CN112662562A - 一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法 - Google Patents

一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法。所述方法如下：步骤一，大肠杆菌的培养；步骤二，酵母菌细胞壁的制备；步骤三，无膜团聚体模型的制备；步骤四，基于酵母菌细胞壁伪装团聚体人工细胞模型的构筑；步骤五，人工细胞模型对两种类型大肠杆菌的靶向捕获；步骤六，人工细胞模型对细菌的杀死作用。本发明的优点：提供了一种简单的高效的酵母菌细胞壁伪装团聚体构筑人工细胞模型的方法，在人工细胞和细菌之间建立一种化学通信和信号传递，揭示了人工细胞模型与细菌之间的识别、凝集、吞噬并杀死细菌的动态过程，实现了一种可程序化调控人工细胞靶向捕获、吞噬并且杀菌的应用。

Description

一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死 大肠杆菌的方法
技术领域
本发明属于细胞模型应用技术领域，具体涉及一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法。
背景技术
近年来，由致病性大肠杆菌引发的食源性疾病爆发频繁，严重影响人类的健康。虽然采取抗生素可以有效地杀死大肠杆菌，但是随着抗生素的滥用，已经报道了对抗菌剂产生耐药性的细菌，即超级细菌，它们对全世界的人类健康构成了严重的挑战。致病菌往往通过凝集素-糖特异性识别来实现对宿主细胞的粘附，进而感染宿主组织，引起病变。因此，研究致病菌和受体表面的相互作用有利于进一步了解感染性疾病的致病机理，为致病菌的特异性检测和感染性疾病的治疗提供新的策略。
细菌粘附是细菌感染人畜的先决条件，受到多种理化因素和生物因素的制约，是多种粘附素和受体共同作用的结果，具有宿主特异性、组织特异性和细胞特异性。大肠杆菌的粘附过程主要由菌毛凝集素与细胞表面的聚糖特异性相互作用来介导。其中，I型菌毛末端的大肠杆菌(例如大肠杆菌ATCC 25922)具有可以与α-甘露糖特异性识别的FimH凝集素，并且FimH凝集素也可以识别多种携带一个或多个N-连接的高甘露糖结构的糖蛋白。这些甘露糖结合域在已知的可以表达FimH凝集素的大肠杆菌中高度保守，但是在肠出血性大肠杆菌O157:H7中表达FimH的基因组发生突变，这种突变消除了对甘露糖的识别作用。有趣的是，酵母菌细胞壁表面含有大量的甘露聚糖，表达FimH凝集素的大肠杆菌也能结合酵母甘露聚糖并介导酵母细胞凝集，而肠出血性大肠杆菌O157:H7则不能粘附和凝集酵母菌细胞。基于荧光光谱、表面等离子体共振、石英晶体微天平和电化学阻抗等检测技术的生物传感在研究凝集素/细菌-糖特异性识别方面受到研究学者的广泛关注，但是通过构筑人工细胞模型的方法，设计可程序化调控人工细胞与细菌之间的靶向识别、吞噬和杀菌的动态过程研究尚未报道。人工细胞是一种通过自下而上的方法构建的简化的细胞模型，用来模拟真实细胞的某些特定性质和功能，有助于深入理解细胞的运行机制。无膜的团聚体结构是原始细胞的一种代表，在探究生命起源，模拟人工细胞方面具有重要的研究意义和价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有对细菌的研究过程中方法较为复杂且缺少细菌与杀菌剂载体之间的相互作用的问题，提供一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，并揭示了杀菌剂载体与细菌之间可程序化调控的靶向识别、吞噬和杀菌的动态过程。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，所述方法步骤如下：
步骤一、大肠杆菌的培养
(1)表达FimH凝集素的大肠杆菌的培养：将菌株置于培养基中，在温度为35℃～37℃的摇床中进行培养增殖，培养到指数生长期后取用；
(2)不表达FimH凝集素的肠出血性大肠杆菌的培养：将菌株置于培养基中，在温度为35℃～37℃的摇床中进行培养增殖，培养到指数生长期后取用；
(3)采用0.01～0.05mol/L的磷酸缓冲溶液分布对培养后的大肠杆菌进行清洗，离心收集细菌；
步骤二、酵母菌细胞壁的制备
(1)酵母菌细胞壁的破碎：选择酵母为生物模板，通过球磨机对酵母菌溶液进行多次反复研磨，离心转速为4000～6000转/分离心5～10分钟，取上清液，冷冻干燥，得到研磨成纳米级的酵母菌细胞壁碎片；
(2)酵母菌细胞壁悬浊液的配制：将细胞壁溶解到无菌PBS缓冲溶液中，配制出0.5～10mg/mL的酵母菌细胞壁悬浊液；
步骤三：无膜团聚体模型的制备
(1)季铵盐化的直链淀粉的合成：将直链淀粉和氢氧化钠溶于去离子水中，加热搅拌至直链淀粉完全溶解，然后加入3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，继续反应，透析，冷冻干燥，得到季铵盐化直链淀粉；
(2)季铵盐化直链淀粉溶液的配制：将合成的季铵盐化直链淀粉溶解到磷酸缓冲溶液中，配制出2～10mg/mL的季铵盐化直链淀粉溶液；
(3)透明质酸溶液的配制：将透明质酸溶解到磷酸缓冲溶液中，配制出0.5～5mg/mL的透明质酸溶液；
(4)将(2)的溶液加入到(3)的溶液中，利用涡旋震荡仪震荡20～30s，得到无膜团聚体模型；
步骤四、基于酵母菌细胞壁伪装团聚体人工细胞模型的构筑
将步骤二得到的细胞壁悬浊液加入到步骤三中得到的团聚体模型中涡旋震荡，得到团聚体表面伪装一层酵母菌细胞壁膜的人工细胞模型；
步骤五、人工细胞模型对两种类型大肠杆菌的粘附
将步骤一中等量的两种类型的大肠杆菌滴入到步骤四得到的人工细胞溶液中，100r/min条件下搅拌，对细菌进行定向捕获；
步骤六、人工细胞模型对细菌的杀死作用
利用碘化丙啶染色剂对细菌染色，通过激光共聚焦显微镜观察细菌的死活情况。
本发明相对于现有技术的有益效果为：
1.本发明以无膜的不稳定团聚体结构为原始细胞模型，在其表面自组装破碎的纳米级酵母菌细胞壁得到人工细胞模型，酵母菌细胞壁的存在不仅可以提高团聚体的稳定性，而且将酵母菌细胞与细菌之间的相互作用很好的传递到人工细胞与细菌之间，赋予人工细胞靶向识别并凝集细菌的能力。此外，人工细胞模型依然保持团聚体本身的扣押特性，细菌在人工细胞表面粘附后借助缓慢的机械搅拌可以通过酵母菌细胞壁膜进入团聚体内部，而组成团聚体的一种基元为季铵盐化的直链淀粉，季铵盐链的存在对进入团聚体内部的细菌有杀死作用，从而杀死捕获的细菌。
2.本发明揭示了人工细胞与细菌之间可程序化调控的靶向识别、吞噬和杀菌的动态过程。
3.本发明的基于团聚体伪装构筑的人工细胞模型制备方法条件温和，操作简单且高效。
4.众所周知，白细胞是人体的免疫细胞，当病菌侵入人体体内时，白细胞能通过变形而穿过毛细血管壁集中到病菌入侵部位，将病菌包围，吞噬。本发明采用一种简单且高效的构筑方法，在人工细胞和细菌之间建立了一种化学通信和信号传递，使构建的人工细胞模型不仅能呈现细菌与酵母菌之间的识别和凝集作用，而且具有类“白细胞”的特性和功能，可以吞噬并杀死所捕获的细菌，实现了一种可程序化调控人工细胞靶向捕获、吞噬并且杀菌的应用。
附图说明
图1为实施例1中得到的酵母菌细胞壁的扫描电子显微镜图片；
图2为实施例1中得到的团聚体模型的光学显微镜图片；
图3为实施例1中得到的团聚体模型的扫描电子显微镜图片；
图4为实施例1中得到的酵母菌细胞壁伪装团聚体人工细胞模型的光学显微镜图片；
图5为实施例1中得到的人工细胞模型的激光共聚焦显微镜图片，其中酵母菌细胞壁带有红色荧光，团聚体中季铵盐化的直链淀粉带有绿色荧光；
图6为实施例1中得到的人工细胞模型的激光共聚焦三维显微镜图片，其中酵母菌细胞壁带有红色荧光，团聚体中季铵盐化的直链淀粉带有绿色荧光；
图7为实施例1中得到的人工细胞捕获大肠杆菌ATCC 25922的激光共聚焦显微镜图片，其中人工细胞带有红色荧光；
图8为实施例1中得到的人工细胞捕获大肠杆菌ATCC 25922的激光共聚焦显微镜图片，其中大肠杆菌ATCC 25922带有蓝色荧光；
图9为实施例1中得到的人工细胞捕获大肠杆菌O157:H7的激光共聚焦显微镜图片，其中大肠杆菌O157:H7带有绿色荧光；
图10为图7，图8和图9的叠合图；
图11为图10中对人工细胞捕获的两种大肠杆菌的数量的对比图；
图12为实施例1中得到的进入人工细胞内部大肠杆菌ATCC 25922采用PI染色的激光共聚焦显微镜图片，死亡的大肠杆菌带有红色荧光；
图13为进入人工细胞内部的细菌和溶液中细菌活性的对比图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和内容，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，所述方法步骤如下：
步骤一、大肠杆菌的培养
(1)表达FimH凝集素的大肠杆菌(ATCC 25922)的培养：将菌株置于培养基中，在温度为35℃～37℃的摇床中进行培养增殖，培养到指数生长期后取用；
(2)不表达FimH凝集素的肠出血性大肠杆菌(O157:H7)的培养：将菌株置于培养基中，在温度为35℃～37℃的摇床中进行培养增殖，培养到指数生长期后取用；
(3)采用0.01～0.05mol/L的磷酸缓冲溶液分布对培养后的大肠杆菌进行清洗，离心收集细菌；
步骤二、酵母菌细胞壁的制备
(1)酵母菌细胞壁的破碎：选择酵母为生物模板，通过球磨机对酵母菌溶液进行多次反复研磨，离心转速为4000～6000转/分离心5～10分钟，取上清液，冷冻干燥，得到研磨成纳米级的酵母菌细胞壁碎片；
(2)酵母菌细胞壁悬浊液的配制：将细胞壁溶解到无菌PBS缓冲溶液中，配制出0.5～10mg/mL的酵母菌细胞壁悬浊液；
步骤三：无膜团聚体模型的制备
(1)季铵盐化的直链淀粉的合成：将直链淀粉和氢氧化钠溶于去离子水中，加热搅拌至直链淀粉完全溶解，然后加入3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液(直链淀粉的氢氧化钠溶液与3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液的体积比15～20：1)，继续反应，透析，冷冻干燥，得到季铵盐化直链淀粉；淀粉分子之间是以氢键结合成淀粉颗粒，35℃条件下加入水，淀粉颗粒只能发生轻微溶胀，只有在高温条件下破坏分子链之间的氢键(高于53℃)淀粉才能溶胀成糊状溶液；因此，该体系选用较低温度为35℃时，加入氢氧化钠，氢氧化钠能与淀粉分子链上的羟基结合，破坏部分氢键，减弱分子之间的作用力，同时氢氧化钠与淀粉分子链上的羧基反应，使其变成钠盐，增加淀粉的亲水性和溶解性。
(2)季铵盐化直链淀粉溶液的配制：将合成的季铵盐化直链淀粉溶解到磷酸缓冲溶液中，配制出2～10mg/mL的季铵盐化直链淀粉溶液；磷酸缓冲溶液浓度为0.01mol/L，pH为7.4；
(3)透明质酸溶液的配制：将透明质酸溶解到磷酸缓冲溶液中，配制出0.5～5mg/mL的透明质酸溶液；其中，磷酸缓冲溶液浓度为0.01mol/L，pH为7.4；
(4)将(2)的溶液加入到(3)的溶液中，利用涡旋震荡仪震荡20～30s，得到无膜团聚体模型；
步骤四、基于酵母菌细胞壁伪装团聚体人工细胞模型的构筑
将步骤二得到的细胞壁悬浊液加入到步骤三中得到的团聚体模型中涡旋震荡，得到团聚体表面伪装一层酵母菌细胞壁膜的人工细胞模型；
步骤五、人工细胞模型对两种类型大肠杆菌的粘附
将步骤一中等量的两种类型的大肠杆菌滴入到步骤四得到的人工细胞溶液中，100r/min条件下搅拌，对细菌进行定向捕获；
步骤六、人工细胞模型对细菌的杀死作用
利用碘化丙啶染色剂对细菌染色，通过激光共聚焦显微镜观察细菌的死活情况。
本发明基于酵母菌细胞壁表面的甘露聚糖能够与两种不同型号的大肠杆菌通过糖-凝集素之间的相互作用产生不同的粘附现象，将酵母菌细胞壁伪装到团聚体表面构筑具有酵母菌细胞壁特性的人工细胞模型，从而能够定向捕获细菌ATCC 25922，并且，由于人工细胞含有季铵盐化的直链淀粉，该成分可以杀死进入到人工细胞内部的大肠杆菌，从而实现了人工细胞靶向捕获、吞噬并杀死细菌的应用。大肠杆菌ATCC 25922是具有I型菌毛的细菌，可以与α-甘露糖特异性识别的FimH凝集素，但是在肠出血性大肠杆菌O157:H7中表达FimH的基因组发生突变，这种突变消除了对甘露糖的识别作用。此外，酵母菌细胞壁表面含有大量的甘露聚糖，因此，表达FimH凝集素的大肠杆菌ATCC 25922也能结合酵母甘露聚糖并介导酵母细胞凝集，而肠出血性大肠杆菌O157:H7则不能粘附和凝集酵母菌细胞。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，步骤一中，大肠杆菌的培养具体为：
(1)大肠杆菌(ATCC 25922，表达FimH凝集素)的培养：将菌株置于LB液体培养基中，在温度为37℃，转速为150rpm的条件下摇动过夜，培养到指数生长期；经过洗涤的细菌细胞重新分散于无菌PBS缓冲溶液中，得到菌液，并通过紫外可见分光光度计将6000nm处的光密度OD值调至1.0～1.2，对应于菌液浓度为108～109CFU/mL；
(2)肠出血性大肠杆菌(O157:H7，不表达FimH凝集素)的培养：将菌株置于LB液体培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的条件下摇动过夜，培养到指数生长期；经过洗涤的细菌细胞重新分散于无菌PBS缓冲溶液中，得到菌液，并通过紫外可见分光光度计将6000nm处的光密度OD值调至1.0～1.2，对应于菌液浓度为108～109CFU/mL。
具体实施方式三：具体实施方式二所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，步骤一(1)中，所述无菌PBS缓冲溶液的pH为7.4，所述两种大肠杆菌的OD分别为1.0。
具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，步骤二(2)中，所述无菌PBS缓冲溶液的pH为7.4。
具体实施方式五：具体实施方式一所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，步骤三(1)中，所述直链淀粉水溶液的浓度为9～11mg/mL，氢氧化钠浓度为18～20mg/mL，3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液的浓度为0.1mg/mL～0.3mg/mL。
具体实施方式六：具体实施方式五所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，步骤三(1)中，所述直链淀粉水溶液的浓度为10mg/mL，氢氧化钠浓度为19mg/mL，3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液的浓度为0.15mg/mL。
具体实施方式七：具体实施方式一所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，步骤三(4)中，季铵盐化直链淀粉溶液与透明质酸溶液的体积比为1～2：1。
具体实施方式八：具体实施方式一所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，步骤四中，酵母菌细胞壁悬浊液浓度为5mg/mL，团聚体模型溶液浓度为5mg/mL，酵母菌细胞壁悬浊液与团聚体模型溶液体积比为1：10～20。
具体实施方式九：具体实施方式一所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，步骤五中，所述两种大肠杆菌的OD分别为1.0，人工细胞溶液浓度为5mg/mL，大肠杆菌溶液总量与人工细胞溶液体积比为1：10～100。
实施例1：
一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，具体是按以下步骤进行的：
一、大肠杆菌的培养：
大肠杆菌(ATCC 25922，表达FimH凝集素)的培养：将菌株置于培养基中，在温度为37℃，转速为150rpm的条件下摇动过夜，预计培养到指数生长期。然后，经过洗涤的细菌细胞重新分散于无菌PBS缓冲溶液中，得到菌液，并通过紫外可见分光光度计将6000nm处的光密度OD值调至1.0，对应于菌液浓度为109CFU/mL；
肠出血性大肠杆菌(O157:H7，不表达FimH凝集素)的培养：将菌株置于培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的条件下摇动过夜，预计培养到指数生长期。然后，经过洗涤的细菌细胞重新分散于无菌PBS缓冲溶液中，得到菌液，并通过紫外可见分光光度计将6000nm处的光密度OD值调至1.0，对应于菌液浓度为109CFU/mL；
二、酵母菌细胞壁的制备：
选择安琪酵母为生物模板，通过球磨机对酵母菌溶液进行多次反复研磨，得到的溶液进行离心分离，离心转速为5000转/分，离心5分钟，去除下层沉淀，取上清液，冷冻干燥，得到研磨成纳米级的酵母菌细胞壁碎片。将纳米级的酵母菌细胞壁溶解到磷酸缓冲溶液中，配制得到5mg/mL的酵母菌细胞壁悬浊液，磷酸缓冲溶液浓度为0.01mol/L，pH为7.4。图1为酵母菌细胞壁的扫描电子显微镜照片，可以看出研磨之后的酵母菌细胞壁尺寸比较均匀，为210～400nm。
三、无膜团聚体模型的制备
季铵盐化直链淀粉的合成，将直链淀粉150mg和280mg氢氧化钠溶于15mL去离子水中，35℃下加热搅拌至直链淀粉完全溶解，然后加入1.1mL 3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，继续反应20h，最终的溶液加入乙酸调节pH至7.4，透析，冷冻干燥，得到季铵盐化的直链淀粉。
季铵盐化直链淀粉溶液的配制，取8mg合成的季铵盐化直链淀粉溶解到1mL磷酸缓冲溶液中，用涡旋震荡仪震荡30s得到季铵盐化直链淀粉溶液；透明质酸溶液的配制，取2mg透明质酸溶解到1mL磷酸缓冲溶液中，配制出2mg/mL的透明质酸溶液。其中，磷酸缓冲溶液浓度为0.01mol/L，pH为7.4。取100μL上述季铵盐化直链淀粉溶液加入到100μL上述透明质酸溶液中，用涡旋震荡仪震荡30s，得到无膜团聚体溶液。图2为团聚体溶液的光学显微镜照片，可以看出团聚体表面形貌光滑，大小分布均匀；图3为团聚体溶液的扫描电子显微镜照片，可以看出团聚体表面形貌光滑，有较好的立体形貌。
四、基于酵母菌细胞壁伪装团聚体人工细胞模型的构筑
将上述5mg/mL的酵母菌细胞壁悬浊液充分分散，取5μL酵母菌细胞壁悬浊液加入到100μL新制备的团聚体溶液中，利用涡旋震荡仪震荡40s，得到团聚体表面伪装一层酵母菌细胞壁的人工细胞模型。图4为人工细胞模型的光学显微镜图片，可以看出团聚体表面已经成功伪装了一层酵母菌细胞壁，其表面变得粗糙不平整，出现颗粒状物质；图5为人工细胞模型的激光共聚焦显微镜图片，其中酵母菌细胞壁用异硫氰酸罗丹明B标记显红色，团聚体中季铵盐化的直链淀粉用异硫氰酸荧光素标记显绿色，从图中可以看出酵母菌细胞壁比较密实的分布于团聚体表面，细胞壁层粗糙不平整，团聚体内部为均匀的红色荧光；图6为人工细胞模型的激光共聚焦三维显微镜图片。
五、人工细胞模型对两种类型大肠杆菌的粘附
分别取ATCC 25922细菌培养缓冲溶液5μL和O157:H7细菌培养缓冲溶液5μL，加入到上述100μL新制备的人工细胞模型溶液中，轻微低速混合搅拌防止溶液中人工细胞和细菌发生沉淀，低速(100r/min)搅拌40分钟后，取2μL混合液与载玻片，在激光共聚焦显微镜下观察两种细菌与人工细胞的粘附情况。其中，所使用的两种细菌的培养缓冲溶液的OD值分别为1.0，ATCC 25922细菌用4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色显蓝色，O157:H7细菌用异硫氰酸荧光素标记显绿色，人工细胞模型用异硫氰酸罗丹明B标记显红色。图7为人工细胞的激光共聚焦显微镜图片；图8为人工细胞捕获大肠杆菌ATCC 25922的激光共聚焦显微镜图片，从图中可以看出人工细胞表面吸附了大量蓝色的ATCC 25922大肠杆菌；图9为人工细胞与大肠杆菌O157:H7的激光共聚焦显微镜图片，从图中可以看出人工细胞表面几乎没有绿色的O157:H7大肠杆菌；图10为图7，图8和图9的叠合，可以看出人工细胞可以定向的识别捕获ATCC 25922大肠杆菌，对O157:H7大肠杆菌几乎没有粘附作用；图11为图10中对人工细胞捕获的两种大肠杆菌的数量的对比图，可以直观的看出，相对与人工细胞对O157:H7大肠杆菌的较低的粘附量，人工细胞对ATCC 25922大肠杆菌粘附量为72％，因此有更好的捕获作用。
六、人工细胞模型对细菌的杀死作用
上述人工细胞粘附两种细菌的溶液静置10分钟后，移去溶液上清液中未被粘附的细菌，向人工细胞粘附两种细菌的溶液里滴加新配制的0.2μL碘化丙啶染色剂，低速(150r/min)搅拌，溶液避光染色30min，通过激光共聚焦显微镜观察细菌的死活情况。其中，碘化丙啶浓度为1mg/mL。图12为人工细胞模型对细菌活性的影响，从图中可以看出，进入人工细胞内部大肠杆菌显红色表明细菌被杀死，未进入人工细胞内部的细菌少数显现红色，表明大多数溶液中的细菌未被杀死；图13为进入人工细胞内部的细菌和溶液中细菌活性的对比图，从图中可以直观看出，进入人工细胞内部的细菌死亡率为100％，未进入人工细胞内部的细菌死亡率明显下降，为13％。

Claims (9)

1.一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
步骤一、大肠杆菌的培养
(1)表达FimH凝集素的大肠杆菌的培养：将菌株置于培养基中，在温度为35℃～37℃的摇床中进行培养增殖，培养到指数生长期后取用；
(2)不表达FimH凝集素的肠出血性大肠杆菌的培养：将菌株置于培养基中，在温度为35℃～37℃的摇床中进行培养增殖，培养到指数生长期后取用；
(3)采用0.01～0.05mol/L的磷酸缓冲溶液分布对培养后的大肠杆菌进行清洗，离心收集细菌；
步骤二、酵母菌细胞壁的制备
(1)酵母菌细胞壁的破碎：选择酵母为生物模板，通过球磨机对酵母菌溶液进行多次反复研磨，离心转速为4000～6000转/分离心5～10分钟，取上清液，冷冻干燥，得到研磨成纳米级的酵母菌细胞壁碎片；
(2)酵母菌细胞壁悬浊液的配制：将细胞壁溶解到无菌PBS缓冲溶液中，配制出0.5～10mg/mL的酵母菌细胞壁悬浊液；
步骤三：无膜团聚体模型的制备
(1)季铵盐化的直链淀粉的合成：将直链淀粉和氢氧化钠溶于去离子水中，加热搅拌至直链淀粉完全溶解，然后加入3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，继续反应，透析，冷冻干燥，得到季铵盐化直链淀粉；
(2)季铵盐化直链淀粉溶液的配制：将合成的季铵盐化直链淀粉溶解到磷酸缓冲溶液中，配制出2～10mg/mL的季铵盐化直链淀粉溶液；
(3)透明质酸溶液的配制：将透明质酸溶解到磷酸缓冲溶液中，配制出0.5～5mg/mL的透明质酸溶液；
(4)将(2)的溶液加入到(3)的溶液中，利用涡旋震荡仪震荡20～30s，得到无膜团聚体模型；
步骤四、基于酵母菌细胞壁伪装团聚体人工细胞模型的构筑
将步骤二得到的细胞壁悬浊液加入到步骤三中得到的团聚体模型中涡旋震荡，得到团聚体表面伪装一层酵母菌细胞壁膜的人工细胞模型；
步骤五、人工细胞模型对两种类型大肠杆菌的粘附
将步骤一中等量的两种类型的大肠杆菌滴入到步骤四得到的人工细胞溶液中，100r/min条件下搅拌，对细菌进行定向捕获；
步骤六、人工细胞模型对细菌的杀死作用
利用碘化丙啶染色剂对细菌染色，通过激光共聚焦显微镜观察细菌的死活情况。
2.根据权利要求1所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤一中，大肠杆菌的培养具体为：
(1)大肠杆菌(ATCC 25922，表达FimH凝集素)的培养：将菌株置于LB液体培养基中，在温度为37℃，转速为150rpm的条件下摇动过夜，培养到指数生长期；经过洗涤的细菌细胞重新分散于无菌PBS缓冲溶液中，得到菌液，并通过紫外可见分光光度计将6000nm处的光密度OD值调至1.0～1.2，对应于菌液浓度为108～109CFU/mL；
(2)肠出血性大肠杆菌(O157:H7，不表达FimH凝集素)的培养：将菌株置于LB液体培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的条件下摇动过夜，培养到指数生长期；经过洗涤的细菌细胞重新分散于无菌PBS缓冲溶液中，得到菌液，并通过紫外可见分光光度计将6000nm处的光密度OD值调至1.0～1.2，对应于菌液浓度为108～109CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤一(1)中，所述无菌PBS缓冲溶液的pH为7.4，所述两种大肠杆菌的OD分别为1.0。
4.根据权利要求1所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤二(2)中，所述无菌PBS缓冲溶液的pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤三(1)中，所述直链淀粉水溶液的浓度为9～11mg/mL，氢氧化钠浓度为18～20mg/mL，3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液的浓度为0.1mg/mL～0.3mg/mL。
6.根据权利要求5所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤三(1)中，所述直链淀粉水溶液的浓度为10mg/mL，氢氧化钠浓度为19mg/mL，3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液的浓度为0.15mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤三(4)中，季铵盐化直链淀粉溶液与透明质酸溶液的体积比为1～2：1。
8.根据权利要求1所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤四中，酵母菌细胞壁悬浊液浓度为5mg/mL，团聚体模型溶液浓度为5mg/mL，酵母菌细胞壁悬浊液与团聚体模型溶液体积比为1：10～20。
9.根据权利要求1所述的一种基于酵母菌细胞壁伪装构筑人工细胞模型靶向捕获杀死大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤五中，所述两种大肠杆菌的OD分别为1.0，人工细胞溶液浓度为5mg/mL，大肠杆菌溶液总量与人工细胞溶液体积比为1：10～100。
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