CN114249813A

CN114249813A - 具自组装性能的白蛋白HSA-Hydrophobic-IB及其应用

Info

Publication number: CN114249813A
Application number: CN202111591716.XA
Authority: CN
Inventors: 王伯初; 孟润; 郝石磊; 祝连彩; 邓佩颖
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114249813B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具自组装性能的白蛋白HSA‑Hydrophobic‑IB及其应用。提供的白蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述白蛋白能够自组装形成纳米粒，所得纳米粒的形貌均一、平均粒径为151.9nm。细胞实验表明，所述白蛋白具有良好的生物相容性。药物释放实验表明，所述白蛋白的纳米胶束具有显著的药物缓释效果。

Description

具自组装性能的白蛋白HSA-Hydrophobic-IB及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具自组装性能的白蛋白HSA-Hydrophobic-IB及其在制备用于疏水性药物递送的纳米胶束中的应用。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是人血浆中含量最丰富的蛋白质，约占血浆总的蛋白质的50％，浓度达到38-48g/L，人的肝脏每天能合成12-20g白蛋白。HSA由585个氨基酸残基组成，分子量约为67kDa，其单分子构象呈“心形”结构，主要分为I、II、III三个结构域，每个结构域又分为两个亚结构域，即IA和IB、IIA和IIB、IIIA和IIIB。因为白蛋白来源于人血浆，因而具有良好的生物相容性，又因其具有较好的生物可降解性、高生物稳定性、极低的细胞毒性、较多的药物结合位点等优势，所以被广泛应用于医药、生化等领域，尤其是白蛋白药物载体的开发与应用更是吸引了越来越多的研究者的关注。

天然的人血清白蛋白来源于人血浆，所以存在原料来源途径单一、成本高昂等缺点。近年来，在体外重组表达获得人血清白蛋白的基因工程技术已越来越成熟，重组人血清白蛋白不仅较好地保留了天然人血清白蛋白的优点，而且具有原料来源不受限、成本低等优点。另一方面，目前市场上的药物有相当大的一部分为疏水性药物，其在水中溶解度极低、难以被机体有效的吸收、药物的应用范围有限。因此，有必要通过体外重组表达技术获得一端亲水、一端疏水的两亲性白蛋白，实现在不添加诱导试剂的条件下蛋白能够自组装形成纳米粒、搭载更多疏水性药物、提高疏水性药物的溶解度等。

发明内容

为了满足上述领域的需求，本发明基于人血清白蛋白，设计出了一条新的氨基酸序列，并运用重组蛋白表达方法获得了一种新型的白蛋白，命名为HSA-Hydrophobic-IB。所述白蛋白能够自组装形成纳米粒，所得纳米粒的形貌均一，平均粒径为151.9nm，载药量达到了23.31％。经实验证明，这种新型白蛋白的纳米胶束具有良好的生物相容性和显著的药物缓释效果。

本发明提供的白蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述白蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

在本发明的一些实施例中，所述白蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

含有所述白蛋白的编码基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述白蛋白在制备用于疏水性药物递送的纳米胶束中的用途也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种用于疏水性药物递送的纳米胶束，其包含所述的白蛋白。

在本发明的一些实施例中，所述用于疏水性药物递送的纳米胶束还包含可用于肿瘤组织的显影或诊断的制剂。

在本发明的一些实施例中，所述用于疏水性药物递送的纳米胶束的药物剂型为注射剂。

本发明还提供一种白蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述白蛋白的编码基因插入表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体导入表达宿主菌中，获得重组菌；培养重组菌，诱导蛋白表达，收集菌体，提取和纯化蛋白。

本发明还提供一种用于疏水性药物递送的纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取所述白蛋白，溶解于去离子水中，配制成浓度为5-10mg/mL的白蛋白水溶液；冰浴条件下，将等体积的所述白蛋白水溶液以0.4-0.6mL/min的速率滴注到pH7.2-7.4的含疏水性药物的PBS溶液中，滴注过程中进行超声分散，滴注完毕后停止超声分散，得到纳米胶束。

本发明还提供一种递送疏水性药物的方法，该方法使用所述用于疏水性药物递送的纳米胶束装载疏水性药物并递送到受试者体内。所述递送优选为注射。

经细胞实验证明，在10-400μg/ml浓度的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白纳米粒共培养下，人胚胎肾细胞(293T)表现出了较高的存活率，证明新型白蛋白HSA-Hydrophobic-IB纳米粒具有良好的生物相容性(图4)。经药物释放实验证明，HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白能够使其搭载的药物在7天内缓慢释放，具有显著的药物缓释效果(图5)。

附图说明

图1显示了pET-22b(+)质粒图谱。

图2显示了天然人血清白蛋白和HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的SDS-PAGE图；A为天然人血清白蛋白的SDS-PAGE图，其中右侧泳道为蛋白分子标记，左侧泳道为纯化得到的天然人血清白蛋白；B为HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的SDS-PAGE图，其中左侧泳道为蛋白分子标记，右侧泳道为纯化的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白。

图3显示了天然人血清白蛋白和HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的透射电镜图；A为天然人血清白蛋白纳米胶束冷冻干燥后的透射电镜图，B为HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白纳米胶束冷冻干燥后的透射电镜图。

图4显示了HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白对人胚胎肾细胞(293T)存活率的影响；其中横坐标为培养基中的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的浓度(μg/mL)，纵坐标为人胚胎肾细胞(293T)的存活率(％)，以培养基中不加HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的对照组细胞的存活率为100％。

图5显示了HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束和通过反溶剂沉淀法制备而得的天然人血清白蛋白载药纳米胶束的药物释放速率(以载阿霉素为例)；其中横坐标为药物释放时间(h)，纵坐标为阿霉素累计释放量(％)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，需要注意的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

材料与试剂

人胚肾细胞293T购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号SCSP-502，细胞名称：人胚胎肾细胞，动物种别：人，组织来源：胎儿，胚肾。

大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购买自北京索莱宝科技有限公司。

pET-22b(+)质粒为市售的大肠杆菌表达载体，购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。载体标签为N-pelB和C-His，载体抗性为Ampicillin(氨苄青霉素)。

限制性内切酶NdeI和XhoI购买自NEB(北京)有限公司。His-tag蛋白纯化树脂(镍柱)，购买自上海联迈生物工程有限公司，货号LM-616。IPTG、氨苄青霉素、DMSO(二甲基亚砜)均购买自北京索莱宝科技有限公司。DMEM培养基购买自GIBCO。CCK8试剂购自重庆葆光技术有限公司，按照试剂说明书操作使用。阿霉素(英文名称adriamycin)是一种抗生素类药物，分子式为C₂₇H₂₉NO₁₁，CAS登录号为23214-92-8，购买自上海麦克林生化科技有限公司。

培养基

每升LB培养基含有：5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10g氯化钠，调节pH至7.0。配制方法为：在950ml双蒸水中溶解5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10g氯化钠，再用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用双蒸水定容至1L。如果配制固体培养基，按1.5g/100ml加入琼脂。121℃高压蒸汽灭菌30min。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可以按照本领域常规方法配制而得或从相关试剂供应商购买获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册或相关试剂生产商的说明书。

实施例1.HSA-Hydrophobic-IB基因设计及蛋白表达

1.基因设计

发明人设计了一个基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，全长1833bp。该基因编码一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，全长610个氨基酸，被命名为HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白。委托生工生物工程(上海)股份有限公司对该基因进行全基因合成并在基因的5’端和3’端分别加上NdeI酶切位点(CATATG)和XhoI酶切位点(CTCGAG)。带有酶切位点的基因序列如SEQ ID No.3所示。对合成的基因进行测序验证，序列正确的基因用于后续的载体构建。

HSA-Hydrophobic-IB的氨基酸序列(610aa)

MDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCVAFHDNEEVFLKKFLFEIARRHPYFFAPELLFFAKRFKAAFVECCLAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHHHHHHGGSGGSWSHPQFEK(SEQ ID No.1)

HSA-Hydrophobic-IB的核苷酸序列(1833bp)

ATGGATGCGCACAAATCTGAAGTGGCGCACCGTTTCAAAGATCTGGGCGAAGAAAACTTCAAAGCGCTGGTTCTGATTGCGTTCGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCGTTCGAAGATCACGTTAAACTGGTTAACGAAGTTACCGAATTCGCAAAAACCTGTGTTGCGGATGAAAGCGCGGAAAACTGCGATAAATCCCTGCACACCCTGTTTGGCGATAAACTGTGCACCGTTGCGACCCTGCGTGAAACTTACGGTGAAATGGCCGACTGTTGCGCGAAACAGGAACCGGAACGTAACGAATGCTTCCTGCAGCATAAAGATGACAACCCGAACCTGCCGCGTCTGGTTCGCCCAGAAGTGGATGTTATGTGTGTTGCGTTCCACGACAACGAAGAAGTGTTCCTGAAAAAATTCCTGTTCGAAATCGCTCGCCGCCACCCGTACTTCTTTGCGCCGGAACTGCTGTTCTTCGCAAAACGTTTCAAAGCTGCGTTCGTTGAATGCTGCCTGGCAGCTGATAAAGCTGCTTGCCTGCTGCCGAAACTGGACGAACTGCGTGATGAAGGCAAAGCGTCCTCTGCGAAACAGCGTCTGAAATGCGCATCCCTGCAGAAATTCGGTGAACGCGCATTCAAAGCATGGGCAGTTGCGCGTCTGTCTCAGCGCTTCCCGAAAGCGGAATTCGCTGAAGTTTCCAAACTGGTTACGGATCTGACTAAAGTACATACCGAATGTTGCCACGGTGATCTGCTGGAGTGCGCGGATGATCGTGCTGACCTGGCAAAATACATCTGTGAAAACCAGGATTCCATTTCTAGCAAACTGAAAGAATGCTGCGAAAAACCGCTGCTGGAAAAATCCCACTGTATCGCCGAAGTTGAAAACGACGAAATGCCGGCGGATCTGCCATCTCTGGCGGCGGACTTCGTTGAAAGCAAAGACGTTTGCAAAAACTACGCGGAAGCCAAAGACGTTTTCCTGGGTATGTTCCTGTACGAATATGCGCGCCGTCACCCGGACTACAGCGTTGTTCTGCTGCTGCGTCTGGCGAAAACCTATGAAACCACCCTGGAAAAATGTTGCGCGGCGGCCGATCCGCACGAATGCTACGCAAAAGTTTTCGATGAATTCAAACCGCTGGTTGAAGAACCGCAGAACCTGATTAAACAGAACTGTGAACTGTTTGAACAGCTGGGCGAATACAAATTCCAGAATGCTCTGCTGGTGCGTTACACCAAAAAAGTGCCGCAGGTAAGCACCCCGACCCTGGTTGAAGTGTCCCGTAACCTGGGCAAAGTTGGTAGCAAATGCTGCAAACACCCGGAAGCGAAACGTATGCCGTGCGCGGAAGATTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAAAAAACCCCGGTTAGCGACCGTGTCACCAAATGCTGTACCGAAAGCCTGGTTAACCGTCGTCCGTGCTTCAGCGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTACGTGCCGAAAGAATTCAACGCGGAAACTTTCACCTTCCACGCAGACATCTGCACCCTGTCTGAAAAAGAACGCCAGATCAAAAAACAGACCGCTCTGGTTGAACTGGTTAAACACAAACCGAAAGCAACCAAAGAACAGCTGAAAGCAGTTATGGATGATTTCGCAGCGTTCGTTGAAAAATGCTGCAAAGCTGATGATAAAGAAACCTGCTTTGCGGAAGAAGGTAAAAAACTGGTTGCTGCTTCTCAGGCGGCGCTGGGCCTGCACCATCACCACCATCACCACCACCACCACGGCGGTAGCGGCGGTAGCTGGTCTCACCCGCAGTTTGAAAAATAA(SEQ ID No.2)

带酶切位点的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白编码基因(1842bp)

CATATGGATGCGCACAAATCTGAAGTGGCGCACCGTTTCAAAGATCTGGGCGAAGAAAACTTCAAAGCGCTGGTTCTGATTGCGTTCGCCCAGTACCTGCAGCAGTGCCCGTTCGAAGATCACGTTAAACTGGTTAACGAAGTTACCGAATTCGCAAAAACCTGTGTTGCGGATGAAAGCGCGGAAAACTGCGATAAATCCCTGCACACCCTGTTTGGCGATAAACTGTGCACCGTTGCGACCCTGCGTGAAACTTACGGTGAAATGGCCGACTGTTGCGCGAAACAGGAACCGGAACGTAACGAATGCTTCCTGCAGCATAAAGATGACAACCCGAACCTGCCGCGTCTGGTTCGCCCAGAAGTGGATGTTATGTGTGTTGCGTTCCACGACAACGAAGAAGTGTTCCTGAAAAAATTCCTGTTCGAAATCGCTCGCCGCCACCCGTACTTCTTTGCGCCGGAACTGCTGTTCTTCGCAAAACGTTTCAAAGCTGCGTTCGTTGAATGCTGCCTGGCAGCTGATAAAGCTGCTTGCCTGCTGCCGAAACTGGACGAACTGCGTGATGAAGGCAAAGCGTCCTCTGCGAAACAGCGTCTGAAATGCGCATCCCTGCAGAAATTCGGTGAACGCGCATTCAAAGCATGGGCAGTTGCGCGTCTGTCTCAGCGCTTCCCGAAAGCGGAATTCGCTGAAGTTTCCAAACTGGTTACGGATCTGACTAAAGTACATACCGAATGTTGCCACGGTGATCTGCTGGAGTGCGCGGATGATCGTGCTGACCTGGCAAAATACATCTGTGAAAACCAGGATTCCATTTCTAGCAAACTGAAAGAATGCTGCGAAAAACCGCTGCTGGAAAAATCCCACTGTATCGCCGAAGTTGAAAACGACGAAATGCCGGCGGATCTGCCATCTCTGGCGGCGGACTTCGTTGAAAGCAAAGACGTTTGCAAAAACTACGCGGAAGCCAAAGACGTTTTCCTGGGTATGTTCCTGTACGAATATGCGCGCCGTCACCCGGACTACAGCGTTGTTCTGCTGCTGCGTCTGGCGAAAACCTATGAAACCACCCTGGAAAAATGTTGCGCGGCGGCCGATCCGCACGAATGCTACGCAAAAGTTTTCGATGAATTCAAACCGCTGGTTGAAGAACCGCAGAACCTGATTAAACAGAACTGTGAACTGTTTGAACAGCTGGGCGAATACAAATTCCAGAATGCTCTGCTGGTGCGTTACACCAAAAAAGTGCCGCAGGTAAGCACCCCGACCCTGGTTGAAGTGTCCCGTAACCTGGGCAAAGTTGGTAGCAAATGCTGCAAACACCCGGAAGCGAAACGTATGCCGTGCGCGGAAGATTATCTGTCTGTGGTGCTGAACCAGCTGTGCGTGCTGCACGAAAAAACCCCGGTTAGCGACCGTGTCACCAAATGCTGTACCGAAAGCCTGGTTAACCGTCGTCCGTGCTTCAGCGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTACGTGCCGAAAGAATTCAACGCGGAAACTTTCACCTTCCACGCAGACATCTGCACCCTGTCTGAAAAAGAACGCCAGATCAAAAAACAGACCGCTCTGGTTGAACTGGTTAAACACAAACCGAAAGCAACCAAAGAACAGCTGAAAGCAGTTATGGATGATTTCGCAGCGTTCGTTGAAAAATGCTGCAAAGCTGATGATAAAGAAACCTGCTTTGCGGAAGAAGGTAAAAAACTGGTTGCTGCTTCTCAGGCGGCGCTGGGCCTGCACCATCACCACCATCACCACCACCACCACGGCGGTAGCGGCGGTAGCTGGTCTCACCCGCAGTTTGAAAAATAACTCGAG（SEQ ID No.3）

2.载体构建

采用pET-22b(+)质粒作为表达载体。用限制性内切酶NdeI、XhoI分别对pET-22b(+)质粒和目的基因(SEQ ID No.3)进行双酶切反应，然后通过连接反应将目的基因连接到pET-22b(+)载体中。载体构建委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行。

3.转化

(1)将大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(北京索莱宝)从-80℃冰箱中取出，冰浴5min。

(2)待保存BL21(DE3)感受态细胞的甘油融化后，将感受态细胞加入连接产物中，枪头吸放3-4次混匀，冰浴静置30min。

(3)用吸水纸迅速擦干管壁的水分，然后42℃热激90s，立即冰浴2min。

(4)在无菌条件下加入800μl的LB液体培养基，37℃，150rpm培养45min。

(5)8000rpm离心5min收集菌体，弃掉部分上清，用剩下的100μl左右的上清重悬大肠杆菌，然后均匀地涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，放入37℃恒温箱中，倒置培养10-16h。

(6)挑取单克隆接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃培养10-16h后，将菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行阳性克隆的鉴定。

4.蛋白表达和纯化

(1)接种：配制好液体LB培养基并灭菌，灭菌完毕后的液体LB培养基放置于超净工作台中冷却至室温，在超净工作台中加氨苄青霉素至LB培养基中并混匀，使得氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL，再按200μL/L的量向LB培养基接种含目的基因质粒的大肠杆菌(阳性克隆)，然后将该LB培养基放置于摇床中，按照转速为170rpm、温度为37℃的条件培养8-10h；

(2)诱导：摇床培养8-10h后，取出2mL菌液经分光光度计测量其OD600值，当菌液的OD600值达到0.6-0.8时，向该菌液中添加终浓度为200μL/mL的IPTG，再按照37℃、170rpm的条件摇床培养8h；

(3)纯化：添加IPTG并摇床培养8h后，取出菌液，于4℃，8000rpm离心5min，离心完毕后去掉上清，保留沉淀(沉淀即为大肠杆菌)；

(4)超声破碎：将大肠杆菌超声破碎后进行离心，离心得到的沉淀即含目的蛋白，将离心得到的沉淀先用洗涤液I(50mmol/L Tris-HCl，1mol/L尿素，10mL/L Triton X-100)洗涤，然后再用洗涤液II(50mmol/L Tris-HCl，2mol/L尿素，5mL/L Triton X-100)洗涤，再用包涵体溶解液(50mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素，100mmol/L NaCl)溶解；

(5)最后对上述包涵体溶解液进行梯度复性，方法如下：将包涵体溶解液装于透析袋(北京索莱宝科技有限公司，货号：YA1071)中，再将透析袋依次置于6M、4M、2M、1M、0.5M的尿素溶液中进行梯度复性，每个尿素浓度下复性2-4小时，需在4℃低温条件下进行复性。复性完毕后的溶液过His-tag蛋白纯化树脂(镍柱，上海联迈)纯化即可得到HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白(目的蛋白的基因序列在设计时已加入组氨酸标签)。纯化完毕后通过跑聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)来鉴定是否成功获得纯化的目的蛋白。结果如图2B所示，获得了大小约70kDa的目的蛋白。

5.HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白纳米胶束的制备

(1)取磷酸盐缓冲液干粉(北京索莱宝科技有限公司，货号：P1010)于烧杯中，加入去离子水进行稀释，最终得到pH为7.4的1×PBS，制得分散溶液，备用；

(2)称取纯化后得到的新型白蛋白50mg，在磁力搅拌的条件下溶于10mL去离子水中，配制成质量浓度为5mg/mL的新型白蛋白水溶液；

(3)量取步骤(1)中配制的分散溶液10mL于25mL的烧杯中，在冰浴的条件下以400W的功率超声分散，同时，量取步骤(2)中制备得到的新型白蛋白溶液10mL，通过恒流泵以0.5mL/min的速率滴注到分散溶液中，新型白蛋白溶液滴注完毕后即可停止超声，得到HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白纳米胶束溶液。

实施例2.天然人血清白蛋白(ori-HSA)的纳米胶束的制备

天然人血清白蛋白(ori-HSA)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，全长591个氨基酸；在其编码基因的5’端和3’端分别加上NdeI酶切位点(CATATG)和XhoI酶切位点(CTCGAG)，得到核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的基因，全长1788bp。委托生工生物工程(上海)股份有限公司对该基因进行全基因合成，并对合成的基因进行测序验证，序列正确的基因用于后续的载体构建。

天然人血清白蛋白(ori-HSA)的原核表达载体构建、转化、蛋白表达和纯化的方法与HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的原核表达载体构建、转化、蛋白表达和纯化的方法一致，详细步骤同实施例1中2-4。结果如图2A所示，获得了大小约67kDa的天然人血清白蛋白。

天然人血清白蛋白(ori-HSA)纳米胶束的制备方法与HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白纳米胶束的制备方法一致，详细步骤同实施例1中“5.HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白纳米胶束的制备”。制备天然人血清白蛋白ori-HSA纳米胶束的目的是为了验证天然人血清白蛋白是否能像新型白蛋白那样进行自组装，以进一步突出显示HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白在不添加诱导试剂的条件下特有的自组装性能。

实施例3.HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的细胞毒性评价

使用CCK8法研究HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白对人胚胎肾细胞293T(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)的毒性以评价新型白蛋白HSA-Hydrophobic-IB的生物安全性。在96孔板中，按照每孔接种1×10⁴个人胚胎肾细胞293T到DMEM培养基(gibco)中，设置5个实验组和1个对照组，每组设置3个复孔。37℃培养细胞24h后，向实验组的孔(实验孔)中加入HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白，使得5个实验组的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的终浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。对照组的孔(对照孔)中不加HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白。37℃继续培养24h，然后使用CCK8法检测活细胞数量，步骤如下：每孔加入10μl CCK8试剂(重庆葆光科技有限公司，货号：BG0025)，37℃孵育3h。然后用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。

细胞存活率的计算方法如下：[实验孔吸光度(含有细胞的培养基、CCK8试剂、蛋白样品)-空白孔吸光度(不含细胞和蛋白样品的培养基、CCK8试剂)]/[对照孔吸光度(含有细胞的培养基、CCK8试剂、没有蛋白样品)-空白孔吸光度(不含细胞和蛋白样品的培养基、CCK8试剂)]×100％。每组的细胞存活率为该组三个复孔的细胞存活率的平均值。以对照组的细胞存活率为100％作图，结果如图4所示，细胞在添加10-400μg/ml浓度的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白后表现出了较高的存活率，证明HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白细胞毒性低、生物相容性好。

实施例4.HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的性能测试

1.白蛋白纳米胶束的透射电镜观察

样品准备：用移液枪吸取10μl实施例1中制备的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白纳米胶束溶液滴加至铜网(品牌：瑞格锐思，型号：RGRS，300目)上，再用移液枪吸取4μl醋酸双氧铀(海德创业生物科技有限公司，货号：SPI-02624)同样滴加至铜网上对新型白蛋白进行染色，然后自然晾干以备进行形貌观察。用实施例2中制备的天然人血清白蛋白纳米胶束溶液，按照上述步骤在铜网上制备天然人血清白蛋白的电镜观察样品。

样品观察：使用透射电镜(Thermo Fisher Scientific CDLtd，型号：TalosF200S)分别观察铜网上的天然人血清白蛋白形貌和HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白形貌。结果显示，本发明制备的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白在不添加诱导试剂的条件下能够自组装形成纳米粒(图3B)，而天然人血清白蛋白在不添加诱导试剂的条件下不能自组装形成纳米粒(图3A)。

2.白蛋白载药纳米胶束的粒径、包封率和载药量测定

以载阿霉素为例，分别使用HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白和天然人血清白蛋白对阿霉素进行包封，并测定粒径、包封率和载药量。

HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束的制备：取HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白，溶解于去离子水中，配制成质量浓度为5mg/mL的白蛋白水溶液。再配制浓度为0.4mg/mL的阿霉素-PBS溶液(PBS溶液的pH值为7.4)，阿霉素-PBS溶液需不断地搅拌，否则由于阿霉素的疏水性会导致药物发生沉降、不能均匀地分散于PBS溶液中。最后，在冰浴条件下，将等体积的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白水溶液以0.5mL/min的速率滴注到浓度为0.4mg/mL的阿霉素-PBS溶液中，滴注过程中进行超声分散，滴注完毕后停止超声分散，得到HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束溶液。

天然人血清白蛋白载药纳米胶束的制备(反溶剂沉淀法)：称取20mg阿霉素溶于0.5mL乙醇中作为良溶剂(此阿霉素-乙醇溶液需要不断地进行搅拌，以防止药物沉降)，称取40mg天然人血清白蛋白溶于10mL去离子水中作为不良溶剂。在冰浴条件下，将良溶剂快速注入不良溶剂，超声5min后即得天然人血清白蛋白载药纳米胶束溶液。

按照如下方法对制备得到的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束和天然人血清白蛋白载药纳米胶束分别进行粒径、包封率和载药量测定。

粒径的测定方法：

用移液枪分别吸取2mL制备好的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束溶液和天然人血清白蛋白载药纳米胶束溶液，分别放置于4.5mL的透明比色皿中，将盛有载药纳米胶束溶液的透明比色皿放置于纳米粒度及ZETA电位分析仪(英国马尔文公司，型号：Nano ZS90)的样品分析孔中，按照Nano ZS90纳米粒度及ZETA电位分析仪的使用说明测定纳米粒的粒径。

包封率的测定方法：

将制备好的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束溶液和天然人血清白蛋白载药纳米胶束溶液分别按照10000r/min的转速离心15min，然后分别取上清液，通过紫外分光光度计测定上清液在480nm处的吸光度，按照公式：A＝0.0184C+0.0216(A为吸光度，C为阿霉素浓度)计算游离药物含量。

包封率＝(W_总-W_游)/W_总*100％

W_总为初始投药量，W_游为纳米粒中未被包封的游离药物量。

载药量的测定方法：

载药量＝(W_总-W_游)/W_总重*100％

W_总为初始投药量，W_游为纳米粒中未被包封的游离药物量，W_总重为载药后的白蛋白纳米粒总重量。W_总重的测定方法：将白蛋白载药纳米胶束在12000r/min的条件下进行离心，离心完毕后舍弃上清，沉淀的重量即为载药后的白蛋白纳米粒总重量(W_总重)。即载药后的白蛋白纳米粒总重量(W_总重)＝含沉淀的离心管总重量-空白离心管的重量。

结果如表1所示，HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束的粒径较小且均匀，载药量达到了23.31％，载药量明显大于通过添加有机试剂诱导而制备得到的天然人血清白蛋白载药纳米胶束的载药量。

表1阿霉素白蛋白纳米胶束的粒径、包封率和载药量的测定结果

3.白蛋白载药纳米胶束的药物释放实验

对制备得到的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束和天然人血清白蛋白载药纳米胶束分别进行药物释放实验。

药物释放实验方法：移取5mL的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束溶液于透析袋(北京索莱宝科技有限公司，货号：YA1071)中，置于20mL含1g/L吐温80的磷酸盐缓冲液(pH7.4)的释放介质中，放置于恒温摇床上，按照37℃、170r/min的条件进行药物释放实验，分别于3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h取出1mL溶液(并增补1mL的释放介质)，通过紫外分光光度计测定取出的1mL溶液在480nm处的吸光度，按照公式：A＝0.0184C+0.0216(A为吸光度，C为阿霉素浓度)计算阿霉素含量，实验设3次重复，结果取平均值。计算3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h的累计药物释放量(％)并绘制出药物释放曲线。累计药物释放量(％)＝释放的药物重量/包封的药物总重量。按照同样的方法对天然人血清白蛋白载药纳米胶束进行药物释放实验并绘制出药物释放曲线。

结果如图5所示，相比较于天然人血清白蛋白载药纳米胶束的药物释放速率，HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白载药纳米胶束的药物累计释放量在150h后才达到90％以上，而天然人血清白蛋白载药纳米胶束在90小时左右的药物累计释放量就达到了90％。因此，HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白纳米胶束具有显著的药物缓释效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆大学

<120> 具自组装性能的白蛋白HSA-Hydrophobic-IB及其应用

<130> P2130895-CQD-CQ-TXH

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 610

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的氨基酸序列

<400> 1

Met Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

1 5 10 15

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu

20 25 30

Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr

35 40 45

Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp

50 55 60

Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr

65 70 75 80

Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu

85 90 95

Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn

100 105 110

Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Val Ala Phe

115 120 125

His Asp Asn Glu Glu Val Phe Leu Lys Lys Phe Leu Phe Glu Ile Ala

130 135 140

Arg Arg His Pro Tyr Phe Phe Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys

145 150 155 160

Arg Phe Lys Ala Ala Phe Val Glu Cys Cys Leu Ala Ala Asp Lys Ala

165 170 175

Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala

180 185 190

Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly

195 200 205

Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe

210 215 220

Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr

225 230 235 240

Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

245 250 255

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile

260 265 270

Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser

275 280 285

His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro

290 295 300

Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr

305 310 315 320

Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala

325 330 335

Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys

340 345 350

Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His

355 360 365

Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu

370 375 380

Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly

385 390 395 400

Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val

405 410 415

Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly

420 425 430

Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro

435 440 445

Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu

450 455 460

His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu

465 470 475 480

Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

485 490 495

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala

500 505 510

Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr

515 520 525

Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln

530 535 540

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys

545 550 555 560

Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu

565 570 575

Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu His His His His His His

580 585 590

His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe

595 600 605

Glu Lys

610

<210> 2

<211> 1833

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的基因序列

<400> 2

atggatgcgc acaaatctga agtggcgcac cgtttcaaag atctgggcga agaaaacttc 60

aaagcgctgg ttctgattgc gttcgcccag tacctgcagc agtgcccgtt cgaagatcac 120

gttaaactgg ttaacgaagt taccgaattc gcaaaaacct gtgttgcgga tgaaagcgcg 180

gaaaactgcg ataaatccct gcacaccctg tttggcgata aactgtgcac cgttgcgacc 240

ctgcgtgaaa cttacggtga aatggccgac tgttgcgcga aacaggaacc ggaacgtaac 300

gaatgcttcc tgcagcataa agatgacaac ccgaacctgc cgcgtctggt tcgcccagaa 360

gtggatgtta tgtgtgttgc gttccacgac aacgaagaag tgttcctgaa aaaattcctg 420

ttcgaaatcg ctcgccgcca cccgtacttc tttgcgccgg aactgctgtt cttcgcaaaa 480

cgtttcaaag ctgcgttcgt tgaatgctgc ctggcagctg ataaagctgc ttgcctgctg 540

ccgaaactgg acgaactgcg tgatgaaggc aaagcgtcct ctgcgaaaca gcgtctgaaa 600

tgcgcatccc tgcagaaatt cggtgaacgc gcattcaaag catgggcagt tgcgcgtctg 660

tctcagcgct tcccgaaagc ggaattcgct gaagtttcca aactggttac ggatctgact 720

aaagtacata ccgaatgttg ccacggtgat ctgctggagt gcgcggatga tcgtgctgac 780

ctggcaaaat acatctgtga aaaccaggat tccatttcta gcaaactgaa agaatgctgc 840

gaaaaaccgc tgctggaaaa atcccactgt atcgccgaag ttgaaaacga cgaaatgccg 900

gcggatctgc catctctggc ggcggacttc gttgaaagca aagacgtttg caaaaactac 960

gcggaagcca aagacgtttt cctgggtatg ttcctgtacg aatatgcgcg ccgtcacccg 1020

gactacagcg ttgttctgct gctgcgtctg gcgaaaacct atgaaaccac cctggaaaaa 1080

tgttgcgcgg cggccgatcc gcacgaatgc tacgcaaaag ttttcgatga attcaaaccg 1140

ctggttgaag aaccgcagaa cctgattaaa cagaactgtg aactgtttga acagctgggc 1200

gaatacaaat tccagaatgc tctgctggtg cgttacacca aaaaagtgcc gcaggtaagc 1260

accccgaccc tggttgaagt gtcccgtaac ctgggcaaag ttggtagcaa atgctgcaaa 1320

cacccggaag cgaaacgtat gccgtgcgcg gaagattatc tgtctgtggt gctgaaccag 1380

ctgtgcgtgc tgcacgaaaa aaccccggtt agcgaccgtg tcaccaaatg ctgtaccgaa 1440

agcctggtta accgtcgtcc gtgcttcagc gcgctggaag tggatgaaac ctacgtgccg 1500

aaagaattca acgcggaaac tttcaccttc cacgcagaca tctgcaccct gtctgaaaaa 1560

gaacgccaga tcaaaaaaca gaccgctctg gttgaactgg ttaaacacaa accgaaagca 1620

accaaagaac agctgaaagc agttatggat gatttcgcag cgttcgttga aaaatgctgc 1680

aaagctgatg ataaagaaac ctgctttgcg gaagaaggta aaaaactggt tgctgcttct 1740

caggcggcgc tgggcctgca ccatcaccac catcaccacc accaccacgg cggtagcggc 1800

ggtagctggt ctcacccgca gtttgaaaaa taa 1833

<210> 3

<211> 1842

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 带酶切位点的HSA-Hydrophobic-IB新型白蛋白的基因序列

<400> 3

catatggatg cgcacaaatc tgaagtggcg caccgtttca aagatctggg cgaagaaaac 60

ttcaaagcgc tggttctgat tgcgttcgcc cagtacctgc agcagtgccc gttcgaagat 120

cacgttaaac tggttaacga agttaccgaa ttcgcaaaaa cctgtgttgc ggatgaaagc 180

gcggaaaact gcgataaatc cctgcacacc ctgtttggcg ataaactgtg caccgttgcg 240

accctgcgtg aaacttacgg tgaaatggcc gactgttgcg cgaaacagga accggaacgt 300

aacgaatgct tcctgcagca taaagatgac aacccgaacc tgccgcgtct ggttcgccca 360

gaagtggatg ttatgtgtgt tgcgttccac gacaacgaag aagtgttcct gaaaaaattc 420

ctgttcgaaa tcgctcgccg ccacccgtac ttctttgcgc cggaactgct gttcttcgca 480

aaacgtttca aagctgcgtt cgttgaatgc tgcctggcag ctgataaagc tgcttgcctg 540

ctgccgaaac tggacgaact gcgtgatgaa ggcaaagcgt cctctgcgaa acagcgtctg 600

aaatgcgcat ccctgcagaa attcggtgaa cgcgcattca aagcatgggc agttgcgcgt 660

ctgtctcagc gcttcccgaa agcggaattc gctgaagttt ccaaactggt tacggatctg 720

actaaagtac ataccgaatg ttgccacggt gatctgctgg agtgcgcgga tgatcgtgct 780

gacctggcaa aatacatctg tgaaaaccag gattccattt ctagcaaact gaaagaatgc 840

tgcgaaaaac cgctgctgga aaaatcccac tgtatcgccg aagttgaaaa cgacgaaatg 900

ccggcggatc tgccatctct ggcggcggac ttcgttgaaa gcaaagacgt ttgcaaaaac 960

tacgcggaag ccaaagacgt tttcctgggt atgttcctgt acgaatatgc gcgccgtcac 1020

ccggactaca gcgttgttct gctgctgcgt ctggcgaaaa cctatgaaac caccctggaa 1080

aaatgttgcg cggcggccga tccgcacgaa tgctacgcaa aagttttcga tgaattcaaa 1140

ccgctggttg aagaaccgca gaacctgatt aaacagaact gtgaactgtt tgaacagctg 1200

ggcgaataca aattccagaa tgctctgctg gtgcgttaca ccaaaaaagt gccgcaggta 1260

agcaccccga ccctggttga agtgtcccgt aacctgggca aagttggtag caaatgctgc 1320

aaacacccgg aagcgaaacg tatgccgtgc gcggaagatt atctgtctgt ggtgctgaac 1380

cagctgtgcg tgctgcacga aaaaaccccg gttagcgacc gtgtcaccaa atgctgtacc 1440

gaaagcctgg ttaaccgtcg tccgtgcttc agcgcgctgg aagtggatga aacctacgtg 1500

ccgaaagaat tcaacgcgga aactttcacc ttccacgcag acatctgcac cctgtctgaa 1560

aaagaacgcc agatcaaaaa acagaccgct ctggttgaac tggttaaaca caaaccgaaa 1620

gcaaccaaag aacagctgaa agcagttatg gatgatttcg cagcgttcgt tgaaaaatgc 1680

tgcaaagctg atgataaaga aacctgcttt gcggaagaag gtaaaaaact ggttgctgct 1740

tctcaggcgg cgctgggcct gcaccatcac caccatcacc accaccacca cggcggtagc 1800

ggcggtagct ggtctcaccc gcagtttgaa aaataactcg ag 1842

<210> 4

<211> 591

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 天然人血清白蛋白的氨基酸序列

<400> 4

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

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325 330 335

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340 345 350

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Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

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Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

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Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

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Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

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Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu His His His His His His

580 585 590

<210> 5

<211> 1788

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 带酶切位点的天然人血清白蛋白的基因序列

<400> 5

catatggatg cgcataaatc tgaagttgcg caccgtttca aagatctggg tgaagaaaac 60

ttcaaagcgc tggttctgat cgcgttcgcg cagtatctgc agcagtgccc gttcgaagat 120

cacgttaaac tggttaacga agttaccgaa ttcgcgaaaa cctgtgtggc agatgaatct 180

gctgaaaact gtgataaaag cctgcacacc ctgttcggtg ataaactgtg caccgttgct 240

accctgcgtg aaacctacgg tgaaatggct gattgctgtg cgaaacagga accggaacgt 300

aacgaatgct tcctgcagca caaagatgat aacccgaacc tgccgcgtct ggttcgtccg 360

gaagttgacg ttatgtgcac cgcattccac gataacgaag aaaccttcct gaaaaaatac 420

ctgtacgaaa ttgcgcgtcg tcacccgtac ttctacgctc cggaactgct gttcttcgct 480

aaacgttata aagcggcatt caccgaatgc tgccaggcgg cagataaagc agcttgcctg 540

ctgccgaaac tggatgaact gcgtgatgaa ggtaaagcga gcagcgcgaa acagcgtctg 600

aaatgcgcga gcctgcagaa attcggcgaa cgtgctttca aagcttgggc agttgctcgt 660

ctgagccagc gtttcccgaa agcggaattc gcggaagtgt ctaaactggt taccgatctg 720

accaaagttc acaccgaatg ctgccacggt gatctgctgg aatgcgcgga tgaccgtgca 780

gatctggcga aatacatctg tgaaaaccag gattctatca gctctaaact gaaagaatgc 840

tgcgaaaaac cgctgctgga aaaatctcac tgcatcgctg aagttgaaaa cgatgaaatg 900

ccggcggatc tgccgagcct ggctgcggat ttcgttgaaa gcaaagatgt ttgcaaaaac 960

tacgcggaag cgaaagatgt tttcctgggc atgttcctgt acgaatacgc gcgtcgtcat 1020

ccggattact ctgttgttct gctgctgcgc ctggcgaaaa cctatgaaac caccctggaa 1080

aaatgctgtg ctgctgcaga tccgcatgaa tgttacgcaa aagttttcga tgaattcaaa 1140

ccgctggtcg aagaaccgca gaacctgatc aaacagaact gcgaactgtt cgaacagctg 1200

ggcgaatata aattccagaa cgcgctgctg gttcgttata ccaaaaaagt gccgcaggtt 1260

agcaccccga ccctggtgga agtgagccgt aacctgggta aagttggttc taaatgctgc 1320

aaacacccgg aagctaaacg tatgccgtgc gcggaagatt acctgagcgt tgttctgaac 1380

cagctgtgtg ttctgcacga aaaaaccccg gttagcgatc gtgttaccaa atgctgcacc 1440

gaaagcctgg ttaaccgtcg tccgtgcttc tctgcgctgg aagttgatga aacctacgtt 1500

ccgaaagaat tcaacgcgga aaccttcacc ttccatgcgg atatttgcac cctgtccgaa 1560

aaagaacgtc agatcaaaaa acagaccgcg ctggttgaac tggttaaaca caaaccgaaa 1620

gcaaccaaag aacagctgaa agcggttatg gatgatttcg ctgcgttcgt tgaaaaatgc 1680

tgcaaagcag atgataaaga aacctgcttc gctgaagaag gtaaaaaact ggttgcggca 1740

tctcaggcgg cgctgggcct gcaccaccat caccatcact aactcgag 1788

Claims

1.一种白蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的白蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的表达盒、载体或重组菌。

5.权利要求1所述的白蛋白在制备用于疏水性药物递送的纳米胶束中的用途。

6.一种用于疏水性药物递送的纳米胶束，其包含权利要求1所述的白蛋白。

7.根据权利要求6所述的纳米胶束，其特征在于，还包含可用于肿瘤组织的显影或诊断的制剂。

8.根据权利要求6所述的纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束的药物剂型为注射剂。

9.一种白蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的编码基因插入表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体导入表达宿主菌中，获得重组菌；培养重组菌，诱导蛋白表达，收集菌体，提取和纯化蛋白。

10.一种用于疏水性药物递送的纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取权利要求1所述的白蛋白，溶解于去离子水中，配制成浓度为5-10mg/mL的白蛋白水溶液；冰浴条件下，将等体积的所述白蛋白水溶液以0.4-0.6mL/min的速率滴注到pH7.2-7.4的含疏水性药物的PBS溶液中，滴注过程中进行超声分散，滴注完毕后停止超声分散，得到纳米胶束。