CN117343900B - 一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂及其制备方法 - Google Patents

一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及到生物技术领域，具体为一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂。本发明通过将胶原蛋白和维生素E进行改性来提高其水溶性和生物活性，且改性胶原蛋白和改性维生素E具有协同促进细胞的增殖，能增强干细胞冰活体的修复和抗衰功效。本发明使用含有干细胞激活剂的培养基不仅能够激活间充质干细胞的活力潜能，释放高浓度的干细胞因子，而且细胞因子还含有集落刺激因子和其他重要的刺激因子，刺激了细胞持续不断的分泌细胞因子。此外，本发明使用半量换液的方法培养间充质干细胞，与传统培养法相比，可以提高细胞因子的浓度和表达量，干细胞因子群的促迁移效果也会明显增强。

Description

一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种干细胞因子群冰活制剂，尤其涉及一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞。它具有造血支持、免疫调控、血管新生、组织损伤的修复等生物学特性。MSC具有分化潜力大、增殖能力强、归巢迁移能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此是最具临床应用前景的多能干细胞。
间充质干细胞的作用主要体现在两个方面，一是替代作用，可以分化成很多组织细胞，修复替代损伤的组织；二是旁分泌作用，可以分泌很多的细胞因子，进而参与组织的修复。旁分泌效应分泌的细胞因子主要包括这几类：抗凋亡因子、免疫调节因子、抗瘢痕因子、造血支持因子、血管生成因子等等；越来越多的实验结果表明MSC在体内的分化和替代的比例很小，在免疫健全的动物体内的定植和分化的细胞数量甚微。而治疗作用绝大部分是通过强大的旁分泌作用来实现的。MSC通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)和胸腺素β4(Tβ4)等来保护缺血性心肌细胞，促进心肌再生。MSC通过分泌一系列的生长因子例如HGF,VEGF,SDF-1,角质细胞生长因子(KGF),bFGF,胎盘生长因子(PGF),转化生长因子β(TGFβ),单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和IGF-1来促进增殖和组织损伤修复。MSC通过分泌抗炎因子如白介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子诱导蛋白6(TSG-6)，抑制促炎因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)表达来发挥抗炎作用。间充质干细胞因子群具有间充质干细胞的抗炎、免疫调节，抗瘢痕，促血管新生的生物学功能，其生物学活性与细胞相当，通过与体内的相应的受体配体结合，可以快速发挥生物学效应，干细胞因子作为蛋白质，其储存和运输与蛋白生物制剂相同，比间充质干细胞的储存和运输成本低，更方便临床应用。
越来越多的研究证明干细胞因子可以发挥与干细胞相当的作用，包括抗凋亡，免疫调节，修复再生，血管新生调节和动员内源性的干细胞。干细胞因子可以用于治疗神经损伤、肾损伤、肝损伤、关节损伤、骨损伤等疾病。干细胞因子包含了上百种细胞因子和化学因子，其中HGF,VEGF,TGFβ,bFGF是其主要的代表性因子。
将干细胞因子群冷冻制成冰活体，在美妆行业中有广阔的应用前景，因为冰活体生物细胞能做到从根源激活、修复、再生细胞，从根本上改善肤质，不仅能全面改善皮肤各种问题，从而达到一个真正抗衰的效果，但使用某些传统方法培养的间质干细胞所得到的冰活体并非能达到真正抗衰修复的效果。
发明内容
针对以上问题，本发明采用半量换液培养间质干细胞，并使用干细胞激活剂促进细胞的增殖和分化，且干细胞激活剂中多数具有修复和抗衰老的功效，最终得到的冰活体能从根本上改善肤质，从而达到一个真正抗衰的效果。
本发明采用如下技术方案：
一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：用含有改性维生素E和改性胶原蛋白的培养基培养间充质干细胞；
其中，改性维生素E的结构式：
所述改性胶原蛋白的制备方法：将胶原蛋白与壳聚糖结合置于烧杯中，再加入甘油，将烧杯放置于水浴锅中以70～80℃进行水浴加热30～40min，得到改性胶原蛋白。
作为优选，具体步骤为：
S1、甄选优质间充质干细胞：选取人脐带血间充质干细胞原代细胞；
S2、改性胶原蛋白：将100～110g胶原蛋白与60～70g壳聚糖结合置于烧杯中，再加入2.5～3.0g甘油，将烧杯放置于水浴锅中以70～80℃进行水浴加热30～40min，得到改性胶原蛋白；该步骤中胶原蛋白与壳聚糖发生氧化聚合反应产生一种新物质，能提高生物相容性，促进细胞的增殖和分化，且有修复和抗衰老的功效；
S3、改性维生素E：将100.4～112.4g海藻酸、20.1～20.3g氧化锌和0.5～1.0L去离子水加入反应器中，开搅拌，温度升至140～150℃后缓慢加入120.1～122.2g维生素E，维持温度在140～150℃反应5-7h后，每隔30min，取样测pH值，直至pH值在2～2.5不再变化，反应结束，过滤，得粗品待用，取50～100ml75％的无水乙醇于烧杯中，在水浴锅中水浴加热至70～75℃后取出，将粗品置于其中，搅拌至完全溶解后，在液氮恒温器里降温，降温速率10℃/h，降至0℃，继续养晶3～4h，过滤，收集滤饼，干燥1～2h，得到改性维生素E；该步骤加入的氧化锌作为催化剂可以加速反应的进行，缩短反应时间；
S4、绞股蓝生物活性物质的制备：精选优质绞股蓝，清洗3～4次后，置冷冻干燥机中进行冷冻干燥24～26h，将冻干的绞股蓝立即转移至-75～-85℃的超低温环境中10～12h，使其硬化变脆，将脆化后的绞股蓝先后经-60～-85℃的超低温微米级与纳米级研磨制粉，取10～15g绞股蓝纳米粉置于30～100ml的去离子水中，于35～37℃进行超声波抽提2～3h，超声频率为30～50Hz；对超声波处理后的溶液进行离心，离心转速为1000～3000r/min，收集上清液，在-10～-18℃的低温下冷凝干燥30～60min，获得绞股蓝高活性萃取物；
S5、制备干细胞激活剂：取50～100g盐酸吡格列酮、20～100g步骤S2制备所得的改性胶原蛋白、20～100g步骤S3制备所得的改性维生素E、100～150g二甲基亚砜、5～10g步骤S4制备所得的绞股蓝高活性萃取物，1～5mg基质细胞衍生因子-1、140～100mg胰岛素样生长因子-1、pH＝7.0-7.2的磷酸盐缓冲液30～100ml于烧杯中，搅拌至完全溶解，获得干细胞激活剂待用；
S6、制备含有干细胞激活剂的培养基：在MEM-α培养基中加入步骤S5制备所得的干细胞激活剂，确保干细胞激活剂的体积浓度为1％；
S7、半量换液法培养间充质干细胞获得干细胞因子群：将步骤S1甄选的优质间充质干细胞接种于含有10％胎牛血清的MEM-α培养基中，培养至80％的融合度后，将培养液转移至离心机中以1000～3000r/min的转速离心8～16min，收集沉降的细胞，弃去培养基，然后将间充质干细胞置于步骤S6制备所得的培养基中培养24～48h后转移培养液至离心机中以1000～3000r/min的转速离心8～16min，收集沉降的细胞，弃去培养基，取30～100ml pH＝7.0～7.2磷酸缓冲液清洗间充质干细胞，向间充质干细胞中加入60～100ml复方电解质溶液，培养24～48h，按半量体积收集培养上清液，然后再加入半量体积复方电解质溶液，培养24～48h，按半量体积收集培养上清液，重复半量加液和半量收集4～8次，将收集的培养上清液过滤浓缩至原体积的80％，纯化、除菌，获得干细胞因子群；
S8、将步骤S7获得的干细胞因子群采用萃取分离技术，在-196℃条件下，去除已经失活的细胞，得到活细胞冰活体，然后在-18℃下冻存保证活细胞冰活体的超高活性。
优选地：所述步骤S2中将105g胶原蛋白与65g壳聚糖结合置于烧杯中，再加入2.8g甘油，将烧杯放置于在水浴锅中以75℃进行水浴加热35min，得到改性胶原蛋白。
优选地：所述步骤S3中将110.0g海藻酸、20.2g氧化锌和0.8L去离子水加入反应器中，开搅拌，温度升至145℃，缓慢加入121.2g维生素E，维持温度在145℃反应6h。
优选地：所述步骤S3中取75ml 75％的无水乙醇于烧杯中，在水浴锅中水浴加热至73℃后取出，将粗品置于其中，搅拌至完全溶解后，在液氮恒温器里降温，降温速率10℃/h，降至0℃，继续养晶3.5h，过滤，收集滤饼，干燥1.5h，得到改性维生素E。
优选地：所述步骤S4中精选优质绞股蓝，清洗3次后，置冷冻干燥机中进行冷冻干燥25h，将冻干的绞股蓝立即转移至-80℃的超低温环境中11h，使其硬化变脆，将脆化后的绞股蓝先后经-70℃的超低温微米级与纳米级研磨制粉，取12g绞股蓝纳米粉置于50ml的去离子水中，于36℃进行超声波抽提2.5h，超声频率为40Hz。
优选地：所述步骤S4中对超声心波处理后的溶液进行离，离心转速为2000r/min，收集上清液，在-15℃的低温下冷凝干燥45min，获得绞股蓝高活性萃取物。
优选地：所述步骤S5中取80g盐酸吡格列酮、20～100g步骤S2制备所得的改性胶原蛋白、20～100g步骤S3制备所得的改性维生素E、120g二甲基亚砜、8g步骤S4制备所得的绞股蓝高活性萃取物、3mg基质细胞衍生因子-1、60mg胰岛素样生长因子-1、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液50ml于烧杯中，搅拌至完全溶解，获得干细胞激活剂。
优选地：所述步骤S7中将培养液转移至离心机中以2000r/min的转速离心12min。
优选地：所述步骤S7中将间质干细胞置于步骤S6制备所得的培养基中培养36h，弃去培养基，取50ml pH＝7.0磷酸缓冲液清洗间质干细胞。
优选地：所述步骤S7中向间质干细胞中加入80ml复方电解质溶液，培养36h，按半量体积收集培养上清液，然后再加入半量体积复方电解质溶液，培养36h，按半量体积收集培养上清液，重复半量加液和半量收集6次，将收集的培养上清液过滤浓缩，纯化、除菌，获得干细胞因子群。
由于采用上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
1.本发明制备的改性胶原蛋白是通过胶原蛋白和壳聚糖发生氧化聚合反应，生成一种新物质，胶原蛋白分子与透明质酸分子间形成了氢键，因此改性胶原蛋白有更好的水溶性，且能提高生物相容性，促进细胞的增殖和分化，达到有修复和抗衰功效。
2.本发明制备的改性维生素E是通过维生素E与海藻酸发生酯化反应，得到一端为羟基羧基组合物的维生素E衍生物，其中羧基是亲水基团，其偶极矩大于水分子，羟基可以和水形成氢键，从而水溶性得到提高。且制备方法简单，原料来源广，成分天然，同时不破坏维生素E的分子结构，仍然具有良好的抗氧化性能，可以保护细胞的稳定性，从而延缓细胞衰老。
3.本发明使用的绞股蓝高活性萃取物中有多肽、天然免疫蛋白、核酸、皂苷、黄酮类、多糖、氨基酸等多种活性物质，可促进机体干细胞增殖、分化，提高身体免疫力和抗衰老作用。
4.本发明使用的培养方法是半量换液的方法，每次保留了一半的干细胞因子，其中含有丰富的生长因子和营养因子，维持了细胞的长期活性，干细胞因子持续稳定，浓度高，操作简便，通过该方法能得到更高浓度的细胞因子且细胞因子的表达量能得到极大提高，以及干细胞因子群的促迁移效果明显增强。
5.本发明使用含有干细胞激活剂的培养基，能够激活间充质干细胞的活力潜能，释放高浓度的干细胞因子，除此之外，细胞因子还含有集落刺激因子和其他重要的刺激因子，刺激了细胞持续不断的分泌细胞因子。
6.预料不到的，本发明制备的改性胶原蛋白和改性维生素E具有协同促进细胞的增殖，能增强干细胞冰活体的修复和抗衰功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5和对比例6间充质干细胞增殖率图。
图2是本发明实施例2、对比例7和对比例8细胞因子表达量图。
图3是本发明实施例2、对比例7和对比例8细胞迁移率图。
图4是本发明实施例3、对比例9和对比例10细胞相对活力图。
具体实施方式
为了使本发明专利所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明内容，并不用于限定本发明专利。
本实施例选取人脐带血间充质干细胞原代细胞，购自上海研生实业有限公司；
实施例1
本实施例说明改性胶原蛋白与改性维生素E均具有良好的水溶性，且能协同促进细胞的增殖。
S1、选取人脐带血间充质干细胞原代细胞；
S2、改性胶原蛋白：将100g胶原蛋白与60g壳聚糖结合置于烧杯中，再加入2.5g甘油，将烧杯放置于水浴锅中以70℃进行水浴加热30min，得到改性胶原蛋白；该步骤中胶原蛋白与壳聚糖发生氧化聚合反应产生一种新物质，能提高生物相容性，促进细胞的增殖和分化，且有修复和抗衰老的功效；
S3、改性维生素E：将100.4g海藻酸、20.1g氧化锌和0.5L去离子水加入反应器中，开搅拌，温度升至140℃，缓慢加入120.1g维生素E，维持温度在140℃反应5h后，每隔30min，取样测pH值，直至pH值在2～2.5不再变化，反应结束，过滤，得粗品待用,取50ml 75％的无水乙醇于烧杯中，在水浴锅中水浴加热至70℃后取出，将粗品置于其中，搅拌至完全溶解后，在液氮恒温器里降温，降温速率10℃/h，降至0℃，继续养晶3h，过滤，收集滤饼，干燥1h，得到改性维生素E；该步骤加入的氧化锌作为催化剂可以加速反应的进行，缩短反应时间；
S4、绞股蓝生物活性物质的制备：精选优质绞股蓝，清洗3次后，置冷冻干燥机中进行冷冻干燥24h，将冻干的绞股蓝立即转移至-75℃的超低温环境中10h，使其硬化变脆，将脆化后的绞股蓝先后经-60℃的超低温微米级与纳米级研磨制粉，取10g绞股蓝纳米粉置于30ml的去离子水中，于35℃进行超声波抽提2h，超声频率为30Hz；对超声波处理后的溶液进行离心，离心转速为1000r/min，收集上清液，在-10℃的低温下冷凝干燥30min，获得绞股蓝高活性萃取物；
S5、制备干细胞激活剂：取50g盐酸吡格列酮、20g步骤S2制备所得的改性胶原蛋白、20g步骤S3制备所得的改性维生素E、100g二甲基亚砜、5g步骤S4制备所得的绞股蓝高活性萃取物、1mg基质细胞衍生因子-1、40mg胰岛素样生长因子-1、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液30ml于烧杯中，搅拌至完全溶解，获得干细胞激活剂待用；
S6、制备含有干细胞激活剂的培养基：在MEM-α培养基中加入步骤S5制备所得的干细胞激活剂，使干细胞激活剂的体积浓度为1％；
S7、半量换液法培养间充质干细胞获得干细胞因子群：将步骤S1甄选的优质间充质干细胞接种于含有10％胎牛血清的MEM-α培养基中，培养至80％的融合度后，将培养液转移至离心机中以1000r/min的转速离心8min，收集沉降的细胞，弃去培养基，然后将间充质干细胞置于步骤S6制备所得的培养基中培养24h后转移培养液至离心机中以1000r/min的转速离心8min，收集沉降的细胞，弃去培养基，取30ml pH＝7.0磷酸缓冲液清洗间充质干细胞，向间充质干细胞中加入60ml复方电解质溶液，培养24h，按半量体积收集培养上清液，然后再加入半量体积复方电解质溶液，培养24h，按半量体积收集培养上清液，重复半量加液和半量收集4次，将收集的培养上清液过滤浓缩至原体积的80％，纯化、除菌，获得干细胞因子群；
S8、将步骤S7获得的干细胞因子群采用萃取分离技术，在-196℃条件下，去除已经失活的细胞，得到活细胞冰活体，然后在-18℃下冻存保证活细胞冰活体的超高活性。
对比例1：省略步骤S2，直接在步骤S5中使用不改性的胶原蛋白，其余步骤均同实施例1。
对比例2：省略步骤S3，直接在步骤S5中使用不改性的维生素E，其余步骤均同实施例1。
对比例3：省略步骤S2，直接在步骤S5中同时使用不改性的胶原蛋白和维生素E，其余步骤均同实施例1。
对比例4：省略步骤S2，且在步骤S5中不使用胶原蛋白，其余步骤均同实施例1。
对比例5：省略步骤S3，且在步骤S5中不使用维生素E，其余步骤均同实施例1。
对比例6：省略步骤S2和S3，在步骤S5中使用15g购自西安妙果生物科技有限公司的水溶性维生素E和15g购自山东晟垄生物科技有限公司的水溶性胶原蛋白代替改性维生素E和改性胶原蛋白，其余步骤均同实施例1。
(1)水溶性
①用红外光谱检测改性胶原蛋白结构
1、仪器：傅里叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司，TENSOR 27型；美国ThermoFisher公司，Nicolet 6700型)；压片机；玛瑙研钵；红外灯。
2、试剂：KBr晶体，待分析试样改性胶原蛋白。
3、在玛瑙研钵将KBr晶体充分研磨后加入其量5％左右的待测样品，混合研磨直至均匀。在一个具有抛光面的金属模具上放一个圆形纸环，用刮勺将研磨好的粉末移至环中，盖上另一块模具，放入油压机中进行压片。KBr压片形成后，若已透明，可用夹具固定测试。打开红外光谱测试软件一进入测试对话框一背景测试一样品测试一标峰值一打印谱图一取出样品。解析谱图，推出改性胶原蛋白含有氢键，从而提高其水溶性。
②根据反应方程式得到改性维生素E结构式
维生素E的结构式为：
改性维生素E的结构式：
海藻酸和维生素E的反应方程式如下：
由维生素E和改性维生素E的结构式可以看出改性维生素E相比于维生素E羧基和羟基数量增加，其中羧基是亲水基团，其偶极矩大于水分子，羟基可以和水形成氢键，从而水溶性得到提高，此外，还预料不到的提高了生物活性。
(2)细胞增殖
采用MTT法测定：取对数期细胞进行细胞计数，调整细胞浓度，取96孔板，每孔加入200μL细胞溶液，使每孔含有1×103-104个细胞为宜，将细胞培养板放入CO2培养箱中，37℃5％CO2条件下培养24-48h，设置不同浓度梯度或者使用不同药物刺激细胞，注意每个梯度或者每种药物请设置三个复孔，每孔加入20μL 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h，终止培养，小心弃去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，低速摇床摇10min，使结晶充分溶解；使用酶标仪测定每孔在570nm波长处的吸光光度值(OD570)，可以使用OD630作为参比波长，将OD570-OD630作为每孔最终值，按照公式：细胞增殖率(％)＝(本组OD均值－对照组OD均值)/(未处理组OD均值－对照组OD均值)×100％计算得到结果见下表1：
表1
实验结果表明，实施例1干细胞的增殖率明显大于各对比例，说明改性胶原蛋白与改性维生素E能协同促进细胞的增殖，对比例6细胞增殖率最低的原因可能是水溶性维生素E和水溶性胶原蛋白仅仅水溶性较好，但没有新的物质生成，说明实施例1中改性维生素E和改性胶原蛋白效果好的原因不仅是通过改性增加了水溶性，更重要的是可能新物质的生成具有了新的功能，从而具有了更强的协同作用，还预料不到的提高了生物活性。
由图1可以更直观的看出实施例1的增殖率大于各对比例。
实施例2
本实施例证明半量换液法和改性维生素E能得到更高浓度的细胞因子且细胞因子的表达量能得到极大提高，以及干细胞因子群的促迁移效果明显增强。
S1、选取人脐带血间充质干细胞原代细胞；
S2、改性胶原蛋白：将105g胶原蛋白与65g壳聚糖结合置于烧杯中，再加入2.8g甘油，将烧杯放置于水浴锅中以75℃进行水浴加热35min，得到改性胶原蛋白；该步骤中胶原蛋白与壳聚糖发生氧化聚合反应产生一种新物质，能提高生物相容性，促进细胞的增殖和分化，且有修复和抗衰老的功效；
S3、改性维生素E：将110.0g海藻酸、20.2g氧化锌和0.8L去离子水加入反应器中，开搅拌，温度升至145℃，缓慢加入121.2g维生素E，维持温度在145℃反应6h后，每隔30min，取样测pH值，直至pH值在2～2.5不再变化，反应结束，过滤，得粗品待用,取75ml 75％的无水乙醇于烧杯中，在水浴锅中水浴加热至73℃后取出，将粗品置于其中，搅拌至完全溶解后，在液氮恒温器里降温，降温速率10℃/h，降至0℃，继续养晶3.5h，过滤，收集滤饼，干燥1.5h，得到改性维生素E；该步骤加入的氧化锌作为催化剂可以加速反应的进行，缩短反应时间；
S4、绞股蓝生物活性物质的制备：精选优质绞股蓝，清洗3次后，置冷冻干燥机中进行冷冻干燥25h，将冻干的绞股蓝立即转移至-80℃的超低温环境中11h，使其硬化变脆，将脆化后的绞股蓝先后经-70℃的超低温微米级与纳米级研磨制粉，取13g绞股蓝纳米粉置于50ml的去离子水中，于36℃进行超声波抽提2.5h，超声频率为40Hz；对超声波处理后的溶液进行离心，离心转速为2000r/min，收集上清液，在-14℃的低温下冷凝干燥45min，获得绞股蓝高活性萃取物；
S5、制备干细胞激活剂：取75g盐酸吡格列酮、60g步骤S2制备所得的改性胶原蛋白、60g步骤S3制备所得的改性维生素E、125g二甲基亚砜、8g步骤S4制备所得的绞股蓝高活性萃取物、3mg基质细胞衍生因子-1、70mg胰岛素样生长因子-1、pH＝7.1的磷酸盐缓冲液50ml于烧杯中，搅拌至完全溶解，获得干细胞激活剂待用；
S6、制备含有干细胞激活剂的培养基：在MEM-α培养基中加入步骤S5制备所得的干细胞激活剂，使干细胞激活剂的体积浓度为1％；
S7、半量换液法培养间充质干细胞获得干细胞因子群：将步骤S1甄选的优质间充质干细胞接种于含有10％胎牛血清的MEM-α培养基中，培养至80％的融合度后，将培养液转移至离心机中以2000r/min的转速离心12min，收集沉降的细胞，弃去培养基，然后将间充质干细胞置于步骤S6制备所得的培养基中培养36h后转移培养液至离心机中以2000r/min的转速离心12min，收集沉降的细胞，弃去培养基，取50ml pH＝7.1磷酸缓冲液清洗间充质干细胞，向间充质干细胞中加入80ml复方电解质溶液，培养36h，按半量体积收集培养上清液，然后再加入半量体积复方电解质溶液，培养36h，按半量体积收集培养上清液，重复半量加液和半量收集6次，将收集的培养上清液过滤浓缩至原体积的80％，纯化、除菌，获得干细胞因子群；
S8、将步骤S7获得的干细胞因子群采用萃取分离技术，在-196℃条件下，去除已经失活的细胞，得到活细胞冰活体，然后在-18℃下冻存保证活细胞冰活体的超高活性。
对比例7：直接通过传统收集方法，即将步骤S7改为用含有10％胎牛血清的MEM-α培养基在T75培养瓶中培养间充质干细胞至80％的融合度，收集培养上清液，检测其中的细胞因子，其余步骤均同实施例2。
对比例8：省略S2和S3，且在步骤S5中使用40g购自西安妙果生物科技有限公司的水溶性维生素E和40g购自山东晟垄生物科技有限公司的水溶性胶原蛋白代替改性维生素E和改性胶原蛋白，直接通过传统收集方法，即将步骤S7改为用含有10％胎牛血清的MEM-α培养基在T75培养瓶中培养间充质干细胞至80％的融合度，收集培养上清液，检测其中的细胞因子，其余步骤均同实施例2。
(1)干细胞因子群的表达能力
将实施例2和对比例7、对比例8制得的干细胞因子群，分别用购自Invitrogen公司的酶联免疫吸附试剂盒检测上清液中细胞因子VEGF,bFGF,HGF,TGF-β的表达，其中操作方法参见酶联免疫吸附试剂盒的说明书，结果见下表2：
表2
实验结果表明，与传统收集方法相比，实施例2能够获得更高浓度的VEGF,bFGF,HGF,TGF-β。其中VEGF的提高了将近3倍，HGF的表达量提高了15倍，bFGF和TGF-β的表达量均提高了将近5倍，且通过对比例8和对比例7的数据对比说明，实施例2中通过改性维生素E和改性胶原蛋白可能由于生成了新物质从而获得了新的性能，对提高细胞因子的表达量极为重要。
图2是本发明实施例2和对比例7、对比例8细胞因子表达量图，可以例证上述结论。
(2)干细胞因子群的迁移率
将实施例2和对比例6制得的干细胞因子群进行细胞学分析比较，通过transwell(市售商品)来比较干细胞因子群对内皮细胞的迁移的影响，将100ul内皮细胞(市售商品)接种在transwell的上腔，将实施例2、对比例7得到的干细胞因子群接种在transwell下腔，培养4小时后，观察内皮细胞进入下腔的情况并计数，结果见下表3：
表3
项目 实施例2 对比例7 对比例8
迁移率(％) 9.8±0.4 4.2±0.2 2.0±0.1
实验结果表明，与传统收集方法相比，本发明方法制得的干细胞因子群的促迁移效果要优于传统方法，迁移率比传统方法提高了2.3倍，且改性维生素E和改性胶原蛋白也可以大大提高干细胞因子群的迁移率。
图3是本发明实施例2和对比例7、对比例8细胞迁移率图：半量换液法和改性维生素E、改性胶原蛋白可以大大提高细胞的迁移率。
实施例3
本实施例说明干细胞激活剂能够激活间充质干细胞的活力潜能，释放高浓度的干细胞因子，改性维生素E能大大增强这种效果。除此之外，细胞因子还含有集落刺激因子和其他重要的刺激因子，刺激了细胞持续不断的分泌细胞因子。
S1、选取人脐带血间充质干细胞原代细胞；
S2、改性胶原蛋白：将110g胶原蛋白与70g壳聚糖结合置于烧杯中，再加入3.0g甘油，将烧杯放置于水浴锅中以80℃进行水浴加热40min，得到改性胶原蛋白；该步骤中胶原蛋白与壳聚糖发生氧化聚合反应产生一种新物质，能提高生物相容性，促进细胞的增殖和分化，且有修复和抗衰老的功效；
S3、改性维生素E：将112.4g海藻酸、20.3g氧化锌和1.0L去离子水加入反应器中，开搅拌，温度升至150℃，缓慢加入122.2g维生素E，维持温度在150℃反应7h后，每隔30min，取样测pH值，直至pH值在2～2.5不再变化，反应结束，过滤，得粗品待用，取100ml 75％的无水乙醇于烧杯中，在水浴锅中水浴加热至75℃后取出，将粗品置于其中，搅拌至完全溶解后，在液氮恒温器里降温，降温速率10℃/h，降至0℃，继续养晶4h，过滤，收集滤饼，干燥2h，得到改性维生素E；该步骤加入的氧化锌作为催化剂可以加速反应的进行，缩短反应时间；
S4、绞股蓝生物活性物质的制备：精选优质绞股蓝，清洗4次后，置冷冻干燥机中进行冷冻干燥26h，将冻干的绞股蓝立即转移至-85℃的超低温环境中12h，使其硬化变脆，将脆化后的绞股蓝先后经-85℃的超低温微米级与纳米级研磨制粉，取15g绞股蓝纳米粉置于100ml的去离子水中，于37℃进行超声波抽提3h，超声频率为50Hz；对超声波处理后的溶液进行离心，离心转速为3000r/min，收集上清液，在-18℃的低温下冷凝干燥60min，获得绞股蓝高活性萃取物；
S5、制备干细胞激活剂：取100g盐酸吡格列酮、100g步骤S2制备所得的改性胶原蛋白、100g步骤S3制备所得的改性维生素E、150g二甲基亚砜、10g步骤S4制备所得的绞股蓝高活性萃取物、5mg基质细胞衍生因子-1、100mg胰岛素样生长因子-1、pH＝7.2的磷酸盐缓冲液100ml于烧杯中，搅拌至完全溶解，获得干细胞激活剂待用；
S6、制备含有干细胞激活剂的培养基：在MEM-α培养基中加入步骤S5制备所得的干细胞激活剂，使干细胞激活剂的体积浓度为1％；
S7、半量换液法培养间充质干细胞获得干细胞因子群：将步骤S1甄选的优质间充质干细胞接种于含有10％胎牛血清的MEM-α培养基中，培养至80％的融合度后，将培养液转移至离心机中以3000r/min的转速离心16min，收集沉降的细胞，弃去培养基，然后将间充质干细胞置于步骤S6制备所得的培养基中培养48h后转移培养液至离心机中以3000r/min的转速离心16min，收集沉降的细胞，弃去培养基，取100ml pH＝7.2磷酸缓冲液清洗间充质干细胞，向间充质干细胞中加入100ml复方电解质溶液，培养48h，按半量体积收集培养上清液，然后再加入半量体积复方电解质溶液，培养48h，按半量体积收集培养上清液，重复半量加液和半量收集8次，将收集的培养上清液过滤浓缩至原体积的80％，纯化、除菌，获得干细胞因子群；
S8、将步骤S7获得的干细胞因子群采用萃取分离技术，在-196℃条件下，去除已经失活的细胞，得到活细胞冰活体，然后在-18℃下冻存保证活细胞冰活体的超高活性。
对比例9：省略步骤S5，不使用干细胞激活剂，其余步骤均同实施例3。
对比例10：将干细胞激活剂中的改性维生素E分子用100g购自西安妙果生物科技有限公司的水溶性维生素E代替、改性胶原蛋白用100g购自山东晟垄生物科技有限公司的水溶性胶原蛋白代替，其余步骤均同实施例3。
用ATP法测定细胞活性：1、ATP反应液(Bio-Orbii)是粉末状混合物，含有荧光素、荧光素酶、0.5mmol醋酸镁、50mg BSA和0.1μmol无机焦磷酸。在4℃可以保存1个月。使用前用10ml含2mmol/L EDTA的0.1mol/L pH＝7.75Tris-醋酸缓冲液稀释。稀释液分装后可在-20℃长期保存。2、在已经完成促增殖或抑生长试验后的96孔细胞培养板中(每孔含100ul细胞培养液)，每孔加0.1ml ATP释放因子，室温中反应5分钟。取另一块96孔细胞培养板，从第一块板的各孔中吸0.1ml细胞溶解物到第二块板的相应各孔。3、在低于25℃中，将第二块板置自动多孔荧光检测仪中。用自动加样器，每孔加入20ul ATP反应液立即检测10秒的荧光强度。温度升高，检测敏感性就下降。4、用RLU(Y轴)对细胞因子准品的稀释度(X轴)作标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中细胞因子的含量，设置对照组，计算细胞的相对活力，结果见下表4：
表4
项目 实施例3 对比例9 对比例10
细胞相对活力 0.27±0.03 0.13±0.01 0.15±0.02
实验结果表明，在培养基中加入干细胞激活剂后，细胞相对活力提高了2倍，对比例10说明实施例3的改性维生素E和改性胶原蛋白因生成了新的物质而使干细胞激活剂的作用大大增强。
由图4可以证明：干细胞激活剂可以提高细胞相对活力，改性维生素E和改性胶原蛋白使干细胞激活剂的作用大大增强。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：用含有改性维生素E和改性胶原蛋白的培养基培养间充质干细胞；
其中，改性维生素E的结构式：；
所述改性胶原蛋白的制备方法：将胶原蛋白与壳聚糖结合置于烧杯中，再加入甘油，将烧杯放置于水浴锅中以70～80℃进行水浴加热30～40min，得到改性胶原蛋白；
具体步骤为：
S1、选取种子活细胞；
S2、改性胶原蛋白：将100～110g胶原蛋白与60～70g壳聚糖结合置于烧杯中，再加入2.5～3.0g甘油，将烧杯放置于水浴锅中以70～80℃进行水浴加热30～40min，得到改性胶原蛋白；
S3、改性维生素E：将100.4～112.4g海藻酸、20.1～20.3g氧化锌和0.5～1.0 L去离子水加入反应器中，开搅拌，温度升至140～150℃后缓慢加入120.1～122.2g维生素E，维持温度在140～150℃反应5-7h后，每隔30min，取样测pH值，直至pH值在2~2.5不再变化，反应结束，过滤，得粗品待用，取50～100ml 75%的无水乙醇于烧杯中，在水浴锅中水浴加热至70-75℃后取出，将粗品置于其中，搅拌至完全溶解后，在液氮恒温器里降温，降温速率10℃/h，降至0℃，继续养晶3-4h，过滤，收集滤饼，干燥1-2h，得到改性维生素E；
S4、绞股蓝生物活性物质的制备：精选优质绞股蓝，清洗3-4次后，置冷冻干燥机中进行冷冻干燥24～26h，将冻干的绞股蓝立即转移至-75～-85℃的超低温环境中10～12h，使其硬化变脆，将脆化后的绞股蓝先后经-60～-85℃的超低温微米级与纳米级研磨制粉，取10～15g绞股蓝纳米粉置于30～100ml的去离子水中，于35～37℃进行超声波抽提2～3h，超声频率为30～50Hz；对超声波处理后的溶液进行离心，离心转速为1000～3000r/min，收集上清液，在-10～-18℃的低温下冷凝干燥30～60min，获得绞股蓝高活性萃取物；
S5、制备干细胞激活剂：取50～100g盐酸吡格列酮、20～100g步骤S2制备所得的改性胶原蛋白、20～100g步骤S3制备所得的改性维生素E、100～150g二甲基亚砜、5～10g步骤S4制备所得的绞股蓝高活性萃取物，1～5mg基质细胞衍生因子-1、140～100mg胰岛素样生长因子-1、pH＝7.0-7.2的磷酸盐缓冲液30～100ml于烧杯中，搅拌至完全溶解，获得干细胞激活剂待用；
S6、制备含有干细胞激活剂的培养基：在MEM-α培养基中加入步骤S5制备所得的干细胞激活剂，确保干细胞激活剂的体积浓度为1％；
S7、半量换液法培养间充质干细胞获得干细胞因子群：将步骤S1甄选的优质间充质干细胞接种于含有10％胎牛血清的MEM-α培养基中，培养至80％的融合度后，将培养液转移至离心机中以1000~3000r/min的转速离心8~16min，收集沉降的细胞，弃去培养基，然后将间充质干细胞置于步骤S6制备所得的培养基中培养24～48h后转移培养液至离心机中以1000~3000r/min的转速离心8~16min，收集沉降的细胞，弃去培养基，取30～100ml pH＝7.0-7.2磷酸缓冲液清洗间充质干细胞，向间充质干细胞中加入60～100ml复方电解质溶液，培养24～48h，按半量体积收集培养上清液，然后再加入半量体积复方电解质溶液，培养24～48h，按半量体积收集培养上清液，重复半量加液和半量收集4～8次，将收集的培养上清液过滤浓缩至原体积的80%，纯化、除菌，获得干细胞因子群；
S8、将步骤S7获得的干细胞因子群采用萃取分离技术，在-196℃条件下，去除已经失活的细胞，得到活细胞冰活体，然后在-18℃下冻存。
2.根据权利要求1所述的一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中将110.0g海藻酸、20.2g氧化锌和0.8 L去离子水加入反应器中，开搅拌，温度升至145℃，缓慢加入121.2g维生素E，维持温度在145℃反应6h。
3.根据权利要求1所述的一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中取75ml 75%的无水乙醇于烧杯中，在水浴锅中水浴加热至73℃后取出，将粗品置于其中，搅拌至完全溶解后，在液氮恒温器里降温，降温速率10℃/h，降至0℃，继续养晶3.5h，过滤，收集滤饼，干燥1.5h，得到改性维生素E。
4.根据权利要求1所述的一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中精选优质绞股蓝，清洗3次后，置冷冻干燥机中进行冷冻干燥25h，将冻干的绞股蓝立即转移至-80℃的超低温环境中11h，使其硬化变脆，将脆化后的绞股蓝先后经-70℃的超低温微米级与纳米级研磨制粉，取12g绞股蓝纳米粉置于50ml的去离子水中，于36℃进行超声波抽提2.5h，超声频率为40Hz。
5.根据权利要求1所述的一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中对超声心波处理后的溶液进行离，离心转速为2000r/min，收集上清液，在-15℃的低温下冷凝干燥45min，获得绞股蓝高活性萃取物。
6.根据权利要求1所述的一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中取80g盐酸吡格列酮、50g步骤S2制备所得的改性维生素E、50g步骤S3制备所得的改性胶原蛋白、120g二甲基亚砜、8g步骤S4制备所得的绞股蓝高活性萃取物、3mg基质细胞衍生因子-1、60mg胰岛素样生长因子-1、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液50ml于烧杯中，搅拌至完全溶解，获得干细胞激活剂。
7.根据权利要求1所述的一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S7中将培养液转移至离心机中以2000r/min的转速离心12min。
8.根据权利要求1所述的一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S7中将间充质干细胞置于步骤S6制备所得的培养基中培养36h，弃去培养基，取50ml pH＝7.0磷酸缓冲液清洗间充质干细胞。
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