CN113304122B - 一种Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统及其制备与应用 - Google Patents

一种Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Ts抗菌肽‑TPGS修饰复合纳米递药系统，以生物相容性材料磷酸钙纳米粒为纳米载体，以Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯为稳定剂，包封替加环素制得，各原料质量百分比如下：Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯10％～25％，磷酸钙65％～85％，替加环素3％～20％。本发明复合纳米递药系统可通过Ts抗菌肽与肺炎克雷伯菌细菌外膜上脂多糖的特异性结合，实现药物向细菌的靶向递送，通过聚乙二醇维生素E琥珀酸酯对外排泵的抑制作用以减少药物外排，从而显著提高细菌内替加环素药物浓度，提高替加环素抗菌效果；同时，可通过Ts抗菌肽与替加环素的联合抗菌作用，进一步提高替加环素的抗感染效果。

Description

一种Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统及其制备与应用，属于药物制剂技术领域。
(二)背景技术
肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，是院内三大条件致病菌之一，可引起免疫力低下患者的多部位感染，包括肺炎、肝脓肿、泌尿道感染、脑膜炎以及败血症等。肺炎克雷伯菌易出现多重耐药。碳青霉烯类抗菌药物曾是治疗多重耐药肺炎克雷伯菌感染的王牌药物，然而近年来随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，中国乃至全球碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌比例不断上升。全国细菌耐药监测网分析报告显示2020年肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率为～20％，现有针对多重耐药尤其是碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌感染的可选药物有限。
替加环素(tigecycline，TIG)是首个应用于临床的新一代甘氨酰环类抗菌药物，但随着临床应用的增加，多重耐药肺炎克雷伯菌对替加环素敏感性逐渐降低，耐药率增加。替加环素耐药肺炎克雷伯菌几乎对其他抗菌药物均表现为耐药，后续可选药物微乎其微。近年来，相比细菌耐药性的迅速增加，抗菌药物研发速度相对滞后。因此，寻找有效手段用以克服肺炎克雷伯菌替加环素耐药具有重要的价值和意义。
外排泵基因高表达是多重耐药肺炎克雷伯菌替加环素耐药的重要机制。高表达的外排泵使细菌内药物浓度降低，从而使细菌对其敏感性降低，因此改变传统的药物递送方式，增加药物在细菌内的分布，是克服细菌耐药和提高药物抗感染疗效的有效途径。纳米递药系统的出现为药物递送方式带来了新的技术革命，它通过尺寸效应和提高生物膜的通透性改变药物的体内分布，可显著提高药物疗效及用药安全系数。因此，选择安全的材料构建抗菌药物纳米递送系统，将抗菌药物靶向递送至细菌内部，并抑制外排泵活性是提高细菌内药物浓度和克服细菌耐药的有效手段。
聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)是一种安全、优良的非离子型表面活性剂，具有两亲性，可作为P-糖蛋白(P-gp)抑制剂应用于克服肿瘤细胞多药耐药性。TPGS由维生素E琥珀酸酯与聚乙二醇1000的酯化反应形成，其中聚乙二醇1000结构可延长所修饰给药系统的体内循环时间并延长药物半衰期；TPGS中维生素E的生育酚结构，可破坏细菌膜结构、增加膜结构渗透性并抑制耐药细菌中的外排泵活性。
Ts抗菌肽(序列：GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRM)是一种阳离子多肽，可通过与革兰氏阴性细菌外膜的主要成分脂多糖(LPS)的结合和相互作用，实现对革兰氏阴性菌的特异性识别；同时，Ts可通过与LPS的结合插入细菌外膜，使细菌外膜通透性增强，以膜依赖性的方式杀死细菌，因此Ts具有选择性抗微生物活性，对多重耐药大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等许多革兰氏阴性细菌具有较好的抗菌活性。
(三)发明内容
本发明目的是一种抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌的Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统及其制备与应用。
本发明采用的技术方案是：
一种Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统，以生物相容性材料磷酸钙纳米粒为纳米载体，以Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯为稳定剂，包封替加环素制得，纳米递药系统中各原料质量百分比如下：Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯10％～25％，磷酸钙65％～85％，替加环素3％～20％。
本发明构建的纳米递药系统应用于抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌感染的治疗，可通过TPGS对外排泵的抑制作用和Ts抗菌肽与细菌外膜LPS的结合，实现药物的靶向递送，并减少药物外排，从而提高细菌内药物浓度，克服肺炎克雷伯菌的替加环素耐药性。
优选的，所述Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯中Ts抗菌肽与聚乙二醇维生素E琥珀酸酯物质的量之比为0.1～1:1。
本发明还涉及制备所述Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统方法，所述方法包括：
(1)Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯嫁接物的合成：称取Ts抗菌肽，加入无水二甲亚砜并超声溶解，冰浴搅拌下，加入(Boc)2O，5～10min后转至室温下继续避光搅拌12h；称取N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，加入反应体系，在50～60℃下搅拌0.5～2h以活化羧基，然后加入到已预热至50～60℃的TPGS无水二甲亚砜溶液中，于200～400rpm下继续反应18～24h；反应结束后，除去Boc保护基，分离纯化得到Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯；所述分离纯化方法可如下：将最终反应产物转移至透析袋(MWCO 1.0kDa)，采用去离子水透析48h，收集透析袋内液体，5000rpm离心20min后，取上清液，经冷冻干燥可得Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯；
(2)Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒的制备：取氯化钙溶液、Ts-TPGS溶液、去离子水，混合均匀后，缓慢滴入磷酸盐水溶液和柠檬酸钠水溶液，采用氢氧化钠将反应液pH调整至7.5～8.0，90～100℃下搅拌反应3～4h后，透析、冷冻干燥得Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒；
(3)Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统的制备：配制替加环素水溶液，缓慢滴入Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒溶液中，室温下继续避光搅拌2～3h后，透析除去未被包封的替加环素，收集透析袋内液体，离心收集上清液，冷冻干燥得所述Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统。
优选的，步骤(1)中Ts抗菌肽与聚乙二醇维生素E琥珀酸酯物质的量之比为0.1～1：1。
优选的，步骤(1)中Ts抗菌肽：N,N'-二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶物质的量之比为1：3～5：0.3～0.5。
优选的，步骤(3)中替加环素与Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒的质量之比为0.05～0.3：1。
本发明还涉及所述Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统在制备抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌的药物中的应用。外排泵基因高表达是多重耐药肺炎克雷伯菌替加环素耐药的重要机制，TPGS可抑制耐药细菌中的外排泵活性，Ts抗菌肽可通过与LPS的结合特异性识别革兰阴性菌，并具有抗菌活性。基于此，本发明以生物相容性材料磷酸钙纳米粒为纳米载体，以Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(Ts-TPGS)为稳定剂，包封替加环素制得复合纳米递药系统，通过药物向细菌的靶向递送和减少外排提高细菌内药物浓度，克服多重耐药肺炎克雷伯菌的替加环素耐药性。
本发明的有益效果主要体现在：本发明复合纳米递药系统可通过Ts抗菌肽与肺炎克雷伯菌细菌外膜上脂多糖的特异性结合，实现药物向细菌的靶向递送，通过聚乙二醇维生素E琥珀酸酯对外排泵的抑制作用以减少药物外排，从而显著提高细菌内替加环素药物浓度，提高替加环素抗菌效果；同时，可通过Ts抗菌肽与替加环素的联合抗菌作用，进一步提高替加环素的抗感染效果，克服肺炎克雷伯菌的替加环素耐药性。
(四)附图说明
图1为Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统的透射电镜观察图；
图2为Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统对替加环素耐药肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度；
图3为替加环素耐药肺炎克雷伯菌与Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统共孵育后的扫描电镜图；
图4为Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统与替加环素耐药肺炎克雷伯菌共孵育后的细菌内替加环素药物浓度；
图5为替加环素耐药肺炎克雷伯菌肺部感染小鼠经Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统治疗后的生存率；
图6为替加环素耐药肺炎克雷伯菌肺部感染小鼠经Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统治疗后肺泡灌洗液的菌落培养。
(五)具体实施方式
下面通过下列具体实施方式对本发明的内容做进一步说明，但本发明的保护范围，不限于此：
实施例1：Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的制备
Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的制备分两步进行，第一步合成Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯嫁接物：
称取Ts抗菌肽(序列：GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRM)(南京莱昂生物科技有限公司)100mg(41mmol)，加入5mL无水二甲亚砜并超声溶解，冰浴搅拌下，加入(Boc)2O(Ts：(Boc)2O)＝1:1.3，mol：mol)，十分钟后转至室温下继续避光搅拌12h。称取N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶(Ts：N,N'-二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶＝1：3：0.3，mol：mol：mol)，加入反应体系，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入到10mL已60℃预热的100mgTPGS(66mmol)(Ts：TPGS＝0.62：1，mol：mol)无水二甲亚砜溶液中，于400rpm下继续反应24h。反应结束后，向反应体系中加入适量去离子水，得到的混悬液于3000rpm下离心10min后，取上清液加酸调节溶液pH至2.0，除去Boc保护基。将最终反应产物转移至透析袋(MWCO1.0kDa)，采用去离子水透析48h，收集透析袋内液体，5000rpm离心20min后，取上清液，经冷冻干燥可得Ts抗菌肽修饰聚乙二醇维生素E琥珀酸酯。
采用核磁共振氢谱对Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯的结构进行确证。经计算，Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯中Ts抗菌肽与聚乙二醇维生素E琥珀酸酯的摩尔比为0.33:1。
第二步制备Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统：
取50mM氯化钙溶液1mL、5mg/mL Ts-TPGS溶液1mL、去离子水2mL，混合均匀后，缓慢滴入30mM磷酸盐水溶液1mL和0.1g/mL柠檬酸钠水溶液0.1mL，采用氢氧化钠将反应液pH调整至8.0。100℃下搅拌反应4h后，转移至透析袋(MWCO 3.5kDa)中，去离子水透析24h，冷冻干燥得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒。
配制1mg/mL替加环素水溶液，取0.5mL缓慢滴入5mL Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒溶液(2mg/mL)中，室温下继续避光搅拌2h后，转移至透析袋(MWCO3.5kDa)中，去离子水透析6h以除去未被包封的替加环素，收集透析袋内液体，5000rpm离心15min，收集上清液，冷冻干燥得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统。
采用紫外分光光度法测定替加环素的含量。经测定，Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统中替加环素含量为3.95％。
采用透射电子显微镜对Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统进行表观形貌观察。透射电子显微镜结果显示，纳米递药系统形态呈棒状，且粒径大小约为25nm。采用微粒粒度与表面电位测定仪测得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的粒径为25.5±3.2nm，电位为-10.56±1.08mV。
采用强酸降解磷酸钙纳米粒，结合药物含量测定，测得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统中Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯、磷酸钙和替加环素的质量含量分别为：24.01％、72.04％和3.95％。
实施例2：Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的制备
Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的制备分两步进行，第一步合成Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯嫁接物：
称取Ts抗菌肽40mg(16mmol)，加入5mL无水二甲亚砜并超声溶解，冰浴搅拌下，加入(Boc)2O(Ts：(Boc)2O)＝1:1.3，mol：mol)，十分钟后转至室温下继续避光搅拌12h。称取N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶(Ts：N,N'-二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶＝1：3：0.3，mol：mol：mol)，加入反应体系，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入到10mL已60℃预热的100mg TPGS(66mmol)(Ts：TPGS＝0.24：1，mol：mol)无水二甲亚砜溶液中，于400rpm下继续反应24h。反应结束后，向反应体系中加入适量去离子水，得到的混悬液于3000rpm下离心10min后，取上清液加酸调节溶液pH至2.0，除去Boc保护基。将最终反应产物转移至透析袋(MWCO 1.0kDa)，采用去离子水透析48h，收集透析袋内液体，5000rpm离心20min后，取上清液，经冷冻干燥可得Ts抗菌肽修饰聚乙二醇维生素E琥珀酸酯。
采用核磁共振氢谱对Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯的结构进行确证。经计算，Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯中Ts抗菌肽与聚乙二醇维生素E琥珀酸酯的摩尔比为0.15:1。
第二步制备Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统：
取50mM氯化钙溶液1mL、5mg/mL Ts-TPGS溶液0.5mL、去离子水2mL，混合均匀后，缓慢滴入30mM磷酸盐水溶液1mL和0.1g/mL柠檬酸钠水溶液0.1mL，采用氢氧化钠将反应液pH调整至8.0。100℃下搅拌反应4h后，转移至透析袋(MWCO 3.5kDa)中，去离子水透析24h，冷冻干燥得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒。
配制1mg/mL替加环素水溶液，取3mL缓慢滴入5mL Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒溶液(2mg/mL)中，室温下继续避光搅拌2h后，转移至透析袋(MWCO3.5kDa)中，去离子水透析6h以除去未被包封的替加环素，收集透析袋内液体，5000rpm离心15min，收集上清液，冷冻干燥得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统。
采用紫外分光光度法测定替加环素的含量。经测定，Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统中替加环素含量为17.84％。
采用透射电子显微镜对Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统进行表观形貌观察。透射电子显微镜结果显示，纳米递药系统形态呈棒状，且粒径大小约为25nm。采用微粒粒度与表面电位测定仪测得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的粒径为26.5±2.9nm，电位为-8.19±0.98mV。
采用强酸降解磷酸钙纳米粒，结合药物含量测定，测得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统中Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯、磷酸钙和替加环素的质量含量分别为：12.36％、69.80％和17.84％。
实施例3：Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的制备
Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的制备分两步进行，第一步合成Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯嫁接物：
称取Ts抗菌肽40mg(16mmol)，加入5mL无水二甲亚砜并超声溶解，冰浴搅拌下，加入(Boc)2O(Ts：(Boc)2O)＝1:1.3，mol:mol)，十分钟后转至室温下继续避光搅拌12h。称取N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶(Ts：N,N'-二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶＝1：3：0.3，mol：mol：mol)，加入反应体系，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入到10mL已60℃预热的100mg TPGS(66mmol)(Ts：TPGS＝0.24：1，mol：mol)无水二甲亚砜溶液中，于400rpm下继续反应24h。反应结束后，向反应体系中加入适量去离子水，得到的混悬液于3000rpm下离心10min后，取上清液加酸调节溶液pH至2.0，除去Boc保护基。将最终反应产物转移至透析袋(MWCO 1.0kDa)，采用去离子水透析48h，收集透析袋内液体，5000rpm离心20min后，取上清液，经冷冻干燥可得Ts抗菌肽修饰聚乙二醇维生素E琥珀酸酯。
采用核磁共振氢谱对Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯的结构进行确证。经计算，Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯中Ts抗菌肽与聚乙二醇维生素E琥珀酸酯的摩尔比为0.15:1。
第二步制备Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统：
取50mM氯化钙溶液1mL、5mg/mL Ts-TPGS溶液0.5mL、去离子水2mL，混合均匀后，缓慢滴入30mM磷酸盐水溶液1mL和0.1g/mL柠檬酸钠水溶液0.1mL，采用氢氧化钠将反应液pH调整至8.0。100℃下搅拌反应4h后，转移至透析袋(MWCO 3.5kDa)中，去离子水透析24h，冷冻干燥得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒。
配制1mg/mL替加环素水溶液，取0.5mL缓慢滴入5mL Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒溶液(2mg/mL)中，室温下继续避光搅拌2h后，转移至透析袋(MWCO3.5kDa)中，去离子水透析6h以除去未被包封的替加环素，收集透析袋内液体，5000rpm离心15min，收集上清液，冷冻干燥得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统。
采用紫外分光光度法测定替加环素的含量。经测定，Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统中替加环素含量为3.54％。
采用透射电子显微镜对Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统进行表观形貌观察，结果见图1。透射电子显微镜结果显示，纳米递药系统形态呈棒状，且粒径大小约为25nm。采用微粒粒度与表面电位测定仪得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统的粒径为28.2±3.3nm，电位为-13.71±1.84mV。该实施例制备纳米递药系统在室温的稳定性优于实施例1和实施例2。基于此，后续选用实施例3构建的复合纳米递药系统研究其在抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌中的应用。
采用强酸降解磷酸钙纳米粒，结合药物含量测定，测得Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统中Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯、磷酸钙和替加环素的质量含量分别为：14.84％、81.62％和3.54％。
实施例4：Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰复合纳米递药系统在抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌中的应用
1.Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统体外抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌效果
按照实施例3的方法制备了Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统，以替加环素和聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统为对照，采用微量肉汤稀释法考察实施例3的抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌效果。具体步骤为：取无菌96孔板，第一列加入200μL替加环素浓度为128μg/mL的溶液，第二至第十列分别加入100μL MH肉汤培养基，从第一列吸取100μL加入第二列，混匀后再吸取100μL至第三列，依此类推，倍比稀释直至第九列，从第九列中吸取100μL溶液弃去，每孔加入100μL对数生长期的菌液，使每孔最终菌液浓度约为5×105CFU/mL，每孔中溶液总体积为200μL(第十一列加入200μL MH培养基作为对照)。将平板置于37℃恒温培养箱中继续孵育20h，观察每孔中溶液混悬或澄清，可使溶液依然保持澄清的最低药物浓度即为测定的样品对细菌的最低抑菌浓度(MIC)值。
经测定：替加环素、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素和Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统对替加环素耐药肺炎克雷伯菌的MIC值分别为4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL(图2所示)，证明Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统可克服肺炎克雷伯菌的替加环素耐药性。
按照实施例3的方法制备Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统，进一步采用扫描电子显微镜观察细菌表面形貌变化，考察实施例3的抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌效果。具体步骤为：将生理盐水、替加环素、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统和实施例3制备的纳米递药系统分别分散于对数生长期的替加环素耐药肺炎克雷伯菌悬液中，震荡培养(37℃，180rpm)4h后，离心(5,000rpm，10min)分离得到细菌沉淀，用生理盐水洗涤三次，采用2.5％戊二醛溶液固定细菌(4℃，24h)，细菌经PBS洗涤，锇酸固定，梯度乙醇溶液(30％、50％、70％、90％、95％和100％)室温脱水10min后，真空干燥。样品喷涂导电材料后，采用扫描电子显微镜对细菌形貌进行观察并拍照。
经观察：生理盐水组细菌表面形态完整，细菌与含替加环素制剂共孵育后，细菌结构被不同程度地破坏，其中实施例三组细菌表面形态呈现贯穿式的破坏和崩坏样细菌碎片，表明Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统的抗菌效果显著优于替加环素和未经Ts抗菌肽修饰纳米递药系统组(图3所示)。
2.Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统与替加环素耐药肺炎克雷伯菌共孵育后的细菌内替加环素药物浓度
按照实施例3的方法制备了Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统，以替加环素和聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统为对照，采用高效液相色谱-质谱仪(HPLC-MS/MS)测定Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统与替加环素耐药肺炎克雷伯菌共孵育后的细菌内替加环素药物浓度。具体步骤为：对数生长期的替加环素耐药肺炎克雷伯菌与Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统在37℃共同培养4h后，5000rpm离心5min得细菌沉淀。用生理盐水洗涤三次后，裂解液裂解细菌，8000rpm离心10min收集上清液，样品中加入甲醇沉淀蛋白，混合、静置后离心后取上清液进样分析，以替加环素-d9为内标，采用HPLC-MS/MS定量检测细菌内替加环素浓度。
经测定：Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统与替加环素耐药肺炎克雷伯菌共孵育2h和6h后，细菌内替加环素浓度分别为30.80±2.11ng/mL和53.14±6.89ng/mL，显著高于替加环素组的4.03±0.41ng/mL和9.22±0.67ng/mL，也显著高于聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素组的17.60±1.39ng/mL和40.93±2.52ng/mL，表明Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统可通过药物的靶向递送和减少外排显著提高细菌内药物浓度(图4所示)。
3.Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌肺部感染作用
按照实施例3的方法制备了Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统，以替加环素和聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统为对照，考察其抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌肺部感染作用。具体步骤为：37℃条件下，从平板上挑取替加环素耐药肺炎克雷伯菌在MH液体培养基中振荡过夜培养，第2天再接种至新鲜的培养基中，当细菌长至对数期时，离心收集细菌，用无菌PBS快速洗涤2次，然后悬浮细菌至1×109CFU/mL。雌性ICR小鼠经麻醉后，取仰卧位固定，通过微量注射器向气管内注入50μL替加环素耐药菌株接种后将小鼠保持直立1min以促进滴注溶液的肺内分布。造模6h后，实施例3经尾静脉给药，观察模型小鼠在5d内的生存率。
另取给药48h后的小鼠，颈椎脱臼法处死后，剪开小鼠颈部皮肤并暴露气管。将去掉针尖的注射器针头插入小鼠气管，采用手术缝合线结扎固定针头与气管。注射器吸取ImL冰浴PBS，缓慢推进小鼠肺组织，随后缓慢抽回，反复冲洗5次后收集肺泡灌洗液，1000rpm离心10min，用无菌PBS将上清进行梯度稀释后，采用涂布平板法考察实施例三的体内抗菌活性。
经测定：替加环素耐药肺炎克雷伯菌肺部感染模型小鼠未经治疗时，5d的生存率为33.3％，替加环素和聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素治疗可将生存率分别提高至50％和75％，而经Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统治疗后，5d内的生存率为100％(图5所示)，且肺泡灌洗液中的菌落显著低于其他治疗组(图6所示)，证明实施例三构建的纳米递药系统体内抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌肺部感染作用显著优于其他治疗组。
以上对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，具体实施方式不同可能会对该复合纳米递药系统的稳定性、药物释放特性、体内外抗菌效果产生影响，而这些改变也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统，以生物相容性材料磷酸钙纳米粒为纳米载体，以Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯为稳定剂，包封替加环素制得，各原料质量百分比如下：Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯10%~25%，磷酸钙65%~85%，替加环素3%~20%；
所述Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统按如下方法制备获得：
（1）Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯嫁接物的合成：称取Ts抗菌肽，加入无水二甲亚砜并超声溶解，冰浴搅拌下，加入(Boc)2O，5~10min后转至室温下继续避光搅拌12h；称取N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入反应体系，在50~60 ºC下搅拌0.5~2h以活化羧基，然后加入到已预热至50~60 ℃的TPGS无水二甲亚砜溶液中，于200~400 rpm下继续反应18~24 h；反应结束后，除去Boc保护基，分离纯化得到Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯；
（2）Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒的制备：取氯化钙溶液、Ts抗菌肽-TPGS溶液、去离子水，混合均匀后，缓慢滴入磷酸盐水溶液和柠檬酸钠水溶液，采用氢氧化钠将反应液pH调整至7.5~8.0，90~100 ℃下搅拌反应3~4 h后，透析、冷冻干燥得Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒；
（3）Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统的制备：配制替加环素水溶液，缓慢滴入Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒溶液中，室温下继续避光搅拌2~3 h后，透析除去未被包封的替加环素，收集透析袋内液体，离心收集上清液，冷冻干燥得所述Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统。
2.如权利要求1所述的Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统，其特征在于Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯中Ts抗菌肽与聚乙二醇维生素E琥珀酸酯物质的量之比为0.1~1:1。
3.制备权利要求1 所述Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统方法，所述方法包括：
（1）Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯嫁接物的合成：称取Ts抗菌肽，加入无水二甲亚砜并超声溶解，冰浴搅拌下，加入(Boc)2O，5~10min后转至室温下继续避光搅拌12h；称取N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入反应体系，在50~60 ºC下搅拌0.5~2h以活化羧基，然后加入到已预热至50~60 ℃的TPGS无水二甲亚砜溶液中，于200~400 rpm下继续反应18~24 h；反应结束后，除去Boc保护基，分离纯化得到Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯；
（2）Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒的制备：取氯化钙溶液、Ts抗菌肽-TPGS溶液、去离子水，混合均匀后，缓慢滴入磷酸盐水溶液和柠檬酸钠水溶液，采用氢氧化钠将反应液pH调整至7.5~8.0，90~100 ℃下搅拌反应3~4 h后，透析、冷冻干燥得Ts抗菌肽修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒；
（3）Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙/替加环素纳米递药系统的制备：配制替加环素水溶液，缓慢滴入Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒溶液中，室温下继续避光搅拌2~3 h后，透析除去未被包封的替加环素，收集透析袋内液体，离心收集上清液，冷冻干燥得所述Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（1）中Ts抗菌肽与聚乙二醇维生素E琥珀酸酯物质的量之比为0.1~1：1。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（1）中Ts抗菌肽：N,N'-二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶物质的量之比为 1：3~5：0.3~0.5。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（3）中替加环素与Ts抗菌肽-聚乙二醇维生素E琥珀酸酯/磷酸钙纳米粒的质量之比为0.05~0.3：1。
7.权利要求1所述Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统在制备抗替加环素耐药肺炎克雷伯菌的药物中的应用。
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