CN102251017A

CN102251017A - 一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及细胞吞噬外源异物能力的方法

Info

Publication number: CN102251017A
Application number: CN2011101303582A
Authority: CN
Inventors: 刘利平; 乐亚玲; 陈桃英
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2011-11-23

Abstract

本发明公开的一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法，包括感染源制备步骤、混合培养步骤、在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤、分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤，其特征在于所述感染源制备步骤是制备表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌。本发明将能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌作为感染源，研究各类细胞的吞噬作用。具有直观、准确、快速、方便等优点。本发明还可以观察具有吞噬功能的细胞类型。

Description

一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及细胞吞噬外源异物能力的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定细胞是否具有吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法。

背景技术

吞噬作用(phagocytosis)是指细胞把入侵的病原体(如细菌和病毒)转运到细胞内并加以清除的过程，此过程构成生物体先天免疫的第一道防线。

吞噬作用是所有后生动物的一种原始的防御机制。早在1862年，Haeckel就描述了腹足动物血细胞的吞噬作用过程，但是，吞噬作用在免疫防御上的重要性直到1882年才被Metchnikoff意识到(Vaughan，1965)。吞噬作用在动物界中普遍存在，低等单细胞动物通过吞噬作用取食，高等多细胞动物则通过吞噬细胞来清除外来物质，吞噬过程可以概括为：识别，粘连，聚集，摄入，清除等(王金星等，2004)。

等(1986)发现透明细胞具有较强的吞噬能力。由于吞噬能力在一定程度上反映了机体免疫力的变化，而吞噬能力一般用吞噬百分比和吞噬指数来表示。

在研究吞噬作用中，不同学者采用不同的感染源。目前有文献报道了腊蛾(Galleria mellonella)、贻贝、Procambarus zonangulus等吞噬细胞对用FITC标记的硅胶颗粒、酵母和酵母聚糖A(zymosan A)的吞噬作用；而国内研究主要是利用金黄色葡萄球菌作为外源感染源，甲醇固定、Gimesa染色后用显微镜观察。由于酵母细胞透明，在显微镜下不易辨认；FITC荧光素不稳定，易受温度、pH值、杂质、细胞固定剂及溶剂等多种因素的影响；而金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，能引起人和动物的多种疾病，而且作为感染源时，需甲醇固定，Gimesa染色，过程繁琐且不易观察吞噬过程。因此选择一种效果明显、易观察的感染源非常必要。

(Tojo et al.，2000；Cima et al.，2001；Barracco t al.，1999；Cárdenas et al.，2000；南旭阳，2009；林清华，1999；魏克强，2006；陈孝煊等，2002；)增强型绿色荧光蛋白因能稳定表达，在生物学研究中常被用作指示物，而将pEGFP转化到大肠杆菌的技术相当成熟。表达了绿色荧光蛋白的大肠杆菌具有外源微生物的特性，绿色荧光蛋白还能在大肠杆菌内稳定、持续表达，荧光不易淬灭，样品还可以长时间保存。而吞噬了大肠杆菌的血细胞在荧光显微镜下清楚可见，能迅速准确得到吞噬百分比及吞噬指数，且吞噬大肠杆菌后还可以利用流式细胞仪对有吞噬作用的血细胞进行分选。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对现有研究吞噬作用中所采用的感染源存在的问题而提供一种鉴定细胞是否具有吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法，包括感染源制备步骤、混合培养步骤、在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤、分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤，其特征在于所述感染源制备步骤是制备表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌。

所述混合培养步骤是指将所述感染源制备步骤制备的表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌与所述研究细胞按照细胞个数10∶1的比例混合，培养1小时制成观察液。

所述在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤是指将所述混合培养步骤培养的观察液制成血涂片于荧光倒置显微镜下观察。

所述分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤是指在显微镜下清晰观察每个视野中参与吞噬的细胞，吞噬细胞中的大肠杆菌数及视野中的总细胞，并且能辨别参与吞噬细胞的类型；然后将每个视野中的参与吞噬的细胞、吞噬细胞中的大肠杆菌数及视野中的总细胞的指标累计，以下列公式分别计算所述研究细胞的吞噬百分比及吞噬指数：

由于采用了如上的技术方案，本发明将能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌作为感染源，研究各类细胞的吞噬作用。具有直观、准确、快速、方便等优点。本发明还可以观察具有吞噬功能的细胞类型。

附图说明

图1本发明实施例1中克氏原螯虾血细胞对能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌的吞噬作用荧光显微镜下观察的示意图。

其中：

图1A为荧光显微镜下观察的能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌示意图；

图1B为荧光显微镜下观察的克氏原螯虾血淋巴细胞(明场+荧光)示意图；

图1C和图1D为感染能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌后30min，血细胞对大肠杆菌的粘连和聚集(明场+荧光)示意图；

图1E和图1F为感染能表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌后30min，血细胞对大肠杆菌的吞噬作用(明场+荧光)示意图。

图2为本发明实施例2中玻璃海鞘血细胞对大肠杆菌感染的细胞应答示意图。

其中图2A为荧光显微镜下观察体外感染60min后透明变形细胞的吞噬作用(血细胞经PI染色)，小室细胞和桑椹细胞不具有吞噬作用示意图；

图2B为体外感染60min，透明变形细胞吞噬表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌(明场+荧光)；颗粒变形细胞不具有吞噬作用示意图。

图2C为感染大肠杆菌后30min，颗粒变形细胞脱颗粒示意图；a，透明变形细胞；b，表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌；c，颗粒变形细胞；d，小室细胞；e，桑椹细胞；f，发生脱颗粒的血细胞。A，B，bar＝10μm；C，bar＝5μm.

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实施例1：

体外培养克氏原螯虾(Procambarus clarkii)血淋巴细胞对表达绿色荧光蛋白大肠杆菌的吞噬作用。

1.构建表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌：

a、用B型小量质粒快速提取试剂盒(博大泰克)从转化有质粒pEGFP的E.coli DH5α中提取、纯化pEGFP，-20℃保存；

b、制备感受态细胞(CaCl₂法)。

c、将200μl感受态细胞加入1μl EGFP质粒，轻轻摇匀，于冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置2min后加入800μlLB培养基，37℃200rpm振荡培养1hr，室温下4000rpm离心5min，弃掉大部分上清，用剩余的约50μl培养基重悬细胞。将细菌涂布于含100μl浓度为20mg/ml的X-gal涂布的氨苄青霉素(100μg/ml)的平板上，培养过夜。→挑取阳性单克隆菌落，在LB(含Amp)培养基中37℃培养12-24hr，达对数增长期后离心收集表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌，镜检。

2.克氏原螯虾血淋巴细胞离体培养：

取健康螯虾，用0.01％的KMnO4溶液浸泡5min，无菌水冲洗，酒精棉球消毒头胸部与腹节连接处，用无菌注射器吸取0.3ml抗凝剂(配方：0.14MNaCl，0.1M葡萄糖，30mM柠檬酸，26mM柠檬酸钠，10mMEDTA，pH＝4.6)心窦采血，抗凝剂与血淋巴液充分混匀后直接培养在盖玻片上(无菌培养皿中灭菌好)，与黑暗的湿盒中静置30min(此时大部分细胞都贴附在盖玻片上)。用60μl血细胞培养基(含15％FBS，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的L-15培养液)替代细胞悬液中的抗凝剂，继续培养4h。

3.克氏原螯虾血淋巴细胞吞噬情况观察：吸取多余培养基，加入60μl表达好的绿色荧光蛋白大肠杆菌，使E.coli与血细胞的数量比为10∶1。于1hr后利用荧光倒置显微镜观察血细胞吞噬情况。参见图1。

实施例2：

玻璃海鞘体外感染大肠杆菌

体外培养玻璃海鞘血淋巴细胞，(培养基配方80％Leibovitz L-15，FBS15％，添加终浓度为1g/l的葡萄糖，300U的青霉素、链霉素，0.1mg/l Vc，20mMHepes，0.75g/l KCl，1.1g/l CaCl2，2g/l MgCl2，NaCl20g/l，7.5％NaCO3调节pH值，)，其余均同实施例1，具体参见图2。

以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种鉴定细胞吞噬外源异物的功能及研究细胞吞噬外源异物能力的方法，包括感染源制备步骤、混合培养步骤、在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤、分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤，其特征在于所述感染源制备步骤是制备表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合培养步骤是指将所述感染源制备步骤制备的表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌与所述研究细胞按照细胞个数10∶1的比例混合，培养1小时制成观察液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述在荧光显微镜直接观察研究细胞对所述感染源吞噬、包囊的整个吞噬过程步骤是指将所述混合培养步骤培养的观察液制成血涂片于荧光倒置显微镜下观察。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分析不同条件下所述研究细胞吞噬能力的变化得出吞噬指标步骤是指在显微镜下清晰观察每个视野中参与吞噬的细胞，吞噬细胞中的大肠杆菌数及视野中的总细胞，并且能辨别参与吞噬细胞的类型；然后将每个视野中的参与吞噬的细胞、吞噬细胞中的大肠杆菌数及视野中的总细胞的指标累计，以下列公式分别计算所述研究细胞的吞噬百分比及吞噬指数：