CN116271257B - 一种修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法，将PLGA和PEO溶解在DCM和DMF的复合溶剂中并搅拌均匀，然后在PLGA‑PEO溶液中加入甲基强的松龙，用混合溶液制备PLGA‑PEO甲基强的松龙复合纳米纤维；将HA溶于去离子水，将外泌体加入水溶液中，最后通过PLGA‑PEO甲基强的松龙复合纳米纤维分散在HA外泌体混合溶液中得到NFs@MP‑HA@Exo。本发明的修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法，合成的NFs@MP‑HA@Exo硬脊膜外贴附能通过渗透作用实现外泌体在脊髓组织的全层分布，并可以调节炎症反应和减少神经元凋亡，有效改善了脊髓损伤后的组织学和功能学结果。

Description

一种修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法。
背景技术
脊髓损伤（SCI）是一种高致残率、高致死率的中枢神经系统损伤。世界卫生组织（WHO）和欧美国家的流行病学研究表明，全世界脊髓损伤的发病率平均为每百万人10-40例，中国和美国都是脊髓损伤高发国家（每年每百万人中超过40人）；由于中枢神经系统的内在修复能力非常有限，大量患者正在与运动和感觉障碍、并发症和抑郁症作斗争；然而，脊髓损伤作为一种世界性难题，目前尚无有效的治疗手段；临床上现有的脊髓损伤治疗方法并不能实现有效的功能恢复，亟须找到治疗脊髓损伤的新方法；脊髓损伤后存在复杂的病理变化，其中残余神经元的数量和持续的炎症反应往往决定最终的预后。
当前的治疗措施针对干细胞和神经元的内源性再生与微环境稳态两个方面，主要包括干细胞移植，药物干预，组织工程等措施；伴随组织工程的快速发展和临床转化趋势，越来越多的组织工程材料应用于脊髓损伤修复并取得了一定的疗效；然而，既往的组织材料修复手段存在一些局限性：1、材料植入无法避免对硬膜等自身组织的破坏；2、修复机制较为单一，仅通过缓释药物或构建内环境等单一机制修复；本申请针对临床上高致死致残率的脊髓损伤亟待攻克的难题，即脊髓损伤后级联出现的炎症反应，神经元凋亡等突出问题，研发一种透明质酸水凝胶纤维复合支架贴片，实现对继发性脊髓损伤的有效治疗，构建的双释放体系复合贴片针对了脊髓继发性损伤病生理的时序特征缓释MP与雪旺细胞外泌体，既能有效控制炎症反应和神经元凋亡，又具有良好生物相容性及渗透性，同时也避免了有创植入后的神经胶质粘连。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法。
本发明提供的一种修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法，包括如下步骤：
1）将100mg PLGA和10mg PEO溶解在DCM和DMF的复合溶剂中并搅拌均匀，形成PLGA-PEO溶液；
2）在所述PLGA-PEO溶液中加入10mg甲基强的松龙，然后用混合溶液制备PLGA-PEO甲基强的松龙复合纳米纤维；
3）将90mgHA溶于去离子水，形成HA水溶液；然后将10mg外泌体加入1ml所述HA水溶液中，形成HA外泌体混合溶液；
4）通过将所述PLGA-PEO甲基强的松龙复合纳米纤维分散在所述HA外泌体混合溶液中得到透明质酸水凝胶纤维复合贴片。
优选的，所述DCM与DMF的比例为V:V=1:9。
相对于现有技术而言，本发明的有益效果是：
本发明的修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法，合成的NFs@MP-HA@Exo硬脊膜外贴附能通过渗透作用实现外泌体在脊髓组织的全层分布，并且可以调节炎症反应和减少神经元凋亡，有效改善了脊髓损伤后的组织学和功能学结果；生物相容性高，经复合贴片释放的外泌体与正常离心获取的外泌体在外形，直径及标志物蛋白方面无显著差异，并且与神经元和星形胶质细胞共培养也表明该材料对于神经细胞的形态及凋亡率无显著影响；相对无创，硬膜外植入贴片，避免了脑脊液渗漏、神经胶质粘连等手术相关并发症出现。
应当理解，发明内容部分中所描述的内容并非旨在限定本发明的实施例的关键或重要特征，亦非用于限制本发明的范围。本发明的其它特征将通过以下的描述变得容易理解。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为示出复合支架贴片的合成及表征的相关图，其中：
A图示出实施例1中NFs@MP-HA@Exo合成模式图；
B图示出实施例2中网络纤维（NF）合成的红外光谱图像；
C图示出实施例3中NF合成的荧光图像；
D-E图示出实施例4中NF的SEM图像和纤维直径分析；
图2为示出透明质酸水凝胶混合外泌体的表征的相关图，其中：
A图示出实施例5中HA@Exo的外泌体荧光分布图；
B图示出实施例6中HA@Exo的外泌体SEM图；
图3为示出透明质酸水凝胶及复合支架的实物图，其中：
A-B示出实施例7中透明质酸水凝胶及复合贴片NFs@MP-HA@Exo合成实例图；
图4为示出复合支架材料的生物安全性鉴定图，其中：
A-B图示出实施例8中对照外泌体（CExos）与NFs@MP-HA@Exo释放外泌体（RExos）的TEM图及粒径分析；
C-D图示出实施例9中NFs@MP-HA@Exo释放外泌体速率分析；
E图示出实施例10中CExos与RExos外泌体标志蛋白Western Blot鉴定；
F图示出实施例11共培养前后各组各时间荧光染色观察的神经元突起长度情况；
G图示出实施例11共培养前后各组观察的神经元细胞骨架分析；
H图示出实施例11共培养前后各组观察的神经元凋亡情况分析；
I图示出实施例11共培养前后各组观察的星形胶质细胞骨架分析；
图5为示出复合支架贴片对巨噬细胞表型的调节作用的相关图，其中：
A图示出实施例12与NFs@MP-HA@Exo共培养的巨噬细胞极化实验示意图；
B-C图示出实施例12与NFs@MP-HA@Exo共培养的巨噬细胞极化标记蛋白表达的荧光图及Western Blot鉴定；
D-E图为荧光及Western Blot量化分析图；
图6为示出复合支架贴片对巨噬细胞表型调节作用的相关机制图，其中：
F-L图示出实施例12与NFs@MP-HA@Exo共培养的巨噬细胞极化潜在TLR4/NF-kB及MAPK通路的Western Blot鉴定及量化分析；
图7为示出复合支架贴片对神经元的抗凋亡作用及相关机制图，其中：
A图示出实施例13与NFs@MP-HA@Exo共培养的神经元凋亡实验示意图；
B图，D图示出实施例13与NFs@MP-HA@Exo共培养的神经元凋亡标记蛋白表达的TUNEL染色及量化；
C图， E-I图示出实施例13与NFs@MP-HA@Exo共培养的神经元凋亡标记蛋白及潜在AKT/mTOR通路蛋白的Western Blot鉴定及量化；
图8为示出复合支架贴片的体内植入及外泌体有效释放鉴定的相关图，其中：
A-B图示出实施例14中NFs@MP-HA@Exo体内植入的模式图及实例图；
C-D图示出实施例15中体内植入NFs@MP-HA@Exo释放的外泌体被小胶质细胞和神经元吞噬的荧光染色；
E-F图示出实施例16中体内植入NFs@MP-HA@Exo释放的外泌体在连续脊髓矢状切面和冠状切面的分布情况的荧光染色图片；
图9为示出复合支架贴片的在脊髓损伤大鼠体内的炎症调节作用及相关机制的相关图，其中：
A图，B图示出实施例17激活态小胶质细胞在各组脊髓损伤区域的数量；
C-E图示出实施例17小胶质细胞在各组脊髓损伤区域的极化状态；
F图，G图示出实施例17各组脊髓组织极化相关蛋白的Western Blot鉴定及量化；
图10为示出复合支架贴片的在脊髓损伤大鼠体内的抗神经元凋亡作用的相关图，其中：
A图，C图示出实施例18残存神经元在各组脊髓前角区域每视野下的数量；
B图，D图，E图示出实施例18各组脊髓损伤区域的神经纤维和星形胶质细胞的免疫荧光及量化；
图11为示出复合支架贴片的在脊髓损伤大鼠体内的神经元电活性鉴定的相关图，其中：
F-K图示出实施例19脊髓组织立体切片获取的神经元电活动检查模式图及相关结果；
图12为示出复合支架贴片对于脊髓损伤大鼠的组织学改善结果的相关图，其中：
A图示出实施例20各组脊髓组织在损伤后28天水平切面NF200/GFAP荧光染色；
B图示出实施例20各组脊髓组织在损伤后28天水平切面HE染色；
图13为示出复合支架贴片对于脊髓损伤大鼠的功能学改善结果的相关图，其中：
A图示出实施例21各组大鼠在损伤后第1, 3, 7, 14, 21, 28天BBB评分；
B-D图示出实施例21各组大鼠在损伤后28天运动诱发电位（MEP）实验模式图及结果；
E-J图示出实施例21各组大鼠在损伤后28天catwalk步态分析；
图14为示出复合支架贴片对于脊髓损伤大鼠炎症及凋亡相关通路的作用与体外研究类似的结果的相关图，其中：
A-B图示出实施例22各组大鼠脊髓组织在损伤后第3天TLR4/NF-κb， MAPK及Akt/mTOR通路相关蛋白表达情况；
C图为体内植入NFs@MP-HA@Exo修复脊髓损伤的机制概念图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
脊髓损伤后存在复杂的病理变化，其中残余神经元的数量和持续的炎症反应往往决定最终的预后；原发创伤后，局部出血导致炎症细胞、血管活性肽和细胞因子涌入脊髓；促凋亡信号通路的激活和缺血损伤导致大量功能神经元丧失和脱髓鞘，从而完全破坏局灶性脊髓微环境；损伤后炎症引发的级联反应，加上血-脊髓屏障的破坏，逐渐加重脊髓肿胀，最终导致脊髓继发性损伤。脊髓发生细胞内钙超载、氧自由基诱导的脂质过氧化、炎症反应和神经元凋亡，影响脊髓微环境的稳定性。因此，局部损伤后，调节微环境，激活内源性再生过程，促进损伤脊髓的修复是治疗脊髓损伤的关键。
外泌体（Exo）作为一种非细胞药物，其修复作用近年来得到了广泛的研究；外泌体是一种直径约50-100 nm的小泡，产生于内体腔室，充满功能蛋白、microRNAs （miRNAs）和mRNA；它们参与细胞间通讯，并在许多生理和病理条件下持续分泌；它们在宿主细胞中的亚粒子性质使它们通过旁分泌机制作为微环境调节器来缓解刺激。最近的报道表明，来自雪旺细胞的外泌体支持外周神经系统损伤后轴突的维持和再生。在外周神经系统中，SCs可促进损伤后轴突的分化和增殖，同时清除髓鞘和轴突片段。与此同时，由SCs分泌的外泌体已被用于修复中枢神经系统内的损伤。因此，外泌体已成为脊髓损伤治疗中最有希望的发展方向。
甲基强的松龙（Methylprednisolone，MP）是一种合成糖皮质激素，是FDA唯一批准临床用于治疗急性脊髓损伤的药物，对改善SCI后的微环境有显著作用。MP可调节脊髓损伤后的神经炎症反应，进而增加损伤部位白细胞的迁移、激活和分化。还能增加抗炎细胞因子的释放，减少炎症细胞外渗，促进神经元存活，缓解SCI诱导的炎症微环境。
基于上述陈述，我们设计了一种由纳米纤维支架（NF）和透明质酸水凝胶（HA） 组成的复合贴片（NFs@MP-HA@Exo）来修复脊髓损伤。与传统的侵入性治疗方法（如疤痕切除、局部细胞药物注射、组织支架植入）相比，该贴片不仅提供了一种无创的脊髓损伤修复策略，而且具有外泌体和甲强的松龙的双重释放功能。能有效抑制神经元凋亡和炎症反应，从而改善脊髓损伤后的神经功能，为临床无创修复脊髓损伤提供了新思路。
本申请研发一种透明质酸水凝胶纤维复合支架贴片，拟通过静电纺丝法制备了负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚氧化乙烯（PLGA-PEO）的甲基强的松龙纳米纤维作为贴片骨架，结合透明质酸水凝胶和雪旺细胞外泌体构建具有双释放体系复合贴片的策略，实现对继发性脊髓损伤的有效治疗。构建的双释放体系复合贴片针对了脊髓继发性损伤病生理的时序特征缓释MP与雪旺细胞外泌体，既能有效控制炎症反应和神经元凋亡，又具有良好生物相容性及渗透性，同时也避免了有创植入后的神经胶质粘连。
依据脊髓继发性损伤的时空特征，及组织材料有创植入的缺陷，我们设计并制备了可时序释放甲基强的松龙和雪旺细胞外泌体的透明质酸水凝胶纤维复合贴片（NFs@MP-HA@Exo）来缓解脊髓损伤后抑制性微环境及改善功能恢复。
其中，透明质酸水凝胶有助于保护雪旺细胞外泌体。此外，在水相环境中，甲基强的松龙和外泌体能够缓慢释放到达病灶，发挥炎症调节和抗凋亡作用。
实施例1
NFs@MP-HA@Exo的合成
NFs@MP-HA@Exo分两步合成；制作过程包括两个步骤：
第一步：将100mg PLGA和10mg PEO溶解在DCM和DMF（V:V=1:9）的复合溶剂中并搅拌均匀，然后在PLGA-PEO溶液中加入10mg甲基强的松龙，然后用混合溶液制备PLGA-PEO甲基强的松龙复合纳米纤维。
第二步：将90毫克HA溶于去离子水，然后将10毫克外泌体加入1mlHA水溶液中，最后通过上述PLGA-PEO甲基强的松龙复合纳米纤维分散在HA外泌体混合溶液中得到NFs@MP-HA@Exo。
实施例2
NF的红外光谱测试：
参照图1
图1中A图为NFs@MP-HAh@Exo合成模式图；
B图为复合纤维支架的红外光谱分析；
C图为纤维支架的免疫荧光染色；
D图为纤维支架的透射电镜图片；
E图为纤维的直径统计分析。
结果见图1中的B图，图1中的B图为纤维支架的免疫荧光染色，说明复合纳米纤维内成功负载甲基强的松龙。
实施例3
NF合成的荧光图像：通过双光子显微镜拍摄获取纤维荧光成像。
结果见图1中的C图，说明复合纳米纤维形成网状结构，具有不同大小孔洞。
实施例4
NF的SEM图像和纤维直径分析：
结果见图1中的D图，图1中的E图，复合纳米纤维具有均匀的直径分布（集中在500-700纳米）和光滑的表面。
实施例5
参照图2
图2中A图为透明质酸水凝胶中外泌体分布的3D荧光图；
B图为透明质酸水凝胶中外泌体分布的扫描电镜图。
HA@Exo的外泌体荧光分布：通过使用PKH26将外泌体标记，将外泌体混合至HA中避光保存。共聚焦显微镜下层扫描获得3D成像，观察外泌体在HA中的空间分布。
结果见图2中的A图。结果均表明外泌体在水凝胶中能够被较好固定，呈现为均匀分布状态。
实施例6
参照图2中的B图，样品HA@Exo的外泌体SEM图
实施例7
透明质酸水凝胶及复合贴片NFs@MP-HA@Exo合成实例图。
将制备完成的纤维支架和含外泌体的透明质酸水凝胶在生物安全柜中无菌混合，获得NFs@MP-HA@Exo：
图3中的A图，图3中的B图可见NFs@MP-HA@Exo成品。
实施例8
对照组外泌体（CExos）与NFs@MP-HA@Exo释放外泌体（RExos）的TEM图及粒径分析。
参照图4 复合贴片的生物相容性评价
图4中A图为CExos与RExos的TEM对比图；
B图为CExos与RExos的粒径对比图；
C图为NFs@MP-HA@Exo外泌体累积释放比例分析；
D图为NFs@MP-HA@Exo外泌体每日释放量评估；
E图为CExos与RExos外泌体标志蛋白Western Blot鉴定；
F图为对照组与NFs-HAh组神经元轴突长度对比；
G图为对照组与NFs-HAh组神经元细胞骨架对比；
H图为对照组与NFs-HAh组神经元活死染色对比图；
I图为对照组与NFs-HAh组星形胶质细胞细胞骨架对比。
如图4中的A图，图4中的B图所示，为了评价贴片对雪旺细胞外泌体性质的影响，通过透射电镜观察未经处理的外泌体和复合贴片释放的外泌体的形态，发现形态上没有明显差异。通过纳米粒径分析，受控施万细胞和复合贴片的外泌体的纳米粒径都在110-150纳米之间，没有明显差异。
实施例9
NFs@MP-HA@Exo释放外泌体速率分析
如图4中的C图、D图，为了观察复合贴片的外泌体释放率，检测了每天从复合贴片中释放的外泌体数量（μg）。
结果表明外泌体从复合贴片中释放了14天，90%以上的外泌体最终被释放出来。
实施例10
CExos与RExos外泌体标志蛋白Western Blot鉴定。
将从复合贴片中释放的外泌体与对照组外泌体对比，分别收集相应的蛋白，鉴定p75-NTR、CD63、CD9和TSG101的表达水平差异。
结果如图4中的E图 ，Western blot分析显示对照施万细胞外泌体与复合贴片释放外泌体外泌体表面标记蛋白p75-NTR、CD63、CD9和TSG101的表达无显著差异。
实施例11
分别提取原代神经元和星形胶质细胞，观察材料对神经元和星形胶质细胞的生物安全性的影响。将与复合贴片共培养的两种细胞与正常培养的细胞进行对比。观察第1，3，7，14天神经元突起长度，神经元突起分支数量，细胞死亡数量以及星形胶质细胞形态变化。
如图4中的F-I图，提取原代皮层神经元后，分别于第1、3、7、14天对两组细胞进行免疫荧光染色。应用Tuj-1和F-actin分别标记神经元及其细胞骨架蛋白。免疫荧光结果显示，对照组与复合材料组神经元形态及轴突、树突长度无明显差异。提取原代星形胶质细胞后，分别在正常培养基和含有复合贴片的培养基中共培养。采用GFAP标记星形胶质细胞。免疫荧光显示，两组星形胶质细胞形态无明显差异（图3中的I图）。提取原代皮层神经元，分别在正常培养基和含有复合贴片的培养基中共培养，对照组与NFs-Hah组死亡细胞百分比无明显差异。
实施例12
复合贴片水凝胶体外促进巨噬细胞M2表型极化
将原代巨噬细胞与复合贴片共培养，原代巨噬细胞以1.5*10^4/ml密度种至24孔板内，分4组培养，分别为Control组，LPS组，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组。其中，LPS的浓度为500ng/ml。共培养24小时后，收集各组细胞分别进行免疫荧光染色和Westernblot分析。
NFs@MP-HAh为含甲基强的松龙的支架水凝胶。
参照图5中A图为与NFs@MP-HA@Exo共培养的巨噬细胞极化实验示意图；
B图为与NFs@MP-HA@Exo共培养的巨噬细胞极化标记蛋白表达的荧光图；
C图为各组巨噬细胞极化相关蛋白Western Blot鉴定；
D-E图为荧光及Western Blot量化分析；
图6为示出复合支架贴片对巨噬细胞表型调节作用的相关机制图，其中：
F-L图示出实施例12与NFs@MP-HA@Exo共培养的巨噬细胞极化潜在TLR4/NF-kB及MAPK通路的Western Blot鉴定及量化分析。
如图5，免疫荧光染色检测M1型和M2型相关巨噬细胞标志物的表达。LPS刺激后，M1型巨噬细胞表型标志物iNOS的表达上调近6倍。在NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组，iNOS的表达分别仅上调2.8倍和2倍。作为M2型巨噬细胞表型标志物的Arg-1在LPS刺激后持续升高，而物质共培养组的Arg-1表达进一步上调。与对照组相比，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组Arg-1表达分别上调3.6倍和5.2倍。同样，western blot结果也显示，复合贴片可有效降低LPS诱导的iNOS上调，上调Arg-1的表达。此外， Western blot显示LPS组巨噬细胞TLR4、p-p65/p65、MAPK相关蛋白表达明显上调， NF-κB抑制蛋白p-IκB表达下调。相比之下，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组对TLR4蛋白上调和NF-κB和MAPK关键相关蛋白的激活有抑制作用。
实施例13
复合贴片水凝胶体外抑制神经元凋亡。
参照图7中A图为与NFs@MP-HA@Exo共培养的神经元凋亡实验示意图；
B图为与NFs@MP-HA@Exo共培养的神经元凋亡标记蛋白表达的TUNEL染色；
C图为各组神经元凋亡相关蛋白及潜在通路的Western Blot鉴定；D-I图为荧光及Western Blot量化分析。
将原代神经元与复合贴片共培养，原代神经元以1.5*10^4密度种至24孔板内，分4组培养，分别为Control组，LPS组，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组。其中，LPS的浓度为500ng/ml。共培养24小时后，收集各组细胞分别进行免疫荧光染色和Western blot分析。
TUNEL染色：将提取的初级神经元平铺在24孔板上，密度为1.5*10^4。在培养的第7天分批给予干预措施，干预后24小时用PBS洗去培养基。用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，然后用PBS再次清洗。用0.25% Triton-X100在室温下孵化细胞5分钟，然后再次清洗。根据一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（C1086，Beyotime Biotechnology）的说明，制备TUNEL染色液并在室温下黑暗中孵育1小时。PBS洗涤3次后，用抗荧光淬灭安装介质密封切片，在荧光显微镜下观察。
如图7中的B图，图7中的D图，TUNEL染色检测神经元凋亡水平。统计结果显示，对照组神经元凋亡水平约为7%，部分视野未见神经元凋亡（数据中未显示）。LPS组神经元凋亡数量明显增加，约占总数的39%。NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组神经元凋亡水平分别有效降低约33%和20%。此外，凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2的Western blot结果显示，NFs@MP-HAH组和NFs@MP-HAH@Exo组均能有效降低Cleaved-Caspase3和Bax的表达，上调Bcl-2的表达，而NFs@MP-HAH@Exo组的作用更为明显。我们发现Akt/mTOR通路在神经元凋亡中起作用。Western blot结果显示，LPS组p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR表达较对照组明显降低，NFs@MP-HAH组和NFs@MP-HAH@Exo组可有效上调p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR表达，其中以NFs@MP-HAh@Exo组效果最为显著。
实施例14
NFs@MP-HA@Exo大鼠体内植入。
（1）脊髓损伤模型的建立
建立了Wistar大鼠脊髓挫伤模型。选择以Wistar大鼠胸椎的最高凸起处为中心，做一个2-3厘米长的切口，分离大鼠的皮肤和皮下筋膜。该手术逐层进行剥离椎旁区域周围的软组织，露出T10椎板。用W.M.Keck中心的III型冲击器（美国）以10克×2.5厘米的速度损伤脊髓，形成脊髓损伤模型。所有模型动物都按照常规标准进行单个隔离饲养，使用柔软的可吸收的垫料，并定期通风。环境温度控制在22-25℃，相对湿度保持在40-70%。术后连续三天在大鼠的大腿上肌肉注射青霉素（每天2次）。每天进行两次人工排尿。每次人工排尿后，用碘伏对尿道口进行消毒。术后每天更换垫料。
（3）实验动物分组
脊髓损伤模型分为3组，SCI组（n=4）、NFs@MP-HAh组（n=4）、NFs@MP-HAh@Exo组（n=4），将生理盐水组（n=4）作为对照组。
（4）统计学方法
所有数据以平均值±SEM表示，统计分析由GraphPad Prism 9.2.0（GraphPadSoftware, San Diego, CA, USA）进行。组间差异通过单因素方差分析和双因素方差分析评估。P值表示为*p < 0.05，**p < 0.01，和***p < 0.001。
结果：
参照图8中A-B图为Wistar大鼠脊髓损伤造模及材料植入；
C图为体内植入NFs@MP-HA@Exo释放的外泌体被小胶质细胞吞噬的荧光染色；
D图为体内植入NFs@MP-HA@Exo释放的外泌体被神经元吞噬的荧光染色；
E图为体内植入NFs@MP-HA@Exo释放的外泌体在连续脊髓矢状切面的分布情况的荧光染色图片；
F图为体内植入NFs@MP-HA@Exo释放的外泌体在连续脊髓冠状切面的分布情况的荧光染色图片。
如图8中的A图， 图8中的B图，为了构建一种新型的复合贴片治疗大鼠脊髓损伤的体内作用模式，采用Impact Model III构建脊髓损伤标准化挫伤模型，损伤局部覆盖该贴片。脊髓损伤后，损伤中心立即形成明显的血肿，复合贴片覆盖在血肿表面，释放药物和外泌体。
实施例15
体内植入NFs@MP-HA@Exo释放的外泌体被小胶质细胞和神经元吞噬
为了评估贴片释放的外泌体在体内是否能被靶细胞吸收，我们使用PKH26染料标记复合贴片中的外泌体，并通过免疫荧光染色分析手术后外泌体的吞噬情况；对脊髓损伤区域的切片及免疫荧光染色标记外泌体，小胶质细胞及神经元。
结果表明，损伤区CD68+小胶质细胞和NeuN+神经元均能与PKH26+外泌体共定位，说明贴片在体内释放的外泌体能被靶细胞有效吸收（图8中的C图，图8中的D图）。
实施例16
体内植入NFs@MP-HA@Exo释放的外泌体在连续脊髓矢状切面和冠状切面的分布
脊髓损伤后3天，为了评估复合纤维材料释放外泌体的渗透作用，对脊髓组织间隔200um进行连续矢状面和间隔100um进行冠状面切片。
如图8中的E图，图8中的F图，脊髓损伤后加载外泌体的复合贴片能有效穿透损伤区域，被靶细胞吸收，调节细胞活性和功能。
实施例17
NFs@MP-HA@Exo大鼠体内植入抑制炎症反应及促进巨噬细胞极化
脊髓损伤模型分为3组，SCI组（n=8）、NFs@MP-HAh组（n=8）、NFs@MP-HAh@Exo组（n=8），术后3天取脊髓组织切片。
参照图9中A-B图为激活态小胶质细胞在各组脊髓损伤区域的数量；
C-E图为小胶质细胞在各组脊髓损伤区域的极化状态的免疫荧光及量化；
F-G图为各组脊髓组织极化相关蛋白的Western Blot鉴定及量化。
如图9中的A图，图9中的B图，为探讨复合贴片通过药物和体内释放外泌体对脊髓损伤急性期炎症微环境的抑制作用，术后3天取脊髓组织切片。应用CD68和GFAP分别标记激活的骨髓巨噬细胞/小胶质细胞和星形胶质细胞，用于评价各组脊髓损伤急性期后炎症细胞浸润情况。免疫荧光结果显示，与SCI组相比，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组CD68+细胞数量均有下降趋势，其中NFs@MP-HAh@Exo组CD68+细胞数量下降最为明显。用INOS和Arg-1分别标记巨噬细胞/小胶质细胞的M1和M2极化状态，用Iba-1标记局部巨噬细胞/小胶质细胞。免疫荧光强度显示，与SCI组相比，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组iNOS表达均下调，其中以NFs@MP-HAh@Exo组下调最为明显（图9中的C-E图）。与SCI组相比，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组Arg-1表达均上调，其中NFs@MP-HAh@Exo组上调更为明显。Western blot结果显示，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组均较SCI组iNOS表达下调，Arg-1表达上调，其中以NFs@MP-HAh@Exo组iNOS上调，Arg-1下调最为明显（图9中的F图，图9中的G图）。
实施例18
脊髓损伤部位残存神经元及GFAP/NF200表达情况评估
参照图10中A、C图为残存神经元在各组脊髓前角区域每视野下的数量；
B、D、E图为小胶质细胞在各组脊髓损伤区域的极化状态的免疫荧光及量化；
图11为示出复合支架贴片的在脊髓损伤大鼠体内的神经元电活性鉴定的相关图，其中：
F图为脊髓组织立体切片获取的神经元电活动检查模式图；
G-K图为脊髓组织立体切片获取的神经元电活动热图及参数量化分析。
脊髓损伤模型分为3组，SCI组（n=4）、NFs@MP-HAh组（n=4）、NFs@MP-HAh@Exo组（n=4），将生理盐水组（n=4）作为对照组。免疫荧光标记神经元，观察损伤后3天脊髓损伤部位周围神经元的存活情况及GFAP/NF200表达情况。
从诱导细胞凋亡和剩余神经元数量两方面探讨复合贴片的治疗作用。这些神经元的功能特征也被评估。与SCI组相比，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组神经元凋亡比例均明显下降，其中以NFs@MP-HAh@Exo组下降最为明显（图10中的A图，图10中的C图）。对NeuN和GFAP进行免疫荧光染色，观察脊髓损伤部位周围神经元的存活情况。NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组脊髓前角神经元数量均较SCI组明显增加，其中NFs@MP-HAh@Exo组趋势明显。这说明复合贴片可以促进脊髓损伤后神经元的存活。应用NF200和GFAP的免疫荧光强度观察脊髓损伤部位周围神经元和星形胶质细胞的数量。显然，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组NF200的表达均高于SCI组，而GFAP的表达结果正好相反（图10中的B图，图10中的D图，图10中的E图）。这说明复合贴片能有效提高神经元的存活率，抑制星形胶质细胞的活化。
实施例19
分离的脊髓组织MEA测定
脊髓中的神经元可以释放电信号，这被认为是其主要特征之一，也是评估神经元功能的重要指标。对于神经元电信号的测量，使用了多电子阵列（MEA）记录。使用AccuSpotClassic MEA 24孔板，每孔16个微电极。脊髓损伤28天后，迅速取出各组大鼠的脊髓，放入含有神经营养因子的脑脊液中，并同时输入一定浓度的O2和CO2。然后用振动切片机对脊髓组织进行切片，最后将切下的脊髓组织切片快速放置在电极板上进行检测。在体外用AxionMaestro MEA读取器进行Axion基线记录，并对培养物的电活动进行10分钟的记录。用AxIS软件对数据进行分析。在体外每10秒进行一次记录。
使用离体脊髓切片和MEA分析来评估体内神经元的电生理活性（图11中的F图）。神经元释放spike速率（spike/10s）的热图显示，脊髓损伤后神经元电生理活性明显下降，而治疗组电生理活性增加，NFs@MP-HAh@Exo组趋势更明显，说明复合贴片可以帮助神经元抵抗脊髓损伤作用（图11中的G图）。MEA分析结果（10秒）显示，实验组神经元在Spikes、Active电极、Burst和Burst比率方面均有明显改善。与NFs@MP-HAh组相比，NFs@MP-HAh@Exo组的这种趋势更为明显。这些数据表明，复合贴片可以改善脊髓损伤后神经元放电功能及其他电生理活动（图11中的H-K图）。
实施例20
各组脊髓组织在损伤后28天水平切面组织学评价
参照图12中A图为各组脊髓组织在损伤后28天水平切面NF200/GFAP荧光染色；
B图为各组脊髓组织在损伤后28天水平切面HE染色。
手术后28天各组脊髓组织被取出，获取10um厚度的组织切片，将各组脊髓组织切片进行免疫荧光和HE染色。免疫荧光染色GFAP/NF200分别标记星形胶质细胞和神经纤维，观察损伤部位周围神经出芽及活化星形胶质细胞水平。HE染色观察脊髓组织空洞的面积。
如图12中的A图，应用GFAP和NF200分别标记星形胶质细胞和神经纤维。免疫荧光染色结果显示SCI组空化明显，空洞周边GFAP荧光强度最大，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组术后28天空化面积均缩小，而NFs@MP-HAh@Exo组空化面积最小，NF200标记的神经丝长入空洞内最长。此外，脊髓HE染色评价植入复合贴片对缓解术后炎症反应和神经元凋亡引起的脊髓空化的效果。NFs@MP-HAh@Exo组空化最小，说明加载MP和雪旺细胞外泌体的复合贴片可有效调节炎症微环境，减少细胞凋亡，改善继发性损伤（图12中的B图）。
实施例21
各组脊髓组织在损伤后28天功能学评价
（1）BBB评分
参照表格1 BBB评分，根据21分制评估大鼠在开放场地的后肢运动。评估时间点是在手术后的第1、3、7、14、21和28天。评估由两名双盲评分员对关节活动次数、前后肢运动协调性和后肢负重能力进行评分。
（2）电生理
电生理评估是在手术后第28天进行的。简而言之，对大鼠进行麻醉，用电生理仪（YRKJ-G2008；珠海亿瑞基有限公司，中国广东）记录运动诱发电位（MEP）。刺激电极放置在头颈后，记录电极放置在后肢腓肠肌上。进行一次5mA的刺激，以刺激皮质运动区。
（3）catwalk
简而言之，大鼠被放在完全黑暗的玻璃地板上从左到右行走，它们的爪印由下面的高速摄像机记录。应用Catwalk软件10.6来标记爪印，并分析大鼠运动过程中的步态参数。规律性指数（%）是衡量大鼠运动过程中四肢协调性的一个综合参数。
表格 1 BBB评分
结果：
参照图13中A图为各组大鼠在损伤后第1，3，7，14，21，28天BBB评分；
B-D图为各组大鼠在损伤后28天运动诱发电位（MEP）实验模式图及量化结果；
E图为各组大鼠在损伤后28天catwalk脚印分析;
F图为各组大鼠在损伤后28天catwalk步序协调及后肢承力分析；
G-J图为各组大鼠在损伤后28天catwalk参数量化分析。
分别于术后第3、7、14、21、28天进行BBB评分。结果显示，NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组均能有效改善大鼠SCI后后肢运动功能，其中NFs@MP-HAH@Exo组功能恢复最为显著（图13中的A图）。并于术后第28天记录各组大鼠的MEP，进行对比分析。电生理结果显示，与对照组相比，SCI组潜伏期明显变长，振幅明显减小。NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组都能有效改善延迟和振幅参数，而NFs@MP-HAh@Exo组的参数最显著（图13中的B-D图）。为了更好地分析各组大鼠SCI后的功能恢复情况，采用catwalk分析各组损伤大鼠的脚印步态（图13中的E-J图）。可见SCI组大鼠后肢运动功能严重受损，行走时后肢步态紊乱，支撑力量减弱。NFs@MP-HAh组大鼠步态协调性有所改善，步幅、后肢接触面积和后肢支撑力量均有所增加。NFs@MP-HAh@Exo组大鼠比NFs@MP-HAh组大鼠功能改善更明显，尤其是步态协调。这些结果表明，NFs@MP-HAh组对于SCI后继发性损伤均能得到一定程度的恢复，而NFs@MP-HAh@Exo组在组织学和功能上均能获得更好的修复效果。
实施例22
NFs@MP-HAh@Exo修复脊髓组织的潜在通路
参照图14中A，B图为各组大鼠脊髓组织在损伤后第3天TLR4/NF-κb， MAPK及Akt/mTOR通路相关蛋白表达情况及量化结果；
C图为体内植入NFs@MP-HA@Exo修复脊髓损伤的机制概念图。
为了更深入地了解复合贴片修复SCI的潜在机制，在术后第3天从脊髓组织中提取蛋白，并进行TLR4/NF-κB和MAPK通路验证（图14）。结果显示，脊髓损伤后第3天，TLR4在局部组织中表达明显上调，是对照组的2.5倍左右。NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组TLR4表达部分降低，NFs@MP-HAh@Exo组TLR4表达最低，约为对照组的1.5倍。同样，NF-κB和MAPK通路关键蛋白如p-p65/p65、p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-ERK/ERK在SCI后表达上调。NFs@MP-HAh组和NFs@MP-HAh@Exo组可有效抑制SCI后NF-κB和MAPK通路关键蛋白的表达。p-IκB在SCI后明显下调，NFs@MP-HAh组无明显改善，而在NFs@MP-HAh@Exo组可获得有效上调，说明复合贴片对NF-κB通路抑制的调控作用显著。此外，Akt/mTOR通路也得到了验证。Western blot结果显示，脊髓损伤后p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR表达明显降低。与SCI组相比，NFs@MP-HAh@Exo组p-Akt/Akt水平改善不明显，而NFs@MP-HAh组p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR水平明显上调。
这表明，含有MP和雪旺细胞外泌体的复合贴片可通过TLR4/NF-κB、MAPK和Akt/mTOR通路调节巨噬细胞极化和减少残余神经元凋亡，体内实验结果与体外实验结果一致。
在本说明书的描述中，术语“连接”、“安装”、“固定”等均应做广义理解，例如，“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将100mg PLGA和10mg PEO溶解在DCM和DMF的复合溶剂中并搅拌均匀，形成PLGA-PEO溶液；
2）在所述PLGA-PEO溶液中加入10mg甲基强的松龙，然后用混合溶液制备PLGA-PEO甲基强的松龙复合纳米纤维；
3）将90mgHA溶于去离子水，形成HA水溶液；然后将10mg外泌体加入1ml所述HA水溶液中，形成HA外泌体混合溶液；
4）通过将所述PLGA-PEO甲基强的松龙复合纳米纤维分散在所述HA外泌体混合溶液中得到透明质酸水凝胶纤维复合贴片。
2.根据权利要求1所述的修复脊髓损伤用的复合支架贴片的制作方法，其特征在于，所述DCM与DMF的比例为V:V=1:9。
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