CN114288405A

CN114288405A - PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在制备抗菌材料上的应用

Info

Publication number: CN114288405A
Application number: CN202111366564.3A
Authority: CN
Inventors: 石长灿; 潘璐琪; 姜大伟; 孟智臻; 潘玲玲; 季志孝; 李徐坚; 杨啸
Original assignee: Wenzhou Research Institute Of Guoke Wenzhou Institute Of Biomaterials And Engineering
Current assignee: Wenzhou Research Institute Of Guoke Wenzhou Institute Of Biomaterials And Engineering
Priority date: 2021-11-18
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2041-11-18
Also published as: CN114288405B

Abstract

PEG‑b‑PAA‑g‑SNO@IR780 NPs纳米粒子在制备抗菌剂或抗菌材料上的应用，其在一定浓度条件下，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有显著的杀菌效果，其在808 nm激光照射下，通过引入NO产生大量过氧亚硝酸盐，可明显提高对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的杀菌效果，且PSNO@IR780 NPs超高效生成高剂量过氧亚硝酸盐对MRSA或其他耐多药菌仍具有良好的杀菌效果，其还是一种既能杀灭耐药菌又能有效破坏生物膜的新型抗菌制剂，且具有低的细胞毒性和良好的血液相容性。

Description

PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在制备抗菌材料上的应用

技术领域

本发明涉及抗菌材料技术领域，具体涉及PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在制备抗菌材料上的应用。

背景技术

过氧亚硝酸盐是一种短寿命的内源性物质。其在炎症反应、癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等生理和病理过程中，起着至关重要的作用。由于超强的氧化和硝化活性（高于一氧化氮、单线态氧、羟基自由基等），生物体中过表达的过氧亚硝酸盐对蛋白质、核酸、脂质体等生物分子进行着不可逆的破坏。近年来，少量的开创性科研工作表明，外源性释放ONOO^—的纳米材料在抗肿瘤治疗和抗菌治疗中均展示出良好的治疗效果。然而，简便、高效、可控释放过氧亚硝酸盐十分困难。

发明内容

为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在制备抗菌剂或抗菌材料上的应用。

本发明采用的技术解决方案是：PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在制备抗菌剂或抗菌材料上的应用。

所述的抗菌剂或抗菌材料为针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抗菌剂或抗菌材料。

所述的抗菌剂或抗菌材料的杀菌条件为在808 nm，1 W/cm2的激光照射下。

所述的的抗菌剂或抗菌材料中IR780光敏剂溶度为2μg/mL以上。

针对金黄色葡萄球菌时所述的抗菌剂或抗菌材料中IR780光敏剂溶度为2μg/mL以上。

针对大肠杆菌时所述的抗菌剂或抗菌材料中IR780光敏剂溶度为5μg/mL以上。

所述的纳米粒子为PEG-b-PAA-g-SNO聚合物侧链上负载一氧化氮释放基元，共组装IR780光敏剂获得的PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子。

所述的纳米粒子侧链上负载一氧化氮释放基元为巯基通过亚硝化得到。

一种PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

（1）将5-10 g聚乙二醇单甲醚溶解于50-100 mL的无水二氯甲烷中，并加入202-400 mg的三乙胺,在冰浴条件下，向混合液中缓慢滴加460-900 mg的溴代异丁酰溴,在快速搅拌下，反应24-48小时,将反应液，用饱和食盐水水洗，二氯甲烷多次萃取，并用正己烷多次沉淀，抽滤，真空干燥，得PEG-Br样品；

（2）取PEG-Br样品2-8 g溶解于10-50 mL的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）中，并加入丙烯酸叔丁酯2.5-10 g、五甲基二乙烯三胺（PMDETA）135-550 mg，以及在氮气保护下，加入溴化亚铜112-450 mg,在快速搅拌下，于65℃的油浴中加热24-48小时,过中性氧化铝柱子，除去反应液中的金属铜，随后，用超纯水透析24-48小时，并冻干都到PEG-b-PtBA样品;

（3）取PEG-b-PtBA样品2-6 g溶解于30-50 mL的二氯甲烷中，并加入三氟乙酸5-15mL,随后，在快速搅拌下，反应24-48小时,旋转除去大部分溶剂，后用冰乙醚沉淀三次，得到PEG-b-PAA样品;

（4）取PEG-b-PAA样品0.5-2 g溶解于10-20 mL的DMF中，并取0.836-3.35 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于5-15 mL的超纯水中，且将所得水溶液加入DMF的溶液中，向上述混合液中继续加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 150-600 mg,常温搅拌2小时后，向反应液中继续加入0.335-1 g的半胱胺,室温下反应24-48小时后，向反应液中继续加入2-4 mL亚硝酸叔丁酯,继续反应2-12小时后，将反应液分别用冰甲醇和乙醚、冰乙醚沉淀2次，获得红色PEG-b-PAA-g-SNO样品;

（5）采用共组装的方法制备PEG-b-PAA-g-SNO@IR780纳米粒子:取20-200 mg PEG-b-PAA-g-SNO样品和2-20 mg的IR780光敏剂，于2-10 mL的四氢呋喃中溶解,将混合液在避光条件下，用冰水多次透析，得PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子。

所述的步骤（1）中聚乙二醇单甲醚的Mn = 5000。

所述的步骤（4）中冰甲醇和乙醚的v/v=1:4。

所述的步骤（5）中透析所用的透析袋的截留分子量为3500。

本发明的有益效果是：本发明提供了PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在制备抗菌剂或抗菌材料上的应用，其在一定浓度条件下，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有显著的杀菌效果，其在808 nm激光照射下，通过引入NO产生大量过氧亚硝酸盐，可明显提高对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的杀菌效果，且PSNO@IR780 NPs超高效生成高剂量过氧亚硝酸盐对MRSA或其他耐多药菌仍具有良好的杀菌效果，其还是一种既能杀灭耐药菌又能有效破坏生物膜的新型抗菌制剂，且具有低的细胞毒性和良好的血液相容性。

附图说明

图1为CFU计数法测定PSNO@IR780 NPs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外有效抗菌浓度图，其在图1A为对大肠杆菌，其在图1B为对金黄色葡萄球菌。

图2为采用CFU计数法测定不同材料对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性图。

图3为采用CFU计数法测定不同材料对大肠杆菌的体外抗菌活性图。

图4为用细菌死活染色液染色处理后的大肠杆菌图。

图5为用细菌死活染色液染色处理后的金黄色葡萄球菌图。

图6为用扫描电镜（SEM）观察大肠杆菌的形态和膜完整性图

图7为用扫描电镜（SEM）观察金黄色葡萄球菌的形态和膜完整性图。

图8为PSNO@IR780 NPs对革兰氏阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的杀菌活性图。

图9为不同材料对细菌生物膜破坏作用图。

图10为不同材料对ONPG的水解效果图。

图11为用细菌死活染色液处理细菌在激光共聚焦显微镜下拍摄生物膜上菌的存活情况图。

图12为用扫描电镜（SEM）观察MRSA生物膜完整性图。

图13为不同材料体内对MRSA的抗菌效果图。

图14为对处理后的创面组织进行H&E染色图。

图15为对处理后的创面组织进行Giemsa染色图。

图16为采用MTT法测定PSNO@IR780 NPs的细胞毒性图。

图17为PSNO@IR780 NPs的血液相容性研究图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

分组情况：

材料	光照组（Light）	不光照组（Dark）
			PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs	PSNO@IR780NPs+L	PSNO@IR780NPs+D
PEG-b-PCL@IR780 NPs	PEC@IR780 NPs+L	PEC@IR780 NPs+D
			PEG-b-PAA-g-SNO NPs	PSNO NPs+L	PSNO NPs+D
PBS	PBS+L	PBS+D

从单菌落中挑选金黄色葡萄球菌(S. aureus，革兰氏阳性菌)、大肠杆菌(E. coli，革兰氏阴性菌)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，将其转移到LB培养基(5 mL)中，37℃，200 rpm孵育一夜。取OD600为1.0的新鲜菌液5000 rpm离心5 min，弃上清，用PBS缓冲液清洗细菌溶液三次，然后用PBS缓冲液悬浮，进行后续实验。

实施例1：体外抗菌浓度

采用CFU计数法测定PSNO@IR780 NPs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的有效抗菌浓度。先将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的新鲜培养物用PBS洗涤3次，分别稀释至10⁶和10⁸CFU/mL。将稀释后的菌悬液(200 μL)加入96孔板。将PSNO@IR780 NPs加入相应孔中，使大肠杆菌菌悬液中IR780光敏剂终浓度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL；金黄色葡萄球菌菌悬液中IR780光敏剂终浓度为10μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。培养0.5 h后，用808nm (1 W/cm2)激光照射或不照射菌悬液2 min。将处理后的菌液稀释，取100µL的稀释液涂在固体培养基上。37℃培养12 h，计数，计算细菌存活率。试验结果证明，PSNO@IR780 NPs中IR780浓度在5μg/mL以上，对大肠杆菌有显著的杀菌效果，杀菌率达到99%以上（图1-A）；浓度在2μg/mL以上，对金黄色葡萄球菌有显著杀菌效果，杀菌率达到99%以上（图1-B）。说明PSNO@IR780 NPs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌效果依赖于浓度；且相同条件下，PSNO@IR780 NPs对金黄色葡萄球菌的杀菌效果要优于大肠杆菌。

实施例2：体外抗菌活性评价

采用CFU计数法测定PSNO@IR780 NPs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。先将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在37℃ LB培养基中培养过夜，PBS洗涤3次，分别稀释至10⁶和10⁸ CFU/mL。将稀释后的菌悬液(200 μL)加入96孔板。将PBS、PSNO NPs、PEC@IR780NPs、PSNO@IR780 NPs分别加入相应孔中共孵育0.5h后，用808 nm (1 W/cm²)激光照射或不照射菌悬液2 min。其中加入金黄色葡萄球菌悬液中的IR780浓度为2μg/ml，NO浓度为10μM；大肠杆菌悬液中的IR780浓度为5μg/ml，NO浓度为50μM。将处理后的菌液稀释，取100µL的菌液涂在固体培养基上。37℃培养12 h，计数，计算细菌存活率。试验结果表明（图2）在808 nm激光照射下，PSNO NPs组金黄色葡萄球菌活力有限下降，PEC@IR780 NPs组菌落明显减少，抗菌率显著增加至90.8%±1.1%，这可能是光动力治疗和光热治疗协同作用的结果。然而，PSNO@IR780 NPs组未发现金黄色葡萄球菌菌落，抗菌率高达99.97%±0.01%。PSNO@IR780NPs具有良好的杀菌效果，其原因在于超高效、高剂量和过氧亚硝酸盐的可控生成。

这些纳米颗粒对大肠杆菌革兰氏阴性菌的杀菌活性与对金黄色葡萄球菌革兰氏阳性菌的杀菌活性表现出相似的趋势。在没有808 nm激光照射的情况下，PSNO NPs、PEC@IR780 NPs和PSNO@IR780 NPs抗菌活性较低(图3)。在808 nm激光照射下，PSNO NPs组的大肠杆菌菌落较PBS组略有下降。虽然IR780的浓度从2μg/ml对金黄色葡萄球菌的抑制作用提高到5μg/ml对大肠杆菌的抑制作用，但PEC@IR780 NPs对大肠杆菌的抑制作用低于对金黄色葡萄球菌的抑制作用。大肠杆菌的抗菌率仅为76.75%±0.76%，而对金黄色葡萄球菌的抗菌率为90.8%±1.1%。然而在相同处理条件下，PSNO@IR780 NPs组与PEC@IR780 NPs组相比，大肠杆菌菌落进一步大幅减少，抗菌率高达99.99%±0.01%，说明PSNO@IR780 NPs仍具有较好的对大肠杆菌的杀菌能力。也可以得出结论，PEC@IR780 NPs产生的ROS和热疗对革兰氏阳性菌的杀菌效果总体上优于革兰氏阴性菌。但激光照射PSNO@IR780 NPs后，通过引入NO产生大量过氧亚硝酸盐，可明显提高对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的杀菌效果。

实施例3：细菌死活染色

用细菌死活染色液染色处理后的细菌，在激光共聚焦显微镜下拍摄菌的生存情况，绿色为活菌，红色为死菌。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液(10⁷ CFU/mL, 1 mL)与不同的纳米颗粒(5 μg/mL)，共孵育0.5h后，用808 nm (1 W/cm2)激光照射或不照射菌悬液2min。随后分离细菌，PBS反复离心洗涤三次。将获得的细菌用STYO 9/PI Live/Deadbacterial alive Kits (Thermo Fisher L7012)处理15min，最后用共聚焦激光扫描显微镜(Nikon A1)对细菌成像。根据相应的荧光照片（大肠杆菌图4）和(金黄色葡萄球菌图5)可以看出，在没有激光照射时，PBS组、PSNO NPs组和PEC@IR780 NPs组几乎所有的菌都呈现绿色，即活着的状态，PSNO@IR780 NPs组出现一部分的小红点。说明在黑暗条件下，各组金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有大部分存活。808 nm激光(1w cm-2)照射金黄色葡萄球菌和大肠杆菌2 min后，PSNO NPs组的荧光结果与PBS组相似，表明其抑菌活性极弱。相反，PEC@IR780 NPs组出现了部分红色或黄色荧光点(红色和绿色荧光覆盖)，说明PEC@IR780 NPs杀死了部分金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。相比之下PSNO@IR780 NPs组观察到只有红色荧光斑点，显示所有的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都被有效杀灭，表明产生过氧亚硝盐的纳米材料对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌活性显著升高，这与实施例2的结果是一致的。

实施例4：材料处理后的SEM照片

用扫描电镜（SEM）观察金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态和膜完整性。前处理同实施例3，进行分组光照和不光照处理后，用PBS清洗，在用2.5%戊二醛固定4h后酒精进行梯度脱水（30, 50, 70, 80, 90和100%, v/v）。喷金后用扫描电镜(SU8220, HITACHI,Japan)观察细菌状态。结果显示（图6），在没有808 nm激光照射的情况下，不同纳米颗粒孵育的大肠杆菌，与对照组一样，全部或大部分的大肠杆菌都呈现光滑完整的形态。808 nm激光辐照2 min后，除PSNO NPs组外，大肠杆菌的形态均有不同程度的变形。经PEC@IR780 NPs培养的细菌，由于活性氧的产生和温度的升高，细胞膜出现明显的收缩和塌陷。PSNO@IR780NPs培养的细菌，细胞膜收缩、塌陷甚至穿孔，破裂程度更加严重。不同纳米粒子处理和808nm激光照射或不照射下金黄色葡萄球菌的损伤程度与大肠杆菌表现出相似的趋势（图7）。PSNO@IR780 NPs培养的细菌经激光照射后菌体塌陷、变形、穿孔甚至溶解，其破损程度也是最严重的。

实施例5：对耐药菌的抗菌活性

由于抗生素的误用和过度使用，出现的多药耐药菌是临床抗感染治疗中的棘手问题，严重威胁着公众的健康。因此，迫切需要制备高效抗多药耐药菌的制剂。于是我们进一步研究了PSNO@IR780 NPs对革兰氏阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的杀菌活性。试验方法同实施例2，平板计数结果显示(图8)，在808 nm激光照射或不照射下，MET抗生素(100 ng/mL)孵育2 h的MRSA菌落与PBS组几乎相同，杀菌效果可以忽略不计。相比之下，PSNO NPs组在808 nm激光照射或未照射下，MRSA菌落均略有下降，说明少量自发释放的NO抑菌活性有限。与体外对金黄色葡萄球菌的抗菌效果相似，在808 nm激光照射(1w/cm，2min)下，PEC@IR780 NPs和PSNO@IR780 NPs表现出良好的抗菌效果，MRSA菌落明显减少，特别是PSNO@IR780 NPs组未发现菌落。定量统计结果(图—)显示，在实验条件下，PSNO@IR780NPs对MRSA的杀菌性能最好，抗菌率最高可达99.61%±0.16%。这些抗菌结果表明PSNO@IR780 NPs超高效生成高剂量过氧亚硝酸盐对MRSA或其他耐多药菌仍具有良好的杀菌效果。

实施例6 对生物膜破坏作用

耐药主要与活组织中生物膜的形成有关。生物膜的结构为三维细菌群落，细菌被包裹在胞外聚合物(EPS)组成的致密生物膜中，使得细菌能够得到有效的保护，生物膜中的细菌通常对宿主的免疫防御和抗生素更有抵抗力(通常比浮游细菌的浓度高100 - 1000倍)，因此很难根除，从而导致多次感染。因此，迫切需要开发一种既能杀灭耐药菌又能有效破坏生物膜的新型抗菌制剂。

将新鲜培养的MRSA菌液（10⁸CFU/mL）加入24孔板，37℃静置培养48h后，弃掉菌悬液，并用PBS轻柔清洗，去掉游离菌，得到MRSA形成的生物膜。每组分别加入相同浓度的PSNONPs、PEC@IR780 NPs、PSNO@IR780 NPs（IR780浓度为6μg/mL）和PBS，孵育2h后进行808nm激光照射（1w/cm，5min）和不照射处理。处理后吸走药物并用PBS清洗3遍。并进行以下试验，

1）用0.1%（w/v）结晶紫染色15min后，灭菌蒸馏水冲洗结晶紫溶液，直至无游离的结晶紫出现，将孔板烘干1h后加入适量30%乙酸溶液，溶解结晶紫，测590nm处的吸光值。结果显示（图9），PSNO NPs和PEC@IR780 NPs处理后的生物膜呈紫色，与PBS组相似，但PSNO@IR780 NPs组的紫色明显下降。根据相应的定量结果(图9)，PSNO@IR780 NPs组在808 nm激光照射下对MRSA生物膜的破坏效果最好，与PBS组相比，生物膜破坏率为85.01%±1.50%。而PEC@IR780 NPs组的生物膜消融率较PSNO@IR780 NPs组下降至73.03%±3.21%，说明PSNO@IR780 NPs产生的高剂量过氧亚硝酸盐可进一步提高生物膜的去除效率。

2）振荡2min，超声5min，循环一次，将生物膜上的菌振荡下来，加入ONPG（0.75μM），检测细胞膜的损伤程度。细菌胞内β-d-半乳糖苷酶可催化内源性的ONPG形成邻硝基苯酚，在420 nm处观察到。结果如图（图10），在黑暗条件下，各组对ONPG的水解没有明显的差异。808 nm激光照射下，PSNO@IR780 NPs组与PSNO NPs组(*p＜0.05)和PBS组相比，ONPG水解都显著增加(*p＜0.05)，与PEC@IR780 NPs组相比仍然具有显著差异(*p＜0.05)，说明超高效生成的过氧亚硝酸盐可进一步显著加剧活性氧或一氧化氮诱导的细菌细胞膜通透性。

3）用细菌死活染色液处理细菌，在激光共聚焦显微镜下拍摄生物膜上菌的存活情况。膜结构完好的细菌以绿色荧光为主，而膜结构受损的细菌以红色荧光为主。如图11所示，在没有808 nm激光照射的情况下，各组均观察到亮绿色荧光，说明各组MRSA生物膜中大部分MRSA都是存活的。在808 nm激光照射下，经PSNO NPs处理的生物膜呈现与PBS组相似的绿色荧光。PEC@IR780 NPs处理后的生物膜呈现出大量的红色荧光，但仍可以观察到大量的绿色荧光。令人兴奋的是，PSNO@IR780 NPs处理后的生物膜表现出最强的红色荧光，几乎没有检测到绿色荧光，说明PSNO@IR780 NPs的抗生物膜效率很好。

4）用扫描电镜（SEM）观察MRSA生物膜完整性。前处理同实施例4。喷金后用扫描电镜(SU8220, HITACHI, Japan)观察细菌状态。从图12可以看出，PBS组菌体被包裹在生物膜内形成非常致密的细菌群体；不经过808 nm激光照射的PSNO@IR780 NPs处理组，生物膜仍然致密，但有被破坏过的迹象，而经过光照的PSNO@IR780 NPs处理组，生物膜被破坏，致密的胞外组织被打断碎裂，从而使菌体暴露，并且可以看到细菌细胞膜也同时受到伤害，造成菌体塌陷穿孔等现象。

实施例7 体内抗菌效果

所有动物操作均经动物保护委员会批准，符合温州医科大学实验动物管理规定。54只雌性BALb/c小鼠(4-5周龄，19-22 g)随机分为9组，每组6只。在老鼠背部制造一个直径为0.5cm的人造伤口。然后在每个伤口上涂抹50 μL的MRSA (10⁸CFU/mL)。24 h后，分别用PBS(50µL)、PSNO NPs(50µL)、PSNO@IR780 NPs(50µL)、P@IR780 NPs(50µL)和甲氧西林（MET）(50µL, 100 mg/mL)处理创面，除MET组外其他组分别用或不用808 nm激光(1.0 W, 3min)照射创面。确保整个伤口都被光均匀覆盖。24 h后，每组处死小鼠，取创面组织，其中一半皮肤组织均质后用PBS稀释，取100μL涂平板，计数平板上生长的菌落，进一步分析。取剩余一半皮肤组织进行组织学分析，将组织固定在4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋、脱水、切片进行H&E染色和Giemsa染色。

如图13显示，与PBS+D组相比，涂抗生素MET组，PBS + L组，PSNO NPs + D组，PSNONPs + L组，PEC@IR780 NPs + D组和PSNO@IR780 NPs + D组，MRSA菌落分别显示轻度下降,表明有限的体内抗菌行为。而PSNO@IR780 NPs + L组的MRSA菌落明显减少，且优于PEC@IR780 NPs + L组。此外，PSNO@IR780 NPs + L组对应的定量抗菌率最高，达85.00%±1.49%，说明PSNO@IR780 NPs在光照刺激下超高效、大量生成过氧亚硝酸盐，显著提高了体内对MRSA的抗菌效果。

为进一步证实PSNO@IR780 NPs的体内杀菌作用，对处理后的创面组织进行Giemsa和H&E染色。如图14，大量的中性粒细胞(箭头指示)渗透到治疗伤口的周围组织,PBS + L组，PSNO NPs + D组，PSNO NPs + L组，PEC@IR780 NPs + D组和PSNO@IR780 NPs + D组,分别表明严重细菌感染仍在发生。PEC@IR780 NPs + L组中性粒细胞明显减少，PSNO@IR780 +L组中性粒细胞进一步减少。

同样，Giemsa染色照片图15进一步证实，MET组，PBS + L组，PSNO NPs + D组，PSNONPs + L组，PEC@IR780 NPs + D组和PSNO@IR780 NPs + D组受感染的伤口附近存在大量的MRSA(箭头指示),但PEC@IR780 NPs + L组明显减少，PSNO@IR780 NPs + L组仅发现少量细菌。这些体内抗菌结果明确表明，808 nm激光触发PSNO@IR780 NPs产生超高效、大量过氧亚硝酸盐，显著提高了体内对MRSA的抗菌效果。

实施例8 生物安全性

采用MTT法测定PSNO@IR780 NPs的细胞毒性。如图16所示，PSNO@IR780 NPs的浓度从0.5%增加到1%，培养时间从4 h延长至16 h或24 h，其细胞毒性均比较低，细胞存活率除4h以外均在95%以上。此外，还进行了PSNO@IR780 NPs的血液相容性研究。如图17所示，PSNONPs、PEC@IR780 NPs、PSNO@IR780 NPs孵育的红细胞(RBC)悬液呈淡粉色，与阴性对照组相同。各纳米颗粒组对应的溶血率均小于2%，说明这些纳米颗粒没有引起严重的溶血。溶血实验证实PSNO NPs、PEC@IR780 NPs、PSNO@IR780 NPs具有良好的血液相容性。细胞毒性和溶血试验结果表明PSNO@IR780 NPs具有低的细胞毒性和良好的血液相容性。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在制备抗菌剂或抗菌材料上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗菌剂或抗菌材料为针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抗菌剂或抗菌材料。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗菌剂或抗菌材料的杀菌条件为在808 nm的激光照射下。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗菌剂或抗菌材料中IR780光敏剂溶度为2μg/mL以上。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，针对金黄色葡萄球菌时所述的抗菌剂或抗菌材料中IR780光敏剂溶度为2μg/mL以上。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，针对大肠杆菌时所述的抗菌剂或抗菌材料中IR780光敏剂溶度为5μg/mL以上。