CN117018210B - 一种游动细胞机器人及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种游动细胞机器人及其制备方法,它涉及微纳米机器人技术领域。本发明要构建同时具有能穿透生物屏障的细胞机器人和能实现肿瘤微环境中自驱动的纳米机器人功能的游动细胞机器人。方法为:获取中性粒细胞;采用脱溶法联合共挤出法制备大肠杆菌外膜伪装的载药纳米凝胶颗粒;然后对载药纳米凝胶颗粒进行双酶修饰得到载药双酶驱动纳米机器人;将步骤一获得的中性粒细胞与步骤三的载药双酶驱动纳米机器人共孵育,诱导中性粒细胞吞噬载药双酶驱动纳米机器人,得到游动细胞机器人。本发明可以在细胞因子、炎症因子、趋化肽等物质刺激下进行定向的趋化运动,具有良好的生物相容性,能够跨越血脑屏障,能避免免疫清除,在体内较好存活,具有较好的生物医学应用前景,本发明应用于医学领域。
Description
技术领域
本发明属于微纳米机器人技术领域,具体涉及一种游动细胞机器人的制备方法。
背景技术
中性粒细胞是体内最丰富的白细胞,是固有免疫的一部分,在固有免疫响应过程中最先被招募,起到消灭病原体、吞噬异物等功能。将来源于生物体的中性粒细胞与可在肿瘤微环境中进行自驱动的纳米机器人相结合,构建生物相容性好,不易被免疫清除的细胞杂化二级马达,能够在体内靶向药物递送、跨越特殊生物屏障、在肿瘤微环境中自驱动、对肿瘤组织进行深入渗透等体内治疗场景中得到丰富的应用。但是目前多采用合成材料制备得到可自驱动的纳米机器人,或者将简单的纳米颗粒与细胞相结合制备细胞杂化马达等,并没有采用中性粒细胞与具有自驱动能力的纳米机器人结合的报道。
发明内容
本发明的目的是为了构建同时具有能穿透生物屏障的细胞机器人和能实现肿瘤微环境中自驱动的纳米机器人功能的游动细胞机器人。而提供一种游动细胞机器人的制备方法。
为了解决上述技术问题,本发明采取了以下的技术方案:
本发明的目的在于提供一种游动细胞机器人的制备方法,所述制备方法是按照以下步骤进行的:
步骤一、采用脱溶法联合共挤出法制备大肠杆菌外膜伪装的载药纳米凝胶颗粒;
步骤二、对步骤一的载药纳米凝胶颗粒进行双酶修饰,得到载药双酶驱动纳米机器人;
步骤三、将中性粒细胞与步骤二的载药双酶驱动纳米机器人共培养,诱导中性粒细胞吞噬纳米颗粒,制备得到游动细胞机器人;
其中,双酶为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。
进一步地限定,步骤一中所述的载药纳米凝胶颗粒具体制备方法如下:
1)将1.25g明胶粉加入25ml水中,加热至50℃,直至完全溶解,冷却至室温,然后以450rpm速率搅拌,再加入25mL丙酮,加入丙酮3分钟后丢弃含有低分子量明胶馏分的上清液;
2)将步骤1)剩余的沉淀加入25ml水中,再次加热至50℃,直至完全溶解;
3)用1n HCl调节该溶液的pH至3.0,在600rpm,40℃的持续搅拌下,使用注射泵以2.75ml min-1的速度加入75ml丙酮,丙酮加入完成后,立即以0.05mL.min-1的速度向明胶溶液中加入0.2mL质量浓度为50%戊二醛溶液,交联纳米凝胶,搅拌1h,室温孵育过夜;
4)然后使用旋转蒸发器在25℃缓慢蒸发丙酮至终体积10毫升,剩下的溶液通过0.2μm的注射器过滤器过滤,得到纳米凝胶颗粒;
5)将得到的纳米凝胶颗粒浸泡在Dox溶液中4小时,以使纳米凝胶颗粒吸附Dox至饱和;
6)将大肠杆菌,5000rpm离心10min去除菌体,过0.45微米滤膜,使用超滤离心管浓缩上清液,在4℃条件下150000rpm离心2h,得到大肠杆菌外膜囊泡;
7)使用共挤出法,将步骤6)得到的大肠杆菌外膜囊泡通过200nm滤膜挤压11次,获得细菌膜囊泡;
8)将步骤7)得到的细菌膜囊泡与步骤4)得到的纳米凝胶颗粒混合,通过200nm滤膜挤压21次,离心清洗3次,得载药纳米凝胶颗粒。
进一步地限定,步骤6)中,超滤离心管的截留分子量为100k Da。
进一步地限定,步骤二中所述的载药双酶驱动纳米机器人具体制备方法如下:
步骤1)步骤一得到的载药纳米凝胶颗粒溶液滴加到亲水盖玻片上,铺开单层,进行单侧喷金;
步骤2)将3-巯基丙酸乙醇溶液滴加其中,震荡2小时后,离心弃去上清液;
步骤3)向被3-巯基丙酸修饰的喷金后的载药纳米凝胶颗粒中滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的PBS(p H 5.5)水溶液,震荡6小时后,离心弃去上清液;
步骤4)将上述纳米颗粒分散到1.5mg/mL葡萄糖氧化酶(GOx)和过氧化氢酶(CAT)的PBS(p H 5.5)水溶液中,震荡12小时后,离心弃去上清液,即得到载药双酶驱动纳米机器人,将其置于4℃冰箱中贮存。
进一步地限定,所述的离心清洗转速均为9000rpm。
进一步地限定,步骤2)中,3-巯基丙酸乙醇溶液的浓度为2mM。
进一步地限定,步骤3)中,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的PBS(p H 5.5)水溶液的浓度为2mM。
进一步地限定,葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的PBS(p H 5.5)水溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为1.5mg/mL,过氧化氢酶的浓度为1.5mg/mL。
进一步地限定,步骤三中所述的将步骤一获得的中性粒细胞与步骤三的载药双酶驱动纳米机器人共培养,是通过如下方式进行的:
将中性粒细胞用PBS稀释,然后离心去除分离中性粒细胞的所用的Percoll分离液;然后将步骤二的载药双酶驱动纳米机器人分散到去除Percoll分离液的中性粒细胞悬液中,在37℃水浴条件下共培养30min后,离心清洗,即完成所述的共培养。
进一步地限定,步骤一中所述的获取中性粒细胞是从新鲜分离的小鼠骨髓中分离获取的;所述的中性粒细胞是通过如下方式获取:
1)将小鼠后肢股骨、胫骨或前肢肱骨,剪断两端,以RPMI1640培养基冲洗骨内腔多次,直至骨呈白色半透明,收集RPMI1640培养基冲洗液,离心后,收取固相物并重悬于磷酸盐缓冲液中,得细胞悬液;
2)依次将体积百分含量为71%Percoll分离液与体积百分含量为61%Percoll分离液加入离心管中,形成界面;所述的体积百分含量为71%Percoll分离液与体积百分含量为61%Percoll分离液是通过体积百分含量为100%Percoll分离液与生理盐水配制而成;
3)向步骤2)中体积百分含量为61%Percoll分离液表面加入步骤1)的细胞悬液,离心后,吸取位于体积百分含量为71%Percoll分离液与体积百分含量为61%Percoll分离液界面液体,即得到中性粒细胞。
进一步地限定,步骤1)中所述的离心是在1600rpm离心5min。
进一步地限定,步骤3)中所述的离心是在3000rpm离心30min。
进一步地限定,所述的体积百分含量为100%Percoll分离液是采用Percoll原液与浓度为1.5M NaCl溶液按体积比为9:1的比例混合而成。
上述任意方法制备的游动细胞机器人。
本发明中游动细胞机器人的运动原理是:一、中性粒细胞对炎症因子的浓度梯度有响应,可以构建炎症因子的浓度梯度,诱导杂化中性粒细胞机器人进行趋化运动。
二、游动细胞机器人内部携带载药双酶驱动纳米机器人,因此游动细胞机器人可以在肿瘤微环境内部进行自驱动;三、本发明大肠杆菌细菌膜伪装的载药纳米凝胶颗粒具有装载药物,装载荧光探针等功能,在应用中可以进行药物释放,荧光成像等功能。细菌膜表面分子可以与中性粒细胞表面受体相作用,细菌膜伪装提高了中性粒细胞对凝胶颗粒的吞噬速度,可快速制备得到游动细胞机器人,同时细菌膜伪装可以减缓药物释放,降低装载药物在杂化中性粒细胞机器人内部的泄露。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明制备得到的游动细胞机器人仍然是活细胞,可以在细胞因子、炎症因子、趋化肽等物质刺激下进行定向的趋化运动。本发明充分利用中性粒细胞的吞噬能力及运动能力,制备得到具有细胞活性和自驱动能力的游动细胞机器人,制备过程安全、高效、快速,游动细胞机器人具有良好的生物相容性,能够跨越血脑屏障,能避免免疫清除,在体内较好存活,具有较好的生物医学应用前景。本发明的游动细胞机器人具有装载药物,装载荧光探针的功能,具有不易被免疫系统清除的功效,能够在体内靶向药物递送、跨越特殊生物屏障等体内治疗场景中得到丰富的应用。
本发明可以在细胞因子、炎症因子、趋化肽等物质刺激下进行定向的趋化运动,具有良好的生物相容性,能够跨越血脑屏障,能避免免疫清除,在体内较好存活,具有较好的生物医学应用前景,本发明应用于医学领域。
为了能够更进一步了解本发明的特征及技术内容,请参阅以下有关本发明详细说明与附图,然而所附的附图仅提供参考和说明之用,并非用来对本发明加以限制。
附图说明
图1为提取得到的中性粒细胞被染色后的激光共聚焦照片,标尺为20μm;
图2为游动细胞机器人的光学显微镜照片,标尺为10μm;
图3为游动细胞机器人对血脑屏障穿透过程的荧光显微镜照片,标尺为20μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本领域的普通技术人员可以理解,上述各实施方式是实现本发明的具体实施例,而在实际应用中,可以在形式上和细节上对其作各种改变,而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神,任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后,当可由本发明内容所教示的技术,加以改变及修饰,其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,但并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例中详细描述中性粒细胞的获取方法:
1.使用的实验材料为雄性昆明鼠(KM)(购买于哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心),体重30g以上。
2.将小鼠断颈处死、解剖以取出后肢股骨、胫骨、前肢肱骨,并将骨浸泡在RPMI1640培养基(购买自美国Hyclone Laboratories公司)中备用。
3.将骨剪断两端,使用1m L注射器,以RPMI1640培养基(购买自美国HycloneLaboratories公司)冲洗骨内腔多次,直至骨呈白色半透明,此时细胞存在于RPMI1640培养基冲洗液中。
4.将冲洗液以1600rpm离心5min,获得细胞沉淀并重新悬浮在2m L磷酸盐缓冲液(PBS,p H 7.4)中。
5.进行梯度离心的准备:使用市售Percoll分离液(购买自上海翊圣生物科技有限公司),以45m L Percoll原液与5m L 1.5M Na Cl溶液混合制备100%Percoll分离液,将100%Percoll分离液与生理盐水按对应比例混合为61%和71%Percoll分离液,依次将71%Percoll分离液3m L和61%Percoll分离液3m L叠加入10m L离心管中,在71%和61%Percoll分离液之间形成界面。
6.在步骤5中的61%Percoll分离液表面叠加步骤4中的2m L细胞悬液,3000rpm离心30min。
7.步骤6中的离心结束后,吸取位于71%和61%Percoll分离液界面上的细胞,即为所需的中性粒细胞。
实施例2
本实施例中详细描述大肠杆菌外膜伪装的载药纳米凝胶颗粒的制备方法:
1.将1.25g明胶粉加入25ml水中,加热至50℃,直至完全溶解。将溶液冷却至室温,然后以450rpm搅拌加入25mL丙酮。加入丙酮3分钟后丢弃含有低分子量明胶馏分的上清。
2.将剩余的沉淀加入25ml水中,再次加热至50℃,直至完全溶解。
3.用1n HCl调节该溶液的pH至3.0。在600rpm,40℃的持续搅拌下,使用注射泵以2.75ml min-1的速度加入75ml丙酮。丙酮加入完成后,立即以0.05mL min-1的速度向明胶溶液中加入0.2mL 50%戊二醛溶液交联纳米凝胶。搅拌1h,室温孵育过夜。
4.然后使用旋转蒸发器在25℃缓慢蒸发丙酮至终体积10毫升。剩下的溶液通过0.2μm的注射器过滤器过滤,得到纳米凝胶颗粒;
5.将得到的纳米凝胶颗粒浸泡在Dox溶液中4小时,以使纳米凝胶颗粒吸附Dox至饱和;
6.培养大肠杆菌(大肠杆菌在LB肉汤培养基(购买自青岛高科园海博生物技术有限公司)中培养,使用摇床培养,培养条件为37℃,200rpm),5000rpm离心10min去除菌体,并且通过0.45微米滤膜过滤使用超滤离心管(截留分子量100kDa)浓缩上清液,4摄氏度,150000g超速离心2h,获得大肠杆菌外膜囊泡。
7.使用共挤出法,将大肠杆菌外膜囊泡通过200nm滤膜挤压11次,获得细菌膜囊泡。将细菌膜囊泡与制备得到的载药纳米凝胶颗粒混合,通过200nm滤膜挤压21次,离心清洗3次,获得的细菌膜伪装载药纳米凝胶颗粒。
实施例3
本实施例中详细描述载药双酶驱动纳米机器人的制备方法:
1.将实施例2中获取得到的大肠杆菌外膜伪装的载药纳米凝胶颗粒溶液滴加到亲水盖玻片上,铺开单层,进行单侧喷金;
2.将2m M 3-巯基丙酸乙醇溶液滴加其中,震荡2小时后,离心弃去上清液。
3.向被3-巯基丙酸修饰的喷金后的载药纳米凝胶颗粒中滴加2m M 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的PBS(p H 5.5)水溶液,震荡6小时后,离心弃去上清液。
4.将上述纳米颗粒分散到1.5mg/mL葡萄糖氧化酶(GOx)和过氧化氢酶(CAT)的PBS(p H 5.5)水溶液中,震荡12小时后,离心弃去上清液,即得到载药双酶驱动纳米机器人,将其置于4℃冰箱中贮存。
实施例4
本实施例中详细描述通过共培养制备游动细胞机器人的方法:
1.将实施例1中获取的含中性粒细胞的Percoll分离液以PBS稀释,然后260*G离心5min以去除Percoll分离液。
2.将实施例3中制备的载药双酶驱动纳米机器人分散到中性粒细胞悬液中,37摄氏度水浴共培养30min后,离心清洗,即得到游动细胞机器人。
本实施例是按照0.5-3×106个新鲜分离的中性粒细胞与0.1-10mg·m L-1的细菌膜伪装载药纳米凝胶颗粒混合,获得游动细胞机器人。
对上述实施例1中提取的中性粒细胞进行形貌表征:
一、形貌:
实施例1中提取的中性粒细胞形貌的评价方法和结果(如图1所示)。
使用正置显微镜(Olympus BX-53,Japan)表征中性粒细胞形貌,观察发现,提取的中性粒细胞大小均一活性良好。
对上述实施例4制得的游动细胞机器人进行性能验证:
二、活性
实施例1至4制备的游动细胞机器人形貌的评价方法和结果(如图2所示)。
使用倒置显微镜表征游动细胞机器人形貌,观察发现,制备的游动细胞机器人保留细胞外形和运动活性。
三、血脑屏障穿透运动:
采用体外构建血脑屏障模型的形式,验证实施例1至4制备的游动细胞机器人的运动。将游动细胞机器人放入血脑屏障模型聚碳酸酯膜上并在下阱中加入10nM趋化因子梯度flmp,吸引游动细胞机器人进行血脑屏障模型的穿透运动。使用荧光显微镜系统观察并记录阱下游动细胞机器人的数量情况。记录所得数据显示,游动细胞机器人保留了原始中性粒细胞对血脑屏障的穿透能力可进行血脑屏障的穿透运动(如图3所示)。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式,而且本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种游动细胞机器人的制备方法,其特征在于,所述制备方法是按照以下步骤进行的:
步骤一、采用脱溶法联合共挤出法制备大肠杆菌外膜伪装的载药纳米凝胶颗粒;
步骤二、对步骤一的载药纳米凝胶颗粒进行双酶修饰,得到载药双酶驱动纳米机器人;
步骤三、将中性粒细胞与步骤二的载药双酶驱动纳米机器人共培养,诱导中性粒细胞吞噬纳米颗粒,制备得到游动细胞机器人;
其中,双酶为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶;
步骤一中所述的载药纳米凝胶颗粒具体制备方法如下:
1)将1.25g明胶粉加入25mL水中,加热至50℃,直至完全溶解,冷却至室温,然后以450rpm速率搅拌,再加入25mL丙酮,加入丙酮3分钟后丢弃含有低分子量明胶馏分的上清液;
2)将步骤1)剩余的沉淀加入25ml水中,再次加热至50℃,直至完全溶解;
3)用1nHCl调节该溶液的pH至3.0,在600rpm,40℃的持续搅拌下,使用注射泵以2.75mL/min的速度加入75ml丙酮,丙酮加入完成后,立即以0.05mL/min的速度向明胶溶液中加入0.2mL质量浓度为50%戊二醛溶液,交联纳米凝胶,搅拌1h,室温孵育过夜;
4)然后使用旋转蒸发器在25℃缓慢蒸发丙酮至终体积10毫升,剩下的溶液通过0.2μm的注射器过滤器过滤,得到纳米凝胶颗粒;
5)将得到的纳米凝胶颗粒浸泡在Dox溶液中4小时,以使纳米凝胶颗粒吸附Dox至饱和;
6)将大肠杆菌,5000rpm离心10min去除菌体,过0.45微米滤膜,使用超滤离心管浓缩上清液,在4℃条件下150000rpm离心2h,得到大肠杆菌外膜囊泡;
7)使用共挤出法,将步骤6)得到的大肠杆菌外膜囊泡通过200nm滤膜挤压11次,获得细菌膜囊泡;
8)将步骤7)得到的细菌膜囊泡与步骤4)得到的纳米凝胶颗粒混合,通过200nm滤膜挤压21次,离心清洗3次,得载药纳米凝胶颗粒;
步骤二中所述的载药双酶驱动纳米机器人具体制备方法如下:
步骤A步骤一得到的载药纳米凝胶颗粒溶液滴加到亲水盖玻片上,铺开单层,进行单侧喷金;
步骤B将3-巯基丙酸乙醇溶液滴加其中,震荡2小时后,离心弃去上清液;
步骤C向被3-巯基丙酸修饰的喷金后的载药纳米凝胶颗粒中滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC的pH5.5的PBS水溶液,震荡6小时后,离心弃去上清液;
步骤D将上述纳米颗粒分散到1.5mg/mL葡萄糖氧化酶GOx和过氧化氢酶CAT的pH5.5的PBS水溶液中,震荡12小时后,离心弃去上清液,即得到载药双酶驱动纳米机器人,将其置于4℃冰箱中贮存;
葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的pH5.5的PBS水溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为1.5mg/mL,过氧化氢酶的浓度为1.5mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种游动细胞机器人的制备方法,其特征在于,步骤6)中,超滤离心管的截留分子量为100kDa。
3.根据权利要求1所述的一种游动细胞机器人的制备方法,其特征在于,所述的离心清洗转速均为9000rpm。
4.根据权利要求1所述的一种游动细胞机器人的制备方法,其特征在于,步骤B中,3-巯基丙酸乙醇溶液的浓度为2mM。
5.根据权利要求1所述的一种游动细胞机器人的制备方法,其特征在于,步骤C中,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC的pH5.5的PBS水溶液的浓度为2mM。
6.根据权利要求1所述的一种游动细胞机器人的制备方法,其特征在于,共培养是通过如下方式进行的:
将中性粒细胞用PBS稀释,然后离心去除分离中性粒细胞的所用的Percoll分离液;然后将步骤二的载药双酶驱动纳米机器人分散到去除Percoll分离液的中性粒细胞悬液中,在37℃水浴条件下共培养30min后,离心清洗,即完成所述的共培养。
7.一种权利要求1-6任意一项方法制备的游动细胞机器人。
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