CN115969810A - 一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用 - Google Patents

一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用 Download PDF

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刘军杰
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Abstract

本发明涉及靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用，可有效解决现有技术难以跨越血脑屏障的问题，其解决的技术方案是，构建pET‑30a(+)‑inaX‑N‑angiopep‑2重组质粒表达载体，转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞中，得重组菌株，将重组菌株涂布于LB固体琼脂培养基上，培养过夜，挑取单菌落至LB肉汤培养基中，用异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导，通过验证Angiopep‑2多肽的表达之后，用溶菌酶消化菌体沉淀，经过超滤离心，制备得到Angiopep‑2菌膜；将PEI和CpG孵育，加入Tris‑HCl和盐酸多巴胺粉末，得到PDA‑PEI‑CpG；然后将Angiopep‑2菌膜和PDA‑PEI‑CpG孵育，即得，本发明制备得到的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒，解决了药物治疗中脑胶质瘤血脑屏障难以穿透等问题，操作简单方便，有广泛的应用前景。

Description

一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，特别是一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用。
背景技术
脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，复发率和死亡率较高。近年来，胶质瘤发病率有逐步上升的趋势，由于肿瘤常呈浸润性生长的特点，加之颅内解剖结构和中枢神经系统的复杂性，使得手术根治性切除十分困难，而普通的放射治疗本身受有效性和放射性损伤的限制也无法实现根治。纳米递药系统能使药物浓集于肿瘤组织，降低正常组织中的药物浓度，从而提高药物的抗肿瘤疗效、降低毒副作用，现已成为抗肿瘤研究的热点。血脑屏障的存在阻碍了绝大部分药物进入脑组织，使得脑胶质瘤的诊断和治疗变得十分棘手。炎症特性是肿瘤微环境的重要特征之一，中性粒细胞具有天然的炎症归巢效应，在脑胶质瘤部位浸润增加，可被发展为纳米药物的细胞载体。但中性粒细胞对药物的吞噬率和递送效率低下，限制了它们的临床应用。
利用细菌等病原体可有效被中性粒细胞识别并吞噬的特性，发展出仿生纳米病原体体系用于载药纳米粒的中性粒细胞靶向，为了增加菌膜被中性粒细胞吞噬摄取的效率，可对菌膜进行基因工程改造，利用Angiopep-2靶向多肽修饰菌膜。Angiopep-2是一种来源于抑肽酶的Koitz域的多肽，可与低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (low-denisitylipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)特异性结合。LRP1在脑毛细血管内皮细胞和胶质瘤细胞上高度表达，这些特性使Angiopep-2有望成为LRP1介导的靶向药物治疗胶质母细胞瘤的候选药物。CpG为非甲基化的DNA序列，模拟细菌在体内的免疫过程是TLR-9的特异性配体，CpG 在体内并不稳定，而纳米递送系统能显著提高CpG 在机体内的传递效率、靶向效应和免疫刺激能力。基于此，用PEI负载CpG，然后覆盖了一层薄薄的聚多巴胺(PDA)，实现CpG在体内稳定递送的同时，PDA清除ROS，将中性粒细胞的死亡方式由NETosis改变成凋亡，由释放的凋亡小体包裹PEI-CPG，最终将载药纳米粒释放，对肿瘤细胞进行治疗，目前还未见有相关报导。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用，可有效解决现有技术难以跨越血脑屏障的问题。
本发明解决的技术方案是，在NCBI上获取inaX-N（GenBank号：ACN91081.1）基因序列，将inaX-N和angiopep-2（TFFYGGSRGKRNNFKTEEY）基因序列插入pET-30a(+) 载体 NdeⅠ和 XhoⅠ 之间，构建pET-30a(+)-inaX-N- angiopep-2重组质粒表达载体，转化至 E. coil BL21(DE3) 感受态细胞中，得重组菌株，将重组菌株涂布于含硫酸卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，培养过夜，挑取单菌落至含硫酸卡那霉素的LB肉汤培养基中，用异丙基- β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，得到inaX-N-angiopep-2培养物，通过验证Angiopep-2多肽的表达之后，用溶菌酶消化菌体沉淀，经过超滤离心，制备得到Angiopep-2菌膜；将PEI(10KD)和CpG孵育，超滤离心去除水，加入Tris-HCl 和盐酸多巴胺粉末，室温搅拌，得到PDA-PEI-CpG；然后将Angiopep-2菌膜和PDA-PEI-CpG孵育，先超声，再超滤离心，洗涤，即得靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒，具体包括以下步骤：
1）重组菌株的制备：在NCBI上获取inaX-N基因序列，将inaX-N和angiopep-2基因序列插入pET-30a(+) 载体 NdeⅠ 和 XhoⅠ 之间，构建pET-30a(+)-inaX-N- angiopep-2重组质粒表达载体，转化至 E. coil BL21(DE3) 感受态细胞中，得重组菌株；
2）angiopep-2菌膜的制备：将步骤1）得到的重组菌株涂布于含硫酸卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含硫酸卡那霉素的LB肉汤培养基中，在37℃恒温摇床中振荡培养2h-4h，保持37℃，用异丙基- β-D-硫代半乳糖苷诱导6h-8h，得到inaX-N-angiopep-2培养物，收集菌液，取菌液离心，PBS洗涤，加入配好的溶菌酶，置于37℃水浴锅中孵育20-40min，取出菌液加入PBS分散在100KD的超滤管中，离心，PBS洗涤，除去未破膜的大肠杆菌和细菌内容物，将得到大肠杆菌生物膜重悬于PBS中，得angiopep-2菌膜；
3）PDA-PEI-CpG的制备：将PEI(10KD)和CpG在25℃水浴条件下孵育，超滤离心去除水，加入Tris-HCl 和盐酸多巴胺粉末，室温搅拌，即得PDA-PEI-CpG；
4）靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备：提取步骤2）制备的angiopep-2菌膜，不裂解，做BCA蛋白定量，将angiopep-2菌膜和步骤3）制备的PDA-PEI-CpG按照质量比6：1~16：1对其包膜，先超声5-10min，再超滤离心，洗涤，即得靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG。
所述的步骤1）中的大肠杆菌为BL21(DE3) 大肠杆菌，溶菌酶的浓度为1mg/ml，超滤管截留分子量为100 KD。
所述的步骤2）中，PEI(10KD)浓度为2mg/ml，CpG为B型CpG，序列为TCCATGACGTTCCTGACGTT，浓度为0.5mg/ml，N/P比值为6，Tris-HCl为10Mm，PH为8.5。
所述的步骤3）中，优选超声时间为8min，超滤管截留分子量为100 KD。
本发明方法制备的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的粒径为190-250nm。
本发明方法制备的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。
本发明针对现有技术中外源蛋白需在大肠杆菌细胞表面展示的需要，提供了一种基于细菌表面展示系统的以冰核蛋白N端结构域为细菌表面锚定元件的重组融合蛋白及其应用，该重组融合蛋白能够使Angiopep-2多肽通过INP表面展示系统在细菌表面成功表达。
一种重组融合蛋白(以下简称“融合蛋白”)，包括冰核蛋白N端结构域、Angiopep-2多肽，其中，冰核蛋白N端结构域提供细菌表面锚定功能，能够使Angiopep-2多肽锚定和展示在细胞表面；Angiopep-2多肽可作为配体与表达在脑毛细血管内皮细胞处LRP1结合，使菌膜被中性粒细胞摄取，上述各元件之间直接连接或者通过连接肽进行连接。
为了验证融合蛋白是否制备成功，使用亲和纯化标签。作为优选，所述的重组融合蛋白包括His标签序列。
进一步的，编码所述冰核蛋白N端结构域的基因的氨基酸序列如SEQ ID No .1所示；编码Angiopep-2的基因的氨基酸序列如SEQ ID No .2所示。
更进一步地，所述的重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No .3所示。
本发明制备得到的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒，解决了药物治疗中脑胶质瘤血脑屏障难以穿透等问题，操作简单方便，有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明inaX-N-angiopep-2诱导前后的SDS-PAGE结果图。
图2为本发明inaX-N-angiopep-2诱导后的加蛋白酶K处理的SDS-PAGE结果图。
图3为本发明inaX-N-angiopep-2菌膜的TEM结果图。
图4为本发明BCA法测inaX-N-angiopep-2菌膜浓度所建立的标准曲线图。
图5为本发明inaX-N-angiopep-2菌膜的SDS-PAGE结果图。
图6为本发明验证inaX-N-angiopep-2菌膜是否成功提取的WB结果图。
图7为本发明PEI和CpG的不同N/P条件下的2%琼脂糖凝胶电泳结果图。
图8为本发明PEI和CpG的不同N/P条件下的粒径结果图。
图9为本发明PEI和CpG的不同N/P条件下的电位结果图。
图10为PDA-PEI-CpG的TEM结果图。
图11为本发明angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的TEM结果图。
图12为本发明angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的粒径检测图。
图13为本发明angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的WB验证His标签、大肠杆菌特征膜蛋白ompA图。
图14为本发明angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的共定位分析图。
图15为本发明PDA-PEI-CpG遇到ROS后的CpG释放曲线图。
图16为本发明PDA-PEI-CpG遇到ROS后的降解TEM图，（a）为12h，（b）为24h。
图17为本发明PDA-PEI-CpG遇到ROS后的紫外降解曲线图。
图18为本发明中性粒细胞摄取angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的共聚焦分析图。
图19为本发明PEI-CpG对GL261细胞的细胞毒性分析图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施时，具体包括以下步骤：
1）重组菌株的制备：在NCBI上获取inaX-N基因序列，将inaX-N和angiopep-2基因序列插入pET-30a(+) 载体 NdeⅠ 和 XhoⅠ 之间，构建pET-30a(+)-inaX-N- angiopep-2重组质粒表达载体，转化至 E. coil BL21(DE3) 感受态细胞中，得重组菌株；
2）angiopep-2菌膜的制备：将步骤1）得到的重组菌株涂布于含硫酸卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含硫酸卡那霉素的LB肉汤培养基中，在37℃恒温摇床中振荡培养2h，保持37℃，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导6h，得到inaX-N-angiopep-2培养物，收集菌液，取40 mL的inaX-N-angiopep-2菌液4℃、10000 rpm 离心10min，PBS洗涤1次；各加入配好的浓度为1mg/mL的溶菌酶4mL，置于37℃水浴锅中孵育20min；取出菌液加入15mL PBS分散在100 KD的超滤管中，4℃、5000 rpm 离心10 min，PBS洗涤2次，除去未破膜的大肠杆菌和细菌内容物，将得到大肠杆菌生物膜各重悬于1.5mL PBS中，得angiopep-2菌膜；
3）PDA-PEI-CpG的制备：将PEI(10KD)和CpG在25℃水浴条件下孵育，其中，PEI(10KD)浓度为2mg/ml，CpG浓度为0.5mg/ml，CpG的N/P比值为6，超滤离心去除水，加入10mMPH为8.5的Tris-HCl 和盐酸多巴胺粉末，盐酸多巴胺粉末加入量为PEI和CpG质量和的2倍，室温搅拌，即得PDA-PEI-CpG；
4）靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备：提取步骤2）制备的angiopep-2菌膜，不裂解，做BCA蛋白定量，将angiopep-2菌膜和步骤3）制备的PDA-PEI-CpG按照质量比10：1对其包膜，先超声8min，再用100 KD超滤管超滤，洗涤，浓缩到100μL，即得靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG。
本发明制备的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒可作为抗脑胶质瘤的靶向药，无需采用光照、超声等方法来触发药物释放，且在到达肿瘤部位前还避免了药物提前泄露，从而最大的发挥了抗肿瘤活性，实现了药物精准释放，具备显著的抗肿瘤活性，相关试验资料如下：
一、inaX-N-angiopep-2蛋白的表达即Angiopep-2菌膜的提取和表征
1） BL21(DE3）感受态细胞的制备
具体实验方法：挑取一个宿主菌BL21(DE3）单克隆至3mL的LB液体培养基中，37℃，210rpm培养至OD600＝0.35~0.50（实际：菌液稍微浑浊后即处理，OD600不宜过高，否则不能保证转化效率），然后放至冰中停止宿主菌的生长；取上述菌液1mL于1.5mL EP管中，1500×g，4℃离心5min，弃尽上清液；在沉淀中加入100μL 4℃预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，轻轻弹动EP管使菌体沉淀重悬，避免剧烈振荡；于1500×g，4℃离心5min，弃尽上清液；在沉淀中加入100μL 4℃预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，轻轻弹动EP管使菌体沉淀重悬，避免剧烈振荡；感受态细胞制备完成。
2）Inax-N/angiopep-2的质粒转化
具体实验方法：取100μl的感受态细胞BL21(DE3）移至新的EP管中；向感受态细胞中加入4μL转化用质粒（10ng/ml），轻轻混匀后冰中放置30min；于42℃水浴中放置50s后，立即于冰中放置1-2min；加入890μl 37℃预热的SOC培养基；于37℃，210rpm振荡培养1h；取适量菌液涂布平板（Kan﹢），先正置30min，然后倒置于37℃培养箱培养过夜。
3）Inax-N/angiopep-2蛋白表达
具体实验方法：取过夜培养的平板和含50mL LB液体培养基（Kan+）试管一支，挑取一个单克隆于上述培养基中，37℃，210rpm培养至OD600值为0.6左右（Inax-N/angiopep-2实际值＝0.60），留样以备SDS-PAGE；添加终浓度0.2mmol/的IPTG，37℃，210rpm诱导6h；诱导表达完成后（Inax-N/angiopep-2实际值＝2.55）留样以备SDS-PAGE，然后10000×g，4℃离心10min，收集菌体沉淀，上清留样以备SDS-PAGE；进行定量SDS-PAGE以验证蛋白表达情况。
实验结果如图1所示，根据SDS-PAGE结果，显示第3泳道诱导后的inaX-N/angiopep-2在25-35kDa之间有明显较粗的蛋白条带，确定蛋白表达。
4）目的蛋白蛋白酶 K 处理
具体实验方法：取诱导完成的各15mL的inaX-N/angiopep-2菌体用PBS洗涤三次，重悬；将重悬菌液分为三个500µL 等份，一个500µL 等份置于冰上；向第二、第三等份中加入20µL的25mM CaCl2；向第三等份中加入2.5µL的20mg/mL蛋白酶K；第二份和第三份在37℃水浴锅孵育20min，然后向两者中加入6µL的200mM EDTA，三个500µL 等份用冰浴的PBS缓冲液洗三次。
实验结果如图2所示，经蛋白酶 K 消化后，inaX-N/angiopep-2重组菌的目的蛋白条带部分消失，目的条带被部分降解，出现许多小分子量蛋白，这一结果确证目的蛋白成功展示于细胞的表面。
5）angiopep-2菌膜的提取
具体实验方法：取40 mL的inaX-N/angiopep-2菌液4℃、10000 rpm 离心10 min，PBS洗涤1次；各加入配好的溶菌酶（1mg/mL、4mL），置于37℃水浴锅中孵育20 min；取出菌液加入15mL PBS分散在100 KD的超滤管中，4℃、5000 rpm 离心10 min，PBS洗涤2次，除去未破膜的大肠杆菌和细菌内容物，将得到大肠杆菌生物膜各重悬于1.5mL PBS中。通过0.8μm的滤膜多次挤压，制备得到菌膜用于TEM拍摄。
结果如图3所示，TEM表征了负染菌膜的形态，发现菌膜结构均一，呈囊泡状。
6）将提取的菌膜进行BCA法测浓度
具体实验方法：采用索莱宝的BCA蛋白浓度测定试剂盒对菌膜浓度进行测定。0.5mg/mL的BSA蛋白标准品梯度稀释至0、0 .025、0 .05、0 .1、0 .2、0 .3、0 .4和0 .5mg/mL，细胞膜囊泡与PBS 2：18稀释10倍。取各浓度标准品与待测样品20μL，分别与200μL BCA工作液涡旋混匀，然后吸200μL混合物至酶标板，在37℃的培养箱孵育30min；用酶标仪的A562吸光度对标准品和样品进行读数检测。根据检测结果，用标准品的读数制作浓度-读数标准曲线，求出公式和R平方值，代入待测样品的读数，从而求出稀释后的样品浓度。
实验结果如4所示，inaX-N-angiopep-2的菌膜浓度为2.88mg/mL
7）进行SDS-PAGE和WB验证菌膜蛋白表达情况
具体实验方法：SDS-PAGE 180V、35min；转膜：准备好转膜槽与转膜液，将转膜液倒进槽内，使吸水纸完全浸湿；裁切与胶等面积的PVDF膜，甲醇浸泡膜5min，胶用转膜液浸泡5min，100V，转膜90min，转膜时温度会升高，需在冰水浴中进行；封闭：PBST洗膜三次，每次10min；配制5%的脱脂奶粉(用PBST配制）用作封闭液，室温脱色摇床封闭2h；一抗孵育：PBST洗膜三次，每次10min；加入一抗（含HRP的His单抗，1 mg/mL），用5%脱脂奶粉1：1000稀释（30μL：30 mL），4℃静止孵育过夜；显色：PBST洗膜五次，每次5min；配制DAB显色剂进行显色。
实验结果如5、6所示，inaX-N-angiopep-2诱导后与提取的inaX-N-angiopep-2菌膜蛋白条带在同一位置，且WB结果正常显色，证明所述的重组融合蛋白已成功构建表达。
二、PDA-PEI-CpG的制备及表征
1）PEI(10KD)和CpG的N/P确定
具体操作为：用2mg/ml的PEI(10KD)根据不同的N/P比（N/P=1、2.5、4、5、6、7.5、9）包覆CpG（0.5mg/ml），25℃孵育30min。
检测：选用2%的琼脂糖凝胶、粒径、电位分别进行不同N/P比条件下的检测CpG装载情况。
结果如图7、8、9所示，琼脂糖凝胶电泳结果显示，当PEI-CpG的N/P=6时，显示CpG能够包封进去，且根据粒径与电位图综合考虑，确定当N/P=6的时候，此时PEI-CpG的粒径是160nm,电位为20mv。
2）PDA-PEI-CpG的制备
具体操作为：将PEI(10KD)和CpG在25℃水浴条件下孵育，超滤离心去除水，加入Tris-HCl 和盐酸多巴胺粉末，室温搅拌，即得PDA-PEI-CpG。
检测：将PDA-PEI-CpG进行TEM表征。
结果如图10所示，PDA-PEI-CpG具有球形结构，PEI-CpG具有内核，其表面有一层薄薄的涂层，为聚多巴胺(PDA)，证明PDA-PEI-CpG制备成功。
三、angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的制备、表征
1）angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的制备
具体操作为：提取angiopep-2菌膜，不裂解，做BCA蛋白定量，angiopep-2菌膜和PDA-PEI-CpG按照一定的质量比例（以PDA的质量为基准）对其包膜，先超声8min，再用100KD超滤管超滤，洗涤，浓缩到100μL左右；菌膜和PDA-PEI-CpG，按照质量比例6：1~16：1。
表征：TEM、WB验证His标签、大肠杆菌特征膜蛋白ompA表达情况、粒径检测
结果分析：如图11、12、13所示，TEM结果表明，angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG具有球形结构，在PDA-PEI-CpG边缘，有一圈很清晰的膜状结构，即为angiopep-2菌膜；WB结果表明，对于His标签的显色结果来说，阴性对照无质粒的BL21菌株没有显色反应，而angiopep-2全菌、angiopep-2菌膜、angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG具有明显的显色反应，对于大肠杆菌特征膜蛋白ompA的显色结果来说，阴性对照无质粒的BL21菌株、angiopep-2全菌、angiopep-2菌膜、angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG具有明显的显色反应，证明angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG制备成功；PDA、PEI-CpG、PDA-PEI-CpG、angiopep-2菌膜、angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的粒径在逐渐增大，angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的粒径为197nm。
2）angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG的共定位分析
具体操作为：取1mL的angiopep-2菌膜（蛋白含量2.88mg/mL）用20μL的DiO标记，37℃孵育30min后,12000rpm,10min,5mlEP管，PBS洗两次，然后重悬为1mL；PDA用Rho-B标记，将溶解在 0.5 mL 乙醇中的 4 mg Rho-B 逐滴添加到含有 2 mg DA 的 10 mL Tris 缓冲液（10 mM，pH = 8.5）中。24h后12000rpm,10min离心，洗涤两次，然后重悬到2mL。将DiO标记的angiopep-2菌膜和Rho-B 标记的PDA以质量比16：1混合后，过0.8μm（10次）;0.4μm滤膜（10次），取50μL于1.5mL EP管内，加入10μL抗荧光猝灭剂，共60μL体系。在此体系内，取10μL滴在载玻片上，盖玻片，封片剂封片进行共聚焦显微镜拍摄共定位情况。
结果分析：结果如图14所示，DiO标记的angiopep-2菌膜和Rho-B 标记的PDA具有一定的重叠，且angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG为球形结构，证明可实现angiopep-2菌膜与PDA-PEI-CpG的共定位，即制备成功。
四、本发明制备的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的体外抗肿瘤治疗
1）PDA-PEI-CpG遇到ROS后的CpG释放测定
具体操作为：取600μL的PDA-PEI-CpG，然后在PH5.3+H2O2（5mM）的溶液体系中分散，在0，2,4,6,8,12,24时间间隔监测CpG的释放。在每个采样时间，将NP悬液在12 000rpm，30KD超滤管下离心10min。释放量根据上清液中紫外吸光度（A266）的增加计算。
结果如图15所示，随着时间的延长，CpG的释放率逐渐增加，在24h的时候，释放率达到83%。
2）PDA-PEI-CpG遇到ROS后的降解情况
具体操作为：取600μL的PDA-PEI-CpG，然后在PH5.3+H2O2（5mM）的溶液体系中分散，分别在12,24h取样进行TEM拍摄和紫外降解检测。
结果如图16、17所示，PDA-PEI-CpG在24h较12h降解较为剧烈。
3）angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG被中性粒细胞摄取情况考察
具体操作为：提取大鼠中性粒细胞，于24孔板爬片（5×105个细胞/孔），铺两个孔，设置两组，FMLP诱导组+angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG，Control组+angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG，30分钟后诱导FMLP 10min,加入angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG（按PDA 100μg/mL），3h后固定，染DAPI，拍摄共聚焦，观察摄取情况。
结果分析：结果如图18所示，FMLP能诱导大鼠中性粒细胞的吞噬能力，使之提高，FMLP诱导组相较于Control组，中性粒细胞摄取的angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG 明显增多，证明angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG可被中性粒细胞摄取摄取。
4）PEI-CpG对GL261细胞的细胞毒性的测定
将GL261细胞（每孔8×103个细胞，96孔板）在200 μL培养基中培养24小时，其中，PEI-CpG的药物浓度为5、10、20、25、50、75、100μgmL-1，将细胞分别孵育24小时。通过使用CCK-8测试细胞活力，结果如图所示。
从图19中分析可知，随着药物浓度的提高，细胞存活率在逐渐下降，当药物浓度为50μgmL-1时，存在IC50值，抑制肿瘤细胞增殖。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1）本发明的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒中，菌膜来源丰富，方便获取，成本低；仅通过菌膜可有效被中性粒细胞识别并吞噬，实现靶向中性粒细胞，制备得到的载药纳米粒可抑制肿瘤的生长；
2）本发明提供的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒作为抗脑胶质瘤的靶向药，无需采用光照、超声等方法来触发药物释放，且在到达肿瘤部位前还避免了药物提前泄露，使得药物更多的转运到肿瘤部位，然后在PDA的作用下，清除ROS，将中性粒细胞的死亡方式由NETosis改变成凋亡，由释放的凋亡小体包裹PEI-CPG，最终将载药纳米粒释放，从而最大的发挥了抗肿瘤活性；
3）本发明提供的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒作为抗脑胶质瘤的靶向药，解决了临床上目前主要以手术、放化疗治疗脑胶质瘤，风险较高，用药物进行治疗时药物无法穿透血脑屏障等问题。整个体系具有毒性小、水溶性好、稳定性强、生物相容性好、无明显毒副作用的优势；用PDA包覆的药物，PDA可清除ROS，将中性粒细胞的死亡方式由NETosis改变成凋亡，由释放的凋亡小体包裹PEI-CPG，最终实现药物精准释放，具备显著的抗肿瘤活性，具有推广应用价值。
本发明中提供一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其抗脑胶质瘤应用，以解决药物难以跨越血脑屏障问题。利用了携载菌膜载药纳米粒的中性粒细胞可主动趋化至炎症肿瘤部位，在受到炎症分子的刺激后，中性粒细胞细胞活化，活化的中性粒细胞通过向细胞外释放NETs， PDA清除ROS，将中性粒细胞的死亡方式由NETosis改变成细胞凋亡，由释放的凋亡小体包裹药物，最终将载药纳米粒释放，对肿瘤细胞进行治疗。本发明提供的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒是脑胶质瘤药物治疗中的一大创新。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (9)

1.一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）重组菌株的制备：在NCBI上获取inaX-N基因序列，将inaX-N和angiopep-2基因序列插入pET-30a(+) 载体NdeⅠ 和XhoⅠ 之间，构建pET-30a(+)-inaX-N- angiopep-2重组质粒表达载体，转化至E. coil BL21(DE3) 感受态细胞中，得重组菌株；
2）angiopep-2菌膜的制备：将步骤1）得到的重组菌株涂布于含硫酸卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含硫酸卡那霉素的LB肉汤培养基中，在37℃恒温摇床中振荡培养2h-4h，保持37℃，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导6h-8h，得到inaX-N-angiopep-2培养物，收集菌液，取菌液离心，PBS洗涤，加入配好的溶菌酶，置于37℃水浴锅中孵育20-40min，取出菌液加入PBS分散在100KD的超滤管中，离心，PBS洗涤，除去未破膜的大肠杆菌和细菌内容物，将得到大肠杆菌生物膜重悬于PBS中，得angiopep-2菌膜；
3）PDA-PEI-CpG的制备：将PEI(10KD)和CpG在25℃水浴条件下孵育，超滤离心去除水，加入Tris-HCl 和盐酸多巴胺粉末，室温搅拌，即得PDA-PEI-CpG；
4）靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备：提取步骤2）制备的angiopep-2菌膜，不裂解，做BCA蛋白定量，将angiopep-2菌膜和步骤3）得到的PDA-PEI-CpG按照质量比6：1~16：1对其包膜，先超声5-10min，再用超滤管离心，洗涤，即得靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG。
2.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中的大肠杆菌为BL21(DE3) 大肠杆菌，溶菌酶的浓度为1mg/ml，超滤管截留分子量为100 KD。
3.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤3）中，PEI(10KD)浓度为2mg/ml，CpG为B型CpG，序列为TCCATGACGTTCCTGACGTT，浓度为0.5mg/ml，N/P比值为6，Tris-HCl为10Mm，PH为8.5。
4.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤4）中，超滤管截留分子量为100 KD。
5.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的粒径为190-250nm。
6.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）重组菌株的制备：在NCBI上获取inaX-N基因序列，将inaX-N和angiopep-2基因序列插入pET-30a(+) 载体NdeⅠ 和XhoⅠ 之间，构建pET-30a(+)-inaX-N- angiopep-2重组质粒表达载体，转化至E. coil BL21(DE3) 感受态细胞中，得重组菌株；
2）angiopep-2菌膜的制备：将步骤1）得到的重组菌株涂布于含硫酸卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含硫酸卡那霉素的LB肉汤培养基中，在37℃恒温摇床中振荡培养2h，保持37℃，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导6h，得到inaX-N-angiopep-2培养物，收集菌液，取40 mL的inaX-N-angiopep-2菌液4℃、10000 rpm 离心10min，PBS洗涤1次；各加入配好的浓度为1mg/mL的溶菌酶4mL，置于37℃水浴锅中孵育20min；取出菌液加入15mL PBS分散在100 KD的超滤管中，4℃、5000 rpm 离心10 min，PBS洗涤2次，除去未破膜的大肠杆菌和细菌内容物，将得到大肠杆菌生物膜各重悬于1.5mL PBS中，得angiopep-2菌膜；
2）PDA-PEI-CpG的制备：将PEI(10KD)和CpG在25℃水浴条件下孵育，其中，PEI浓度为2mg/ml，CpG浓度为0.5mg/ml，CpG的N/P比值为6，超滤离心去除水，加入10mM PH为8.5的Tris-HCl 和盐酸多巴胺粉末，盐酸多巴胺粉末加入量为PEI和CpG质量和的2倍，室温搅拌，即得PDA-PEI-CpG；
3）靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备：提取步骤1）制备的angiopep-2菌膜，不裂解，做BCA蛋白定量，将angiopep-2菌膜和PDA-PEI-CpG按照质量比10：1对其包膜，先超声8min，再用100 KD超滤管离心，洗涤，浓缩到100μL，即得靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒angiopep-2菌膜@PDA-PEI-CpG。
7.权利要求1-6任一项所述方法制备的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。
8.一种含有权利要求1所述的Inax-N-angiopep-2基因的重组融合蛋白，其特征在于，包括冰核蛋白N端结构域、Angiopep-2多肽，其中，冰核蛋白N端结构域提供细菌表面锚定功能，能够使Angiopep-2多肽锚定和展示在细胞表面；Angiopep-2多肽可作为配体与表达在脑毛细血管内皮细胞处低密度脂蛋白受体相关蛋白1结合，使菌膜被中性粒细胞摄取，上述各元件之间直接连接或者通过连接肽进行连接。
9.根据权利要求8所述的含有Inax-N-angiopep-2基因的重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白包括His标签序列；编码所述的冰核蛋白N端结构域的基因的氨基酸序列如SEQ ID No .1所示；编码Angiopep-2的基因的氨基酸序列如SEQ ID No .2所示；所述的重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No .3所示。
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