CN104593438A - 一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，采用悬浮培养发菜细胞，利用超声波提取发菜中的氨基酸，不仅能有效破碎细胞，而且还具有操作简单、提取时间短、消耗溶剂低、得率高、无需加热等优点，提取率可达到7.2%，为研究开发具有高氨基酸评价分的产品做出了贡献。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法。
背景技术
发菜（Nostoc flagelliforme），又称发状念珠藻，属蓝菌门念珠藻目，发菜主要产于中国西北部的干旱和半干旱地区，发菜是一种能固氮的光合原核生物，它的丝状体中主要有两种细胞：一种是营养细胞，呈绿色，进行光合作用，吸收、释放、合成有机物质；另一种是异形细胞，体积较大，细胞壁较厚，颜色较淡，主要进行固氮作用，把空气中的氮气还原成氨，合成氨基酸。
发菜的营养价值很高，尤其是蛋白质的含量较高，每千克发菜中含蛋白质200～234.1克，还含有海胆酮、蓝藻叶黄素、藻蓝素和别藻蓝素等，营养成分高于同量的肉类与蛋类；发菜有较高的药用价值，其性平，味甘淡，有平肝潜阳、清肠止痢的功效；可清热解毒、化痰止咳、凉血明目、通便利尿，对佝偻病、痢疾、高血压、气管炎、鼻出血、营养不良等多种疾病都有一定疗效，并且发菜中具有高氨基酸评分的氨基酸组成，因此测定发菜中蛋白质的氨基酸的含量，对于评价发菜的营养与药用价值有重要意义。
氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，与生物的生命活动有着密切的关系，是生物体内不可缺少的营养成分之一；研究一种操作简单、提取率高的从发菜中提取氨基酸的方法很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、提取率高的从发菜中提取氨基酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：无菌条件下将发菜细胞接种到BG-11液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25℃恒温培养，光照强度为1800~2200Lux，恒温培养15~20天后，得发菜细胞培养液备用；
步骤二：将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三：将步骤二所得的发菜细胞于40~60℃条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四：将步骤三所得的发菜细胞粉末按照l:20~1:50的料液比加入体积分数为30%~75%的乙醇水溶液，于水浴温度为50~80℃条件下超声提取30~75min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五：将步骤四所得的发菜细胞提取液于3500~4500rpm条件下离心分离15~25min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液；
所述步骤一中光照强度为2000Lux；
所述步骤三中将所得的发菜细胞于50℃条件下干燥至恒重；
所述步骤四中将所得的发菜细胞粉末按照l:40的料液比加入体积分数为60%的乙醇，于水浴温度为70℃条件下超声提取60min，过滤，得发菜细胞提取液；
所述步骤五中将所得的发菜细胞提取液于4000rpm条件下离心分离20min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
本发明的有益效果：
本发明提供的悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，采用悬浮培养发菜细胞，利用超声波提取发菜中的氨基酸，不仅能有效破碎细胞，而且还具有操作简单、提取时间短、消耗溶剂低、得率高、无需加热等优点，提取率可达到7.2%，为研究开发具有高氨基酸评价分的产品做出了贡献。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的阐述。
实施例1
一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：无菌条件下将发菜细胞接种到BG-11液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25℃恒温培养，光照强度为2000Lux，恒温培养18天，得发菜细胞培养液备用；
步骤二：将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三：将步骤二所得的发菜细胞于50℃条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四：将步骤三所得的发菜细胞粉末按照1:40的料液比加入体积分数为60%的乙醇水溶液，于水浴温度为70℃条件下超声提取60min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五：将步骤四所得的发菜细胞提取液于4000rpm条件下离心分离20min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
实施例2
一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：无菌条件下将发菜细胞接种到BG-11液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25℃恒温培养，光照强度为1800Lux，恒温培养20天，得发菜细胞培养液备用；
步骤二：将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三：将步骤二所得的发菜细胞于40℃条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四：将步骤三所得的发菜细胞粉末按照1:20的料液比加入体积分数为75%的乙醇，于水浴温度为50℃条件下超声提取30min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五：将步骤四所得的发菜细胞提取液于3500rpm条件下离心分离25min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
实施例3
一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，包括以下步骤：
步骤一：无菌条件下将发菜细胞接种到BG-11液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25℃恒温培养，光照强度为2200Lux，恒温培养15天，得发菜细胞培养液备用；
步骤二：将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三：将步骤二所得的发菜细胞于60℃条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四：将步骤三所得的发菜细胞粉末按照1:50的料液比加入体积分数为30%的乙醇，于水浴温度为80℃条件下超声提取75min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五：将步骤四所得的发菜细胞提取液于4500rpm条件下离心分离15min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
BG-11培养基：NaNO3 1.5g，K2HPO4·3H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.075g，CaCl2·2H2O 0.036g 柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵 0.006g，EDTA 0.001g，Na2CO3 0.02g，A5溶液1000× 1mL，蒸馏水919mL。
氨基酸含量的测定
（1）标准溶液的制备
配制0.1 mg／mL的标准L-谷氨酸溶液；
（2）测定波长的选择
准确称取发菜粉末0.20g于具塞试管中，加入60％乙醇8mL，于70℃、功率70%条件下超声提取60 min后，于4000rpm条件下离心分离20min，取上清液定容至100mL，再取l mL样品溶液稀释至10mL，即为待测的氨基酸提取液；
分别取标准液和待测样品液各2mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液2mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min后冷却，放置5min后，加3mL60％乙醇稀释，摇匀后在紫外-可见分光光度计中进行波长扫描，每种液体平行做3次，取平均值，结果显示对照品溶液和样品溶液在570nm处均有最大吸收，最后选择570 nm为本试验的最佳测定波长；
（3）标准曲线的制备
分别取20ug/mL的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL于试管中，用水补足至2mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入2mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min后冷却，放置5min后，加入3mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD 570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD 440nm）。以X表示谷氨酸体积分数，Y表示相应体积分数的吸光度值，得出标准方程为Y=0.0377X+0.0054（R2=0.9999）；
（4）氨基酸含量的测定
将待测的氨基酸提取液加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入2mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min后冷却，放置5min后，加入3mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD 570nm，将得到的吸光值代入回归方程，测得氨基酸的含量为7.2%。
Claims (5)
1. 一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：无菌条件下将发菜细胞接种到BG-11液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25℃恒温培养，光照强度为1800~2200Lux，恒温培养15~20天后，得发菜细胞培养液备用；
步骤二：将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三：将步骤二所得的发菜细胞于40~60℃条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四：将步骤三所得的发菜细胞粉末按照l:20~1:50的料液比加入体积分数为30%~75%的乙醇水溶液，于水浴温度为50~80℃条件下超声提取30~75min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五：将步骤四所得的发菜细胞提取液于3500~4500rpm条件下离心分离15~25min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
2. 如权利要求1所述的悬浮培养发菜氨基酸提取方法，其特征在于：所述步骤一中光照强度为2000Lux。
3. 如权利要求1所述的悬浮培养发菜氨基酸提取方法，其特征在于：所述步骤三中将所得的发菜细胞于50℃条件下干燥至恒重。
4. 如权利要求1所述的悬浮培养发菜氨基酸提取方法，其特征在于：所述步骤四中将所得的发菜细胞粉末按照l:40的料液比加入体积分数为60%的乙醇，于水浴温度为70℃条件下超声提取60min，过滤，得发菜细胞提取液。
5. 如权利要求1所述的悬浮培养发菜氨基酸提取方法，其特征在于：所述步骤五中将所得的发菜细胞提取液于4000rpm条件下离心分离20min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
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