CN107630000A

CN107630000A - 一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒

Info

Publication number: CN107630000A
Application number: CN201711077978.8A
Authority: CN
Inventors: 韩红兵; 刘永晓; 刘哲熹; 连正兴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-11-06
Filing date: 2017-11-06
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2037-11-06
Also published as: CN107630000B

Abstract

本发明公开了一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒。本发明保护一种用于制备巨噬细胞的试剂盒，包括Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液和巨噬细胞培养液。本发明通过血液密度梯度离心法将颈静脉血、Hank，s溶液、人外周血淋巴细胞分离液(1:1:2均匀混合)的混合液离心，获得外周血单个核细胞，经体外分离培养7‑10天，从而获得巨噬细胞。实验证明，本发明试剂盒分离培养的巨噬细胞具有自发增殖和吞噬能力，可以经过20多次传代培养，分离培养的巨噬细胞与传统方法培育出的巨噬细胞在形态上一致；对巨噬细胞吞噬能力的鉴定与传统方法培育出的细胞差别不大，本发明试剂盒制备简单，成本低廉。

Description

一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒。

背景技术

动物疫病的高发生率是当前畜牧业发展面临的重大挑战，据统计每年畜牧业总产值的12％至15％的损失是由畜禽疾病造成的。采用遗传学方法从遗传本质上提高动物机体免疫功能，增加动物对疾病的抗性具有治本的功效。随着细胞分子生物学的发展，通过对免疫细胞的免疫机制进行研究，加快了动物抗病育种工作的进程。

巨噬细胞作为哺乳动物机体重要的免疫细胞之一，参与固有免疫反应，对病原微生物有吞噬消化功能，具有抗原加工呈递作用，参与适应性免疫应答，在机体抵抗病原微生物入侵，衰老细胞清除，受损组织修复重建及促进炎症反应过程中均发挥关键的作用。巨噬细胞分离培养技术的建立为机体相关免疫反应研究及胞内菌感染机制提供了重要的细胞材料。

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

发明内容

本发明的目的是提供一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒。

本发明提供了一种制备巨噬细胞的方法，包括如下步骤：

(1)以离体外周血为出发材料，获得外周血单个核细胞；

(2)对步骤(1)得到的外周血单个核细胞进行培养，得到巨噬细胞。

所述步骤(2)中，采用巨噬细胞培养基对步骤(1)得到的外周血单个核细胞进行培养。

本发明还保护一种制备巨噬细胞的方法，包括如下步骤：

(a)将离体外周血、Hank's溶液和外周血淋巴细胞分离液混合，收集外周血单个核细胞；

(b)采用巨噬细胞培养液培养步骤(a)得到的外周血单个核细胞，得到巨噬细胞。

所述步骤(a)中，所述离体外周血、Hank's溶液和外周血淋巴细胞分离液的体积配比为1:1:2。

所述步骤(a)具体包括如下步骤：(1)将1体积份离体外周血和1体积份Hank's溶液均匀混合，得到混合溶液；(2)将1体积份步骤(1)得到的混合溶液加至1体积份外周血淋巴细胞分离液上面，分离得到外周血单个核细胞。

所述步骤(2)具体包括如下步骤：(I)将1体积份步骤(1)得到的混合溶液加至1体积份外周血淋巴细胞分离液上面，离心，将中间白色雾状层细胞转移至离心管中，离心，收集沉淀；(Ⅱ)采用Hank's溶液洗涤步骤(I)得到的沉淀(具体可为两次)，离心，收集沉淀(即外周血单个核细胞)。

所述步骤(b)具体包括如下步骤：采用巨噬细胞培养液培养所述外周血单个核细胞24h，弃去悬浮细胞，PBS溶液洗涤贴壁细胞(具体可洗涤两遍)，在巨噬细胞培养液中培养，每隔3-4天更换新的巨噬细胞培养液，连续培养7-10天，得到巨噬细胞。

本发明还保护以上任一所述的方法制备得到的巨噬细胞。

本发明还保护一种用于制备巨噬细胞的试剂盒，包括Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液和巨噬细胞培养液。

所述试剂盒还包括离体外周血。

所述试剂盒中，离体外周血、Hank's溶液和外周血淋巴细胞分离液的体积配比为1:1:2。

所述试剂盒还包括PBS溶液。

本发明还保护Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液和巨噬细胞培养液在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为制备巨噬细胞。

本发明还保护Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液、巨噬细胞培养液和离体外周血在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为制备巨噬细胞。

以上任一所述巨噬细胞同时具备如下三个特征：(1)经α－醋酸萘酚酯酶染色和酸性磷酸酶染色均为阳性；(2)具有异物吞噬能力；(3)F4/80、CD14、INOS、CD36、CCR7和MSR均有表达。

以上任一所述外周血可为颈静脉血，更具体可为家畜颈静脉血。所述家畜具体可为绵羊。所述家畜具体可为猪。

以上任一所述巨噬细胞培养液由胎牛血清和RPMI-1640培养基组成；胎牛血清在巨噬细胞培养液中的体积百分含量为10％。

以上任一所述Hank's溶液的配方为(以1000ml为例)：NaCl8.00g，KCl0.4g，Na₂HPO₄0.06g，KH₂PO₄ 0.06g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，CaCl₂ 1.4g，葡萄糖10.0g溶解于1000ml双蒸水中，混合均匀后加入10ml青霉素和链霉素(10ml中含有青霉素10000IU、链霉素10mg/ml)。

以上任一所述外周血淋巴细胞分离液可为人外周血淋巴细胞分离液。人外周血淋巴细胞分离液具体可为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：LTS1077的产品。

以上任一所述PBS溶液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在PBS溶液中的浓度为：KCl 0.2g/1000ml，NaCl 8.00g/1000ml，Na₂HPO₄ 1.15g/1000ml，KH₂PO₄ 0.2g/1000ml；所述溶剂为水。所述PBS溶液的pH值为7.0-7.2。

传统的家畜巨噬细胞分离与培养的方法有骨髓来源巨噬细胞诱导培养法、支气管肺泡灌洗法、腹腔灌洗法、脾脏巨噬细胞贴壁纯化法。但是这些巨噬细胞获取方法均需要处死动物，巨噬细胞获取的难度较大，重复性低，巨噬细胞在获取过程中易受到刺激或污染，使其功能发生改变等因素限制了对巨噬细胞研究的进展。

本发明通过血液密度梯度离心法将颈静脉血、Hank，s溶液、人外周血淋巴细胞分离液(1:1:2均匀混合)的混合液离心，获得外周血单个核细胞，经体外分离培养7-10天，从而获得巨噬细胞。实验证明，本发明试剂盒分离培养的巨噬细胞具有自发增殖和吞噬能力，可以经过20多次传代培养。实验证明，本发明分离培养的巨噬细胞与传统方法培育出的巨噬细胞在形态上一致；对巨噬细胞吞噬能力的鉴定与传统方法培育出的细胞差别不大，本发明试剂盒制备简单，成本低廉。

附图说明

图1为培养后巨噬细胞形态(200×)。

图2为培养巨噬细胞溶酶体酶类染色。

图3为培养巨噬细胞吞噬荧光凝胶球。

图4为培养巨噬细胞标记蛋白荧光染色。

图5为培养巨噬细胞体外传代培养20代核型分析图。

图6为猪外周血巨噬细胞吉姆萨染色和CD14蛋白荧光染色。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Hank's溶液：NaCl8.00g，KCl0.4g，Na₂HPO₄0.06g，KH₂PO₄ 0.06g，MgSO₄·7H₂O2.0g，CaCl₂ 1.4g，葡萄糖10.0g溶解于1000ml双蒸水中，混合均匀后加入10ml青霉素和链霉素(10ml中含有青霉素10000IU、链霉素10mg/ml)，经0.22μm滤器过滤，4℃储存备用。

人外周血淋巴细胞分离液：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：LTS1077。

PBS溶液：KCl 0.2g，NaCl 8.00g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄ 0.2g溶解于1000ml的双蒸水中，混合均匀后，经0.22μm滤器过滤除菌。pH值为7.0-7.2。

实施例1、用于分离和培养巨噬细胞的试剂盒的组成

试剂盒由单个核细胞分离组分和巨噬细胞培养组分组成；

单个核细胞分离组分包括Hank's溶液、PBS溶液和人外周血淋巴细胞分离液；

巨噬细胞培养组分包括巨噬细胞培养液；

巨噬细胞培养液由胎牛血清和RPMI-1640培养基组成；胎牛血清在巨噬细胞培养液中的浓度为10％(体积百分比)。

实施例2、绵羊外周血巨噬细胞分离、培养及鉴定

一、单个核细胞的制备

1、将1体积份绵羊颈静脉血和1体积份Hank's溶液均匀混合，得到混合溶液。

2、将1体积份步骤1得到的混合溶液加于1体积份人外周血淋巴细胞分离液上面，2000r/min离心20min，将中间白色雾状层细胞转移至离心管中，2000r/min离心5min，收集沉淀。

3、采用3ml Hank's溶液重悬步骤2得到的细胞沉淀，重复洗涤两遍，收集细胞沉淀(即外周血单个核细胞)。

二、巨噬细胞的制备

1、使用巨噬细胞细胞培养液重悬步骤一得到的淋巴细胞沉淀，以10⁶个细胞/ml的浓度接种于6孔培养板，置于37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养24h，弃去悬浮细胞，PBS洗涤两遍，贴壁细胞即为巨噬细胞前体的细胞。

2、将步骤1得到的巨噬细胞前体的细胞在巨噬细胞培养液中培养，每隔3-4天更换新的巨噬细胞培养液，连续培养7天，得到巨噬细胞。

三、巨噬细胞鉴定

1、在相差显微镜下观察步骤二得到的巨噬细胞的形态，并对细胞进行吉姆萨染色1h，在倒置显微镜下观察染色后的细胞形态。结果如图1所示。显微镜下可见细胞贴壁紧密，形状多样，梭形和椭圆形居多，细胞界限清楚，具有突起和伪足。细胞核着色较深，呈卵圆形、肾形或不规则形,偏居于细胞的一端。细胞胞浆丰富,含有少量颗粒及空泡。实验设3次重复，结果无显著差异。

2、对步骤二得到的巨噬细胞进行酸性磷酸酶和α-醋酸萘酚酯酶染色，在倒置显微镜下观察。结果如图2所示。结果表明，经α－醋酸萘酚酯酶染色，细胞胞浆内呈现棕黄色和棕褐色颗粒状弥散沉淀，细胞染色结果呈阳性。酸性磷酸酶为溶酶体标志性酶，在巨噬细胞等吞噬细胞中具有广泛分布，结果显示细胞胞浆中有大量棕褐色沉淀分布，证明细胞具有较高的酸性磷酸酶活性。实验设3次重复，结果无显著差异。

3、检测步骤二得到的巨噬细胞的异物吞噬能力，检测方法如下：用移液器将细胞培养板中的培养基吸走，按1:10的比例将绿色荧光吞噬球(sigma aldrich公司，货号：L4530)加入细胞，5％CO₂，37℃细胞恒温培养箱中培养12h。PBS洗涤细胞3次，清除未被吞噬的吞噬球。利用高内涵对吞噬球的吞噬情况进行观察。对巨噬细胞的吞噬指数和吞噬百分率进行统计。

吞噬百分率(％)＝吞噬鸡红细胞(吞噬球)的巨噬细胞数/计数总巨噬细胞数×100％；

吞噬指数＝吞噬鸡红细胞(吞噬球)数/参与吞噬巨噬细胞数。

结果如3所示。结果表明，巨噬细胞具有吞噬异物的能力，对细胞的吞噬指数进行统计分析，吞噬指数为72.2±8.1。实验设3次重复，结果无显著差异。

4、利用免疫荧光技术，检测步骤二得到的巨噬细胞中F4/80、CD14、INOS、CD36、CCR7和MSR的表达情况(抗体均购于北京博奥森生物技术有限公，F4/80，货号：bs-11182R；CD14，货号：bs-20796R；INOS，货号：bs-20601R；CD36，货号：bs-8873R；CCR7，货号：bs-1305R；MSR，货号：bs-6763R；二抗，货号：bs-0295G-HRP)。结果如图4所示。结果表明，6种蛋白细胞荧光染色结果均呈阳性，但是不同蛋白染色荧光强度之间存在一定差异，证明6种蛋白在细胞内具有不同的表达量。实验设3次重复，结果无显著差异。

5、对步骤二得到的巨噬细胞进行核型分析，依次按照如下步骤操作：

(1)选择生长旺盛，状态良好细胞传代培养，当细胞数达80％-90％时，加入终浓度为0.1μg/ml秋水仙碱，继续培养6-10h，至大部分细胞形态变圆处于分裂中期。

(2)用枪反复吹打细胞，将细胞悬液1000rpm离心10min，将上层多余液体用枪移走，剩余500μl，吹打混匀，制备成细胞悬液。

(3)向细胞悬液中加入经过37℃预热处理的10ml kcl低渗液(浓度为0.075mol/L)，37℃水浴低渗处理8分钟，然后1000rpm离心10min，弃上清。-20℃预冷固定液10min，加入1ml固定液后轻轻摇匀，继续加入5ml固定液，轻轻吹打，继续加入5ml固定液，室温固定30min。

(4)1000rpm离心10min，弃上清，剩余500μl固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，转移至5mlEP管中。重新加入3ml固定液，进行二次固定。

(5)1000rpm离心10min，弃上清，剩余500μl固定液，转移至5mlEP管中。重新加入3ml固定液，进行三次固定。

(6)1000rpm，离心10min，弃上清液，根据细胞数多少用适量固定液重悬细胞。将10μl细胞悬液悬空滴落于湿冷的载玻片，载玻片进行酒精灯火焰固定，固定好的玻片用10％吉姆萨染液进行染色体染色。流水冲洗多余的染色，室温下，空气干燥，封片。倒置显微镜下，镜检观察细胞的分裂相，染色体专用分析软件，对染色体形态数目进行匹配分析。

结果如图4所示。结果表明，绵羊巨噬细胞具有54条染色体，其中26对常染色体，一对性染色体。1-3对染色体为最大的中部着丝粒染色体，4-9对染色体差异明显，10-26对染色体差异较小，经鉴定体外培养获得巨噬细胞在染色体数目和形态均可保持正常，无染色体缺失、粘连情况产生，证明绵羊外周血单核细胞体外分离培养得到的巨噬细胞，经体外传代后可保持稳定的染色体数目与结构，可作为稳定的细胞材料用于后期相关研究。

四、巨噬细胞传代

巨噬细胞传25代可以保持稳定，25代细胞经过染色体核型分析证明染色体没有异常，细胞稳定正常、没有癌变的情况出现。

实施例3、猪外周血巨噬细胞分离、培养及鉴定

一、单个核细胞的制备

1、将1体积份猪颈静脉血和1体积份Hank's溶液均匀混合，得到混合溶液。

二、巨噬细胞的制备

2、将步骤1得到的巨噬细胞前体的细胞在巨噬细胞培养液中培养，每隔3-4天更换新的巨噬细胞培养液，连续培养10天，得到巨噬细胞。

三、巨噬细胞鉴定

对步骤二得到的巨噬细胞进行吉姆萨染色1h，在倒置显微镜下观察染色后的细胞形态。利用免疫荧光技术，检测步骤1得到的巨噬细胞中CD14的表达情况。结果如图5所示。结果表明，细胞形状多样，梭形和椭圆形居多，细胞界限清楚，具有突起和伪足。细胞核着色较深，呈卵圆形、肾形或不规则形，偏居于细胞的一端。细胞胞浆丰富,含有少量颗。巨噬细胞标记蛋白CD14染色后，所有细胞都呈现CD14阳性细胞，并且主要在细胞膜表达。采用实施例二中步骤三的2、3、4进行鉴定，综合各项结果，证实了猪外周血分离培养的细胞为巨噬细胞。

四、巨噬细胞传代

巨噬细胞传20代可以保持稳定，20代细胞经过染色体核型分析证明染色体没有异常，细胞稳定正常、没有癌变的情况出现。

实施例4、巨噬细胞的制备方法

经过实施例2和实施例3的巨噬细胞制备和验证，建立一套巨噬细胞制备方法，并已证明制备的细胞确实为巨噬细胞。

一、单个核细胞的制备

1、将1体积家畜份颈静脉血和1体积份Hank's溶液均匀混合，得到混合溶液。

二、巨噬细胞的制备

2、将步骤1得到的巨噬细胞前体的细胞在巨噬细胞培养液中培养，每隔3-4天更换新的巨噬细胞培养液，连续培养7-10天，得到巨噬细胞。

Claims

1.一种制备巨噬细胞的方法，包括如下步骤：

(1)以离体外周血为出发材料，获得外周血单个核细胞；

2.一种制备巨噬细胞的方法，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述巨噬细胞培养液由胎牛血清和RPMI-1640培养基组成；胎牛血清在巨噬细胞培养液中的体积百分含量为10％。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤(a)中，所述离体外周血、Hank's溶液和外周血淋巴细胞分离液的体积配比关系为1:1:2。

5.权利要求1至4任一所述的方法制备得到的巨噬细胞。

6.一种用于制备巨噬细胞的试剂盒，包括Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液和巨噬细胞培养液；所述巨噬细胞培养液由胎牛血清和RPMI-1640培养基组成；胎牛血清在巨噬细胞培养液中的体积百分含量为10％。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括离体外周血。

8.如权利要求所述的试剂盒，其特征在于：所述离体外周血、Hank's溶液和外周血淋巴细胞分离液的体积配比关系为1:1:2。

9.Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液和巨噬细胞培养液在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为制备巨噬细胞。

10.Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液、巨噬细胞培养液和离体外周血在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为制备巨噬细胞。