JPH06507565A - 体外受精方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 体外受精方法および装置 発明の背景 本発明は体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）受精の方法および装置に関する。

ヒトと動物の不妊は、多くの原因から起こり得る。そしてその不妊は、少ない精 子数、低い精子の運動性、および低い割合の生存可能な運動精子に関連すること が多い。これらの問題を克服する１つの手法は、体外受精（ｒＩＶＦ」）、すな わち、体外の制御され観察できる環境における精子と卵母細胞の結合である。

現在実施されているように、体外受精は一般的に、パーコル勾配または「スイム −アップ（Ｓｗｉｍ−Ｕｐ）Ｊのような方法により不健康精子または非運動精子 からの健康運動精子の前分離を含む（ローファー等、不妊において、サーベル、 Ｍ、　Ｍ、出版、アブレトン＆５ンク（１９９０）　）。

そのような分別工程は、精子が通常のものである場合（例えば、女性の生殖系の 病理学による不妊）を含む全ての場合に行なわれる。普通の精子の試料でさえ、 がなりの数の非運動精子または死んだ精子および上皮細胞を含有するためにこの 基準がとられ、これらの外来性細胞は、運動精子と卵子の相互作用を妨害するこ とがある。しがしながら、望ましくない精子の除去に加え、これらの精子の分別 技術によって、同様にかなりの運動精子が損失することにもなり、それゆえ、体 外受精の失敗となり得ることもあるそれ自身の問題を引き起こす。

使用する精子分画を一度得ると、その精子を、液体培地中に少数の卵母細胞（一 般的に１から２）を含有する試料皿に加える。動物研究により、非常に少量の液 体培地または「微小小滴（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｓ）Ｊ中への精液注入は、卵子： 精子の相互作用を最大にし、受精に必要な精子：卵子比率を最少にするので、好 ましいものである。（バビスター、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｚｏｏ　１．２１０　：２５ ９−２６４　（１９７９））。しかしながら、ヒトのＩＶＦにおいては、微小小 滴は、蒸発によるｐＨの急速な変動および／または容量モル濃度の変化に晒され るので、そのような小滴は用いられない。それゆえ、標準ＩＶＦ方法には通常２ ミリリツトルの培地中における卵子の受精が必要である。ローファー等。

これらの比較的大量の培地を用いると、受精を確実にするために大量の精子（１ −２ＸｌＯ’以上）による受精が必要となる。しかしながら、精子試料が異常な 場合、または多くの卵子が得られる場合には、分別中の損失により、続いての受 精のための運動精子の数が不十分となることがある。この問題は、精子の数が低 い場合、および／または試料中の運動精子の比率が低い場合に、特に重大である 。

それゆえ、体外受精技術においては、精子の前分別工程を必要とせずに高い受精 能率を供することが必要とされている。本発明の目的は、この必要性を満たす方 法および装置を提供することにある。

発明の概要 本発明によると、受精せしめられる卵母細胞を、受精培地の小滴の周囲または中 央に配された個々の低容積の卵母細胞室中に配する場合に、高能率の受精が達成 される。次いで精子試料、特に未分別精子試料を、小滴の中央、または修正した 中央を囲む周囲のくぼみに配する。運動精子はこの環境において卵母細胞に向か って敏速に動く傾向にあり、それゆえ、非運動精子からの運動精子のｉｎ　５ｉ ｔＵ分離となる。卵母細胞室（ｃｈａｍｂｅｒｓ）に進入する精子による受精は 、低容積の室のために極めて容易である。

この受精方法は好ましくは、特にこの目的のために設計された培養皿中で行なわ れる。そのような培養皿は、皿の底部の内面に形成された複数の卵母細胞室を有 する。各卵母細胞室は、受精せしめられる卵母細胞の容積を超えるが、容易な受 精となるのに十分に小さい容積を有する。一般的に、卵母細胞室は、卵母細胞の 容積を８００％から２．０００％上回る容積を有する。この卵母細胞室は、０． ５から３ｃｍの直径を有する皿の中央円形領域の周囲または中央プラトー領域に 配してもよい。

第１図は、微小小滴の周囲を造形することにより卵母細胞室を形成した本発明の 実施態様を示す。

第２図は、本発明による培養皿の上面図を示す。

第３図は、本発明による培養皿の断面図を示す。

第４図は、Ｔ形状の案内部材の断面図を示す。

第５図は、本発明による培養皿の断面図を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、１段階方法による低容積の受精培地内の精子の分離と卵母細胞の単離 の両方を提供する。この方法の能率は、第１図に示したような原型の受精微小室 を用いて説明する。

第１図において、培養皿を上から示す。この皿は、皿の金縁に亘る側面部１およ び底部２からなる。底部２の内面の中央に培養培地３の微小小滴を配し、皿表面 の接着特性を活用することにより卵母細胞室４を形成し、プラスチック微量ピペ ットチップを用いてこの形状に微小小滴を形成した。培養培地のリング５を微小 小滴の回りに配し、培地の通路６を形成して各卵母細胞室４を培養培地のリング ５に連結した。実験装置の様々な部分の寸法を表１に示す。

表１．第１図の実験例の寸法 この設計の能率を試験するために、マウスの卵母細胞（約８０μＭの直径を有す る）を培地の微小小滴中に形成された４つの卵母細胞室のそれぞれに配し、未分 別冷凍−解凍マウス精子を微小小滴の中央に加え、上面に亘って油滴を配して培 地を正しい位置に保持した。物質は、中央微小小′ａ３から通路６を通じて外側 のリング５に流動する傾向にあり、この流動により卵母細胞を卵母細胞室内の適 性位置に保持する。体外受精のためのこの設計を用−）た結果、受精能率が５倍 に増大した。

卵母細胞室と通路を製造するいくつかの技術を必要とし、その方法には時間がか かるので、各使用ための「注文」体外受精器の個々の構成は、実際的ではない。

さらに、中央微小小滴と外側リングの間の不完全に釣り合った表面張力が卵母細 胞を損傷し得ることが分かった。それゆえ、上述したマウス実験において具体化 した原理がより日常的に実施し得る、大量生産に適した培養皿を設計した。

第２図は、本発明の使用に特に適合せしめた培養皿の上面図を示す。この培養皿 において、２つの卵母細胞室４が、円形領域２１の反対側で、培地の微小小滴の 縁を定義する壁部材２２の内側に配されている。

しかしながら、卵母細胞室の数が多く、２から６０が体外受精の試みに適した通 常の卵母細胞の範囲であることが分かっている。

中央円形領域２１は好ましくは、隆起部３２が中央円形領域２１の中央と卵母細 胞室４の間に形成されるように中央くぼみ３１（第３図）を育する。中央円形領 域２１の直径は好ましくは、０．５から３０ｍｍ、より好ましくはｌＯから２０ ｍｍである。

使用に際して、培地の微小小滴を壁部材２２内に配する。

この微小小滴の容積は、中央円形領域２１の直径、中央くぼみ３１の深さ、およ び存在する場合には卵母細胞室４の容積と数に依存するが、一般的には約８０か ら１２０μｌである。

以下に記載するように、精子を導くために案内部材が存在する場合には、より大 きな容積を用いてもよい。卵母細胞３３を卵母細胞室４中に配し、精子試料３４ を中央円形領域２１の中央に配する。中央円形領域２１は、添加する精子の容積 の規定を補助するためにその領域に印刷されたリング２４（第２図）を有しても よい。添加する精子の数は一般的に、８−１２μｍの容積で８．０００から１２ ．０００である。

精子を添加した後、壁部材２２と重複するふた３５を用いて、中央円形領域２１ を覆ってもよい。次いでこの皿において、所定の期間（通常１０から２０時間） に亘り、健康な運動精子が中央円形領域の縁にある卵母細胞に泳いで行き、そこ に存在する卵母細胞と受精することを行なわせる。

本発明による培養皿はまた、中央円形領域２１の表面に配された案内部材２６を 有してもよい。これらの案内部材は、卵母細胞が存在し、それゆえ受精の速度と 頻度を高める部分に向かって運動精子を導く傾向にある。好ましい案内部材は、 Ｔ型の断面図を有する（第４図）。案内部材を使用することにより、潜在的に有 用な１−２ｍ１はどの容積で「微小小滴」において大容積を使用することができ る。

本発明の卵母細胞室は、第３図に示すように、単純なくぼみであっても、または 渦の形状を有してもよい。後者の場合には、卵母細胞室は、２００から５．ＯＱ Ｑ　、好ましくは４００から１．０００ミクロンの上面直径、２００から２．０ ００　、好ましくは２００から５００ミクロンの底面の直径、および１５０から ｉ、ｏｏｏ　、好ましくは１５０から５００　ミクロンの深さを有する。

第１図に示した微小室形状はまた、例えば微小小滴の周囲の辺りのプラスチック 皿の表面上に上昇した縁を形成することにより設けることもできる。卵母細胞室 は、上述したようなこの上昇した縁またはくぼみに形成されるアネックスであっ てもよい。

ＩＶＦ工程において活発に関連する、上述した要素に加えて、室は、蒸発を低減 する水蒸気供給源を提供するために室の回りに溝（ｗｅｌｌ）を含んでもよい。

溝は微小室とは隣接していないが、微小室に沿って覆いの下に位置する。

本発明の方法は、ヒトの卵母細胞並びに動物からの卵母細胞の体外受精を行なう のに有用である。これらの卵母細胞は、直径で約８０から約１５０ミクロンに亘 る様々なサイズを有する。例えば、ヒトの卵母細胞は一般的に、直径で約１２０ 　ミクロンであるが、マウスとラットからの卵母細胞は一般的に直径で約８０ミ クロンである。ここに使用している「卵母細胞」という用語は、ともに回収され て分離できない卵母細胞の小さなりラスターまたは周囲の卵丘細胞を有する卵母 細胞を包含してもよい。

受精せしめられる卵母細胞は、例えば標準受精の卵子の装填に通常用いられるよ うな微量ピペットにより、卵母細胞室に手動で配される。卵母細胞室は、受精せ しめられる卵母細胞の特定の種に合わせて作られている。卵母細胞への損傷を避 けて能率的な受精を行なうために、室の容積は一般的に、卵母細胞の容積の８０ ０から２．（１００％である。ヒトを含む、様々な種への使用に適した室サイズ は、直径２００μ×深さ４００μの寸法を有する。

培養皿内に用いる特定の培地は重要ではなく、特定の種に適している二とが知ら れているいかなる培地を用いてもよい。例えば、表２に示したヒト培地を用いて 好結果が得られた。

実施例１ はとんどのマウスの精子は冷凍すると生存できないので、冷凍−解凍マウスの精 子を用いて、第１図に示したような原型装置の効用を研究した。この試験におい て、ゴートン等、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｚｏｏ　１．２３９．３４７　（１９８６） に記載されているように、いくつかの運動精子が卵母細胞を貫通するのを補助す るためにその卵母細胞を帯穴開けしくｚｏｎａ　ｄｒｉｌｌｅｄ）、表３に示し た受精培地の微小小滴中に形成された卵母細胞室に卵母細胞それぞれを配した。

次いで１０μｌの冷凍−解凍精子の試料をその微小小滴の中央に配した。運動精 子の割合が５％未満である５つの実験において、平均６５％（５３−７６％の範 囲）の受精が達成できた。

Ｆ−１０イーグル培地 （ｌｘ）　（ｌｘ） 成　分（ｉｇ／Ｌ） 無機塩： ＣａＣ１□　（無水＞　２００．００ ＣａＣ１２”　２Ｈ２０４４，１−− ＣｕＳＯ４”　５Ｈ２０’　０．００２５　−Ｆ　ｅ　ＳＯ４’　７Ｈ２００， ８３４−−Ｋ　Ｃｌ　２ｇ５．０　４００．００ ＫＢ２　ＰＯ４ｇ３．０　−− Ｍｇ　Ｓｏａ　’　７Ｈ２０１５２，８２００，０ＯＮ　ａ　Ｃｌ　７４００． ０　６８００．０ＯＮ　ａ　ＨＣＯ３１２００，０２２００，０ＯＮａＨｚＰＯ ４”ＨｚＯ＋＋　１４０．０ＯＮ　ａ　２　ＨＰ　０４　・７　Ｈ２０２９０， ＯＺ　ｎ　Ｓ　０４　”　７　Ｈ２００，０２８８他の成分： Ｄ−グルコース１１Ｇ０．０　１０００．ｃｌ。

ヒポキサンチン　４．０　− リポ酸　０．２　− フェノールレッド　１．２　ｔｏ、ｏ。

ピルビン酸ナトリウム　１１０．０ チミジン　０．７ Ｌ−アルギニン　−　１７．４０ Ｌ−７ｈギニ＞ＥＣ１２１１，０− Ｌ−アスパラギン・ＨｚＯ１５，０１ Ｌ−アスパラギン酸　１３．Ｏ Ｌ−システィン　２５．０ Ｌ−シスチン　−１２，００ Ｌ−グルタミン酸　１４．７ Ｌ−グルタミン　１４８．０Ｇ　２９２．００グリシン　７．５１ Ｌ−ヒスチジン　８．００ Ｌ　ｈスチシ：／ＨＣｌ　・Ｈ２０２３，ＯＬ−イソロイシン　２．６　２６． ０ＯＬ−ロイシン　１３．０　２６．０Ｏ Ｌ−リジン　２９．２Ｏ Ｌ−リシンＨＣＩ　２９．０　− Ｌ−メチオニン　７．５Ｏ Ｌ−フェニルアラニン　１６．５Ｏ Ｌ−スレオニン　２４．００ Ｌ−）リブトファン　４．０Ｏ Ｌ−チロシン　１８．０Ｏ Ｌ−チロシン（２ナトリウム塩）− Ｌ−バリン　２３．５０ ビタミン： ビオチン　０．０２４　１．００ 重酒石酸コリン　ｌ、００ 塩酸コリン　０．６９８　１．００ 葉酸　１．３２　１．００ １−イノシタル　０．５４１　２．００ニコチンアミド　１．００ ピリドキサールＨＣＩ　１．００ リボフラビン　０．３７Ｂ　０．１０ チアミンＨＣ１１，００１，ＱＯ Ｄ−Ｃａ−パントテン酸塩　０．７１５ナイアシンアミド　０．８１５ ピロトキシンＨＣＩ　０．２０６ ビタミンＢ、□　１６３Ｂ 表　３ ＮａＣ１（ｖリンクＯｙト審７８５１）　５．１４グラムＫＣＩ（ベーカ−＄１ −３０４０）　０．３８グラムＫＨ２ＰＯ４（７リンクＯ−／ト＄７１００）　 ０．１８グラムＭｇ５Ｏ，−７Ｈ２０ （マリンクロット零８０８Ｂ）　０．２９グラムＮ　ａ　ＨＣＯｉ　（フィッシ ャー審Ｓ−２３３）　２．１１グラムピルビン酸Ｎａ（シュヮル゛ンーマン審９ ０４１４４）０．０４グラムグルコース（フィッシャー零〇−１８）　１．００ グラムペニシリンＧ、　Ｋ塩 （シュワルツ−マン婁４０４９）　０．７５グラムストレプトマイシン硫酸塩 （シュワルツ−マン霧３２４２）　０．０５グラムこれらの成分をフラスコ中に 重りとり、９９５１の二重蒸留Ｈ２０を加え、溶解するまで撹拌する。次いで、 乳酸ナトリウム６０％、ファンスティールラボ　３．６８ｍ１７　工／　−ルＬ ／−／ド、１％溶液（ディ７　：４５３５８−５９）１．００ｍ１を加える。こ れに３ｇ／ｌの結晶性ウシ血清アルブミン（ベンテックスｌｌ８ｌ−００１−３ ）を加え、溶解するまで撹拌する。

この培地を、殺菌のために０．２２ミクロンのミリポアフィルタ−で濾過する。

これを４℃で貯蔵してもよい。

比較を行なうために、帯穴開けしたマウスの卵母細胞を、２ｍｌの組織器（ｔｉ ｓｓｕｅ　ｄｉｓｈ）中の同一容積の冷凍−解凍精子に露出した。この環境では 、おそらくは、多くの非運動精子が卵母細胞への接近を妨げたので、受精率はた ったの１０％であった。

本発明の培養皿中の体外受精の改良能率は、精子の冷凍保存により、遺伝子導入 系統のような価値のあるマウス系統を保存することを可能にする。それゆえ本発 明は、価値ある動物の系統の管理における価値ある手段を証明する。

実施例２ ６か月以上も不妊であることが証明されている精管切除した雄のマウスからの精 子を、第１図に示したような造形微小小滴中で試験した。合計で３０の卵母細胞 を、卵母細胞室中に配し、１０μｍの未分別精子の試料を添加した。受精培地は 表３に示したものであった。

非常にわずかな自由遊泳精子しか存在しない１つの実験を含む２つの実験におい て、受精能率は１００％であった。

それとは対称的に、１０６の運動精子を２ｍｌの培養培地の皿に添加したときに 、同一の精子試料を用いて、たったの７％の卵母細胞が受精せしめられた。

これらの結果は、本発明が、運動精子の割合が非常に低い、すなわち＜１０％で ある場合にも受精能率を改善できることを示している。本発明は、先天性精管欠 如または失敗した精管切除の修復のような臨床状況に特に有用であるのが分かる 。さらに、分別が不必要であるので、本発明を使用すると、体外受精の「手順」 を簡素化できる。

実施例３ 先天性精管欠如のヒトの患者から得た精子試料で卵母細胞を受精せしめるのに、 第１図の微小室を用いた。回収と洗浄の後、この試料は、約５％の運動性がある １×１０６の精子を有し、血液でひどく汚染されていた。微小路質中の２つの卵 母細胞を受精するために分別していない洗浄試料を用い、残りの試料をバーコル 技術を用いて分別した。

バーコル分別した後、微小室中に配されない卵母細胞の受精には、運動精子は回 収されなかった。しかしながら、微小室中の２つの卵子のうち１つ（５０％）は 、未分別標品で受精せしめられ、受精卵移植を行なった。

実施例４ 他の研究において、第１図の微小室中にヒト卵子を装填することにより標準受精 を行なった。精子を洗浄または希釈し、直接室に添加した。受精率を、「スイム −アップ」方法後の２ｍ１皿中の通常対照受精と比較した。射出精液中に５ｏｘ ｔｏ６の運動精子を有する１人の患者において、精子は単に希釈し、微小室中に 配した。２回の洗浄後にスイムアップを行なったが、この方法にはほぼ２時間を 要し、結果として著しく精子を損失した。結果は、微小室（２／４の卵子が受精 した）のほうが対照（１／６が受精した）より良好であり、それゆえ、微小室は 、時間、出費および洗浄と分別に関連する精子の損失を低減できることを示して いる。

いくつかの付加実験において、精子を洗浄し、分別せずに微小室で用いた。微小 室の受精率（９／２８．３２％）は、対照器の受精率（１５１５Ｂ、２７％）と 同様であり、再度微小室を用いると分別の必要がなくなることを示した。

前述した議論と実施例は、本発明の方法と装置の根本的なパラメータを述べたも のである。しかしながら、他の形状もまた用いられることも明確である。例えば 、第５図に示すように、精子を装填する環状の溝５２により囲まれた中央プラト ー領域５１上に配された１つ以上の卵母細胞４を有する培養皿もまた本発明の方 法に用いられる。中央プラトー５１は好ましくは、底部の内面より低い表面水準 を有する。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）卵母細胞室中に卵母細胞を配し、前記卵母細胞室は前記卵母細胞の容 積を８００％から２０００％上回る容積を有し、該卵母細胞が受精培地の小滴と 隣接してその周囲または中央に位置しており、 （ｂ）前記卵母細胞室から離れた小滴の部分に精子の試料を配し、 （ｃ）通帯の運動性を有する精子が前記卵母細胞室の近傍に集まるのに十分な期 間に亘り待ち、次いで前記卵母細胞の受精を監視し、 （ｄ）前記卵母細胞室から受精した卵母細胞を回収する各工程からなることを特 徴とする体外受精を行なう方法。
2. ２．前記小滴が０．５から３ｃｍの直径を有することを特徴とする請求の範囲第 １項記載の方法。
3. ３．前記精子を、前記小滴の部分に配する前に分別しないことを特徴とする請求 の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. ４．底部と側面部を有する体外受精の培養皿であって、該皿の底部が、その内面 に複数の卵母細胞室を有し、各卵母細胞室が、受精せしめられる卵母細胞の容積 を８００％から２０００％上回る容積を有し、該卵母細胞が、０．５から３．０ ｃｍの直径を有する中央領域の周辺に配されることを特徴とする培養皿。
5. ５．前記卵母細胞室が、前記皿の底部の内面に形成されたくぼみであることを特 徴とする請求の範囲第４項記載の培養皿。
6. ６．前記中央環状領域は、該中央環状領域の配された液体の深さが周囲よりも中 央のほうが深いように、その中央にくぼみを有することを特徴とする請求の範囲 第４項または第５項記載の培養皿。
7. ７．案内部材が前記皿の底部の内面上に形成され、該案内部材が、前記中央環状 領域に配された運動精子を前記卵母細胞の方に泳がせるように指示する傾向にあ るように位置せしめられていることを特徴とする請求の範囲第４項から第６項い ずれか１項記載の培養皿。
8. ８．前記卵母細胞室が渦形状にあることを特徴とする請求の範囲第４項から第７ 項いずれか１項記載の培養皿。
9. ９．前記卵母細胞室が、２００から５０００ミクロンの上部直径、２００から２ ０００ミクロンの底部直径、および１５０から１０００ミクロンの深さを有する ことを特徴とする請求の範囲第８項記載の培養皿。
10. １０．前記卵母細胞室が約２００μｍの直径および約４００μｍの深さを有する ことを特徴とする請求の範囲第４項から第８項いずれか１項記載の培養皿。
11. １１．底部と側面部を有する体外受精の培養皿であって、該底部が、その内面に 、中央プラトーを規定する環状溝領域を有し、該プラトーが前記底部の内面より 低い表面水準を有し、１つ以上の卵母細胞が前記中央プラトー上に形成され、各 卵母細胞室が、受精される卵母細胞の容積を８００％から２０００％上回る容積 を有することを特徴とする培養皿。
12. １２．前記卵母細胞室が前記皿の底部の内面に形成されたくぼみであることを特 徴とする請求の範囲第１１項記載の培養皿。
13. １３．前記卵母細胞室が約２００μｍの直径および約４００μｍの深さを有する ことを特徴とする請求の範囲第１１項または第１２項記載の培養皿。
14. １４．（ａ）容器中に受精培地の小滴を配し、（ｂ）前記小滴の部分が少なくと も１つの卵母細胞室の外側の小滴の残りの容積よりも小さい容積を有する前記少 なくとも１つの室に形成されるように前記小滴を造形せしめ、前記室の容積が前 記卵母細胞の容積を８００％から２０００％上回り、 （ｃ）通常の運動性を有する精子が、前記室から離れた前記小滴中に配されたと きに、前記卵母細胞室の近傍に集まる傾向となるように、前記卵母細胞室を前記 小滴の残りに関して造形し位置せしめ、（ｄ）前記少なくとも１つの卵母細胞室 中に受精せしめられる卵母細胞を配し、 （ｅ）前記少なくとも１つの卵母細胞室から離れた位置の前記小滴中に精子の試 料を配し、 （ｆ）該精子を、通常の運動性を有する精子が前記少なくとも１つの卵母細胞室 の近傍に集まるのに十分な期間に亘り前記小滴中にとどまらせ、 （ｇ）前記精子により前記卵母細胞を受精せしめ、前記卵母細胞室から受精した 卵母細胞を回収する各工程からなることを特徴とする卵母細胞の体外受精を行な う方法。