CN103494865A

CN103494865A - 人源干细胞与绞股蓝生物活性物质组合物及其制备方法

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Publication number: CN103494865A
Application number: CN201310491295.2A
Authority: CN
Inventors: 张正前
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-10-13
Filing date: 2013-10-13
Publication date: 2014-01-08

Abstract

本发明公开了一种人源干细胞与绞股蓝生物活性物质组合物及其制备方法。人源干细胞生物活性物质制备：首先提取健康人源干细胞，经体外培养，扩增，收集特定阶段干细胞，低温萃取其生物活性物质；绞股蓝生物活性物质制备：精选优质绞股蓝鲜品，利用现代超低温、纳米与超声波等现代生物技术萃取其生物活性物质。最后按照一定比例配伍两类生物活性物质形成组合物，该组合物富含干细胞因子群、多肽、天然免疫蛋白、核酸、皂苷、黄酮类、多糖、氨基酸等多种活性物质。该组合物可开发成具有细胞生物学活性功能的产品，作用于人体后可活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，调节血脂、血糖与血压，增强机体免疫力，抗衰老等功效。人源干细胞与绞股蓝生物活性物质组合物。

Description

人源干细胞与绞股蓝生物活性物质组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及：1，从健康人的脐带或胎盘组织中提取干细胞，经体外培养、扩增，然后利用此类干细胞制备生物活性物质；2，精选优质绞股蓝鲜品，利用现代超低温纳米萃取技术高效提取皂苷、黄酮类、多糖等多种活性物质，并最大程度保持其生物活性：3，将人源干细胞生物活性提取物与绞股蓝生物活性提取物按一定比例配伍形成组合物并应用。

背景技术

国家“十二五”重大专项规划指出再生医学是未来医学革命的核心，而干细胞技术又是再生医学的核心，深度开发干细胞具有重大现实意义。

干细胞(stem cell)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是形成人体各种组织、器官的“祖宗细胞”、“万能细胞”。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞，根据分化潜能大小又可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。

干细胞可以产生和分泌大量生物活性因子，这些干细胞生物活性因子可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素6与7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，其中大部分细胞因子都具有促进细胞增殖、分化作用，抑制炎症因子与抗凋亡效应密切相关等；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，从而抵御或修复自身和外界因素对机体细胞的损伤。研究表明人体骨髓、血管、脂肪组织、骨骼肌、心脏和大脑，也包括在肺、肝、胰腺、消化道、皮肤、视网膜、乳房、卵巢、前列腺和睾丸的上皮内均可分离到相应的干细胞。理论上，干细胞可以修复身体任何部位的组织缺损，可以利用干细胞去治疗遗传疾病、恶性疾病和退变性疾病等。2007年10月10日，国际干细胞权威杂志《Cell》系列刊物《Cell-Stem Cell》的一篇研究论文揭示干细胞功能下降可导致人类衰老，并证明干细胞衰老过程是受到外在和内在因素共同调控的。最新科学研究揭示，心血管疾病、糖尿病等的发生机理与干细胞再生修复有密切关系。

因此，利用干细胞分泌产生的生物活性因子或干细胞内的生物活性物质激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。

绞股蓝[Gnostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino]为葫芦科绞股蓝属Gnostemma植物，又名七叶参、神仙草等，本属植物全世界约13种，我国有11种2变种，其中7种为我国特有。1986年国家科委把绞股蓝列为“星火计划”的中药材开发项目首位，2001年国家林业局在《国家重点保护野生植物名录》中将绞股蓝调整为国家重点保护植物，2002年国家卫生部将其正式列为新资源药食两用，并将其列入保健品名单。我国绞股蓝资源丰富，开发前景广阔。

绞股蓝含有绞股蓝皂苷、黄酮类、多糖、氨基酸、微量元素等多种成分。民间用以治疗咳嗽、痰喘、慢性支气管炎、传染性肝炎等疾病。现代药理实验证明，绞股蓝具有抗肿瘤、延长细胞寿命、抗疲劳、增强机体免疫功能、抗溃疡、防治糖皮质激素副作用、调节脂质代谢、降低过氧化脂质、镇静催眠、镇痛，防治老年性白发、狐臭、美润皮肤等多方面作用。现已被开发用来降血脂、降血糖、平衡血压、抗癌、提高免疫力以及抗衰老等。

鉴于上，我们研究开发从人源干细胞和绞股蓝中提取生物活性物质，同时避免萃取过程中高温处理对温敏活性物质的损耗，利用这两类生物活性物质组合物发挥综合效应，活化人体自身干细胞来生理性修复或替代机体损伤、病变和衰老的组织细胞，调节血脂、血糖与血压，增强机体免疫力，从而延缓衰老。

发明内容

本发明的目的是：1、提供干细胞与绞股蓝生物活性物质的制备方法；2、提供一种干细胞生物活性物质与绞股蓝生物活性物质组合物的制备方法及其应用。

本发明的技术方案如下：

从健康人的脐带或胎盘中提取干细胞，使之在体外培养、扩增，并维持干细胞的高增殖能力和稳定性状。脐带或胎盘干细胞体外最多传代至第5代，此时的干细胞不但产量大，而且性状稳定，收集此时细胞。调整细胞至合适浓度密封于冻存管中，经液氮反复冻融至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，即可获得高纯度的干细胞生物活性物质群。整个过程要求无细菌、真菌和支原体等污染。

精选优质绞股蓝鲜品，清洗、去老叶、切碎等预处理，冻干干燥，将脱水绞股蓝转移至超低温环境中一定时间，使其硬化变脆。取出分别进行超低温微米级与纳米级粉碎，研磨，获得大小均一的纳米级颗粒，且低温保证了活性物质的最低损耗。将绞股蓝纳米粉置5倍重量的37℃纯水中超声波抽提2小时，再离心，抽滤分离。混合溶液经冷凝干燥，去水分，即可获得高活性绞股蓝萃取物。

最后，将从人源干细胞和绞股蓝中提取的生物活性物质按照一定比例配伍形成组合物，该组合物富含干细胞因子群、多肽、天然免疫蛋白、核酸、皂苷、黄酮类、多糖、氨基酸等多种活性物质，可促进机体干细胞增殖、分化，提高身体免疫力和抗衰老作用。该活性物质组合物可制成片剂、粉剂或胶囊，在医学和保健领域有极佳的应用前景。

本发明首次将人源干细胞和绞股蓝生物活性提取物进行配伍，在发挥各自优势的基础上协同作用，使之发挥更大的综合效应，从而更好地调节血脂、血糖、血压，提高身体免疫力和抗衰老等，其效果优于单独使用干细胞活性物或绞股蓝提取物。

具体实施方式

实施例1、脐带或胎盘干细胞生物活性物质的制备

从健康人的脐带或胎盘组织提取干细胞，此干细胞主要为间充质干细胞，获得的干细胞进行体外培养、扩增。原代细胞收集后按1∶2比率进行传代培养，当细胞约80％汇合时，利用胰酶进行消化、收集，按相同的比率进行传代，最多传代培养至第5代，收集5代以内(包括第5代)的细胞，此时收集的干细胞生物学性状稳定，增值能力强，同时收集培养、扩增过程中更换的废培养液于-80℃冰箱中保存。具体过程如下：

1、采集健康人的脐带；

2、去掉脐带内血管和外层薄膜；

3、将脐带组织剪切成1～2mm³大小的小块；

4、将剪切后小块种植于加有无血清间充质干细胞培养液的培养皿(直径为100mm)中，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养；

5、每3～4天半量换液，培养14～16天细胞生长约80％汇合，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；

6、当细胞约80％汇合时，利用0.25％胰酶对细胞进行消化，以1～3×10⁵cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；

7、当细胞约80％汇合时，利用0.25％胰酶对细胞进行消化，收集第1代细胞，按1∶2比率进行传代，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；

8、若需多次传代，重复步骤⑦即可；

9、分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACS Calibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度。

10、将体外培养获得的脐带或胎盘组织干细胞浓度调整为5×10⁶～1×10⁷个/毫升密封于冻存管中，经超低温液氮反复冻融4～5次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群。

实施例2、绞股蓝生物活性物质的制备

1、精选优质绞股蓝，清洗、去老叶、机械切碎等预处理，；

2、将预处理后的绞股蓝置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，脱水；

3、将冻干的绞股蓝立即转移至超低温环境(-75℃～-85℃)中10小时以上，使其硬化变脆；

4、脆化后的绞股蓝先后经超低温(-60℃～-85℃)微米级与纳米接研磨制粉；

5、绞股蓝纳米粉加5倍重量纯水，于37℃进行超声波(30Hz～50Hz)抽提2小时；

6、对超声波处理后的溶液进行离心，抽滤去杂质；

7、对上清混合溶液进行低温冷凝干燥，去水，获得绞股蓝高活性萃取物。

实施例3、干细胞与绞股蓝生物活性组合物的制备及其应用

将从干细胞和绞股蓝中提取的生物活性物质按照1∶(10～20)的质量比例进行均匀混合，即可获得所需组合物，该组合物可以制成片剂、粉剂或胶囊应用于调节血脂、血糖与血压，抗衰老，提高免疫力等医学保健领域。

Claims

1.人源干细胞与绞股蓝生物活性物质组合物及其制备方法，其特征是干细胞生物活性物质来源于人脐带或胎盘组织的干细胞，其内富含干细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等物质；绞股蓝生物活性物质利用超低温纳米技术萃取，其内富含皂苷、黄酮类、多糖等多种活性物质。其制备方法为人源干细胞：提取人源干细胞→体外培养、扩增→超低温液氮反复冻融至细胞破碎→低温分离、纯化干细胞生物活性物质；绞股蓝：精选绞股蓝鲜品→超低温冷冻脆化→微米与纳米级制粉→超声波抽提→离心、抽滤→冷凝干燥→获得绞股蓝提取物。最后将两者按一定比例配伍形成组合物，该组合物可应用于医学保健领域。

2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征是来源于健康人的脐带或胎盘，经体外培养、扩增获得。

3.根据权利要求2所述的干细胞，其特征是包含但不限于间充质干细胞。

4.根据权利要求1所述的干细胞生物活性物质，其特征是包括细胞内容物和分泌因子。

5.根据权利要求1所述的绞股蓝，其特征是经过超低温冷冻脆化。

6.根据权利要求1所述的绞股蓝生物活性物质，其特征是纳米研磨，超声波抽提，冷凝干燥提取，富含高活性生物物质。

7.根据权利要求1所述的组合物，其特征是人源干细胞与绞股蓝生物活性物质按1∶(10～20)的质量比例进行均匀混合，但不限于此比例。

根据权利要求1所述的医学保健用途，其特征主要是调节血脂、血糖与血压，提高机体免疫力和抗衰老等。