CN111205351B - 一种pd-1靶向阻断肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PD‑1靶向阻断肽及其应用，属于抗肿瘤免疫治疗领域。本发明利用噬菌体展示技术获得一种能特异性靶向PD‑1阻断肽，所述阻断肽序列如SEQ ID NO.1所示；本发明运用噬菌体展示十二肽库，通过四轮生物淘选得到同PD‑1蛋白具有特异性亲和作用的噬菌体单克隆，可靶向天然表达PD‑1的肿瘤细胞；通过测序得到展示于噬菌体表面的多肽序列并进行化学合成，可调节人PBMC分泌细胞因子IFN‑γ和IL‑2；包载PD‑1阻断肽制成纳米粒子，体内药效实验证明其具有显著抗肿瘤作用；本发明的PD‑1靶向阻断肽可与PD‑1特异性结合，阻断PD1与PD‑L1的结合，恢复T细胞的功能，可广泛用于肿瘤靶向、免疫调节及抗肿瘤领域。

Description

一种PD-1靶向阻断肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种能特异性结合PD-1的靶向阻断肽，属于生物技术领域。具体涉及所述阻断肽的生物淘选方法，细胞水平靶向作用与免疫刺激作用及其在抗肿瘤研究中的应用。

背景技术

噬菌体展示技术于1985年由George P.Smith创建，通过将噬菌体工程化改造，将外源多肽或蛋白与噬菌体的某种衣壳蛋白进行融合表达，在保证其侵染能力和繁殖能力的情况下，使外源氨基酸序列展示于衣壳蛋白末端。随机十二肽噬菌体展示文库是将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，为一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端。通过至少三轮的吸附，洗脱，扩增的生物筛选程序，从众多随机的噬菌体中，富集得到同靶标有特异性亲和能力的噬菌体。通过对噬菌体DNA测序，可鉴定与靶标结合的多肽编码核酸序列，并得到其编码多肽的氨基酸序列。

PD-1/PD-L1免疫疗法是通过阻断二者间的相互作用来提高免疫应答，具有治疗多种类型肿瘤及感染性疾病的潜力。程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是CD28超家族成员，为一种重要的免疫抑制分子，主要表达在激活的T细胞和B细胞上。PD-1与其配体PD-Ls(programmed death-1ligands，主要是PD-L1与PD-L2)结合能够抑制T细胞的增殖、活化和相关细胞因子的分泌，使机体免受自身免疫系统的攻击。但在机体的肿瘤微环境中，肿瘤细胞高表达PD-L1，与T细胞上的PD-1发生结合后，诱导T细胞的衰竭，抑制T细胞的功能，无法有效激活免疫系统，引起肿瘤细胞的免疫逃逸。

目前已经有多种针对PD-1/PD-L1通路的单克隆抗体药物上市或已进入临床实验阶段，并取得良好效果，但由于在生理条件下，PD-1免疫检查点对维持自身免疫耐受同样发挥重要作用，因此靶向该通路的免疫治疗可能因长期阻断该通路导致免疫失衡，引起自身组织和器官受到自身免疫攻击而损伤的不良反应，因此药物的安全性需要进一步改善。而关于该靶点的小分子抑制剂的研究尚处于早期阶段。多肽类小分子抑制剂的优势在于其较低的免疫原性，良好的组织穿透力与更低的制造成本，更好的安全性与成药性。还可以通过调节多肽类药物的半衰期，减少因与靶标结合时间过长而导致的免疫相关不良反应。但因PD-1/PD-L1相互作用的特点，即蛋白质的面-面相互作用界面较平坦、作用位点范围较大且具有高度可变性，因此寻找具有阻断作用的小分子抑制剂成为了一项富有挑战性的工作。

本发明旨在运用噬菌体展示肽文库筛选PD-1/PD-L1通路靶向阻断肽。该肽通过与靶标PD-1结合，占据PD-1/PD-L1相互作用界面，从而阻断该通路，从而解除抑制，重新激活免疫系统，并恢复T细胞活性。

发明内容

为了解决上述问题；利用噬菌体展示技术获得一种能与PD-1特异性结合的多肽。该多肽可用于靶向PD-1表达阳性的肿瘤细胞、免疫调节及抗肿瘤免疫治疗研究。

本发明的技术方案是：一种PD-1靶向阻断肽P-F4，所述的靶向阻断肽P-F4的氨基酸序列为SEQ ID NO.1：FSGTVTTAGLLF；

所述PD-1靶向阻断肽P-F4包含原多肽序列及其衍生物，

所述衍生物包含乙酰化修饰物，脂肪酸链修饰物，PEG修饰物中的一种或几种，所述原多肽序列的两端分别连接有一个Cys，

其中，所述的原多肽序列的首尾以酰胺环相连；

一种融合多肽或蛋白，所述融合多肽或蛋白的N端或C端或中间包含所述的原多肽序列；

一种药物组合物，所述的药物组合物包含所述的原多肽序列、融合多肽或蛋白与其他成分通过共价或非共价偶联，或包含所述的原多肽序列，融合多肽或蛋白的递药载体；

所述氨基酸序列在肿瘤靶向中的应用；

所述氨基酸序列在免疫调节中的应用；

所述氨基酸序列在抗肿瘤领域的应用。

具体的：(1)、运用噬菌体展示十二肽库，通过生物筛选得到同PD-1蛋白具有特异性亲和作用的五个噬菌体单克隆P-V1、P-S2、P-T3、P-F4、P-H5，并通过测序得到展示于噬菌体表面的多肽序列；

(2)、通过细胞ELISA检测噬菌体克隆与稳转细胞CHO-PD-1的结合情况；运用流式细胞术检测噬菌体克隆与天然表达PD-1细胞的结合情况；分离人外周血淋巴细胞(PBMC)，用ELISA试剂盒检测化学合成多肽对淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-2的调节作用；

(3)、化学合成多肽P-F4，溶剂置换法包载制成纳米粒子，建立小鼠CT-26结肠癌模型，进行体内药效学实验，探究P-F4纳米粒的抗肿瘤免疫治疗作用。

本发明的有益效果：本发明通过噬菌体展示技术，成功获得了五个同PD-1蛋白特异性结合的噬菌体克隆P-V1、P-S2、P-T3、P-F4、P-H5，细胞ELISA实验表明以上克隆可以很好地与稳转细胞CHO-PD-1结合，流式细胞术证明以上克隆同样与天然表达PD-1的细胞特异性结合；化学合成以上五条多肽序列，体外实验证明部分多肽序列能有效恢复淋巴细胞活性，促进人外周血淋巴细胞(PBMC)分泌IFN-γ和IL-2，尤以P-F4刺激效果最为显著；溶剂置换法包载制备P-F4/MPP纳米粒，小鼠结肠癌模型体内药效实验证明PF-4/MPP纳米粒有显著的抗肿瘤作用。

附图说明

图1是本发明中四轮筛选PD-1噬菌体回收率柱状图；

图2是本发明中PD-1筛选噬菌体单克隆ELISA结果图；

图3是本发明中PD-1筛选高吸光值克隆ELISA重复验证结合效果图；

图4是本发明中五个PD-1潜在噬菌体结合克隆的细胞ELISA(CHO-PD-1)结果图；

图5是本发明中流式细胞术检测细胞株表面天然PD-1表达情况结果图；

图6是本发明中流式细胞术检测各噬菌体克隆靶向天然表达PD-1的THP-1细胞结果图；

图7是本发明中ELISA实验探究PD-1多肽对淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-2的调节作用结果图：图7A为检测PBMC分泌IFN-γ的变化结果图；图7B为检测PBMC分泌IL-2的变化结果图；

图8是本发明中为体内药效学实验示意图：图8A为肿瘤生长曲线图，图8B为不同组别小鼠体重变化曲线图；图8C为不同组别小鼠肿瘤拍照结果示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明；然而应当理解，这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明；在本发明的构思前提下对本发明生物淘选PD-1/PD-L1通路靶向阻断肽及制备纳米粒子的简单改造，都属于本发明要求保护的范围。

本发明所涉及的多肽P-V1、P-S2、P-T3、P-F4、P-H5通过化学合成。

实施例1：

宿主菌的准备与活化：

以下操作均需在超净工作台内进行无菌操作：

1、融化100mL LB固体培养基，待其温度降至50～60℃加入100μL四环素储存液，混匀后倾注约20mL于无菌培养皿(Φ＝0.9cm)内，制备为终浓度20μg/mL四环素抗性-LB平板(Tet-LB平板)；

2、将置于-70℃保存的菌种E.coli ER2738划线接种于Tet-LB平板，于37℃倒置培养过夜(约16-18h)，可置于4℃冰箱保存两周；

3、准备含2mL LB液体培养基的无菌试管，加入2μL浓度为20mg/mL四环素储存液，终浓度为20μg/mL；

4、挑取Tet-LB平板上的ER2738单克隆菌落至2mL Tet-LB培养基中，37℃震荡培养过夜备用。

实施例2：

噬菌体文库的扩增：

1、将200μL过夜培养的ER2738接种于200mL灭菌LB液体培养基中，37℃剧烈震荡培养约2～2.5h，使其达到对数生长期(OD600 nm吸光值为0.4～0.6)；

2、取1.5μL噬菌体原始文库稀释于150μL TBS缓冲溶液中；将100μL稀释的噬菌体文库感染200mL处于对数期的ER2738菌液；

3、混匀并静置15min，于37℃220～250rpm剧烈震荡扩增4.5～5h；

4、收集培养物于已灭菌离心杯中，4℃预冷，10000rpm离心10min；

5、将离心后所得上清噬菌体溶液转移至一新离心杯中，并加入其1/5体积PEG/NaCl(约40mL)，混匀并置于4℃过夜(约16-18h)，使噬菌体沉淀完全；

6、将4℃沉降过夜后的样品于4℃10000rpm离心15min，轻弃上清，并用1mL TBS重悬沉淀；

7、将重悬后的溶液转移至灭菌离心管中，4℃10000rpm离心1min以去除残余菌体；

8、将上清转移至一新灭菌离心管中，并加入200～300μL PEG/NaCl，再次置于4℃沉降1～2h；

9、重复步骤6中离心及重悬噬菌体步骤，再次10000rpm短暂离心1min，并将上清转移至一新离心管中，即可获得扩增后的噬菌体肽库；将其储存于4℃冰箱，待测定其滴度后，应用于靶蛋白的筛选；

10、此噬菌体肽库溶液暂储存于4℃冰箱不超过30天，长期保存需加入20％甘油置于-70℃冰箱储存；每次使用前均需重新测定噬菌体滴度。

实施例3：

噬菌体滴度测定：

1、下层IPTG/X-gal/LB平板的制备：将100mL固体LB培养基加热融化并冷却至55℃左右，均匀加入100μL IPTG/X-gal储存液，快速混匀并倾倒无菌平板(Φ＝0.9cm)。待冷却后包覆保鲜膜并预温于37℃备用；

2、上层LB半固体琼脂的制备：将半固体LB培养基加热融化并冷却至55℃，将其每3mL分装于无菌EP管中，水浴45℃保温备用；

3、将1.2.1步骤3中过夜培养的ER2738，以1:100转接于LB液体培养基内(共准备2～3mL培养物即可)，37℃剧烈震荡约2h，使其达到对数生长期；

4、将处于对数生长期的ER2738以200μL/支分装于1.5mL灭菌Eppendorf(EP)中备用；

5、准备系列梯度稀释的噬菌体溶液：

(1)、将无菌LB培养基分别以每990μL分装于4个EP管中，900μL分装于3个EP管中；

(2)、取10uL扩增噬菌体肽库加入到第一支含990μL LB培养基EP管中，涡旋振荡10s使其完全混匀，制为稀释度为10²噬菌体溶液；继续从10²稀释度中取10μL至下一支含990μL LB培养基EP管中并混匀制为10⁴稀释度；依次稀释至10⁸稀释度噬菌体溶液；

(3)、从10⁸稀释度中取100μL至含900μL LB培养基EP管中，混匀制为稀释度为10⁹噬菌体溶液；依次稀释制为10¹⁰、10¹¹稀释度噬菌体溶液；

6、各取10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹稀释度噬菌体10μL分别感染200μL处于对数期宿主菌ER2738，室温孵育5～10min；

7、将已感染的宿主菌全部加入已预温的上层LB琼脂中，快速混匀后立即倾倒至下层IPTG/X-gal/LB平板并均匀铺开；

8、待四块平板上层琼脂全部凝固后，37℃倒置培养过夜；

9、计数每个稀释度平板上蓝色噬菌斑的个数，并按以下公式计算噬菌体滴度：

噬菌体滴度(pfu/mL)＝蓝色噬菌斑个数×稀释度×100。

实施例4：

靶标蛋白筛选流程：

本筛选实验共进行四轮亲和淘选程序：

1、将实验室自行制备的PD-1、PD-L1蛋白用碳酸盐缓冲液CBS稀释至100μg/mL，共准备1mL该溶液作为靶蛋白包被液；

2、使用前，将微孔板在紫外灯下照射10min左右，增加其吸附蛋白能力；

3、向微孔板每孔内加入150μL上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润，小心旋转勿使溶液溅出；

4、用封口膜将孔封好并放置于密闭容器内，防止其蒸发导致浓度改变；置于4℃孵育过夜，使靶蛋白吸附于微孔板内壁；

5、挑取ER2738单菌落至2mL LB培养基内(含20μg/mL Tet)37℃振摇过夜；

6、转接ER2738过夜培养物250μL至25mL LB液体培养基，37℃剧烈震荡培养(转速约250rpm)约2h至对数培养期，取2～3mL用于测定噬菌体滴度，剩余培养物用于噬菌体扩增；

7、弃去包被液，将微孔倒置于已灭菌干净纸巾上，用力拍甩数次以除去残余溶液；

8、立即加入250μL 3％(w/v)BSA-TBS封闭缓冲液，使用封口膜封口并重新置于密闭容器内，37℃封闭2h；

9、弃去封闭缓冲液，使用含0.05％(v/v)Tween20-TBS缓冲液快速洗孔3至5次，每次洗涤均旋转微孔使孔底部及边缘部位均被洗涤；弃去缓冲液，将微孔倒置于已灭菌干净纸巾上，用力拍甩数次以除去残余溶液；每次洗涤间隔不超过10s以防微孔干燥；

10、向微孔中加入用150μL新鲜制备的噬菌体随机肽库溶液，封口膜封口，37℃孵育2h；

11、倾倒除去未结合噬菌体，用力拍甩微孔于已灭菌干净纸巾上数次以除去残余溶液；

12、每孔加入250μL 0.05％(v/v)Tween20-TBS(TBST)缓冲液洗涤，每次洗涤均旋转微孔使孔底部及边缘部位均被洗涤，重复洗涤5次；第一轮筛选时，洗涤5次；第二轮筛选时，洗涤10次；第三、四轮筛选时，洗涤10～15次，注意不要过度洗涤；

13、弃去洗涤液后，每孔加入250μL TBS缓冲液，以同样的方法洗涤三次；

14、弃去TBS后，向每孔内加入100μL 100mM HCl-Glycine pH 2.2洗脱缓冲液，封口膜封口，20-25℃下孵育10min，中间用移液枪洗头反复吹打几次，但注意勿吹出过多气泡；

15、加入6μL 2M Tris-HCl pH 9.1，使溶液pH恢复为中性(pH 7.0左右)；

16、取5μL洗脱后噬菌体溶液测定该轮噬菌体输出滴度；

17、将剩余洗脱噬菌体溶液加入到步骤6准备的剩余ER2738培养物中(约20mL)37℃250rpm剧烈振摇以扩增洗脱后噬菌体4.5～5h；

18、将全部培养物转入一干净灭菌50mL离心管中，4℃10000rpm离心10min；

19、将上清转入另一干净灭菌管中，加入1/5体积(4～5mL)PEG/NaCl，混匀并置于4℃过夜(16～18h)，使噬菌体沉淀完全；

20、将4℃沉降过夜后的样品于4℃10000rpm离心15min，轻弃上清，并用1mL 1％(w/v)BSA-TBS保存缓冲液重悬沉淀；

21、将重悬后的溶液转移至灭菌离心管中，4℃10000rpm短暂离心1min以去除残余菌体；

22、将上清转移至一新灭菌离心管中，即获得经第一轮筛选洗脱后扩增的噬菌体溶液；将此噬菌体溶液作为第二轮筛选时所需投入的噬菌体溶液，并测定其滴度作为第二轮输入滴度；

23、重新用靶蛋白包被一个微孔，以备第二轮筛选使用；

24、计数LB/IPTG/X-gal板上蓝色噬菌斑数并计算滴度，将第二轮投入噬菌体量调整为10¹¹～10¹²(pfu/mL)，以保证每次投入噬菌体颗粒数较为一致；

25、封闭包被靶蛋白孔后进行第二轮筛选(即重复步骤2至24筛选步骤)；需注意的是，在使用非特异性洗涤液0.05％TBST缓冲液洗涤时，适当增加洗涤次数至8～10次，TBS洗涤3次，以增强洗涤效果；

26、在LB/IPTG/X-gal平板上测定第二轮筛选后所得洗脱物滴度作为第二轮输出滴度；

27、继续进行第三轮和第四轮淘选，同时增强洗涤强度(即第三、四轮筛选时，洗涤10～15次，且注意勿过度洗涤)；

28、将筛选过程中所有噬菌体滴度检测平板以及扩增物溶液暂存于4℃冰箱，以备后续实验使用；

29、计算各轮回收率：

回收率＝各轮输入滴度(pfu/mL)/各轮输出滴度(pfu/mL)。

实施例5：

筛选过程中噬菌体滴度测定：

1、根据实施例3步骤1～4准备下层平板、上层培养以及菌液，同时设置阴性(用于稀释噬菌体的培养基)、阳性对照组(低稀释度的噬菌体文库溶液)；

2、每轮输入噬菌体测定方法同实施例3，即取10⁸～10¹¹稀释度检测蓝色噬菌斑数量；以下为测定每轮输出噬菌体滴度的方法：

(1)、将无菌LB培养基分别以495μL分装于1个EP管中，450μL分装于3个EP管中；

(2)、将洗脱后的5μL噬菌体溶液加入到第一支含495μL LB培养基EP管中，涡旋振荡10s使其完全混匀，制为稀释度为10²噬菌体溶液；从此稀释度中取50μL至含450μLLB培养基EP管中并混匀制为10³稀释度；依次稀释至10⁵稀释度噬菌体溶液；第三、四轮洗脱噬菌体滴度测定可增加至10⁶稀释度；

(3)、感染及测定步骤同实施例3步骤6～9；

靶向PD-1蛋白的噬菌体克隆四轮筛选输入滴度、输出滴度及回收率结果见表1、回收率柱状图见图1；经四轮噬菌体亲和筛选程序后，各靶标蛋白输入噬菌体滴度均稳定于10¹²数量级，说明噬菌体扩增正常；输出滴度逐轮递增，靶标结合噬菌体回收率逐轮增高，并均在第四轮有较大提升；该结果可说明筛选过程中噬菌体克隆富集，初步判断噬菌体文库筛选有效。

表1：

实施例6：

单克隆噬菌体ELISA：

1、将实验室自行制备的PD-1蛋白用碳酸盐缓冲液CBS稀释至5μg/ml，包被96孔ELISA微孔板，并预留未包被蛋白空孔作为空白对照；

2、用100μL 2μg/ml的靶分子包被ELISA板的每个孔，并预留设置阴性对照组(包被靶蛋白加M13KE)和空白对照孔(不包被蛋白只加入CBS溶液)，4℃包被过夜；

3、挑ER2738单克隆于2mL LB(含20μg/mL Tet)液体培养基中；37℃振荡培养过夜；

4、按1：100比例转接过夜培养物于100ml LB液体培养基；37℃剧烈振荡培养2h至对数期；

5、向96孔细菌培养深孔板各个孔中加入500μL对数期的ER2738；

6、用枪头小心挑取每一轮筛选过程中噬菌体滴度平板上蓝色单克隆噬菌斑，并转移至含对数生长期宿主菌的96孔细菌培养深孔板中，37℃剧烈扩增振摇4.5～5h(第一二轮挑取较少克隆，第三四轮挑取较多克隆)；

7、噬菌体单克隆扩增至2～3h时，拍甩去除已包被的靶蛋白溶液，将5％BSA-TBS封闭液以300μL/孔加入已包被有抗原的ELISA微孔板，37℃孵育2h；

8、拍甩去除封闭液，每次每孔加入200μL 0.05％TBST洗涤液，共洗涤三次，每次洗涤5min；再使用TBS洗涤微孔板三次，每次每孔200μL；每次洗涤后均需将微孔板倒置在干净纸巾上用力拍甩，去除多余缓冲液；

9、最后一次洗涤微孔板时，使用平板离心机将96孔细菌培养深孔板2500rpm离心20min；

10、将所得各噬菌体单克隆上清以100μL/孔，对应加入到已包被靶蛋白并经封闭、洗涤后的ELISA微孔板中；在两组阴性对照组中加入：野生型M13KE噬菌体溶液、TBS缓冲溶液；空白对照组中加入TBS溶液。将其置于密闭容器中，4℃孵育过夜(16～18h)；

11、将步骤10中扩增后剩余的单克隆噬菌体上清转移至另一灭菌96孔深孔板中，每孔加入甘油终浓度15％，-20℃贮存；

12、拍甩去除噬菌体溶液，使用200μL 0.05％TBST洗涤各孔三次，每次5min，再使用TBS洗涤三次(注意收集各轮洗涤废液，防止噬菌体污染)、每次洗涤后，需在干净吸水纸或滤纸上用力拍甩，去除多余洗涤液；注意更换纸张，切勿引起交叉；

13、使用5％脱脂牛奶-TBS(NFM-TBS)稀释HRP-鼠抗M13抗体(1:8000稀释)；向洗涤后的微孔板每孔内加入100μL已稀释抗体，37℃轻轻振荡孵育1.5～2h；

14、拍甩去除各孔内HRP-鼠抗M13稀释抗体，并以0.05％TBST和TBS洗涤各孔三次；

15、准备HRP底物溶液：取5.14mL底物液A与4.86mL底物液B混合，加入1μL H2O2与500μL TMB母液，避光混匀(需现用现配)；将100μL新鲜配制底物溶液中加入10μLHRP-稀释抗体，混匀，待溶液颜色变为蓝色后即可说明该HRP底物液可用；

16、每孔加入100μL底物液，室温孵育5～20min。待孔内溶液反应显蓝色并呈差异性后即可终止；

17、每孔加入50μL 1M稀硫酸终止反应；

18、使用酶标仪检测OD450 nm处该酶联吸附反应各孔吸光值并记录结果；

19、根据以下公式计算并确定阳性克隆：

(单克隆孔吸光值-空白孔吸光值)/(M13KE孔吸光值-空白孔吸光值)≥2即为阳性克隆

PD-1单克隆ELISA初步鉴定结合克隆结果见图2；

根据以上靶蛋白筛选的回收率情况，从各种筛选输出滴度平板上挑取噬菌斑扩增；由于在第四轮有较大提升，因此第一、二轮各挑取12个克隆(图2中1～3列)，第三轮挑取24个克隆(图2中4～6列)，第四轮挑取48个克隆(图2中7～11列)；靶向PD-1蛋白的高吸光值噬菌体克隆在各轮中均有分布，在第三轮高吸光值克隆较多，在第四轮中克隆整体吸光值较其他轮次更高；

经过噬菌体ELISA的初步检验，将其中高吸光值克隆扩增、纯化后，再次进行ELISA验证结合效果；结果如图3所示，经扩增和纯化后，PD-1结合序列各克隆吸光值均稳定在较高水平，且与同野生型M13KE对照克隆相比均有显著性差异(图中control为空白对照孔；图中显著性差异均为各克隆与M13KE进行t检验结果，其中*为P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005)。

实施例7：

提取噬菌体克隆ssDNA并进行测序结果分析：

1、准备25mL处于对数期ER2738，1.5mL分装于试管中用于纯化噬菌体测序；

2、根据单克隆ELISA结果挑选吸光值呈阳性且较高的克隆，吸取15μL至对数生长期的各宿主菌试管中，并注意标注序号；37℃剧烈扩增4.5～5h；

3、将扩增培养物转移至灭菌离心管中，12500rpm于4℃离心10min；

4、吸取90％上清转移至一新灭菌离心管中，加入500μL PEG/NaCl，颠倒混匀后置于4℃沉淀过夜；

5、4℃预冷离心机，12500rpm离心15min，弃去上清；

以下操作可转移至超净台外进行：

6、将沉淀物彻底重悬于300μL碘化物(NaI)缓冲液；

7、加入750ul乙醇，室温孵育10min；

8、4℃预冷离心机，12500rpm离心15min，弃去上清；

9、加入1mL 70％冰冷乙醇洗涤沉淀，12500rpm 4℃离心15min，弃去上清；

10、将离心管置于洁净环境中，打开离心管盖使管内残留液体挥发干燥；

11、加入25μL UP H2O重悬沉淀并准备琼脂糖凝胶核酸电泳。

实施例8：

琼脂糖凝胶电泳及序列分析：

1、制备20mL 1％琼脂糖凝胶，待琼脂糖完全融化加入0.2μL Golden View染料，混匀后制为质地均一的溶液；

2、快速导入制胶模板内并插入梳齿，静置15min使其完全冷却凝固；

3、将琼脂糖凝胶置于核酸电泳槽内，加入电泳缓冲液使其浸没凝胶；

4、取各克隆ssDNA抽提样品5μL与1μL 6×Loading Buffer混匀并上样；

5、确定电泳方向(从负极电泳至正极)，连接电泳设备，恒压60V电泳约45min；

6、取出琼脂糖凝胶并置于凝胶成像系统，在紫外光下检测目的条带；

7、将各克隆纯化后ssDNA样品以及其上游-96测序引物进行测序，通过DNAMAN与在线ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)读取测序结果并分析序列出现频率；

8、将出现频率较高序列输入蛋白质在线分析BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast；cgi)比对是否有同源序列，并作为潜在序列进一步研究。

通过综合对ELISA结果和测序结果进行分析之后，PD-1结合序列存在重复序列，申请人共获得五条短肽，分别命名为P-V1、P-S2、P-T3、P-F4、P-H5，其中P-F4的氨基酸序列为SEQ ID NO.1：FSGTVTTAGLLF。

实施例9：

细胞ELISA：

为进一步检测结合肽序列与细胞表面PD-1蛋白结合情况，分别将实验室稳转细胞CHO-PD-1作为靶标固定于微孔板，检测已纯化噬菌体克隆PD-1结合肽P-V1、P-S2、P-T3、P-F4、P-H5与相应稳转细胞的结合情况；

1、使用DMEM-F12(含10％FBS)并加入G418，37℃5％CO₂通气培养稳转细胞系CHO-PD-1，待其生长至单层约80％，弃去培养基并使用PBS洗涤两次；使用0.25％胰酶消化(含0.05％EDTA)约1～2min，加入完全培养基终止；吹打均匀后转移至15mL尖底离心管中，1500rpm离心5min。弃去上清，使用1mL培养基将细胞沉淀完全重悬，继续传代培养或计数用于细胞ELISA实验；

2.将靶标细胞数量调整至2×10⁵个/mL，并以100μL/孔加入96孔细胞培养板，于37℃5％CO₂培养过夜；

3、靶标潜在结合单克隆噬菌体序列的扩增与纯化：

(1)、根据实施例7步骤1～5(将扩增体系增至20mL)扩增高吸光值噬菌体克隆；

(2)、将各噬菌体克隆沉淀沉降后用1mL TBS重悬各噬菌体沉淀；

(3)、4℃10000rpm短暂离心1min以去除残余菌体；

(4)、将各噬菌体克隆溶液分别过滤去除菌体碎片(使用0.45μm滤器)；

(5)、测定滴度并将其调整为10¹¹～10¹²(pfu/mL)，即可获得纯化后各潜在噬菌体溶液；

4、待步骤2中已准备的96孔培养板中细胞生长接近至单层汇合(约80～90％)，取出培养板，弃去上清并用PBS(200uL/孔)轻轻洗涤2次；

5、每孔加入125μL 4％多聚甲醛固定液，室温固定15min；

6、弃去甲醛，使用PBS洗板两次(注意：勿拍板，用力甩净溶液即可)；

7、每孔加入250μL 3％脱脂牛奶-PBS，于37℃封闭2h；

8、弃去封闭液，并用PBS洗板两次；

9、将步骤3中已纯化的各噬菌体克隆，分别以100μL加入封闭后细胞培养板各孔中，4℃孵育过夜；

10、弃去各噬菌体克隆上清(注意回收处理)，使用含0.05％(v/v)Tween20-PBS洗涤各三次，再使用PBS洗涤三次；

11、弃去洗涤液，向每孔中加入3％脱脂牛奶-TBS稀释HRP-鼠抗M₁₃抗体(1:8000稀释)，37℃孵育1.5～2h；

12、使用PBST和PBS分别洗板三次，加入100μL HRP底物液20-25℃下避光反应5～20min；

13、加入50μL 1M H₂SO₄终止反应并于OD₄₅₀ nm处检测各孔吸光值；

检测结果如图4所示；PD-1结合序列均与CHO-PD-1结合，较对照克隆均有显著性差异(图中显著性差异均为各克隆与M13KE进行t检验结果，其中*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005)。

实施例10：

流式细胞术验证细胞株表面PD-1表达：

为检测噬菌体展示多肽序列同天然构象蛋白的结合情况，通过流式细胞术检测各克隆与天然表达PD-1细胞结合情况；首先通过查阅文献选取细胞株；PD-1表达备选细胞株为：Jurkat、THP-1，并使用市售PD-1抗体检测细胞株表面分子表达情况，以FITC标记的荧光二抗进行检测；

1、使用1640培养基+10％FBS，37℃5％CO₂通气培养jurkat、THP-1细胞；收集细胞并调整细胞数量至2×10⁶个/mL，分别分装于各1.5mL尖底EP管中；

2、使用2％(v/v)FBS-PBS稀释市售PD-1抗体(1:100)，分别加入待检测细胞样品中，混匀后置于4℃孵育1h；每管加入1mL 2％FBS-PBS洗涤，3000rpm离心5min。弃去上清，重复以上洗涤步骤一次；

3、使用2％FBS-PBS稀释FITC-羊抗鼠抗体(1:100)或AF647-羊抗鼠抗体(1:100)，向各样品中加入100μL稀释抗体并轻轻混匀，置于4℃孵育1h，此步骤需避光操作；每管加入1mL 2％FBS-PBS，3000rpm离心5min，共洗涤两次(注意避光操作)；弃去上清，加入300μLPBS重悬细胞后上机检测(注意避光操作)；

4、使用Flowjo 7.6处理流式数据图；

细胞表面天然表达PD-1的情况如图5所示；THP-1细胞表面有较高的PD-1表达。

实施例11：

流式细胞术检测噬菌体克隆潜在序列对THP-1细胞的结合：

1、重复实施例10步骤1，向各实验组中加入150μL已纯化噬菌体溶液，并设置空白对照组、M13KE阴性对照组，混合均匀后于4℃孵育1h；每管加入1mL 2％FBS-PBS洗涤，3000rpm离心5min。弃去上清，重复以上洗涤步骤一次；

2、使用2％FBS-PBS稀释鼠抗M13抗体(1:100稀释)，向各样品中加入100μL稀释抗体并轻轻混匀，置于4℃孵育1h。加入1mL 2％FBS-PBS，3000rpm离心5min，共洗涤两次；

3、使用2％FBS-PBS稀释AF647-羊抗鼠抗体(1:100)，向各样品中加入100μL稀释抗体并轻轻混匀，置于4℃孵育1h；此步骤需避光操作；加入1mL 2％FBS-PBS洗涤标记细胞，3000rpm离心5min，共洗涤两次(注意避光操作)；弃去上清，每管加入300μL PBS重悬细胞后上机检测(注意避光操作)。

4.使用Flowjo 7.6处理流式数据图：

结合结果如图6所示(图中各百分比均为M13KE及各噬菌体克隆与空白细胞相比峰位移情况)，P-V1～P-H5分别与THP-1(图1-8)有较高结合；因此从该实验结果可证明筛选结果有效，能够获得与天然靶标结合的特异性序列P-V1～P-H5，可继续进行实验进一步探究各序列的功能及活性。

实施例12：

PD-1结合多肽调节人PBMC分泌细胞因子：

1、据实施例8所得多肽序列P-V1、P-S2、P-T3、P-F4、P-H5，进行化学合成；

2、分离人外周血PBMCs细胞：

(1)、从含抗凝剂的真空采血管中将血液转移至15mL灭菌离心管，加入等体积PBS稀释；

(2)、取一系列15mL灭菌离心管，各加入3mL淋巴细胞分离液；

(3)、在淋巴细胞分离液界面上方缓慢加入6mL已稀释血液，尽可能减少与淋巴细胞分离液在交界面混合；

(4)、2400rpm于室温离心20min；

(5)、将离心后交界面处出现的淋巴细胞层小心吸出并转移至新的15mL灭菌离心管中；

(6)、加入PBS稀释淋巴细胞，2400rpm于室温离心10min；

(7)、弃去上清，并加入培养基洗涤细胞两次；

3、体外激活T细胞，并通过ELISA实验探究合成多肽的免疫调节作用：

(1)、使用无菌PBS将CD3抗体稀释并调整至2μg/mL；细胞培养板每孔中加入100μLCD3稀释抗体，将其包被于37℃2h，并以100μL PBS替代抗体溶液设置不激活孔作为对照组，周围孔加入200μL PBS以防止边缘效应；吸去包被抗体溶液并加入200μLPBS洗涤各孔三次；吸去孔内洗涤PBS并准备加入PBMCs细胞；

(2)、使用1640完全培养基将PBMCs细胞数量调整为2×10⁶个/mL；将100μL PBMCs加入已包被CD3抗体各孔内；

(3)、每孔分别加入20μL浓度为1mg/mL各P-V1、P-S2、P-T3、P-F4、P-H5多肽溶液，5μL 4mg/mL PD-L1蛋白，以及100μL 2μg/mL CD28抗体；

(4)、将细胞培养板置于37℃5％CO₂刺激72h；

(5)、收集细胞及细胞上清至离心管中，3000rpm离心5min，将上清转移至一新离心管中用于细胞因子检测；

(6)、使用人IFN-γ及IL-2试剂盒检测淋巴细胞分泌细胞因子的情况：将IFN-γ及IL-2ELISA试剂盒中提供的10×洗涤缓冲液和10×检测缓冲液用超纯水稀释为1×洗涤缓冲液和1×检测缓冲液；使用超纯水溶解IL-2及IFN-γ标准品，使其浓度为1ng/mL，溶解并充分混匀后静置30min；取250μL标准品溶液稀释于250μL无菌PBS中并充分混匀，以相同方法1:1系列稀释共制为5个浓度梯度；

(7)、计算待检测样品及标准蛋白个数，取出相应IL-2及IFN-γ微孔酶条，加入300μL 1×洗涤缓冲液浸泡30s；

(8)、拍甩去除缓冲液后立即向孔内加入100μL系列稀释标准品，并在一孔内加入PBS作为零浓度孔；IL-2微孔酶条中加入25μL各样品上清，补加75μL 1×检测缓冲液，使孔内液体达到100μL，即四倍稀释样品；IFN-γ微孔酶条中加入10μL各样品上清，补加90μL 1×检测缓冲液，使孔内液体补足至100μL，即十倍稀释样品；

(9)、根据标准品及样品数量，用1×检测缓冲液1:100分别稀释IL-2及IFN-γ浓缩抗体，并在相应待检样品孔内加入50μL稀释抗体；

(10)、将微孔板用封板膜封严于室温250rpm振荡孵育2h；弃去孔板中液体，每孔加入250μL 1×洗涤缓冲液洗涤孔板6次，每次洗涤均需拍甩干净去除残留液体；

(11)、根据待测孔数量，用1×检测缓冲液1:100稀释HRP-链霉亲和素，每孔加入100μL稀释链霉亲和素；

(12)、将微孔板用封板膜封严于室温250rpm振荡孵育2h；弃去孵育抗体并将各孔洗涤6次；

(13)、每孔加入100μL TMB底物液，避光孵育5～25min；

(14)、每孔加入100μL终止液后于OD450 nm检测吸光值；

(15)、通过标准品的浓度及吸光值建立标准曲线，将待测样品孔吸光值代入该标准曲线内，计算出各样品孔中IFN-γ及IL-2浓度；

根据以下公式计算IFN-γ及IL-2释放百分比：

细胞因子释放％＝[(多肽实验组–PD-L1抑制组)/(激活组-PD-L1抑制组)]×100％

各合成多肽对人PBMCs分泌IFN-γ及IL-2的调节作用结果如图7A和B所示；经P-F4处理过的细胞分泌IFN-γ和IL-2均较PD-L1抑制对照组有所升高，产生显著性差异，与CD3/CD28激活组没有显著性差异，表现出一定阻断PD-1/PD-L1信号通路、恢复T细胞分泌细胞因子的活性功能；因此将其中P-F4作为潜在阻断肽的代表，以进一步研究探究其结合位点以及阻断原理。(图中统计学差异为t检验，其中*P＜0.05)

实施例13：

溶剂置换法包载P-F4多肽制备纳米粒子：

选用聚乙二醇-聚乳酸mPEG-PLA(MPP)作为包载材料，精密称取质量3:1(载体：多肽P-F4)，将MPP溶于10mL纯水中超声促进其溶解并转移至100mL茄形瓶中，PF-4溶于600μLDMSO中，随后使用1mL注射器将要含有多肽的有机溶液均匀缓慢滴加到MPP溶液中，滴加完毕后继续搅拌4h，冰浴条件下探头超声30min，用分子量3500的透析袋透析24h，第二天经3000rpm离心10min，取上清液过0.8μm的微孔滤膜，检测其粒径和多分散指数PDI，测完粒径后，最后冻干，即得PD-1MPP纳米粒；

取适量P-F4/MPP纳米粒子溶于1份ddH₂O中，再加入9份DMSO进行破乳，超声30min裂解纳米粒；以P-F4合成多肽粉末作为标准品，用90％DMSO+10％ddH₂O溶解稀释，制成一系列浓度的标准品溶液；以BCA法测定所制备纳米粒子中P-F4的含量；

最终测得包封率61％，载药量17％。

实施例14：

P-F4/MPP纳米粒(P-F4 NPs)在荷瘤小鼠模型中的抑瘤作用：

选择4-6周龄的雌性Bal b/c小鼠随机分成三个小组。每组6只老鼠，分组包括：①阴性对照组②阳性药组③P-F4 NPs组；阴性对照组采用生理盐水进行瘤内给药，阳性对照组以3mg/kg市售DOX·HCl尾静脉给药，P-F4 NPs组以10mg/kg进行瘤内给药，各组均两天一次给药；

第0天在小鼠左上肢近心端腋下皮下注射CT26小鼠结肠癌细胞，8.5×10⁴个细胞/小鼠，待小鼠平均肿瘤体积达50-100mm³后进行给药；隔天测量小鼠肿瘤体积与体重，肿瘤体积计算按照a·b²/2(a为长径，b为短径)计算；共计给药7次后，对小鼠进行安乐死，剥瘤称重拍照；

结果如图8所示；从图8A肿瘤生长曲线可以看出，在CT26结肠癌模型中，P-F4NPs10mg/kg瘤内注射给药与阳性药DOX 3mg/kg尾静脉给药的抑瘤效果没有显著性差异，与阴性对照相比，二者都显著减缓了小鼠肿瘤生长；从图8B小鼠体重变化曲线可以看出，DOX有明显全身毒性，而P-F4 NPs与对照组均无明显系统毒性；从图8C肿瘤拍照结果可以看出，P-F4 NPs和DOX组的肿瘤明显小于阴性对照组。以上结果说明了P-F4纳米粒有显著抗肿瘤作用，且没有系统毒性(图中显著性差异均为进行t检验结果，其中*为P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005)。

最后，应当理解的是，本发明中所述实施例仅用以说明本发明实施例的原则；其他的变形也可能属于本发明的范围；因此，作为示例而非限制，本发明实施例的替代配置可视为与本发明的教导一致；相应地，本发明的实施例不限于本发明明确介绍和描述的实施例。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种PD-1靶向阻断肽及其应用

<140> 202010058292X

<141> 2020-01-19

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Phe Ser Gly Thr Val Thr Thr Ala Gly Leu Leu Phe

1 5 10

Claims (1)

1.一种PD-1靶向阻断肽P-F4，其特征在于，所述的靶向阻断肽P-F4的氨基酸序列 如SEQ ID NO.1所示。

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