金刚）。

此类药物的主要副作用为肝毒性，静注过快可引起头痛、晕眩、乏力、视力模糊、恶心及心动过速，剂量过大有可能导致癫痫样发作、抽搐、呼吸抑制。

2.改善脑血液循环和脑细胞代谢的药物

老年痴呆患者存在糖、蛋白、核酸、脂质等代谢障碍，同时其脑血液流量及耗氧量明显低于同龄正常人。因此，脑代谢激活剂和脑循环改善剂，尤其是具有脑血管扩张作用的脑代谢激活剂成为老年痴呆治疗的一大类可供选用的药物。此类药物如脑复康、都可喜、喜得镇、己酮可可碱、脑通等。

此类药物的主要副作用为多有消化道系统反应和肝肾功能损害等不良反应。

3.钙拮抗剂

此类药物易于通过血脑屏障，选择性扩张脑血管，减少因钙离子内流造成的神经细胞损伤或死亡，从而改善记忆和认知功能。

此类药物的副作用和不良反应较多，一般包括体位性低血压，心动过速，头痛，多尿，便秘，心动过缓或传导阻滞，抑制心肌收缩力，皮疹和过敏反应等。

4.激素类药物

使用雌激素治疗老年痴呆症可以缓解女性患者的症状，并可以延缓或防止患者病情发展。研究认为，雌激素的这方面作用与其抗氧化，减少淀粉样蛋白沉积对细胞的损伤，促进神经元的修复，防止神经细胞死亡等有关。加拿大研究人员发现，男性睾丸素可以用来治疗包括老年痴呆症在内的多神经退化性疾病。

激素有少量高效的特点，因此临床使用需严格控制用量，如过量会导致内分泌失调，情绪失控等症状。激素类药物日常应用不便，需要在医生指导下应用，且长时间应用易产生依赖性。

5.非甾体抗炎药物

经常服用阿斯匹林或消炎镇痛药物的老年人患老年痴呆和认知障碍的危险性明显降低。小剂量阿司匹林可以减少老年痴呆症恶化。这是因为阿司匹林具有增强脑血流量，防止血液凝固的作用。此外，正在研究的非甾体抗炎药布洛芬、双氯芬酸、奈普生等都有可能成为治疗老年痴呆症的有效药物。

此类药对胃肠道及肾脏的副作用较大。

6.自由基清除剂和抗氧剂

有人利用具有自由基清除作用的银杏叶提取物EGB—761治疗老年痴呆患者，发现有明显的认知功能改善作用。维生素E是重要的抗氧化剂，具有自由基代谢的神经保护作用，还可能通过抑制和清除脑内β-淀粉样蛋白沉积，产生延缓衰老的作用。其它自由基清除剂还有，退黑素、姜黄素、去铁敏、艾地苯醌、甲磺酸替拉扎特等。维生素C具有清除自由基、抗氧化作用，能够稳定细胞膜。

该类药物需长期定时服用，阿尔茨海默病患者短期记忆严重缺失，难以做到按时服用，需要家人给予长期照顾和帮助。

7.毒蕈碱受体激动剂

高剂量服用毒蕈碱M1受体激动剂占诺美林，可明显改善老年痴呆患者的认知功能和动作行为能力。

但由于该药在胃肠及心血管方面的严重副作用，许多患者不能继续治疗。

综上所述，所有现有技术的治疗阿尔茨海默症的药物都存在这样那样的毒副作用。因此开发一种全新的、既能治疗阿尔茨海默症、而又能避免上述种种副作用的药物，已成为该领域亟待解决的一个课题。

发明内容

本发明的目的，就是为了克服现有技术的缺陷，提供一种人干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途。

关于本文中有关干细胞的相关术语定义如下：

1.干细胞组合物：为本申请人的专利申请（201210017987.9）中提到的2-4mm厚的油状干细胞层（详见其说明书中干细胞制备过程）；

2.干细胞悬液：为该油状干细胞层经生理盐水清洗及稀释后得到的悬液，定容为10-80ml；

3.干细胞悬液的稀释液：由于悬液中的干细胞数量多，易吸附成团，为了防止静滴时不能通过滤网，因此静滴前需再用100ml的生理盐水进一步稀释，即得到干细胞悬液的稀释液，此时的总容量为110-180ml。

注：自始至终，干细胞的数量并未发生变化，即溶质为定量，只是增加了生理盐水的量，即溶剂为变量，因此溶液的量也随之变化，即有了三种不同的称呼。若不同，也只是溶液的密度不同，由于起效成分为干细胞，因此生理盐水的多少并不会影响治疗的效果。

干细胞是一类具有自我更新，高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，被医学界称为“万用细胞”。

本发明就是基于干细胞具有的细胞替代作用，将干细胞植入体内后，能自动识别并移行至细胞损伤部位，然后分裂增殖成新的细胞，替代受损或病变细胞行使其功能。干细胞可于患病部位建立侧支循环，改善局部血供，修复受损细胞。

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，而干细胞具有细胞替代作用，干细胞植入体内后，能自动识别并移行至细胞损伤部位，然后分裂增殖成新的细胞，替代坏死的神经细胞行使其功能。干细胞可于缺血病变部位的周围建立侧支循环，恢复血运，修复受损的脑神经细胞，进而逐渐恢复大脑功能。

另外，由于干细胞具有增殖和定向分化的能力，当干细胞被趋化至脑细胞损伤局部后，其中部分细胞分泌大量小分子物质，趋化受体干细胞，可促进细胞增殖并定向分化，完成大脑皮层功能的修复。而且干细胞能释放多种生物活性物质，如可以释放膜微粒，趋化并调节周围细胞的功能活性，唤醒处于休眠期的组织细胞，促进其发挥其生物学特性；另由于其具有的免疫调节作用，可增强人体的免疫机能和修复受损的免疫系统，降低机体炎症反应，从而预防各种免疫因素及感染所致的相关疾病。

本发明的人干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途是这样实现的：

本发明所述的人干细胞选自人类骨髓、脐带血或外周血干细胞；

所述的干细胞组合物为按照本申请人的申请号为201210017987.9、名称为“一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法”中的干细胞分离方法步骤（3）得到的“存在于整个离心管中间位置的约（2-4）mm厚的油状干细胞层”；

每份所述干细胞组合物经（10-80）ml生理盐水清洗及定容后，得到含有的人干细胞的数量为（1～8）×10⁸个的干细胞悬液；

每份所述的干细胞悬液在使用前再用100ml的生理盐水进一步稀释，得到干细胞悬液中的个数密度为（0.125～8）×10⁷个/ml、总容量为110-180ml的干细胞悬液的稀释液。

在具体实施中，所述的用途采用以下方法实现：

所述的干细胞悬液的稀释液通过体表浅静脉进行静脉点滴法注射到人体。

所述的静脉点滴法的步骤为：

（1）先用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲管；

（2）接着开始静脉点滴注射输入干细胞悬液的稀释液，保持20-30滴/分钟，半小时后无不良反应可增加到30-50滴/分钟，细胞输入过程中每15分钟轻轻晃动装有所述干细胞悬液的稀释液的细胞保存袋一次；

（3）细胞输入完毕后用0.9%的氯化钠溶液20ml冲入细胞保存袋中轻轻晃动，再用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲净即可将输液器中细胞冲净，得到的冲洗液也同样注入患者体内，以保证细胞输入的数量；

静滴时将细胞液摇匀，避免细胞贴壁。

所述的人干细胞优选为人类脐带血干细胞。

当用所述干细胞组合物用于治疗阿尔茨海默症选择静脉输入治疗时，由于干细胞具有增殖和定向分化的能力，当干细胞被趋化至脑细胞损伤局部后，其中部分细胞分泌大量小分子物质，趋化受体干细胞，可促进细胞增殖并定向分化，完成内膜结构和功能的修复。而且干细胞能释放多种生物活性物质，如可以释放膜微粒，趋化并调节周围细胞的功能活性，唤醒处于休眠期的组织细胞，促进其发挥其生物学特性；另由于其具有的免疫调节作用，可增强人体的免疫机能和修复受损的免疫系统，降低机体炎症反应，从而预防各种免疫因素及感染所致的相关疾病。同时静脉输入安全可靠，操作性强，副作用小，干细胞可以通过血液循环到达细胞受损部位。

综上所述，本发明的优点在于：

1.临床使用安全，内毒素﹤1EU，符合国家药典规定的注射用标准。

2.获取的细胞悬液体积小，可按医生的需求配成临床治疗所需剂量。

3.静脉输入安全可靠，操作性强，治疗损伤小，副作用小，干细胞可以通过血液循环到达细胞受损部位。

4.另外使用本申请人的申请号为201210017987.9、名称为“一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法”的方法制得的人造血干细胞，还具备以下优势

（1）含有多种细胞因子，能够使干细胞快速准确的到达受损部位，并辅助其发挥生物学活性；

（2）细胞数量大，特别是由人脐带血分离提取的纯化干细胞，每份脐带血（80ml左右）分离出的干细胞数量皆可达到10⁸以上；

（3）细胞种类全，分离全部的红细胞，血小板，血浆物质，去除部分成熟白细胞，淋巴细胞，纯化有核细胞，保留所有干细胞；

（4）细胞活性强，采自人体新鲜活细胞，经分离纯化后获取干细胞。细胞活性达96%以上。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

实施例1

用于治疗阿尔茨海默症的干细胞悬液的制备。

无菌纱布蘸75%的酒精，擦拭所有操作过程中所需物品及操作台。（本操作中所涉及消毒步骤皆用75%酒精的无菌纱布擦拭，以下简称消毒）

1，将50mL含有枸橼酸钠的脐带血血袋消毒，导入50mL1号液瓶中。将50mL2号液全部倒入1号液瓶中，盖紧瓶盖，充分摇匀。将1号液瓶置于超净台，松动瓶盖后静置20-30min，待分层。12支离心管拆封，备用。

2，取3号液，消毒外壁，开盖，用新移液管取25mL3号液置于50mL新离心管中，一共移取3次，得到3支有试剂3号液的离心管，备用。

3，取步骤1静置20-30min后的试剂1号液瓶中的上层液，用移液管移取分别置于离心管中每只45mL，盖紧盖置于离心机中设置速度为2500转时间为5分钟温度为5℃。从离心机中取出离心管，消毒，开盖，弃上清液。

4，取新移液管，移取0.9%NaCl分别加入到离心管中至10mL处，摇匀，得细胞混合液备用。取步骤2下装有3号液的离心管，缓慢加入刚刚制备的细胞混合液，保持细胞混合液悬浮于3号液表面，加至45ml，轻放至试管架，即得到3支具有分层液的离心管，置于离心机中，设置速度为1800转，时间为30分钟，温度为5℃。

5，从离心机中轻取出离心管，保持液面平稳，消毒，开盖，用一次性胶头滴管吸取离心管中间的絮状液体，收集置三支新离心管中，用移液管加入0.9%NaCl至45ml处，摇匀，配平，离心，设置速度为2000转时间为5分钟温度为5℃（注：第一次清洗）。

6，取出具有细胞液的离心管，消毒，开盖，弃上清液后，用注射器先加入少量0.9%NaCl，摇匀后吸取至一支试管内，加入0.9%NaCl至45ml处，再摇匀，配平，离心，速度为1800转，时间为5分钟温度为5℃（注：第二次清洗）。

7，取出具有细胞液的离心管，消毒，开盖，弃上清液，用注射器先加入少量0.9%NaCl，摇匀后加入0.9%NaCl至45ml处，再摇匀，配平，离心，设置速度为1600转时间为5分钟温度为5℃（第三次清洗）。

8，取出具有细胞液的离心管，消毒，开盖，弃上清液后加入0.9%NaCl至所需要稀释刻度处摇匀，用微量定量移液器取10ul用于细胞计数，其余细胞液密封，置于冰桶内待用。

实施例2

药理实验，脐带血干细胞悬液的一般药理学实验

1材料

1.1动物：KM小鼠体质量18～22g，雌雄各半。健康杂种家犬，体重12～18kg，雌雄皆用。动物饲养于SPF级实验动物实验室条件下，室内温度19～22℃，相对湿度40%～50%，给予全价颗粒饲料，自由摄食、饮水。

1.2药物：人类脐带血干细胞悬液，其中干细胞含量为8×10⁷个/ml。

1.3上海欣曼公司SYS-G型小鼠自主活动测频仪，美国BIOPAC公司RM-6000型多导生理记录仪。

2试验方法

2.1对精神神经系统的影响

2.1.1对小鼠一般外观行为的影响：取小鼠80只，随机分为四组，每组20只，雌雄各半，给药组分设0.5、1.0、2.0ul/kg三个剂量组，对照组给予5%葡萄糖注射液，均按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药，给药后10min，观察小鼠的一般行为表现，步态、姿势、肌肉紧张度、瞳孔变化、流涎、二便、皮毛等，同对照组比较，了解受试药对动物的影响。

2.1.2对小鼠协调运动的影响：分组及给药同前，采用倾斜板法，于给药前及给药后10min、30min及60min各进行一次测定，计算各组小鼠从木板上跌落的百分率，按简化直接法统计。

2.1.3对小鼠自主活动的影响：小鼠80只，分组及给药同前，于尾静脉注射给药后10min，置小鼠于自发活动测定仪中，稳定5min后，测定10min内自主活动次数，用组间t检验进行统计处理。

2.2对呼吸系统及心血管系统的影响

家犬6只，雌雄各半，用戊巴比妥钠30mg/kg，静脉注射麻醉后，背位固定，分离右颈总动脉，插管连接TP—101型压力转换能以多导生理记录仪记录收缩压，舒张压及平均动脉压；以针形电极刺入四肢皮下记录Ⅱ导联心电图，以立位转换能器连接胸骨记录呼吸频率及幅度。实验设0.5、1.0、2.0ul/kg三个剂量组，对照组用5%葡萄糖注射液，给药容积为1ml/kg，由股静脉插管给药，注射速度为30s，分别在静脉注射给药后1、2、5、10、15、20及30min时记录上述各项指标，观察脐带血干细胞悬液对呼吸，心电及血压的作用，用t检验法进行用药前后显著性检验分析。

3结论

3.1对小鼠一般行为表现的影响：实验各组动物在用药后60min内的一般行为，步态、肌紧张度、活动、饮食、皮毛及二便，均无显著变化，未见有瞳孔大小改变，竖毛、倦伏、流涎等异常症状，同对照组相比，差异无统计学意义。

3.2对协调运动的影响：各组动物于给药前及给药后各观测点的跌落率均为0，表明在实验所用0.5、1.0、2.0ul/kg剂量下对小鼠协调运动无明显影响。

3.3对小鼠自主活动的影响：脐带血干细胞悬液各剂量组对小鼠自主活动的影响见表1。

表1对小鼠自主活动的影响

注：与对照组比较P＞0.05。

从表1结果可见：实验组1.0、2.0ul/kg剂量时，活动次数略有减少，但同对照组比较，差异并无统计学意义，表明脐带血干细胞悬液对小鼠自主活动无明显影响。

3.4对呼吸系统的影响：静脉注射各剂量后，分别在不同时间点描记呼吸频率及幅度的变化，结果见表2。

表2对麻醉犬呼吸频率及幅度的影响

注：对照组和实验组与用药前比较P均＞0.05。

从表2结果可见：用药组在0.5、1.0ul/kg剂量时静脉注射对麻醉犬各时间点的呼吸频率及幅度均无明显作用，在2.0ul/kg剂量时，频率及幅度均略有增加，但同对照组相比，差异无统计学意义。表明脐带血干细胞悬液对犬的呼吸系统无显著影响。

3.5对心血管系统的影响：结果见表3、4。

表3对麻醉犬平均动脉压的影响(KPa)

注：与用药前比较P＞0.05。

表4对麻醉犬心率的影响（次/min）

注：与用药前比较P＞0.05。

表3、4结果表明：脐带血干细胞悬液静脉注射1.0、2.0ul/kg时，对麻醉犬的心率计平均动脉压无明显作用，同对照组及用药前相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)，表明脐带血干细胞悬液在本剂量时无心血管刺激作用。

表5对麻醉犬Ⅱ导联心电图（ECG）的影响

从表5结果可见：静脉注射脐带血干细胞悬液0.5、1.0、2.0ul/kg计量时，对麻醉犬心电图无明显作用，其各波间隔时间及电压振幅均在正常范围内波动，用药前后及用药组同对照组相比，均未发现差异有统计学意义，表明脐带血干细胞悬液在本实验所用剂量下，对麻醉犬的心电图无影响。

4结论

脐带血干细胞悬液的临床用药途径多为静脉滴注。故在本实验研究中，采用了与临床用药途径相同的静脉给药方式。当剂量分别为0.5、1.0、2.0ul/kg时，对小鼠的一般行为、协调运动及自主活动均无明显作用，表明本品对神经系统无明显影响。0.5、1.0及2.0ul/kg剂量时，对麻醉犬的呼吸次数和呼吸幅度无影响，对麻醉犬的血压亦无明显影响。在0.5、1.0及2.0ul/kg剂量时，对麻醉犬的心率、收缩压、舒张压及平均动脉压皆无明显影响。表明脐带血干细胞悬液静脉滴注的安全性较高。

实施例3

脐带血干细胞悬液的急性毒性实验

一、材料

A.啮齿类动物组：SD大鼠，周龄6～9周，体重180～240g

1、实验组：大鼠60只（雌雄比例1:1）

2、空白对照组：大鼠20只（雌雄比例1:1）

B.非啮齿类动物组：Beagle犬，月龄6～10个月，体重8～15kg。

1、实验组：犬30只（雌雄比例1:1）

2、空白对照组：犬10只（雌雄比例1:1）

C.药物：人类脐带血干细胞悬液，其中干细胞的含量为8×10⁷个/ml。

二、方法

1、给药途径：静脉注射

2、给药剂量（起始剂量，中间剂量，最大剂量）：

A组：a、大鼠2.5ml/kg b、大鼠5.0ml/kg c、大鼠10.0ml/kg

B组：a、犬1.25ml/kg b、犬2.5ml/kg c、犬5.0ml/kg

三、观察方法

给药后2h同时观察各组观察动物反应，以后每天上、下午各观察一次，连续观察15天。

指标：观察一般指标（见下表6），动物死亡情况，体重变化。

表6急性毒性实验结果

注：1.实验组大鼠偶发呼吸急促(1/20)，给药后30min出现，持续2min。

2.实验组大鼠自发活动增多（3/20），表现为神经系统兴奋状态，给药后3～15天间歇性出现。

3.实验组Beagle犬自发活动增多（2/20），表现为神经系统兴奋状态，给药后7～14天间歇性出现。

4.空白对照组大鼠出现困倦（2/20），表现为偶尔昏睡，正常饲养第8～13天间歇性出现。

5.空白对照组Beagle犬出现困倦（1/20），表现为偶尔昏睡，正常饲养第9～11天间歇性出现。

6.实验组Beagle犬出现小微血管扩张（1/20），表现为舌、耳、结膜、阴囊发红，体热等。给药后5～13天出现。

四、实验结果

参与实验的大鼠及Beagle犬在实验周期内皆未出现死亡，体重稍有增加，大鼠平均增加10～15g，犬平均增加400～900g，实验组与空白对照组相比无明显差别。除最大剂量组及空白对照组出现阳性表现外，其余各组均为出现有意义的阳性体征，现以表格形式记录如下，症状阳性表现用“+”表示，阴性表现用“—”表示，并记录了阳性表现的出现比例及起始时间（详见下表及注释）。实验结束后对全部实验动物进行大体解剖，其组织器官的体积，颜色，质地均未见异常。

五、结论

1、最高剂量下，A组实验组大鼠偶发的呼吸急促，且持续时间很短，考虑可能与该大鼠心肺功能不全有关。A组实验组3只大鼠及B组实验组2只犬在给药后分别出现了间歇性的自发活动增加，探究，梳理毛发，运动增加，考虑是由于干细胞增殖，增加了神经细胞的数量，刺激中枢神经系统使其表现为兴奋状态。另有A组空白对照组2只大鼠及B组空白对照组1只犬出现昏睡状态，但易警醒而恢复正常活动，睡眠中枢短暂受到抑制，考虑可能与饲养环境较封闭，运动减少，通风不良有关。B组实验组1只犬出现体表微血管扩张，微循环加快，考虑为心输出量增加，或局部环境温度过高所致。

2、由起始剂量到中间剂量均未出现有意义的阳性表现，说明脐带血干细胞悬液作用于动物的安全性高，最高剂量下偶发中枢神经兴奋，说明其不良反应少，受试物安全范围为大鼠0～5.0ml/kg，犬0～2.5ml/kg，毒性反应小，对心脑肺等重要器官基本无不良影响，并且短时间内可恢复正常。

实施例4

脐带血干细胞悬液长期毒性实验

1材料

1.1动物：采用SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量80～90g。动物饲养于SPF级实验动物实验室条件下，室内温度19～22℃，相对湿度40%～50%，每笼6只动物，给予鼠全价颗粒饲料，自由摄食、饮水。

1.2药物：人类脐带血干细胞悬液，其中干细胞的含量为8×10⁷个/ml。

2方法

2.1分组与给药

将脐带血干细胞悬液每日上午以最大剂量2.0ul/kg尾静脉注射给药1次，对照组注射等剂量的蒸馏水，每周称1次体重并记录摄食量，根据体重的变化重新计算给药量。根据急性毒性试验、药效学试验结果确定脐带血干细胞悬液高剂量组2.0ul/kg、中剂量组1.0ul/kg、低剂量组0.5ul/kg。

2.2观察指标

2.2.1一般观察给药期间，观察动物的外观，行为活动，饮食、粪便及被毛的情况，并记录体质量(每周称重1次)、进食量、进水量。

2.2.2血液学检查采用美国雅培CD-1200型全自动血球记数仪，测定红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、红细胞压积容量(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、淋巴细胞数目(LYM)、单核细胞数目(MID)、粒细胞数目(GRA)、红细胞分布宽度(RDW)、血红蛋白(HGB)。

2.2.3血液生化检测采用日本日立7610型自动仪，测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、总胆红素(TB)等。

2.2.4系统尸解及脏器系数全面细致观察每只动物的脏器，并称量每只动物的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑等，并计算脏器系数。

3结果

3.1脐带血干细胞悬液对大鼠血液学指标的影响结果见表7～8。

3.2脐带血干细胞悬液对大鼠血液生化学指标的影响结果见表9～10。

3.3脐带血干细胞悬液对大鼠脏器系数的影响结果见表11。

表7脐带血干细胞悬液对给药180d末期大鼠血液学指标的影响

表8脐带血干细胞悬液对停药15d后大鼠血液学指标的影响

表9脐带血干细胞悬液对给药180d末期大鼠血液生化学指标的影响

表10脐带血干细胞悬液对停药15d后大鼠血液生化学指标的影响

表11脐带血干细胞悬液对给药180d末期大鼠脏器系数的影响

4结论

大鼠长期毒性实验以3个剂量(即2.0，1.0，0.5ul/kg)连续给药6个月及停药2周后，对大鼠一般状况、体质量增长无明显影响;血液学指标及血液生化学指标均在正常范围内，对大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器重量，脏器系数与对照组比较均无显著差异，并对大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、子宫等重要脏器进行组织检查也未见明显病理改变。故本实验结果提示脐带血干细胞悬液在大鼠6个月长期毒性实验中，未发现明显的毒性反应及延迟性毒性反应，可以安全地应用于临床。

实施例5

脐带血干细胞悬液静脉注射对血管刺激性、溶血、过敏性实验

1材料

1.1人类脐带血干细胞悬液，其中干细胞的含量为8×10⁷个/ml。

；5%葡萄糖注射液；甲醛；白蛋白；牛血清白蛋白；白百破三联疫苗；伊文思兰。

1.2受试动物日本大耳白家兔，体重2～3kg，雌雄兼用；荷兰豚鼠，体重200～250g，雄性。SD大鼠，体重180～220g，雄性。

2方法

2.1血管刺激性实验

实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22～24℃，湿度40%～60%，取家兔3只，右侧耳缘静脉以无菌操作方法注射量为8.3ml/kg（注：由于该系列实验涉及到受试物的耐受性，因此选用干细胞悬液范围中的最大浓度进行试验。）的脐带血干细胞悬液，左侧耳缘静脉注射等体积5%葡萄糖注射液，1次/d，连续给药5d。上述两组均分别于末次给药后96h，肉眼观察注射部位有无红肿、充血等刺激现象，处死动物，以耳缘静脉注射点至向心方向，连续取3段血管连同周围组织，每段1cm，用10％甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切5μm薄片，HE染色，光镜下做组织学检查，另一侧对照血管也同法处理。

2.2溶血实验

2.2.12％兔红细胞混悬液制备取健康家兔1只，自心脏取血约20ml，置于三角瓶中，用玻璃棒搅拌，除去纤维蛋白，然后将血移入刻度离心管内，加入生理盐水10ml，混匀后离心5min（2000～2500r/min），去除上清液，再加生理盐水混匀离心，反复洗涤3～4次，至上清液无色透明，将所得红细胞按其容积用生理盐水稀释成2%的混悬液。

2.2.2方法取干净试管7支，编号排列于试管架上，按配比量依次加入2%兔红细胞混悬液和生理盐水，混匀后，置于37℃恒温箱中30min，然后于1-5管中加入不同量的干细胞悬液，分别为1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6号管中加入1ml生理盐水，7号管中加入1ml溶血素。（第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管），摇匀，置37℃恒温箱中进行温育，观察15，30，45min，1，2，3，24h有无溶血及凝集情况。

结果判定：

全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留。

部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留。

无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。

凝集：虽不溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不能分散。

2.3全身主动过敏实验

实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22～24℃，湿度40%～60%，取48只健康雄性豚鼠，随机分成5％葡萄糖注射液组、阳性药物组（白蛋白组）、脐带血干细胞悬液大剂量组、小剂量组，每组12只。分别给各组豚鼠隔日腹腔注射5％葡萄糖注射液、白蛋白25mg/kg，脐带血干细胞悬液4，16ul/kg，体积为0.5ml，共注射3次，然后每组内分成两批，于第1次给药后14d及21d分别静脉注射5％葡萄糖注射液、白蛋白50mg/kg，脐带血干细胞悬液16，64ul/kg，体积为1ml，观察豚鼠在静脉注射后30min内有无表12中的躁动、搔鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、甚至死亡等过敏反应症状。

表12过敏反应症状

2.4被动皮肤过敏实验

2.4.1大鼠含IgE的抗血清制备取4只健康雄性SD大鼠，按注射剂大鼠同种被动皮肤过敏试验的要求，分别腹腔注射5%葡萄糖注射液、牛血清白蛋白25mg/kg，脐带血干细胞悬液4，16ul/kg，同时腹腔注射白百破三联疫苗1ml/只，隔日1次、共3次。11d后眼眶取血，分离血清，－20℃保存，备用。

2.4.2大鼠同种被动皮肤过敏反应实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22～24℃，湿度40%～60%，取16只健康雄性SD大鼠，随机分为5%葡萄糖组、阳性组（牛血清白蛋白组）、脐带血干细胞悬液大剂量组和小剂量组。分别在各组大鼠背中线两侧距脊柱约1.5cm处备皮，4cm×4cm。

取上述含IgE的抗血清，用5%葡萄糖注射液按1∶2，1∶4，1∶8，1∶16比例分别稀释成4个稀释度，将稀释的抗血清按逆时针方向（左上-左下-右下-右上）皮内注射于大鼠背部预先备皮部位，每一稀释度注射一个点，每点注射0.1ml。致敏24h后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0.8％伊文思兰染料共1ml，进行激发。30min后处死各组大鼠，测量皮肤内层的蓝色反应斑直径，直径大于5mm者判定为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和。

3结果

3.1血管刺激性实验：给药组3只家兔耳缘静脉注射部位均未见红肿、充血等刺激现象。光镜病理组织学检查：脐带血干细胞悬液给药组和5％葡萄糖对照组家兔耳缘静脉注射部位血管结构完整，血管内皮细胞无肿胀、变性、坏死，管壁无炎细胞浸润，管腔内无血栓形成。

3.2溶血性实验：在0.25～3h及24h内除第7管（阳性对照管）溶液呈现澄明红色，其余6管均末见澄明红色，且红细胞全部下沉，上层液体无色澄明，经振摇后红细胞能均匀分散。表明脐带血干细胞悬液无溶血及无凝集作用。

3.3全身主动过敏实验：5％葡萄糖注射液组、脐带血干细胞悬液大、小剂量组在静脉给药30min后，豚鼠活动正常，未出现1～20级反应症状，判定为过敏反应阴性。而阳性药组豚鼠出现痉挛、抽搐、休克死亡，判定为过敏反应极强阳性。

3.4被动皮肤过敏实验：脐带血干细胞悬液大、小剂量组、5％葡萄糖注射液组大鼠背部皮肤均未见蓝色反应斑点。阳性组注射部位皮肤均不同程度的出现蓝色斑点反应，其中1∶16处有3例出现蓝斑，1∶8处有4例出现蓝斑，1∶4与1∶2处6例均出现蓝斑，蓝斑直径均大于5mm，判定为阳性反应。结果表明：脐带血干细胞悬液无同种被动皮肤致敏作用。

4结论

本实验采用的方法简便、准确、可靠，4项指标检测脐带血干细胞悬液均未出现阳性结果，说明脐带血干细胞悬液对血管无刺激性，无溶血作用，全身主动过敏反应阴性，无同种被动皮肤致敏作用。表明脐带血干细胞悬液安全性好，可供临床应用。

实施例6

效果实施例，治疗模式动物的效果

脐带血干细胞治疗阿尔茨海默症所致大鼠功能损伤的实验研究

实验目的：

观察脐带血干细胞移植对阿尔茨海默症慢性缺血模型大鼠脑功能的影响。

实验材料：

1、药品：脐带血干细胞悬液，其中干细胞的含量为3×10⁷个/ml，戊巴比妥钠，生理盐水。

2、器材：大鼠手术台，脑立体定位仪，手术显微镜，单极电凝器，显微手术器械。

3、动物：正常14-16个月的雄性SD大鼠80只。

1）实验组：成年雄性SD大鼠40只（建模的SD大鼠，予干细胞移植）。

2）模型对照组：成年雄性SD大鼠20只（建模的SD大鼠，不予干细胞移植，予生理盐水注射）。

3）空白对照组：成年雄性SD大鼠20只（不需建模，不予干细胞移植）。

实验方法：

1、实验动物麻醉：实验组及模型对照组大鼠称重，腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉。

2、建模：随机抽取60只正常成年SD大鼠建立慢性脑缺血模型，具体操作方式如下：将大鼠固定于脑立体定位仪上，硅胶管或橡皮栓扎鼠尾轻轻牵引，使颈椎伸展，翼孔呈水平位。枕骨下第一颈椎水平正中切口，仔细分离一侧第一颈椎横突，暴露第一颈椎横突翼孔下椎动脉。用小的单极电凝器插入翼孔烧灼闭塞一侧椎动脉。然后，动物取背位，颈部正中切口，分离颈总动脉。结扎和切断一侧的颈总动脉，用外科缝合线套住另一侧颈总动脉（不结扎），将线头藏于皮下，简单关闭切口。待动物麻醉清醒后送回饲养笼，自由饮水，禁食12-14小时后，将动物于清醒状态下取背位，分别用绳子固定四肢和门齿，以控制动物挣扎。小心分离颈前部的切口，辨认套在未结扎侧颈总动脉上的缝线，轻轻牵起，结扎和切断该侧的颈总动脉，缝合皮肤切口。相同环境下正常喂养，给予标准光照（14h光照，10h黑夜），全价颗粒饲料喂养，自由摄食，室温20℃～25℃，相对湿度45%～55%。如上喂养10-12周，分别观察实验动物的皮质和海马的脑血流，并进行Morris水迷宫测试，以评估实验动物脑功能。

评价：术后动物10-12周，此时皮质和海马的脑血流分别较空白对照组减少20%和60%。Morris水迷宫测试显示空间记忆能力缺失明显，组织学检查证实，海马神经元减少，胶质纤维酸性蛋白免疫反应增强，以CA1区最明显。虽然经历了慢性缺血，但缺血动物脑内并未发现梗死灶。

3、分组：选取以上建模成功的60只大鼠，随机分为实验组（40只）和模型对照组（20只）。未建模的空白对照组大鼠20只。

4、干细胞悬液注射：

建模完成后，分别将实验组的40只大鼠自尾静脉注射脐带血干细胞悬液0.5ml/100g。模型对照组的20只大鼠注射生理盐水0.5ml/100g。空白对照组大鼠不予处理。

观察方法：以上大鼠在相同环境下正常饲养12-16周，重新检查其皮质和海马的脑血流，并进行Morris水迷宫测试。

实验结果：

一、脑血流检查

1、模型对照组：该组大鼠的皮质和海马的脑血流较空白对照组减少30%和65%，与前次检查结果相比脑缺血程度进一步加深。

2、实验组：该组大鼠的皮质和海马的脑血流与空白对照组相比基本无差异。

3、空白对照组：与前次检查结果相比无明显差异。

二、Morris水迷宫测试

1、建模前，各组大鼠经训练后皆可完成可视平台任务和隐藏平台任务，并能完成探测实验。建模完成后，实验组及模型对照组大鼠虽能完成可视平台任务，但却无法完成隐藏平台任务，且探测实验表现不佳，空白对照组与之前相比无差别。

2、对实验组大鼠进行干细胞悬液注射处理后，90%的大鼠经过训练能够完成隐藏平台和探测实验，经生理盐水注射处理的模型对照组大鼠仍然无法完成隐藏平台任务，探测实验中经过隐藏平台的次数和时间也远远小于建模前和其他两组。

结论:

阿尔茨海默症多起病于老年期，病程缓慢且不可逆，临床上表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并伴有各种神经精神症状和行为障碍。病理改变主要为皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，并可见老年斑（SP），神经原纤维结（NFT）等病变，胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱含量显著减少。而大脑皮质中含有大量的神经元，这些神经元构成皮质内信息传递的复杂微环路，且能够对信息进行分析，存储，产出，各环节相互作用导致了复杂的心理活动。海马区是大脑皮质的一个内褶区，主要负责学习和记忆，尤其主管近期记忆。因此，皮质和海马的脑血流减少会影响实验动物的认知和记忆功能。Morris水迷宫则能够反映出受试动物的空间记忆能力，可视平台任务可以测试动物完成任务的行为能力，尤其是观察室内信号的视觉能力和水池中的游泳能力。而隐藏平台任务和探测式试验则主要测试的是动物对空间位置的鉴别能力。实验动物在进行外科手术处理后，Morris水迷宫测试显示空间记忆能力缺失明显。组织学检查证实，海马神经元减少，胶质纤维酸性蛋白免疫反应增强，以CA1区最明显。虽然经历了慢性缺血，但缺血动物脑内并未发现梗死灶。而脐带血干细胞能够移行至缺血损伤的皮质和海马区，然后分裂增殖成新的细胞，替代坏死的神经细胞行使其功能。干细胞可于缺血病变部位的周围建立侧支循环，恢复血运，逐渐恢复大脑功能。该实验表明脐带血干细胞移植对阿尔茨海默症的相关症状具有显著的治疗效果。

实施例7-10用于治疗人类阿尔茨海默症患者的过程及获得效果

实施例7

在实施7方案中，所述疾病、障碍或病状是轻中度的阿尔茨海默症，患者为老年男性，于79岁出现以记忆障碍为主的首发症状，常弄混家人及朋友的名字，忘记要做的事情，后逐渐出现思维迟缓，精神淡漠，话语减少，情绪不稳，易激惹，且伴有日间嗜睡症状。经静脉注射移植脐带血干细胞悬液的稀释液1次，用量为：50ml的干细胞浓度为5.2×10⁵个/ml干细胞悬液，1个月后该患者情绪明显稳定，精神好，话语逐渐增多，3个月后忘记事情的频率逐渐减低，可与家人做简单的日常交流，睡眠规律，较前有明显改善，经自体对比可见，脐带血干细胞能修复受损的脑神经元细胞，激活周围组织细胞，恢复患者大脑皮层功能。

实施例8

在实施8方案中，所述疾病、障碍或病状是中度的阿尔茨海默症，患者为83岁女性，于4年前出现记忆障碍，思维迟缓，思考困难，近1年症状表现逐渐加重，远期记忆出现障碍，不能回忆起自己的籍贯，出生日期等，且不能分辨地点，一年内已走失过数次。静脉注射脐带血干细胞悬液的稀释液两次，用量分别为60ml的干细胞浓度为5.5×10⁵个/ml干细胞悬液，及55ml的干细胞浓度为4.6×10⁵个/ml干细胞悬液，其间隔为两个月，6个月后家人反馈以上症状明显缓解，可以记起一些年轻时期的往事，可与家人简单交流，精神状态较好，睡眠佳。

实施例9

实施方案9为老年病前期痴呆，患者为63岁女性，有同病家族史。闭经后逐渐出现认知功能减退症状，做事缺乏主动性，时常健忘，不能处理日常事务，并伴有轻微抑郁，自我评价低，对家人非常依赖。经静脉滴注脐带血干细胞悬液的稀释液一次，用量为65ml的干细胞浓度为6.0×10⁵个/ml干细胞悬液，3个月后，患者可主动与人交流，抑郁情绪得到改善，对他人的依赖感降低，认知障碍也有所缓解。

实施例10

在实施方案10中，所述疾病、障碍或病状是重度阿尔茨海默症，患者为86岁老年男性，8年前即出现记忆减退症状，对周围环境兴趣减少，待人冷淡，近两年症状逐渐加重，表现为严重的认知及言语功能障碍，情志淡漠，睡眠障碍，行走困难，不能辨认亲人，朋友等。经静脉滴注脐带血干细胞悬液的稀释液三次，每次间隔1个月，用量分别为65ml的干细胞浓度为5.8×10⁵个/ml干细胞悬液，58ml的干细胞浓度为6.3×10⁵个/ml干细胞悬液，60ml的干细胞浓度为5.5×10⁵个/ml干细胞悬液，3个月后，经家属反馈患者睡眠状况得到改善，精神良好，8个月后该患者基本能够认出经常接触的家人朋友，可主动与他人进行简单的日常交流，可自行扶墙行走，自体对比显示，脐带血干细胞在阿尔茨海默症的治疗上具有明显疗效。

Claims (4)

1.一种人干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途，其特征在于：

所述的人干细胞选自人类骨髓、脐带血或外周血干细胞；

所述的干细胞组合物为按照本申请人的申请号为201210017987.9、名称为“一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法”中的干细胞分离方法步骤（3）得到的“存在于整个离心管中间位置的约（2-4）mm厚的油状干细胞层”；

每份所述干细胞组合物经（10-80）ml生理盐水清洗及定容后，得到含有的人干细胞的数量为（1～8）×10⁸个的干细胞悬液；

每份所述的干细胞悬液在使用前再用100ml的生理盐水进一步稀释，得到干细胞悬液中的个数密度为（0.125～8）×10⁷个/ml、总容量为110-180ml的干细胞悬液的稀释液。

2.根据权利要求1所述的在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途，其特征在于，所述的用途采用以下方法实现：

所述的干细胞悬液的稀释液通过体表浅静脉进行静脉点滴法注射到人体。

3.根据权利要求2所述的在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途，其特征在于，所述的静脉点滴法的步骤为：

（1）先用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲管；

（2）接着开始静脉点滴注射输入干细胞悬液的稀释液，保持20-30滴/分钟，半小时后无不良反应可增加到30-50滴/分钟，细胞输入过程中每15分钟轻轻晃动装有所述干细胞悬液的稀释液的细胞保存袋一次；

（3）细胞输入完毕后用0.9%的氯化钠溶液20ml冲入细胞保存袋中轻轻晃动，再用0.9%的氯化钠溶液20-30ml冲净即可将输液器中细胞冲净，得到的冲洗液也同样注入患者体内，以保证细胞输入的数量；

静滴时将细胞液摇匀，避免细胞贴壁。

4.根据权利要求1～3之一的人干细胞组合物在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的用途，其特征在于：

所述的人干细胞为人类脐带血干细胞。