CN103361312A - 一种甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种细胞的分离技术，特别涉及一种甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法，分离步骤为：将采集到的甲状腺乳头状癌组织置于D-hanks液中、冲洗，弃D-hanks液、去除结缔组织，并将甲状腺乳头状癌组织剪成块状；在块状组织中加入Ⅱ型胶原酶，在35℃-40℃温度下消化反应1-3小时，加入含有10%胎牛血清的1640培养基终止消化反应，过滤、离心、弃上清；将细胞液用1640培养基重悬、铺板，置于5%CO2的细胞培养箱中孵育，用PBS充分洗涤；将得到的贴壁细胞在培养，收集上清液，冷冻保存。分离的巨噬细胞呈圆形，可紧密贴壁于培养皿中，CD68染色阳性，阳性率高达95%以上，证实分离巨噬细胞成功。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞的分离技术，特别涉及一种甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法。
背景技术
肿瘤微环境是指除肿瘤实质细胞以外其他所有细胞的总称，包括肿瘤部位的居住细胞如成纤维细胞，还有迁移浸润至局部的细胞如淋巴细胞和巨噬细胞等，其中数量最多的还是是经血液运输迁移至肿瘤部位的巨噬细胞，为肿瘤微环境中的主要成分。巨噬细胞来源于骨髓CD34+祖细胞，首先在骨髓中增殖分裂再以单核细胞的形式通过血液运输迁移至不同的组织，在不同的环境下分化成巨噬细胞。在生理状态下，巨噬细胞参与不同的生命活动，包括炎症，免疫防御，免疫调节，创伤愈合，组织修复，清理外来异物和清除凋亡细胞等。巨噬细胞是动态变化的异质性免疫细胞，不同的组织环境可以诱导巨噬细胞发生不同的活化和分化并具有不同的性质使得巨噬细胞具有不同的分子特征和功能特征。活化和分化过程中巨噬细胞可出现不同的状态伴随着特异性膜型或分泌型蛋白的表达，这些特异性蛋白随着巨噬细胞活化过程上调表达或下调表达从而调节巨噬细胞的功能。
大量临床数据和实验结果都已经很明确提示巨噬细胞可以促进肿瘤的发生和肿瘤的恶性进展。在肿瘤的不同阶段和状态中，巨噬细胞都可以发挥着重要的作用，研究表明：作为一个固有免疫细胞，巨噬细胞可以分泌大量的细胞因子，在巨噬细胞促进肿瘤发生发展的机制研究中，巨噬细胞产生的细胞因子是极其重要的效应分子，巨噬细胞主要通过其分泌的细胞因子，包括生长因子，炎症因子和趋化因子等，如EGF，VEGF，MMP等促进肿瘤的生长和进展。总体上来说肿瘤相关巨噬细胞可通过复杂的自分泌与旁分泌途径在促进肿瘤的生长和转移方面扮演着重要的角色。
甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，近年来发病率增长迅速，已成为最常见的恶性肿瘤之一，在中国也已达到女性恶性肿瘤中第七位，其中90%是甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)。虽然PTC的死亡率和其他恶性肿瘤相比，死亡率比较低，但是PTC转移率很高，淋巴结转移率高达30%-50%，如果PTC转移和复发，病人没能及时诊断，结果丧失最佳手术时机，死亡率则显著升高，是预后不良的重要指标。
临床数据和实验结果都明确提示巨噬细胞可以促进甲状腺乳头状癌肿瘤的发生和恶性进展。将甲状腺乳头状癌组织中的巨噬细胞进行分离，并对其进行检测和研究，为研究甲状腺乳头状癌中巨噬细胞的表型及巨噬细胞与甲状腺乳头状癌的关系提供了必要条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法，该方法，将巨噬细胞成功从甲状腺乳头状癌组织中分离出来，为研究甲状腺乳头状癌中巨噬细胞的表型及巨噬细胞与甲状腺乳头状癌的关系奠定了基础。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法，其步骤包括：
（1）、将采集到的甲状腺乳头状癌组织置于D-hanks液中，并冲洗2-4次，弃去D-hanks液，去除甲状腺乳头状癌组织周围的结缔组织，并将甲状腺乳头状癌组织剪成1×1×1mm3的块状；
（2）、在步骤（1）中的块状组织中加入Ⅱ型胶原酶，在35℃-40℃温度下消化反应1-3小时，然后加入含有10%胎牛血清的1640培养基终止消化反应，过滤、离心、弃上清；
（3）、将步骤（2）中的细胞液用1640培养基重悬、铺板，然后置于5%CO2的细胞培养箱中孵育30-50分钟，最后用PBS充分洗涤；
（4）将步骤（3）中得到的贴壁细胞用1640培养基培养20-28小时，收集上清液，冷冻保存。
所述步骤（2）中，块状组织与Ⅱ型胶原酶的加入比例为4-6mg：1mL。优选的，块状组织与Ⅱ型胶原酶的加入比例为5mg：1mL。
所述步骤（2）中，块状组织中加入Ⅱ型胶原酶后，在37℃温度条件下消化反应2小时。
所述步骤（2）中，终止消化反应后，将消化液滤过70μm直径的网筛，然后把滤过液在转速为1500rpm下离心10分钟，弃上清。
所述步骤（3）中，培养箱中的孵育时间为40分钟。
所述步骤（4）中，贴壁细胞用1640培养基培养24小时，收集上清液，在零下80℃条件下冷冻保存。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种从甲状腺乳头状癌组织中分离巨噬细胞的方法，并进行CD68免疫荧光染色，结果说明：分离的巨噬细胞呈圆形，可紧密贴壁于培养皿中，CD68染色阳性，阳性率高达95%以上，证实分离巨噬细胞成功。
2、采用本发明提供的分离方法得到的巨噬细胞，可用于研究甲状腺乳头状癌中巨噬细胞的表型及巨噬细胞与甲状腺乳头状癌的关系，为甲状腺乳头状癌病人的治疗提供了依据。
附图说明
图1是从甲状腺乳头状癌组织中分离出来的巨噬细胞的CD68免疫荧光染色图。
图2是从甲状腺乳头状癌组织中分离出来的巨噬细胞的Tg免疫荧光染色图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实施例中用到的试剂：
Ⅱ型胶原酶(SIGMA，美国)、Hank’s液和D-Hank’s液(GIBICO,美国)、1640培养基(GIBICO，美国)、胎牛血清(GIBICO，美国)、PBS(GIBICO，美国)、兔源CD68抗体(rabbit anti-human-CD68Ab)(STAN CLUZ,美国)、鼠源CD68抗体(mouse anti-humanCD68Ab)(DAKO,丹麦)。
实施例1、甲状腺乳头状癌标本的收集
甲状腺乳头状癌（PTC）的手术标本在半小时内由手术室工作人员在手术切除甲状腺组织后立即送往病理科进行冰冻切片病理诊断，若初步病理结果为甲状腺乳头状癌的病理类型，在甲状腺乳头状癌癌灶组织在不影响后续完整的病理诊断的情况下，由病理科医生指导并帮助收集甲状腺乳头状癌的新鲜手术组织标本，在无菌条件下切取肿瘤组织迅速丢入装有胎牛血清和抗生素的D-Hank’s液的50mL无菌离心管中，立即送往实验室进行进一步的检测实验。
实施例2、甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离过程
（1）、将实施例1中的甲状腺乳头状癌标本中，转移至装有D-hanks液的10cm培养皿中，培养皿下垫冰盒，冲洗肿瘤组织3次。
（2）、弃去大部分D-hanks液，留取少量D-hanks使组织保持湿润，使用眼科手术剪刀细心剪除甲状腺乳头状癌周围的结缔组织，并将组织剪成1×1×1mm3大小的组织块。
（3）、转移剪碎的组织颗粒至无菌50mL离心管中，加入Ⅱ型胶原酶，使剪碎的组织颗粒的终浓度达到5mg/mL（Ⅱ型胶原酶的体积为组织体积的5倍左右），至于37℃水浴箱中振荡消化2小时。
（4）、在消化过程中隔15-30分钟观察离心管中甲状腺乳头状癌组织的消化进展，待组织颗粒消化完全时加入预冷的含有10%胎牛血清的1640培养基，稀释胶原酶浓度，终止消化反应。
（5）、将消化液滤过70μm直径的网筛，将滤过液低温离心1500rpm，10min，弃上清。
（6）、将离心下来的细胞用不含血清的1640培养基重悬，将细胞铺板于3.5cm的培养皿中。
（7）将细胞悬液铺板的的培养皿或载玻片置于含有5%CO2的细胞培养箱中孵育40分钟。
（8）、40分钟后取出培养皿或细胞培养载玻片用PBS充分洗涤，冲走和去除不能贴壁的细胞，剩余的不能被PBS冲洗和去除的细胞可牢固贴壁在培养皿中或细胞培养载玻片上的细胞即为巨噬细胞。
（9）、继续使用不含血清的1640培养基培养巨噬细胞24小时，培养24小时后收集巨噬细胞培养上清，保存于-80℃冰箱待用。
实施例3
验证分离的甲状腺乳头状癌相关巨噬细胞：
将实施例2中分离到的甲状腺乳头状癌中的巨噬细胞，进行CD68免疫荧光染色，结果如下图1所示，分离的巨噬细胞呈圆形，可紧密贴壁于培养皿中，CD68染色阳性，阳性率高达95%以上，证实分离巨噬细胞成功。同时进行甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)染色，见图2所示，染色呈阴性，排除了甲状腺滤泡上皮细胞的污染。
Claims (6)
1.一种甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法，其步骤包括：
（1）、将采集到的甲状腺乳头状癌组织置于D-hanks液中，并冲洗2-4次，弃去D-hanks液，去除甲状腺乳头状癌组织周围的结缔组织，并将甲状腺乳头状癌组织剪成1×1×1mm3的块状；
（2）、在步骤（1）中的块状组织中加入Ⅱ型胶原酶，在35℃-40℃温度下消化反应1-3小时，然后加入含有10%胎牛血清的1640培养基终止消化反应，过滤、离心、弃上清；
（3）、将步骤（2）中的细胞液用1640培养基重悬、铺板，然后置于5%CO2的细胞培养箱中孵育30-50分钟，最后用PBS充分洗涤；
（4）将步骤（3）中得到的贴壁细胞用1640培养基培养20-28小时，收集上清液，冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤（2）中，块状组织与Ⅱ型胶原酶的加入比例为4-6mg：1mL。
3.根据权利要求1所述的甲状腺乳头状癌中巨噬细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤（2）中，块状组织中加入Ⅱ型胶原酶后，在37℃温度条件下消化反应2小时。
4.根据权利要求1所述的甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤（2）中，终止消化反应后，将消化液滤过70μm直径的网筛，然后把滤过液在转速为1500rpm下离心10分钟，弃上清。
5.根据权利要求1所述的甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤（3）中，培养箱中的孵育时间为40分钟。
6.根据权利要求1所述的甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤（4）中，贴壁细胞用1640培养基培养24小时，收集上清液，在零下80℃条件下冷冻保存。
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