CN101845395A - 一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效两阶段生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，步骤为(1)取发菜细胞种子液接种到培养容器中，培养基是改良的BG11培养基，培养8-10天，(2)向上述培养液中加入终浓度为1～20g/L的葡萄糖，培养2-8天，收集发菜细胞，取离心上清液提取培养液中的胞外多糖。本发明涉及的方法中，在相近的培养时间内生产的发菜细胞的干重提高5-8倍，胞外多糖产量提高近15-31倍，细胞干重达3.0～5.0g/L，多糖产量达1.0～2.3g/L，在有效缩短了发菜细胞的培养周期同时提高了胞外多糖的产量，与单一混养培养方法相比可提高葡萄糖的利用率，有效降低染菌率，降低生产成本。

Description

一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及薇藻细胞的培养领域，具体涉及一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法。
背景技术
发菜(Nostoc flagelliforme)，学名是发状念珠藻，俗称发菜，是一种丝状聚合体陆生蓝细菌(蓝藻)，主要分布于我国西北和华北的荒漠-半荒漠地区。发菜进行光合作用，固定二氧化碳，同时具有固氮能力，可将大气中的分子态氮固定为生物可利用的氮素化合物，是荒漠地区土壤中氮元素的主要来源，能为其它土壤微生物的生长提供碳源和氮源，因此，人们称其为荒漠中的“先锋生物”，在生态脆弱带的能量与物质循环中起着重要作用。
长期以来，发菜作为一种食用蓝细菌，受到广大消费者尤其是闽粤、港澳台及东南亚地区消费者的青睐。发菜对恶劣环境具有极强的适应性，其生长过程中向细胞外分泌大量的胶状物质，包裹于发菜细胞及藻丝外，形成胶质鞘，保护发菜细胞不受干旱、高温、紫外辐射的损伤。胶状物质的主要成分为多糖，发菜多糖是一类酸性杂多糖，初步研究表明，发菜多糖对流感病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等多种具封套的病毒均具有抗病毒活性。发菜多糖能阻断病毒对寄主细胞的吸附，阻止病毒在寄主细胞内的复制，具有直接的抗病毒活性。日本等国对发菜多糖的生理功能进行了多方面的研究，开展了有关药物和保健品的研发工作。
由于发菜具有很高的经济和药用价值，因此，发菜和发菜多糖的需求量不断上升，巨大的市场需求导致过渡采收造成发菜资源濒临枯竭，从保护生态的角度出发，我国政府从2000年7月起就已禁止了对发菜的采收和销售，导致作为一种具有良好应用前景的生物活性物质发菜多糖因原料资源匮乏而难以得到大规模的开发和生产。
为了解决市场需求不足和保护生态环境这一两难问题，人们对人工培养发菜进行了深入的研究，主要包括固态培养法和液体培养法，在不消耗天然发菜资源、不破坏发菜生长地生态环境的情况下扩大发菜的生产，能够基本满足市场需求。
根据检索，发现有以下几篇专利文献与本发明相关，分别是：
1、专利(02138828.8)“一种培养发菜细胞的方法”，该方法提供了一种发菜细胞的培养方法，其特点是从原种发菜匀浆获得匀浆液，经逐步扩大用于发菜细胞培养，为发菜细胞的液体培养提供了一个新的途径，但是该方法只采用发菜藻丝体而非发菜细胞进行光合自养培养，并且没有涉及利用发菜细胞生产胞外多糖。
2、专利(CN12144690C)“一种发菜细胞培养联产发菜多糖的方法”，该方法从野生发菜藻体中分离获得离体细胞，将分离得到的发菜细胞作为种子进行长期保藏，用于发菜细胞进一步培养，从培养液中提取发菜多糖或直接作为功能性食品、药物的生产胞外多糖方法。该方法与野生发菜相比，生长速度有了较大的提高，该方法改变了只能从发菜藻体中提取发菜多糖的现状，但由于该方法采用光合自养培养方法，在培养的后期受到光衰减的影响，使最终收获的发菜细胞量和胞外多糖的产量都较低。
3、专利(200510122059.9)“发菜细胞的固态培养方法”，并在日本申请两项专利：“髪菜細胞の培餋と髪菜多糖の抽出をリンクさせて行ぅたぬの方法(C12N1/12PF5483)、髪菜細胞の固体培餋方法(C12N1/12PF5482)”，该方法是将液体悬浮培养获得的发菜细胞培养物接种于固态培养基中，在人工或自然条件下培养发菜细胞，并进行干湿节律培养，提供可控的适宜培养条件，实现完全人工培养或野外扩大培养，该方法突破了传统培养方式，加快了生产速度，但该方法还不能实现发菜的人工种植产业化生产。
4、专利(200610013589.4)“稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养方法”提供了一种发菜细胞高密度培养的方法，采用混合营养和异养培养的模式，能在较短的时间内获得大量发菜细胞和胞外多糖，该方法突破了传统的发菜细胞生长的光合自养培养模式，减少了培养过程中对光的依赖性，通过添加有机碳源可以提高发菜细胞的生长速度，缩短了发菜细胞的培养周期，同时可以提高发菜多糖的产量，但由于该培养方法在培养开始时就在培养基中添加了葡萄糖，极易染菌，使培养过程中对无菌生产条件要求非常严格，从而大大提高了生产成本和生产的风险性，不利于发菜细胞及其胞外多糖的工业化生产。
目前文献报道的发菜培养方法都是采用单一阶段方式培养，包括光合自养、混合营养和异养培养，光合自养培养法存在对光照的依赖性、细胞生长速度慢、细胞密度低、胞外多糖产量低等缺点，混合营养和异养培养存在原料利用率低、容易污染杂菌、无菌条件要求高、风险性高、生产成本高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，该方法采用光合自养和混合营养培养相结合的两阶段培养模式，有效提高了发菜细胞的生长速度和培养基中葡萄糖的利用率，同时降低染菌几率和生产成本，简化生产工艺。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，
(1)第一阶段：取发菜细胞种子液接种到培养容器中，培养基是改良的BG11培养基，培养8-10天，当发菜细胞浓度达到0.5～0.7g/L时进行第二阶段培养；
(2)第二阶段：在第一阶段相同的培养条件下，向上述培养液中加入终浓度为1～20g/L的葡萄糖，培养2-8天，将发菜细胞培养液离心，收集发菜细胞，取离心上清液提取培养液中的胞外多糖。
而且，所述改良的BG11培养基成分及含量为：
NaNO3 1.5g/L，K2HPO4 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，Na2SiO3·9H2O 0.058g/L，柠檬酸0.60mg/L，FeSO4·H2O 4.80mg/L，H3BO4 2.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O 0.20mg/L，EDTA·2Na 1mg/L，Na2MoO4 0.39mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2 0.01mg/L。
而且，所述步骤(1)的培养方法为：
取发菜细胞种子液以5～10％(v/v)的接种量接种到培养容器中，培养基是改良的BG11培养基，初始pH9.0，温度为20-30℃，转速80-120r/min或通风比0.06-1.0vvm，光照强度为2500-3500lux，培养8-10天，当发菜细胞浓度达到0.5～0.7g/L时进行下一阶段培养。
而且，在步骤(1)前还包括制备发菜细胞种子液的步骤是：
将保存的发菜种细胞种接入培养液，在20-30℃静置培养，培养基是改良的BG11培养基，初始pH9.0，光照强度为800-1200lux，培养10-15d后结束培养，静置培养液至细胞完全沉底，弃去上清液，细胞用无菌水重新悬浮，制成发菜细胞种子液。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明建立了一种发菜及其胞外多糖的两阶段高效生产方法，即第一阶段是光合自养培养，第二阶段是光合自养培养与异养培养混合培养，本方法突破了传统的发菜细胞生长和多糖积累只采用单一阶段的培养模式，充分利用了光合自养与混合营养的优点，提高了发菜细胞的生长速度和培养基中葡萄糖的利用率。
2、本发明在第一阶段培养8-10后，向培养体系中添加葡萄糖，使培养基能够及时补充碳源和能源，发菜细胞进如快速生长期，同时由于中后期添加葡萄糖，提高了葡萄糖的利用率，减少了杂菌的污染机会，降低了发菜细胞培养对无菌生产条件的要求，从而有效降低了生产风险和生产成本，简化生产工艺，为发菜细胞及胞外多糖的工业化生产探索出一条新的途径。
3、本发明涉及的方法中采用两阶段培养模式与单一光合自养培养方法相比，在相近的培养时间内生产的发菜细胞的干重提高5-8倍，胞外多糖产量提高近15-31倍，细胞干重达3.0～5.0g/L，多糖产量达1.0～2.3g/L，在有效缩短了发菜细胞的培养周期同时提高了胞外多糖的产量，与单一混养培养方法相比有效降低染菌率，显著降低生产成本。
4、本发明培养过程中采用改良的BG11培养基，在原来BG11培养基培养基中添加了Na2SiO3·9H2O，添加该物质后，使发菜细胞的生长更加快速，有效提高了发菜细胞和胞外多糖的产量。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明的培养机理是：
第一阶段是将生长旺盛的发菜细胞接种到改良的BG11培养基中进行液体悬浮培养，其中改良的BG11培养基中不添加有机碳源，发菜细胞仅以空气中的CO2为碳源，通过光合作用固定CO2，为细胞的生长繁殖提供碳源，当细胞培养到8～10d后，其光合作用受到光衰减的影响，单位细胞的光合作用效率下降，不能为发菜细胞的生长和胞外多糖生成提供充足能源时，因此细胞的生长和胞外多糖的生成开始受到抑制，这时需转入培养的第二阶段，此时的细胞浓度达到0.5～0.7g/L。
第二阶段是光合作用受到光衰减的影响后，添加终浓度为1～20g/L的葡萄糖，为细胞提供充足的碳源和能源，细胞继续快速分裂生长，并且开始生成大量的胞外多糖，继续培养2～8天，停止培养，分离收集细胞，提取培养液中的胞外多糖，添加葡萄糖后促进胞外多糖的大量分泌，多糖产量达1.0～2.3g/L，细胞干重达到3.0～5.0g/L。
本发明实施例采用的发菜细胞种是本实验室从野生发菜中分离纯化并保存的离体发菜单细胞种，利用发菜单细胞种培养发菜细胞种子液的方法为：
将保存的发菜细胞种接入装有200mL培养液的三角瓶(500mL)中，在25℃静置培养，培养基是改良的BG11培养基，初始pH9.0，光照强度为1000lux，细胞从缓慢生长过渡到快速生长状态，培养15d后结束培养，静置培养液，等细胞完全沉底，将上清液弃去，细胞再用200mL无菌水重新悬浮，制成发菜细胞种子液。
上述改良的BG11培养基成分及含量为：
NaNO3 1.5g/L，K2HPO4 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，Na2SiO3·9H2O 0.058g/L，柠檬酸0.60mg/L，FeSO4·H2O 4.80mg/L，H3BO4 2.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O 0.20mg/L，EDTA·2Na 1mg/L，Na2MoO4 0.39mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2 0.01mg/L。
实施例1：
一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，步骤如下：
(1)发菜细胞第一阶段培养：取发菜细胞种子液以5～10％(v/v)的接种量接种到装有200mL培养液的三角瓶(500mL)中，培养基是改良BG11培养基，初始pH9.0，在25℃的摇床上培养，转速100rpm，光照强度为3000lux，培养10天，当发菜细胞浓度达到0.5～0.7g/L时进行下一步；
(2)发菜细胞第二阶段培养：当第一阶段培养10天后，向培养液中加入终浓度为5g/L的葡萄糖，继续培养5天，取200mL发菜细胞培养液4000r/min离心10min收集发菜细胞，用无菌水洗涤两次，以去除残留的培养基，在80℃烘干至恒重，测定发菜细胞的产量，取发菜细胞培养液的离心上清液用醇沉法分离提取发菜多糖，测定粗多糖的产量。
本实施例得到发菜细胞的干重是3.974g/L，胞外多糖产量是1120.1mg/L。
醇沉法提取发菜多糖的方法为：向发菜细胞培养液离心上清中加入发菜细胞培养液离心上清液4倍体积的无水乙醇，4℃静置12h，4000r/min离心15min收集胞外多糖，冷冻干燥获得多糖产品，称重。
实施例2：
一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，步骤如下：
(1)发菜细胞第一阶段培养：取发菜细胞种子液，以5～10％(v/v)的接种量接种到装有200mL培养液的三角瓶(500mL)中，培养基是改良的BG11培养基，初始pH9.0，在25℃的摇床上培养，转速100rpm，光照强度为3000lux，培养10天；
(2)发菜细胞第二阶段培养：当第一阶段培养10天后，向培养液中加入终浓度10g/L的葡萄糖，继续培养5天，取200mL发菜细胞培养液4000r/min离心10min收集发菜细胞，用无菌水洗涤两次，以去除残留的培养基，在80℃烘干至恒重，测定发菜细胞的产量。取发菜细胞培养液离心上清液用醇沉法分离提取发菜多糖，测定粗多糖的产量。
本实施例中得到细胞的干重是4.910g/L，胞外多糖产量是2210.2mg/L。
实施例3：
一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，步骤如下：
(1)发菜细胞第一阶段培养：取发菜细胞种子液以5～10％(v/v)的接种量接种到装有2.5L培养液的3L光照生物反应器，通气量为0.8vvm，培养基是改良BG11培养基，初始pH9.0，培养温度为25℃，转速100rpm，光照强度为3500lux，培养8天后细胞产量达到0.6g/L。
(2)发菜细胞第二阶段培养：当第一阶段8天后，向培养液中加入终浓度5g/L的葡萄糖，继续培养7天，取200mL发菜细胞培养液4000r/min离心10min收集发菜细胞，用无菌水洗涤两次，以去除残留的培养基，在80℃烘干至恒重，测定发菜细胞的产量。取发菜细胞培养液用醇沉法分离提取发菜多糖，测定粗多糖的产量。
本实施例中得到发菜细胞的干重是5.040g/L，胞外多糖产量是1520.1mg/L。
产量对比试验：发菜细胞经单一的光合自养培养获得细胞干重和多糖产量对比，步骤如下：
取发菜细胞种子液以5～10％(v/v)的接种量接种到装有200mL培养液的三角瓶(500mL)中，培养基是改良BG11培养基，初始pH9.0，在25℃摇床培养，转速100rpm，光照强度为3000lux，培养15天，取200mL发菜细胞培养液4000r/min离心10min收集发菜细胞，用无菌水洗涤两次，以去除残留的培养基，在80℃烘干至恒重，测定发菜细胞的产量；取发菜细胞培养液离心上清液用醇沉法分离提取发菜胞外多糖，冷冻干燥后测定粗多糖的产量，据检测经单一培养得到发菜细胞的干重是0.711g/L，胞外多糖产量是72.9mg/L。
染菌率对比：发菜细胞经单一的混养培养的染菌率对比，步骤如下：
取发菜细胞种子液以5～10％(v/v)的接种量接种到装有200mL培养液的三角瓶(500mL)中，培养基是在改良BG11培养基基础上添加0.5～10g/L葡萄糖，初始pH9.0，在25℃摇床培养，转速100rpm，光照强度为3000lux，培养15天。进行10批次，每次20瓶，共200瓶，培养结束后共有15瓶染菌，染菌率7.5％，而采用实施例1两阶段法培养10批次，每次20瓶，培养结束后共染菌3瓶，染菌率1.5％，比混养培养染菌率降低了80％。

Claims (4)

1.一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，其特征在于：
(1)第一阶段：取发菜细胞种子液接种到培养容器中，培养基是改良的BG11培养基，培养8-10天，当发菜细胞浓度达到0.5～0.7g/L时进行第二阶段培养；
(2)第二阶段：在第一阶段相同的培养条件下，向上述培养液中加入终浓度为1～20g/L的葡萄糖，培养2-8天，将发菜细胞培养液离心，收集发菜细胞，取离心上清液提取培养液中的胞外多糖。
2.根据权利要求1所述的一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，其特征在于：所述改良的BG11培养基成分及含量为：
NaNO3 1.5g/L，K2HPO4 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，Na2SiO3·9H2O 0.058g/L，柠檬酸0.60mg/L，FeSO4·H2O 4.80mg/L，H3BO4 2.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O 0.20mg/L，EDTA·2Na 1mg/L，Na2MoO4 0.39mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2 0.01mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤(1)的培养方法为：
取发菜细胞种子液以5～10％(v/v)的接种量接种到培养容器中，培养基是改良的BG11培养基，初始pH9.0，温度为20-30℃，转速80-120r/min或通风比0.06-1.0vvm，光照强度为2500-3500lux，培养8-10天，当发菜细胞浓度达到0.5～0.7g/L时进行下一阶段培养。
4.根据权利要求1所述的一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法：其特征在于：在步骤(1)前还包括制备发菜细胞种子液的步骤是：
将保存的发菜种细胞种接入培养液，在20-30℃静置培养，培养基是改良的BG11培养基，初始pH9.0，光照强度为800-1200lux，培养10-15d后结束培养，静置培养液至细胞完全沉底，弃去上清液，细胞用无菌水重新悬浮，制成发菜细胞种子液。
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