CN108542918A - 一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物及动物模型 - Google Patents

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Abstract

本发明属于干细胞及有机化学技术领域，公开了一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物及动物模型，联合不同剂量的甲基强的松龙，利用抗炎、抗凋亡的神经保护作用以及术后不同时间移植羊膜源神经干细胞，观察二者联合能否促进实验大鼠脊髓损伤后的轴突再生和功能恢复，为SCI修复探索新的治疗策略，具有重大的理论意义及广阔的临床应用前景。本发明结合细胞移植；联合甲基强的松龙的神经保护作用和HAM‑NSCs的神经修复作用，探索SCI治疗的新策略；对探讨神经损伤修复机制提供理论基础，为临床治疗脊髓损伤修复提供可行性方案；对有效降低SCI致残率，提高脊髓损伤患者生活质量，具有广阔的临床应用价值。

Description

一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物及动物模型
技术领域
本发明属于干细胞及有机化学技术领域，尤其涉及一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物及动物模型。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：脊髓损伤(Spinal cordinjury，SCI)是中枢神经系统的严重创伤，由于脊髓是许多神经功能的中介通路，SCI及其继发性病理生理反应可直接导致神经功能损伤，从而引起组织、器官功能障碍，致残率与致死率非常高。SCI是世界公认的疑难病之一，它呈高发生率、高致残率、高耗费、低死亡率的特点，严重威胁人类的健康，影响人们的生活质量，给社会和家庭带来沉重的负担，如何有效地促进损伤脊髓的再生与修复一直是医学研究领域的难点和热点。近年来，随着神经生物学和干细胞技术的发展，细胞移植给SCI的治疗带来了新的曙光。目前已有多种细胞用于SCI的基础研究领域，那么，何种细胞是最适于组织工程和临床运用的种子细胞？胚胎干细胞虽在理论上有较高的评价，可用于异体移植，但用于临床存在伦理上的限制。雪旺氏细胞和嗅鞘细胞疗效也得到肯定，但受取材和扩增能力的限制，也不适于用于临床。目前基础及I期临床研究中常用的种子细胞为自体来源的间充质干细胞，包括有骨髓、脂肪及各种器官的间充质干细胞。自体骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是经典的种子细胞，但BMSCs的获得需要进行骨髓穿刺，患者具有一定的痛苦，且随年龄增长BMSCs的数量和增殖能力显著下降，并且病毒感染的几率增加。自体脂肪间充质干细胞(adipose-derived stromal cell，ADSCs)来源广泛，但也需要二次手术。异体来源的细胞因有免疫排斥而较少选用。新近发现间充质干细胞也存在于羊膜组织，称之为羊膜干细胞(human amniotic membranemesenchymal stromal cells，HAM-MSCs)。众所周知，胎盘羊膜作为分娩废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法理的限制。而且HAM-MSCs从新生儿分离而来，具有极强的扩增和分化能力。此外，HAM-MSCs具有较强的组织相容性，免疫原型低，适于异体移植。HAM-MSCs可跨胚层分化为骨、软骨、脂肪、心肌和血管内皮细胞，HAM-MSCs可加速大创面伤口愈合、改善衰竭肝脏功能并能促进中风动物神经功能恢复，这些研究表明HAM-MSCs是一种有巨大应用前景的种子细胞。但HAM-MSCs是否能促进SCI动物的神经功能康复并不清楚。我们前期研究发现表明通过多种神经营养因子和细胞因子诱导，HAM-MSCs可在体外分化为神经干细胞(neural stem cells，NSCs)，这为HAM-MSCs治疗SCI提供了前期基础。甲基强的松龙(Methylprednisolone，MP)是目前应用最广泛且公认有一定疗效的少数几种治疗SCI的药物之一，是唯一一种在III期临床试验中证实有效的药物。目前发现的作用机制为抑制细胞水肿和炎症渗出、组织溶酶体破坏、抗细胞凋亡等]，而大剂量应用MP也会产生较大的副作用。目前对MP的剂量、使用时间和作用机制尚未达成一致。最新研究表明MP可促进局灶性脑缺血大鼠损伤后新生神经元的存活以及功能修复[。因此，MP在CNS中主要起神经保护作用，而NSCs主要起神经修复作用？那么，MP对NSCs有何影响？MP能否促进移植的NSCs的存活、MP和NSCs是否具有协同治疗作用？
综上所述，现有技术存在的问题是：脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)修复是世界性难题。临床目前唯一可减轻SCI急性期继发性损伤的药物是激素类药物，细胞移植则为SCI的功能恢复提供了潜在的可能性，修复相关组织的缺损并恢复其原有的功能，这样的组织再生模式可以避免“以创伤修复创伤”的缺陷，有望真正实现微创甚至无创的组织器官再生与功能重建。因而寻找合适的激素给药量，多靶点协同改善神经细胞生存环境，促进损伤细胞修复，进而探讨其具体机制。鉴于体外移植后神经干细胞的存活与分化并不令人满意，极其不适宜的移植环境包括缺乏营养支持，炎症过程活化，胶质瘢痕的出现等等，这些因素均阻碍结构修复，导致移植的干细胞存活率低。甲基强的松龙可以抑制SCI后早期炎症反应及之中脂质过氧化反应，减轻水肿和细胞凋亡，维持神经细胞兴奋性以及改善微循环。这些改善微循环的作用有助于移植细胞存活。，而激素联合移植干细胞是否具有协同治疗作用及其机制目前尚不清楚。.
解决上述技术问题的难度和意义：目前对SCI的治疗效果仍不佳，预后难以预料，原因是SCI后的病理生理机制非常复杂，人们对此认识还很不全面、深入。因为SCI后涉及到诸多病理过程，因而针对单一病理因素的治疗不会有最大的功能恢复。甲基强的松龙(Methylprednisolone，MP)是目前应用最广泛且公认有一定疗效的少数几种治疗SCI的药物之一，是唯一一种在III期临床试验中证实有效的药物。而大剂量应用MP也会产生较大的副作用。目前对MP的剂量、使用时间和作用机制尚未达成一致，选择小剂量甲基强的松龙也是研究内容之一。因而，甲基强的松龙可以作为联合治疗的选择。MP在CNS中主要起神经保护作用，而NSCs主要起神经修复作用？那么，不同剂量的MP对NSCs有何影响？MP能否促进移植的NSCs的存活、MP和NSCs是否具有协同治疗作用？文献检索发现这方面研究甚少，研究意义重大。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物及动物模型。
本发明是这样实现的，一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物，所述促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物为羊膜源神经干细胞和甲基强的松龙，药剂量为30mg/Kg～200mg/Kg；通过建立大鼠脊髓损伤动物模型，研究HAM-NSCs与临床小剂量甲泼尼龙联合应用对实验性脊髓损伤大鼠运动功能的恢复情况、神经保护作用，探求SCI后联合疗法发挥作用的机制，是单独发挥作用还是协同作用，甲强龙对羊膜源神经干细胞有何作用等等设想，并与大剂量甲泼尼龙相比较，为临床上寻求一种有效且副作用低的脊髓损伤治疗手段提供实验依据。
本发明的另一目的在于提供一种验证所述促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物的动物模型，所述动物模型为：选取健康成年SD大鼠，性别不限；切开皮肤；分离两侧椎旁肌，出血用低功率双极电凝止血；去除T10棘突，微型磨钻打开椎板后，暴露T10脊髓；打开硬脊膜，标准脊髓致伤器进行造模，制定标准动量；造模完成后逐层缝合皮下和皮肤，行HE染色观察模型的可靠性。造模前后用摄像机将大鼠的活动情况记录。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：联合不同剂量的甲基强的松龙(Methylprednisolone，MP)，利用其抗炎、抗凋亡的神经保护作用以及术后不同时间移植羊膜源神经干细胞，观察二者联合能否促进实验大鼠脊髓损伤后的轴突再生和功能恢复，为SCI修复探索新的治疗策略，具有重大的理论意义及广阔的临床应用前景。从治疗机制出发，探索MP在脊髓损伤中适合的治疗时间，并结合细胞移植，探索MP适合的治疗剂量；联合MP的神经保护作用和HAM-NSCs的神经修复作用，探索SCI治疗的新策略；对探讨神经损伤修复机制提供进一步理论研究基础，为临床治疗脊髓损伤修复提供可行性方案；对有效降低SCI致残率，提高患者生活质量，具有广阔的临床应用价值。目前发现的作用机制为抑制细胞水肿和炎症渗出、组织溶酶体破坏、抗细胞凋亡以及促进局灶性脑缺血大鼠损伤后新生神经元的存活以及功能修复等。
本发明发现证实了联合应用甲基强的松龙及HAM-NSCs对SCI修复效果优于两者的单独应用效果；联合应用对于抑制SCI炎性反应及神经细胞凋亡方面优于单独应用；联合应用可以促进抑制的HAM-NSCs存活率。单独应用甲基强的松龙可以促进SCI早期神经功能的恢复，但是在SCI 21天后并没有进一步的恢复。单独应用羊膜源神经干细胞并没有显示促进恢复效应，推测联合疗法的康复机制可能来自以下方面：(1)联合疗法较单一疗法对控制炎症反应更有效。强的松有抗炎及免疫抑制作用。AM-MSCs在脑缺血及肺损伤有减低局灶炎症反应及修饰免疫疫应答作用。AM-MSCs可能在SCI后增强甲强龙的抗炎作用；(2)10mg/kg甲强龙可以促进AM-MSCs存活并增强联合治疗的效应。不同剂量甲强龙对干细胞的分化及存活有不同效应。另外，有文献报道甲强龙可以减少海马齿状核成人祖细胞的增殖，也可以减少大脑灰白质NG2阳性OPCs的增殖。Schroter et al.于2009年报道来自中枢神经系统不同区域的神经祖细胞对相同剂量甲强龙反应不同。本研究却观察到不同于以往的结果。提示今后要对此进一步研究确定联合疗法对SCI恢复的正向作用机制。
附图说明
图1是本发明实施例提供的促进大鼠脊髓损伤功能修复的动物模型建立流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明采用HAM-MSCs作为种子细胞，在体外诱导分化为NSCs后，联合不同剂量、不同时间MP治疗大鼠撞击伤动物模型，有机联合HAM-NSCs的神经保护作用和MP的抗炎和免疫调节作用，为SCI修复探索新的治疗策略。
如图1所示，本发明实施例提供的促进大鼠脊髓损伤功能修复的动物模型构建方法包括以下步骤：
S101：选取健康成年SD大鼠，性别不限。切开皮肤后，所有手术过程均在手术显微镜下进行。分离两侧椎旁肌，出血用低功率双极电凝止血；
S102：去除T10棘突，微型磨钻打开椎板后，充分暴露T10脊髓。打开硬脊膜，用纽约大学(NewYork Impactor)标准脊髓致伤器进行造模，制定标准动量，保证打击力度精确一致，减少误差；
S103：造模完成后逐层缝合皮下和皮肤，行HE染色观察模型的可靠性。造模前后用摄像机将大鼠的活动情况记录下来，以便客观评价。术后给予人工排尿和加强保暖等护理工作。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
(1)种子细胞的筛选及定向诱导分化
HAM-MSCs的分离，纯化和鉴定：材料取自本院妇产科正常足月顺产后获取的新鲜羊膜，利用贴壁换液和反复传代的方法进行粗提，后再利用免疫磁珠分离系统进行高纯度提取。然后进行细胞增殖、细胞周期、细胞表型和细胞免疫组织化学鉴定，并检测HAF-NSCs向骨，软骨和脂肪细胞的多向分化潜能。最后检测细胞的克隆形成率。
(2)HAM-MSCs向HAM-NSCs的转分化
HAM-MSCs向神经干细胞的转分化：首先联合N2和表皮生长因子(epidermalgrowth factor，EGF)把HAM-MSCs转变为nestin阳性表达的HUC-MSCs。然后，利用bFGF，EGF和B27将nestin阳性表达的HAM-MSCs转变为NSCs。鉴定：细胞光镜，扫描和透射电镜形态学观察；nestin，stro-1等干细胞特异性表面标志免疫组织化学鉴定；神经递质释放；神经电生理监测；向神经元和胶质细胞的分化能力。
(3)SD大鼠脊髓挫伤模型的构建
选取健康成年SD大鼠，性别不限。切开皮肤后，所有手术过程均在手术显微镜下进行。分离两侧椎旁肌，出血用低功率双极电凝止血。去除T10棘突，微型磨钻打开椎板后，充分暴露T10脊髓。打开硬脊膜，用纽约大学(NewYorkImpactor)标准脊髓致伤器进行造模，制定标准动量，保证打击力度精确一致，减少误差，造模完成后逐层缝合皮下和皮肤，行HE染色观察模型的可靠性。造模前后用摄像机将大鼠的活动情况记录下来，以便客观评价。术后给予人工排尿和加强保暖等护理工作。
(4)实验分组
假手术组
生理盐水治疗组
HAF-NSCs急性期移植+MP(30mg/Kg，1次/d，连续3d)治疗组
HAF-NSCs急性期移植+MP(200mg/Kg，1次/d，连续3d)治疗组
HAF-NSCs慢性期移植+MP(30mg/Kg，1次/d，连续3d)
HAF-NSCs慢性期移植+MP(200mg/Kg，1次/d，连续3d)
对于假手术组，仅打开椎板，暴露脊髓，但不损伤脊髓。以上各组造模成功后，分别存活1，2，和4月，然后对动物进行灌注、固定和取材。
(5)功能评价和神经电生理监测
在灌注固定之前，在术后不同时间点行功能评价和神经电生理监测。
神经电生理监测：在术后每隔两周，用电生理监测仪分别连接到双下肢的坐骨神经和大脑皮质感觉运动区进行神经电生理的监测。记录皮层运动和皮层感觉诱发电位的振幅和潜伏期，以此来间接证明皮质脊髓束和后索感觉传入通路的恢复情况。
运动功能评价：①一般功能评价：BBB旷地功能评分，爬网格实验；②精细功能评价：爬阶梯实验，步态检测，前爪握持力量和摄食功能检测。
(6)组织学修复情况
行HE染色，用color image analyzer计算空洞大小；用快蓝染色(Luxol fastblue，LFB)计算脱髓鞘区域面积；应RT87和GAP-43双标计算备用轴突区域面积；
(7)炎症反应情况
用分光光度法和免疫组织化学检测髓过氧化物酶(MPO)和ED-1在损伤节段的表达水平；
(8)轴突再生情况
按免疫组化常规步骤对不同种类的纤维，包括：总纤维染色(anti-NF-200)，5羟色胺能阳性神经纤维(anti-5-HT)，酪氨酸羟化酶阳性神经纤维(anti-TH)，降钙素基因相关肽神经纤维(anti-CGRP)进行免疫组织化学染色后，用相关软件计数和比较各组各种阳性纤维的数量、长度和密度。
(9)神经束路顺行和逆行追踪
术后不同时间点，参照SD大鼠立体定位图谱、调整坐标值，在立体定位系统引导下)，分别运用生物素化葡聚糖(BDA)和荧光金顺行和逆行追踪皮质脊髓束；运用霍乱毒素B(CDB)顺行追踪后索。顺行追踪取损伤移植区-宿主交界处头尾侧脊髓组织，镜下观察皮质脊髓束再生的情况。逆行追踪取损伤移植区至延髓薄束核和楔束核平面，观察背索向薄束核和楔束核靶区神经元定向再生的情况。
(10)移植细胞的转归
移植前用PKH-26标记移植细胞，以NSE、NeuN、MAP-2抗原标记神经元细胞，以oligodendrocytes抗原标记少突胶质细胞，以GFAP标记胶质细胞，行免疫组织化学单标和双标染色，观察各治疗组移植的HAF-NSCs向少突胶质细胞，神经元和星形胶质细胞分化的情况；检测细胞向损伤区的归巢现象；运用胶体金免疫电镜技术进行移植细胞标记染色后，观察移植细胞形成髓鞘的情况，并观察观察、比较移植物内及宿主神经元中细胞器结构的改变情况以及移植细胞的胞体和突起与宿主的胞体和突起之间突触形成情况以及移植细胞之间的联系。
(11)MP抗凋亡作用机制研究
观察损伤中心及周围各组细胞凋亡情况。实验一：根据试剂盒操作说明，行TUNEL染色(In Situ Cell Death Detection kit；Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)，计数损伤区及临近节段凋亡细胞数目。实验二：ELISA和免疫组织化学检测caspase-3、Fas和FasL的表达情况；实验三：Western blot检测Bax和Bcl2表达情况；
(12)统计学分析
实验将使用SPSS统计学软件对所有实验数据进行统计学处理。拟涉及到t检验、卡方检验、方差分析等统计学方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物，其特征在于，所述促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物为羊膜源神经干细胞和甲基强的松龙；药剂量为30mg/Kg～200mg/Kg。
2.一种验证权利要求1所述促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物的动物模型，其特征在于，所述动物模型为：选取健康成年SD大鼠，性别不限；切开皮肤；分离两侧椎旁肌，出血用低功率双极电凝止血；去除T10棘突，微型磨钻打开椎板后，暴露T10脊髓；打开硬脊膜，标准脊髓致伤器进行造模，制定标准动量；造模完成后逐层缝合皮下和皮肤，行HE染色观察模型的可靠性；造模前后用摄像机将大鼠的活动情况记录。
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