CN106665496A - 一种治疗脊髓损伤药物的实验方法 - Google Patents

一种治疗脊髓损伤药物的实验方法 Download PDF

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CN106665496A CN201710115327.7A CN201710115327A CN106665496A CN 106665496 A CN106665496 A CN 106665496A CN 201710115327 A CN201710115327 A CN 201710115327A CN 106665496 A CN106665496 A CN 106665496A
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张菁
蒋娜娜
刘岳鹏
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彭霞林
谢芳芳
张爱娟
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Abstract

本发明公开了一种治疗脊髓损伤药物的实验方法，采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对SCI进行治疗，通过比较大鼠神经功能恢复，观察损伤脊髓神经细胞形态学变化及细胞凋亡情况，探索联合治疗的有效性，使富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法成为SCI新的治疗方法。记录和分析MBI及ASIA评分，验证富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在临床上的应用效果。本发明为富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在治疗脊髓损伤的实际应用中获取证据。为脊髓损伤提供一种更为有效的治疗方法。

Description

一种治疗脊髓损伤药物的实验方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，涉及一种治疗脊髓损伤药物的实验方法。
背景技术
随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)的发生率呈现逐年增高的趋势，并导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。SCI在给患者本人带来严重身心损害的同时，也给整个社会造成巨大的经济负担。因此针对SCI的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。在SCI的急性期，为了保护未完全损伤的脊髓，有必要在早期采取合理、有效的神经保护措施，从而在一定程度上改善受损脊髓的神经功能。
目前，皮质类固醇激素现已被证实是治疗急性SCI的有效药物，而氢气可以治疗脑缺血-再灌注损伤，并在动物模型、各种细胞学、和化学反应等层面被证明可以选择性与毒性自由基直接反应，具有抗氧化损伤的作用。因此，提出如下假说：采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对SCI进行治疗，可以通过抑制SCI早期氧自由基的损伤，包括抑制过氧化物活性及增加抗氧化酶活性以及抑制炎症反应的发生，从而达到保护受损脊髓神经功能的作用，对于SCI的恢复有重要意义。
氢的研究机制已经比较明确，如何将其应用到临床各种疾病中是国内外研究者正在思考的问题，在SCI领域，本发明具有一定的领先性。SCI发病率虽然呈现逐年增加的趋势，但目前缺乏较好的治疗手段，本发明将基础研究成果转化为临床治疗技术，为临床提供了一种有效的、副作用较小的治疗方法，具有良好的推广前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗脊髓损伤药物的实验方法，通过基础实验闸明富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法是否优于单独的甲基强的松龙的疗法及其疗效的机制；然后通过临床实验验证富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在临床上的应用效果，积累临床数据，为富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在治疗脊髓损伤的实际应用中获取证据。为脊髓损伤提供一种更为有效的治疗方法。
其具体技术方案为：
一种治疗脊髓损伤药物的实验方法，包括以下步骤：
步骤1、动物实验部分
1)分组：
(1)Sham组(n＝12)：假损伤组
(2)急性SCI动物模型(n＝36)：制作大鼠急性SCI动物模型之后，随机分成四组，即MP组(n＝12)、MP+H2治疗组(n＝12)及NS组(n＝12)。
2)动物模型的制作：
(1)假损伤组(n＝12)：10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠脊柱(T9-T12)水平正中切口纵形切开，分离脊柱骨膜，暴露T10椎骨，用高速磨钻磨除椎骨嵴突，暴露椎管硬脊膜，注意保持硬膜完整。术后缝合创口。
(2)急性SCI动物模型(n＝36)：采用精确损伤撞击器(PinPointTMPCI3000Precision Cortical ImpactorTM)制作大鼠急性SCI动物模型。10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠脊柱(T9-T12)水平正中切口纵形切开，分离脊柱骨膜，暴露T10椎骨，用高速磨钻磨除椎骨嵴突，暴露椎管硬脊膜，注意保持硬膜完整。将大鼠固定于立体定位仪上。将撞击锤(直径3mm)安置于椎管窗内，紧贴硬模。采用PinPointTM颅脑损伤撞击器，建立中度损伤的可控性皮质打击伤模型，打击条件为：撞击速度为2m/s，撞击深度为2.5mm，接触时间为85ms。术后缝合创口。
3)富氢生理盐水的制备：
高压下(0.4MPa)将氢气溶于生理盐水，持续6h。制备后的饱和氢盐水经γ射线灭菌后，于标准大气压下4℃冰箱保存。氢盐水每周补充氢气，使用前按照Ohaswa描述的方法进行气相色谱分析检测饱和氢盐水浓度，以保证其浓度＞0.6mmol/L。
4)改良大鼠神经功能缺损评分(mNSS)：
共计18分，分数越高，神经系统功能损害越严重。其中包括：提尾试验3分；将大鼠放置于地板上(正常值＝0；最大值＝3)；感觉试验共计2分；平衡木试验(正常值＝0；最大值＝6)；反射丧失和不正常运动共计4分。
5)急性SCI的治疗干预：
(1)Sham组(n＝12)：无任何治疗。
(2)MP+H2治疗组(n＝12)：采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对急性SCI进行治疗。急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予甲基强的松龙(20mg/10ml)+富氢生理盐水(10ml)于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周。
(3)MP组(n＝12)：采用甲基强的松龙对急性SCI进行治疗。急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予甲基强的松龙(20mg/10ml)于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周。
(4)NS组(n＝12)：采用生理盐水对急性SCI进行治疗。急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予生理盐水(10ml)于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周。
6)大鼠后肢运动神经功能评估：
采用改良大鼠神经功能缺损评分表(Modified Neurological Severity Score，mNSS)分别于大鼠手术前、手术后第1、2、3、4、5、6、7天进行评估，并记录。
7)检测方法
(1)HE染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，常规多聚甲醛固定、石蜡包埋切片，行HE染色，显微镜下观察脊髓神经细胞形态学变化。
(2)普鲁士蓝染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，常规多聚甲醛固定、石蜡包埋切片，行HE染色，显微镜下观察脊髓神经细胞局部组织内各种出血性病变变化。
(3)TUNEL染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，冰冻切片，行TUNEL染色，显微镜下观察脊髓神经细胞凋亡情况。
(4)Western-Blot检测：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，采用Western-Blot检测凋亡蛋白(Caspase3)的表达，观察脊髓神经细胞凋亡情况。
(5)超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)检测：采用SOD试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行SOD检测。
(6)过氧化氢酶(Catalase，CAT)检测：采用CAT试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行CAT检测。
(7)早期炎症因子(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)检测：采用ELISA试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行TNF-α检测。
(8)晚期促炎细胞因子(High mobility group box-1 protein，HMGBl)检测：采用ELISA试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行HMGBl检测。
8)数据处理和统计学分析：
采用IBM SPSS Statistics 19、SigmaPlot 12.5及Adobe ll lustrator CS5进行数据处理、统计学分析及图像处理，Western Blot实验结果采用单因素方差分析(ANOVA)，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示。用双因素(时间和分组)方差分析，多组间两两比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)检验。神经功功能评分(mNSS)采用Kruskal-Wallis检验，若存在组间差异，以Mann-Whitney U检验Bonferroni进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
步骤2、临床实验部分
1)纳入标准：选择急性SCI患者，根据ASIA损伤评分将其分为A、B、C、D、E级别，将符合B、C、D损伤级别的患者60例纳入实验组，并征得患者及家属同意，经连云港市东方医院伦理委员会批准。排除标准：严重的凝血功能障碍，危及生命的其他脏器损伤或多器官功能衰竭及出现下肢机械压缩，影响康复功能评定及康复治疗措施的实施者。
2)分组：随机分成3组，即MP组(n＝20)、MP+H2全程治疗组(n＝20)、MP+H2二次损伤期治疗组(n＝20)。说明：MP组：甲强龙常规应用，即伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，余23h改为5.4mg/kg.h连续滴注。MP+H2全程治疗组：伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，同时即给予富氢生理盐水250ml治疗，余23h改为甲强龙5.4mg/kg.h连续滴，此后6天给予富氢生理盐水250ml静滴；MP+H2二次损伤期治疗组：伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，余23h改为5.4mg/kg.h连续滴注，而富氢生理盐水250ml在损伤后24小时以后给予。所有各组患者均治疗2周。
3)早期治疗及康复治疗：所有各组患者SCI早期均接受减压、固定等手术治疗。损伤后2周均接受正规康复治疗。
(1)运动训练：括正确体位的摆放，瘫痪肢体的被动运动，个人卫生护理；
(2)物理因子：功能性电刺激，以精确的刺激顺序和刺激强度激活瘫痪或轻瘫的肌肉；
(3)步行能力的训练：①用减重设备进行步态训练②机器人模式减重活动平板训练；
(4)并发症的康复治疗：①神经源性膀胱：药物、间歇导尿、神经电刺激；②肌痉挛；持续牵张训练；巴氯芬：
(5)矫形器及辅助用具的应用；
(6)心理干预与家庭支持。
4)评估手段：所有各组患者均随访6个月，分别于治疗前、治疗期间2周内每天、1月、3月、6月，评估改良Barthel指数(MBI)和ASIA评分。
5)统计学分析：采用SPSS统计学软件包进行处理，数据以均数士标准差表示，组内和组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有显著性意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过基础实验比较富氢生理盐水联合甲基强的松龙治疗SCI是否优于单独的甲基强的松龙的治疗及其疗效的机制；然后通过临床实验验证富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在临床上的应用效果，积累临床数据，为富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在治疗SCI的实际应用获取证据。为治疗SCI提供一种更为有效的治疗方法。
附图说明
图1是本发明治疗脊髓损伤药物的实验方法示意图；
图2是大鼠后肢运动神经功能评分：假损伤组后肢运动神经功能基本正常，SCI模型对照组出现明显的运动神经功能损伤(P＜0.01vs假损伤组)，干预组的运动神经功能损伤明显改善(P＜0.01vs对照组)。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对SCI进行治疗，通过比较大鼠神经功能后肢运动，观察脊髓神经细胞形态学变化及细胞凋亡情况，了解富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法对急性SCI运动神经功能的作用。通过检测不同的时间点血清和脊髓样本超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测早期炎症因子(TNF-α)和晚期促炎细胞因子(HMGB1)，了解富氢生理盐水联合甲基强的松龙治疗对大鼠急性SCI炎症反应和氧化应激的影响。记录和分析MBI及ASIA评分，验证富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在临床上的应用效果。具体如图2所示。
1.基础实验部分：
本实验部分具体内容是，采用PinPointTM制作大鼠急性SCI动物模型。然后采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对SCI进行治疗，并与单独采用甲基强的松龙治疗进行对比，通过神经功能评分(NSS)比较两种疗法治疗过程中大鼠后肢运动功能的恢复情况，判断富氢生理盐水联合甲基强的松龙治疗对急性SCI运动神经功能的疗效；并通过观察脊髓神经元凋亡情况，通过检测不同的时间点血清和脊髓样本超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测早期炎症因子(TNF-α)和晚期促炎细胞因子(HMGB1)，了解富氢生理盐水联合甲基强的松龙治疗对大鼠急性SCI伤造成的细胞凋亡、炎症反应和氧化应激的影响，了解富氢生理盐水联合甲基强的松龙发挥作用的机制。
2.临床实验部分：
本实验部分具体内容是，将给药方法分为“全程给药”和“二次损伤期给药”两种方式，甲基强的松龙的给药以及其它的治疗方法按照临床标准进行，通过改良Barthel指数(MBI)和ASIA评分判断新疗法是否较单纯激素治疗更具有优势。
实施例 急性脊髓损伤(SCI)大鼠模型预试验报告：
采用精确损伤撞击器(PinPointTM PCI3000 Precision Cortical ImpactorTM)制作急性SCI大鼠模型。在制作急性SCI大鼠模型之后，采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙进行药物干预，在不同的时间点进行神经功能评分、组织切片HE染色、普鲁士蓝染色，评价急性SCI动物的病程进展。现将预试验过程和结果报告如下：
(1)目的
制作急性SCI大鼠模型，采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙进行药物干预，在不同的时间点进行脊髓神经功能评分、组织切片HE染色、普鲁士蓝染色，评价富氢生理盐水联合甲基强的松龙对急性SCI大鼠后肢运动神经功能的影响。
(2)资料与方法
①实验动物及分组：雄性Wistar大鼠20只，体重200～230g。其中假损伤组10只，SCI模型对照组10只，SCI模型干预组10只。
②假损伤组：10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠脊柱(T9-T12)水平正中切口纵形切开，分离脊柱骨膜，暴露T10椎骨，用高速磨钻磨除椎骨嵴突，暴露椎管硬脊膜，注意保持硬膜完整。术后缝合创口。
③SCI模型对照组：采用精确损伤撞击器(PinPointTM PCI3000 PrecisionCortical ImpactorTM)制作大鼠急性SCI动物模型。10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠脊柱(T9-T12)水平正中切口纵形切开，分离脊柱骨膜，暴露T10椎骨，用高速磨钻磨除椎骨嵴突，暴露椎管硬脊膜，注意保持硬膜完整。将大鼠固定于立体定位仪上。将撞击锤(直径3mm)安置于椎管窗内，紧贴硬模。采用PinPointTM颅脑损伤撞击器，建立中度损伤的可控性皮质打击伤模型，打击条件为：撞击速度为2m/s，撞击深度为2.5mm，接触时间为85ms。术后缝合创口。
④SCI模型干预组：同上制作急性SCI大鼠模型，采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对急性SCI进行治疗。急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予甲基强的松龙(20mg/10ml)+富氢生理盐水(10ml)于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周。
⑤大鼠后肢运动神经功能评估：采用改良大鼠神经功能缺损评分表(ModifiedNeurological Severity Score，mNSS)分别于大鼠手术前、手术后第1、2、3、4、5、6、7天进行评估，并记录。
(3).预试验结果：如图2所示，假损伤组后肢运动神经功能基本正常，SCI模型对照组出现明显的运动神经功能损伤(P＜0.01vs假损伤组)，干预组的运动神经功能损伤明显改善(P＜0.01vs对照组)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种治疗脊髓损伤药物的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、动物实验部分
1)分组：
(1)Sham组n＝12：假损伤组
(2)急性SCI动物模型n＝36：制作大鼠急性SCI动物模型之后，随机分成四组，即MP组n＝12、MP+H2治疗组n＝12及NS组n＝12；
2)动物模型的制作：
(1)假损伤组n＝12：10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠脊柱T9-T12水平正中切口纵形切开，分离脊柱骨膜，暴露T10椎骨，用高速磨钻磨除椎骨嵴突，暴露椎管硬脊膜，注意保持硬膜完整；术后缝合创口；
(2)急性SCI动物模型n＝36：采用精确损伤撞击器制作大鼠急性SCI动物模型；10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠脊柱T9-T12水平正中切口纵形切开，分离脊柱骨膜，暴露T10椎骨，用高速磨钻磨除椎骨嵴突，暴露椎管硬脊膜，注意保持硬膜完整；将大鼠固定于立体定位仪上；将撞击锤安置于椎管窗内，紧贴硬模；采用颅脑损伤撞击器，建立中度损伤的可控性皮质打击伤模型，打击条件为：撞击速度为2m/s，撞击深度为2.5mm，接触时间为85ms；术后缝合创口；
3)富氢生理盐水的制备：
0.4MPa高压下将氢气溶于生理盐水，持续6h；制备后的饱和氢盐水经γ射线灭菌后，于标准大气压下4℃冰箱保存；氢盐水每周补充氢气，使用前按照Ohaswa描述的方法进行气相色谱分析检测饱和氢盐水浓度，以保证其浓度＞0.6mmol/L；
4)改良大鼠神经功能缺损评分mNSS：
共计18分，分数越高，神经系统功能损害越严重；其中包括：提尾试验3分；将大鼠放置于地板上，正常值＝0；最大值＝3；感觉试验共计2分；平衡木试验，正常值＝0；最大值＝6；反射丧失和不正常运动共计4分；
5)急性SCI的治疗干预：
(1)Sham组n＝12：无任何治疗；
(2)MP+H2治疗组n＝12：采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对急性SCI进行治疗；急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予甲基强的松龙20mg/10ml+富氢生理盐水10ml于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周；
(3)MP组n＝12：采用甲基强的松龙对急性SCI进行治疗；急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予甲基强的松龙20mg/10ml于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周；
(4)NS组n＝12：采用生理盐水对急性SCI进行治疗；急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予生理盐水10ml于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周；
6)大鼠后肢运动神经功能评估：
采用改良大鼠神经功能缺损评分表分别于大鼠手术前、手术后第1、2、3、4、5、6、7天进行评估，并记录；
7)检测方法
(1)HE染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，常规多聚甲醛固定、石蜡包埋切片，行HE染色，显微镜下观察脊髓神经细胞形态学变化；
(2)普鲁士蓝染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，常规多聚甲醛固定、石蜡包埋切片，行HE染色，显微镜下观察脊髓神经细胞局部组织内各种出血性病变变化；
(3)TUNEL染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，冰冻切片，行TUNEL染色，显微镜下观察脊髓神经细胞凋亡情况；
(4)Western-Blot检测：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，采用Western-Blot检测凋亡蛋白的表达，观察脊髓神经细胞凋亡情况；
(5)超氧化物歧化酶检测：采用SOD试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行SOD检测；
(6)过氧化氢酶检测：采用CAT试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行CAT检测；
(7)早期炎症因子检测：采用ELISA试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行TNF-α检测；
(8)晚期促炎细胞因子检测：采用ELISA试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行HMGB1检测；
8)数据处理和统计学分析：
采用IBM SPSS Statistics 19、SigmaPlot 12.5及Adobe IIIustrator CS5进行数据处理、统计学分析及图像处理，Western Blot实验结果采用单因素方差分析，计量资料采用均数±标准差表示；用时间和分组双因素方差分析，多组间两两比较采用SNK检验；神经功功能评分采用Kruskal-Wallis检验，若存在组间差异，以Mann-Whitney U检验Bonferroni进行两两比较；P＜0.05为差异有统计学意义；
步骤2、临床实验部分
1)纳入标准：选择急性SCI患者，根据ASIA损伤评分将其分为A、B、C、D、E级别，将符合B、C、D损伤级别的患者60例纳入实验组，并征得患者及家属同意，经连云港市东方医院伦理委员会批准；排除标准：严重的凝血功能障碍，危及生命的其他脏器损伤或多器官功能衰竭及出现下肢机械压缩，影响康复功能评定及康复治疗措施的实施者；
2)分组：随机分成3组，即MP组n＝20、MP+H2全程治疗组n＝20、MP+H2二次损伤期治疗组n＝20；说明：MP组：甲强龙常规应用，即伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，余23h改为5.4mg/kg.h连续滴注；MP+H2全程治疗组：伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，同时即给予富氢生理盐水250ml治疗，余23h改为甲强龙5.4mg/kg.h连续滴，此后6天给予富氢生理盐水250ml静滴；MP+H2二次损伤期治疗组：伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，余23h改为5.4mg/kg.h连续滴注，而富氢生理盐水250ml在损伤后24小时以后给予；所有各组患者均治疗2周；
3)早期治疗及康复治疗：所有各组患者SCI早期均接受减压、固定的手术治疗；损伤后2周均接受正规康复治疗；
(1)运动训练：括正确体位的摆放，瘫痪肢体的被动运动，个人卫生护理；
(2)物理因子：功能性电刺激，以精确的刺激顺序和刺激强度激活瘫痪或轻瘫的肌肉；
(3)步行能力的训练：①用减重设备进行步态训练②机器人模式减重活动平板训练；
(4)并发症的康复治疗：①神经源性膀胱：药物、间歇导尿、神经电刺激；②肌痉挛；持续牵张训练；巴氯芬：
(5)矫形器及辅助用具的应用；
(6)心理干预与家庭支持；
4)评估手段：所有各组患者均随访6个月，分别于治疗前、治疗期间2周内每天、1月、3月、6月，评估改良Barthel指数MBI和ASIA评分；
5)统计学分析：采用SPSS统计学软件包进行处理，数据以均数士标准差表示，组内和组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有显著性意义。
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