CN102218144A

CN102218144A - 一种调节生物体内微小核糖核酸含量的方法及其用途

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Publication number: CN102218144A
Application number: CN2010101463394A
Authority: CN
Inventors: 曾科; 张辰宇; 张峻峰; 李海进
Original assignee: Jiangsu Micromedmark Biotech Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Micromedmark Biotech Co Ltd
Priority date: 2010-04-13
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2030-04-13
Also published as: CN102218144B

Abstract

本发明一种调节生物体内微小核糖核酸含量的方法及其用途。微小核糖核酸(miRNAs)通过细胞微粒子(microparticles/microvesicles/exosomes)被细胞主动地、选择性地分泌到循环系统和靶细胞/组织中发挥作用。本发明提供了一种全新的介导细胞间通信的信号分子家族：细胞通过微粒子分泌的miRNAs。同时提供了制备含有特定微小核糖核酸的细胞微粒子的方法，并利用该类包载微小核糖核酸的细胞微粒子对细胞及组织进行基因水平调控及修饰，以此提供了一种新的、强有效的、能够适用于所有细胞的调节生物体内微小核糖核酸含量的方法。

Description

一种调节生物体内微小核糖核酸含量的方法及其用途

发明领域

本发明涉及一种调节生物体内微小核糖核酸含量的方法及其用途，具体涉及一种将包含含量经过调节的微小核糖核酸的细胞微粒子导入目标生物体内，靶向性、高效率地调节生物体内微小核糖核酸的含量，从而影响目标生物体的生理、病理状况的方法，以及该方法在治疗和/或预防疾病中的用途。

背景技术

细胞微粒子(microvesicles)是一类大小介于10-500nm之间，具有脂质双层膜的生物囊泡结构，其早在1967年就有报道，当时被称为“plateletdust”。细胞微粒子来源于血小板，其包含囊泡，具有促进凝结的作用。后来的体外研究发现内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板、白细胞、淋巴细胞、红细胞等都能释放微粒子。根据微粒子产生的途径，又可以将微粒子区分为exosomes和shedding vesicles两大类。Exosomes是细胞在被刺激的情况下，通过多囊泡小体(Multivesicular bodies，MVBs)胞吐到细胞外的，而shedding vesicles则是直接从细胞表面以出芽的方式分泌出来的。目前，不同细胞分泌的shedding vesicles被命名为不同的名称，比如中性粒细胞和单核细胞分泌的被称为ectosomes，而血小板分泌的则被称为microparticles。

已知的产生细胞微粒子的途径有两个：细胞激活和细胞凋亡，但是至今尚不清楚这两条途径产生的细胞微粒子在大小、组成和生理功能上是否相似。细胞微粒子的膜成分取决于其来源细胞，主要是由脂质和蛋白质组成，但细胞微粒子的内部成分尚不清楚。有人预测细胞释放微粒子在细胞间通信、受体传递、引发信号或细胞接触方面起作用，也可能在器官防御系统的应激反应、炎症反应和组织再生中起作用。然而，细胞微粒子的明确生理功能至今尚未全部研究清楚。

微小核糖核酸(microRNAs，简称miRNA)是近年来的一个研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链小核糖核酸分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可以通过抑制靶基因的翻译过程对基因表达进行调节，并且与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA已逐渐成为有关调控miRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，并且分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。现在预测miRNA至少能调控5300个人类基因，也就是所有基因的30％。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现，其中miRNA与肿瘤的关系越来越成为研究的重点，已经发现若干miRNA通过负调控基因的表达从而与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。最近的研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核糖核酸的表达水平均有不同程度的下调；分析比较人肺癌、乳腺癌组织中的微小核糖核酸表达时，也发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展，并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病的发生和发展之间存在着必然联系。

由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它与疾病存在以下的关联性：首先，微小核糖核酸的变化可能是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增。若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。其次，微小核糖核酸的变化也可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点。当微小核糖核酸本身发生表达紊乱时，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生。反之，如果抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量增加或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量减少也会导致下游一系列促进疾病进程的基因表达的下调，进而抑制疾病发生或发展。因此，理论上微小核糖核酸分子不仅可以作为一类新的疾病标志物，它的特异性变化必然与疾病产生、发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物，通过减少疾病过程中表达上调的微小核糖核酸或补充表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。因此，开发一种能够调节患者体内微小核糖核酸的含量以上调疾病抑制因子或下调疾病促进因子的药物，对于多种疾病的预防和/或治疗具有重要的意义。

近年来，微小核糖核酸药物已经成为药物开发的热点之一。目前研究成果已经证明可以通过调节生物体内特定的微小核糖核酸的含量来阻断或延缓疾病的进程。例如，miR-206在骨骼肌中的高表达可改善运动神经元的损伤或丧失，其作用主要是通过促进与激活肌肉与肌肉之间神经元联系的再生来实现的，由此可以治疗肌萎缩性侧索硬化(或称ALS)；通过下调肝脏中的miR-122表达，能够对丙型肝炎起到治疗作用；miR-15和miR-16的丢失导致的Bcl-2过表达，这是人类发生慢性淋巴性白血病(CLL)的重要机理，在生物体内过表达miR-15和miR-16可以起到治疗CLL的作用。

尽管微小核糖核酸药物的研究开发已经取得了不少成果，但要将其作为药物真正用于医疗还面临着很多问题。最关键的问题就是要提高药物传送的效率和靶向性。目前，运送微小核糖核酸药物的载体主要有脂质体、毫微型胶囊(Nanocapsules或Nanoparticles)、β-环糊精包含物(β-cyclodextrin inclusion compoujnd或称β-环糊精胶囊)等，虽然这些载体可以延长药物在体内的存留时间并一定程度上提高药物的吸收率，但是其传送药物的靶向性和高效性仍然不足。病毒载体也能提高药物在体内的输送效率，但其对生物体潜在的危险性也限制了其在微小核糖核酸药物递送中的应用。如何对人或动物进行有效给药，既能确保药物在靶器官/组织有效释放，还要具有高度安全性等问题都尚需进一步研究。

发明内容

综上所述，微小核糖核酸作为潜在的药物手段，目前还存在一些尚未解决的问题。除微小核糖核酸的靶基因还不清楚外，微小核糖核酸的递送特异性差、效率低以及安全性问题是妨碍其应用的主要原因。

本发明人在以微小核糖核酸作为疾病标志物的相关研究中发现人体血清/血浆以及细胞培养液中存在稳定的微小核糖核酸，而且鉴于这些微小核糖核酸与人体的病理、生理状况，包括恶性肿瘤的发生、免疫缺陷以及炎症等的形成等有密切关系，基于对血清/血浆中微小核糖核酸的系统研究，首次提出了以血清/血浆中微小核糖核酸作为全新的疾病检测标志物。进一步研究血清/血浆以及细胞培养液中微小核糖核酸的来源，本发明人发现大部分的血清/血浆以及细胞培养液中的微小核糖核酸来自于细胞微粒子。这些细胞微粒子大小不一，分布在10-500纳米范围内。更值得注意的发现是，血清中的细胞微粒子并不仅仅来自血细胞，其来源还包括人体其它组织的细胞，如血管内皮细胞以及肺、肝等组织细胞。在病理状况下，肿瘤细胞和外侵病源体可以分泌或诱导细胞分泌微粒子，这些微粒子包载特异微小核糖核酸，并专一结合免疫细胞，将微小核糖核酸传递给免疫细胞从而沉默免疫细胞功能，从而使肿瘤及病源体免受攻击。本申请通过研究证实，不同细胞释放的微粒子的膜成分(包括特异性表面受体及膜脂结构)与对应细胞的质膜成分相同，而且所包载的微小核糖核酸种类也与对应细胞的微小核糖核酸相关。因此，细胞微粒子具有源头细胞表面特有的受体蛋白或膜脂结构，与对应的靶细胞有高亲和性，因而可以选择性地递送微小核糖核酸到靶细胞/组织，从而大大提高微小核糖核酸调控细胞功能的作用。由于细胞微粒子(包括所有具有微粒子特征的膜脂囊泡结构，如exosome和shedding vesicles以及针对各种细胞分泌的shedding vesicles的特称)本身具有与特定组织及细胞结合的特异性，其所包载微小核糖核酸也呈现较强的靶向性、稳定性及高效率，它在疾病机制的研究及治疗方面有重大应用前景。

因此，本发明的目的在于提供一种能够特异性、高效性将微小核糖核酸递送进入生物体从而改变生物体内微小核糖核酸含量方法。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种调节生物体内微小核糖核酸含量的方法，该方法包括以下步骤：

(1)调节供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的含量；

(2)分离供体细胞细胞微粒子；

(3)将分离的细胞微粒子引入生物体内。

在上述方法中，供体细胞细胞微粒子的来源可以选自体液，优选为血液；细胞培养物；和组织中的一种或多种。

在上述方法中，调节供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的含量步骤为增加或减少供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的表达量。其中，增加供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的表达量的方法可以为施加外源性刺激和/或导入微小核糖核酸前体。优选地，施加外源性刺激包括以下步骤：在体外培养的细胞中加入一种或多种能够影响细胞的炎症反应、代谢情况、生活周期和功能的外源性刺激物，例如激素、细胞因子、脂多糖、自由脂肪酸、高级糖基化终产物和过氧化氢，然后孵育。优选地，导入微小核糖核酸前体包括以下步骤：采用脂质体载体(invitrogen公司Lipofectamine 2000)将相应的微小核糖核酸前体导入细胞内，然后孵育。其中，减少供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的表达量的方法为施加外源性刺激和/或导入微小核糖核酸的反义RNA。优选地，施加外源性刺激包括以下步骤：在体外培养的细胞中加入一种或多种能够影响细胞的炎症反应、代谢情况、生活周期和功能的外源性刺激物，例如激素、细胞因子、脂多糖、自由脂肪酸、高级糖基化终产物和过氧化氢，然后孵育。优选地，导入微小核糖核酸的反义RNA包括以下步骤：采用脂质体载体(invitrogen公司Lipofectamine 2000)将相应的微小核糖核酸的反义RNA导入细胞内，然后孵育。

在上述方法中，分离供体细胞细胞微粒子的方法可以选自差速离心法、免疫吸附法和超滤法中的一种或多种。

具体地，差速离心法可以包括以下步骤：

(1)将细胞培养物或组织，或者体液以300g的转速离心5分钟，取上清；

(2)将上清以1500g的转速离心20分钟，取上清；

(3)将上清以10000g的转速离心30分钟，取上清；

(4)将上清以110000g的转速离心70分钟，沉淀即供体细胞细胞微粒子。

具体地，免疫吸附法可以包括以下步骤：

(1)将细胞培养物或组织，或者体液以3000转/分的转速离心30分钟，取上清；

(2)将上清置于吸附细胞特异性抗体或免疫磁珠的组织培养皿上温育30～60分钟，回收被吸附的细胞微粒子。

具体地，超滤法可以包括以下步骤：

(2)将上清置于带有100KD滤膜的浓缩离心管中，以4000转/分钟的转速离心、浓缩即得。

在上述方法中，生物体可以选自人；动物，例如软骨鱼、硬骨鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳类；微生物，例如细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、放线菌和病毒中的一种或多种。具体地，病毒可以选自DNA病毒和RNA病毒，例如乙肝病毒、天花病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、SARS病毒和流感病毒中的一种或多种。

本发明还提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，该方法包括采用上述的调节生物体内微小核糖核酸含量的方法来调节人或动物体内与疾病相关的微小核糖核酸的含量。其中，微小核糖核酸的含量增加或减少与疾病发生和/或发展相关。

上述疾病可以选自肿瘤；急、慢性传染病，例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病和SARS等病毒性疾病，例如肺结核、细菌性肺炎等细菌性疾病，以及其它病原微生物导致的急、慢性传染病；呼吸系统疾病；免疫系统疾病；血液与造血系统疾病；循环系统疾病，例如心脑血管疾病；内分泌系统疾病；消化系统疾病；神经系统疾病；泌尿系统疾病；生殖系统疾病以及运动系统疾病中的一种或多种。具体地，上述疾病选自动脉粥样硬化，血管损伤导致的肥胖、高血糖和慢性炎症中的一种或多种。

上述与疾病相关的微小核糖核酸选自let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126^*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154^*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182^*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a^*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191^*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a^*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a^*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202^*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a^*、miR-302b、miR-302b^*、miR-302c、miR-302c^*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363^*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373^*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a^*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432^*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452^*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517^*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2^*、miR-518b、miR-518c、miR-518c^*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f^*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e^*、miR-520a、miR-520a^*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d^*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524^*、miR-525、miR-525^*、miR-526a、miR-526b、miR-526b^*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9^*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a和miR-99b中的一种或多种。例如，miR-16、miR-26a、miR-29a、miR-30c、miR-125b、miR-138、miR-142-3p、miR-150、miR-181a、miR-181b、miR-136、miR-146a、miR-222和miR-451中的一种或多种。具体的例子选自miR-125b、miR-16、miR-142-3p、miR-451和miR-150中的一种或多种。更具体的例子为miR-451和miR-150，或者miR-150。

上述预防和/或治疗疾病的方法通过首先调节供体细胞细胞微粒子中能够影响疾病的发生、发展的miRNA的含量，再分离制备经过这样处理的细胞微粒子并将其导入受体细胞或注入病人体内，细胞微粒子携带miRNA进入受体细胞或病人组织，通过与其靶基因的相互作用，引起靶基因蛋白质含量的改变，从而影响细胞功能，起到预防和/或治疗疾病的作用。

为了体外检测携带miRNA的细胞微粒子对于细胞与细胞、或者组织与组织之间的生理作用及其作用方式的影响，本发明采用了以下检测手段：共聚焦荧光显微镜法、Real-time PCR方法、细胞转染方法、WesternBloting方法以及细胞迁移方法。

其中，共聚焦荧光显微镜方法包括以下步骤：diI-C₁₆标记细胞；PBS洗涤细胞；采用含有10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，37℃过夜；离心去掉细胞上清获得细胞微粒子；获得的细胞微粒子重悬在另一种细胞中并设置不同的时间梯度进行孵育；洗涤细胞、固定、共聚焦显微镜观察。

细胞迁移方法包括以下步骤：将Transwell Boyden Chamber(6.5mm，Costar，Cambridge，MA，USA)的上面小室底部的聚碳酸酯膜(8μm孔径)用0.1％的明胶覆盖；细胞用不含血清的培养基悬起，浓度控制在(1-10)×10⁵细胞/mL；细胞用或者不用来源于另一种细胞的细胞微粒子孵育2小时，然后将细胞加入上面的小室，同时向下面的小室加入0.5mL含有10％胎牛血清的培养基；在5％CO₂的细胞培养箱孵育4小时；迁移到下层的细胞用90％乙醇在室温下固定15分钟；洗涤；用0.1％的结晶紫室温染色15分钟；将留在滤膜上的细胞小心地刮下；拍照(Olympus，BX51，Japan)；细胞计数。

为了体内检测携带miRNA的细胞微粒子对于细胞与细胞，或者组织与组织之间的生理作用及其作用方式的影响，本发明采用了以下手段：向小鼠尾静脉注射细胞微粒子并检测其中包裹的miRNA在小鼠血管壁上的含量，以及在显微镜下检查通过小鼠尾静脉注射的荧光标记的细胞微粒子影响小鼠血管内皮细胞的情况。

其中，向小鼠尾静脉注射细胞微粒子并检测其中包裹的miRNA在小鼠血管壁上的含量的方法包括以下步骤：

(1)分离一种细胞的细胞微粒子；

(2)注射到小鼠尾静脉；

(3)取小鼠血管，提取RNA；

(4)Real-time PCR方法检测正常小鼠的血管组织与注射其他细胞细胞微粒子的小鼠血管组织中miRNA的变化。

其中，在显微镜下检查通过小鼠尾静脉注射的荧光标记的细胞微粒子影响小鼠血管内皮细胞的情况的方法包括以下步骤：

(1)用荧光标记细胞微粒子；

(2)将细胞微粒子通过尾静脉注射到小鼠体内；

(3)分离小鼠血管内皮层；

(4)荧光显微镜下观察。

目前，激素和细胞因子作为经典的信号分子与靶细胞上的受体分子结合并调节细胞间的通信，但它们只作用于一些特定的细胞，因为仅有一些特定的细胞能够分泌激素和细胞因子，而目前还没有发现适用于所有细胞的细胞间通信方式，也还没有细胞将细胞微粒子主动地、选择性地分泌的miRNA作为一种新的、能用于所有细胞的信号分子家族的任何报道。基于细胞微粒子载有微小核糖核酸这一发现，本发明人将研究目光锁定在(或类似微粒子的膜脂囊泡结构)携载微小核糖核酸的细胞微粒子的靶向性、稳定性及高效率以及它在生物学信号机制的研究、新的疾病机制的发现和新的疾病治疗方法的发展等方面的重大应用前景。由于微小核糖核酸分子是一类新型疾病标志物，因此希望通过对血清/血浆以及组织/细胞培养液中细胞微粒子所载微小核糖核酸是否存在，能否被检测，及其与靶细胞和疾病的相关性的研究，建立一种利用血清/血浆以及细胞培养液中稳定存在的细胞微粒子所载微小核糖核酸来进行新的细胞间信号通路、疾病机制、疾病治疗方法等方面研究的新技术。因此，本发明的目的是提供调节细胞微粒子内微小核糖核酸的方法及其应用。

本发明人已经开展了以细胞微粒子作为载体运送微小核糖核酸(miRNA)进入靶细胞的研究。由于细胞微粒子是细胞自身分泌的物质，具有生物亲和性，不会对生物体本身造成伤害；同时，由于细胞微粒子表面携带了来源细胞表面特异的表面分子，能够通过与靶细胞表面的受体/配体结合而高效、特异地将其携带的微小核糖核酸药物递送到靶细胞/组织。进入靶细胞/组织的微小核糖核酸可以发挥其功能，通过与靶基因信使核糖核酸特定序列的结合，阻断靶基因蛋白质翻译过程，从而起到特异性阻断基因表达的作用。

通过上述一系列的研究，本发明提供了一种具有较高靶向性、稳定性及高效率并在疾病机制的研究和治疗方面有重大应用前景的微小核糖核酸：细胞微粒子(或类似微粒子的膜脂囊泡结构)所载微小核糖核酸。并证明，通过调节细胞微粒子所载微小核糖核酸的含量，可以对疾病的预防和治疗起到一定的作用。

本发明需要解决的问题包括：(1)研究各种临床疾病(包括各种肿瘤；各种急慢性传染病，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病；其它急慢性疾病，如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，例如心脑血管疾病的循环系统疾病，内分泌代谢系统疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病)与细胞微粒子所载的微小核糖核酸的相关性；(2)调节细胞微粒子所载微小核糖核酸的含量，在体外制备载有特异微小核糖核酸的细胞微粒子，然后将其导入体内，利用细胞微粒子的稳定性及靶向能力将特定的微小核糖核酸传递到特定细胞/组织，从而达到组织功能改善或疾病治疗的效果。

细胞微粒子所载微小核糖核酸用于疾病治疗的具有以下几方面的有益效果：

(1)细胞微粒子有宿主细胞的特征，细胞微粒子种类及其所包含微小核糖核酸的变化可以直接确认病源细胞。

(2)细胞微粒子作为一种全新的、稳定、高特异的微小核糖核酸传递工具，可有效地将特定微小核糖核酸导入靶细胞/组织，从而改善细胞状况和治疗疾病。

总之，使用细胞微粒子及其所包含的微小核糖核酸不仅为人们在分子水平上全面了解细胞间信号传导通路和组织病变的机理提供了物质基础，也将加速临床疾病诊断学和治疗学的进步。当然，早期研究疾病机制、检测和治疗疾病的绝大多数分子技术还正处于初步的实验阶段，其有效性有待进一步的验证和提高。但是，基于细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸的优越性，相信不久的将来，利用细胞微粒子及其所包含微小核糖核酸对重症疾病如癌症的发病机制及其特异性治疗将会成为现实。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1A显示肿瘤特异性miRNAs在非小细胞肺癌病人和正常人的血清和血细胞中表达水平的比较；

图1B显示肿瘤特异性miRNAs在结直肠癌病人和正常人的血清和组织间表达水平的比较；

图2显示正常人血清/血浆细胞微粒子的透射电镜图；

图3显示正常人血清细胞微粒子中miRNAs的凝胶电泳结果图；

图4显示在动脉粥样硬化病人与正常人情况下微粒子所载miRNAs表达水平的比较；

图5A显示正常人全血经LPS处理与未经处理的细胞微粒子中miRNAs表达水平的比较；

图5B显示THP-1细胞经H₂O₂处理后与未经处理对照细胞微粒子中miRNA表达水平的比较；

图5C显示THP-1细胞经AGE处理后与未经处理对照细胞微粒子中miRNA表达水平的比较；

图5D显示THP-1细胞经FFAs处理后与未经处理对照细胞微粒子中miRNA表达水平的比较；

图6A显示通过导入微小核糖核酸前体升高细胞微粒子中微小核糖核酸含量结果；

图6B显示通过导入微小核糖核酸反义RNA降低细胞微粒子中微小核糖核酸的含量结果；

图7A显示THP-1细胞微粒子与HMEC-1细胞之间的特异性相互作用；

图7B显示miRNA在HMEC-1细胞、THP-1细胞和293T细胞中的表达水平；

图7C显示miRNA在HMEC-1细胞、分别经AGEs处理的THP-1和293T细胞微粒子温育的HMEC-1细胞中的表达水平；

图7D显示转入THP-1细胞微粒子的HMEC-1细胞中c-Myb蛋白的western blot结果图；

图7E和图7F分别显示未经THP-1细胞微粒子处理的HMEC-1细胞和经THP-1细胞微粒子处理的HMEC-1细胞的迁移照片；

图7G显示未经THP-1细胞微粒子处理的HMEC-1细胞和经THP-1细胞微粒子处理的HMEC-1细胞的迁移细胞计数结果图；

图7H显示尾静脉注射荧光标记的THP-1细胞微粒子进入小鼠血管内皮细胞；

图7I显示静脉注射THP-1或293T细胞微粒子对C57BL/6小鼠血管miRNAs表达水平的影响；

图8A-图8C分别显示未经细胞微粒子处理的HMEC-1细胞、经正常人或动脉硬化症病人血清/血浆细胞微粒子处理的HMEC-1细胞的迁移照片；

图8D显示未经细胞微粒子处理的HMEC-1细胞、经正常人或动脉硬化症病人血清/血浆细胞微粒子处理的HMEC-1细胞的的迁移细胞计数结果图；

图8E显示调节THP-1细胞微粒子中miRNA含量能影响靶细胞HEMC-1蛋白表达；

图8F显示调节THP-1细胞微粒子中miRNA含量能影响靶HMEC-1细胞迁移功能。

具体实施方式

可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。

实施例1血清和血细胞/组织的Solexa测序

本实施例使用Solexa测序技术发现血清与血细胞/组织中的miRNA呈负相关。

血清和血细胞的Solexa测序包括以下步骤：

(1)收集正常人和非小细胞肺癌病人的血样；

(2)离心分离出血清和血细胞；

(3)分别提取总RNA。提取用于Solexa测序的细胞RNA采用Trizol试剂(Invitrogen公司)；用于Solexa测序的血清RNA提取方法包括以下具体步骤：取100μl样品加入酸性酚，剧烈震荡混匀后加入氯仿，再次充分震荡混匀，12000g室温离心10分钟。小心吸取上清液加入到1000μl乙醇中，再加入醋酸钠40μl，充分混匀后室温静置10分钟后，16000g下4℃离心20分钟。充分弃上清后，加入75％乙醇1ml，轻柔颠倒数次，16000g下4℃离心10分钟。充分弃上清，室温干燥后，加入20μl DEPC水溶解沉淀。将重复样品混合后，加入等体积异丙醇混匀，16000g下4℃离心20分钟。充分弃上清，室温干燥后溶于100μl DEPC水中。取少许样品通过紫外分光光度计进行RNA定量。

(4)进行Solexa测序，具体步骤参照illumina公司操作说明书。

对Solexa测序结果进行分析发现，相对于正常人，非小细胞肺癌病人有16个肿瘤特异性的miRNAs在血细胞中表达下降而在血清中上升，具体结果见图1A。

血清和组织的Solexa测序包括以下步骤：

(1)搜集正常人和结肠癌病人的结肠组织和血清；

(2)分别提取总RNA。提取用于Solexa测序的结肠组织RNA采用Trizol试剂(Invitrogen公司)；用于Solexa测序的血清RNA提取方法与实施例1中血清和血细胞的Solexa测序步骤中用于Solexa测序的血清RNA的提取方法相同。

(3)进行Solexa测序，具体步骤参照illumina公司操作说明书。

对Solexa测序结果进行分析发现，相对于正常人，结肠癌病人有8个肿瘤特异性的miRNAs在结肠组织中下降而在血清中上升，具体结果见图1B。

以上结果证明，肿瘤特异性的miRNAs在上述两种癌症的组织/细胞中的表达与血清存在差异(呈负相关)，表明血清中miRNA并不仅是体内破碎细胞随机释放的，而是由细胞主动分泌并主动参与疾病发生发展的一种方式。因此提示，可以通过调节血清中miRNA的含量起到干预疾病发生发展的作用。

实施例2血清/血浆和细胞培养液中细胞微粒子的分离及观测本实施例分别采用以下方法分离出血清/血浆和细胞培养液中细胞微粒子：

(1)差速离心法：先将血清/血浆或培养细胞依次通过300g、1500g及10000g离心，除去各类细胞及碎片，然后将上清超速离心(110000g/)70分钟，取沉淀便是血清/血浆或细胞总的细胞微粒子。

(2)免疫吸附法：将细胞特异性的抗体吸附在组织培养皿上或直接用免疫磁珠，将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接和培养皿或免疫磁珠温育(30分钟或1小时)，不同细胞的细胞微粒子可直接被吸附和回收。

(3)过滤法：将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接放在带有100KD滤膜的浓缩离心管，在4000转/分钟进行离心，细胞微粒子将留在离心管内被浓缩获得。

将分离得到的细胞微粒子在透射电镜(FEI Tecnai T20透射电子显微镜)下观察。细胞微粒子电镜标本的制备及观察包括：细胞微粒子沉淀用2.5％戊二醛固定液在4℃固定过夜，PBS漂洗三遍，每遍10分钟。之后用1％的四氧化锇室温固定60分钟。固定后的样品用10％的明胶包埋，然后在4℃下用戊二醛再固定后，将样品切成小块(体积小于1立方毫米)。样品用依次增高浓度的乙醇溶液脱水(30％、50％、70％、90％、95％和100％×3)。用环氧树脂浸透包埋后，用Leica UC6超薄切片机切片，最后在120kV条件下透射电子显微镜观察。

采用差速离心法分离得到细胞微粒子的透射电镜图如图2所示，显示从正常人血清/血浆中分离到的细胞微粒子大小不一，分布在10-500nm范围内。

实施例3血清/血浆中细胞微粒子所载微小核糖核酸的RT-PCR实验

本实施例使用RT-PCR技术发现并证明人血清/血浆中细胞微粒子载有各种微小核糖核酸，且量上存在显著的差异，具体步骤为：

(1)收集正常人的血清/血浆；

(2)采用实施例2中所描述的差速离心法分离血清/血浆中细胞微粒子。

(3)分离制备cDNA样品：用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取细胞微粒子的总RNA，然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM各dNTP混合物(Takara公司)、0.5μl Rnase抑制剂(Takara公司)、2μl AMV(Takara公司)以及1.5μl需要检测的miRNA的特异性反向引物混合物，反应步骤为：16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

(4)PCR反应：将cDNA按1/50稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，0.25μl 10μM正向引物，0.25μl 10μM通用反向引物，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM各dNTP混合物(Takara公司)，2μl 10×PCR缓冲液，13.4μlH₂O，20μl体系进行PCR。PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行30个循环。

(5)电泳观察：PCR产物取10μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察。图3是以正常人血清为研究对象，从将血清中通过超高速离心分离总的细胞微粒子，然后直接进行RT-PCR的实验结果，选用人全部五百多个微小核糖核酸成熟体进行PCR反应，图3为其中的23种微小核糖核酸：let-7a、miR-101、miR-21、miR-22、miR-20a、miR-25、miR-26a、miR-106a、miR-24、miR-103、miR-107、miR-16、miR-1、miR-15a、miR-17、miR-18a、miR-146a、miR-451、miR-181a、miR-142-3p、miR-155、miR-150和miR-233。其中，miR-150、miR-21、miR-142-5p和miR-181a是血细胞特有的微小核糖核酸，let-7a是血细胞富集的miRNA。

由以上结果可知，细胞微粒子中确实携带有微小核糖核酸，并且各种微小核糖核酸的含量存在差异。

实施例4不同生理状态下血清/血浆和细胞中细胞微粒子所载微小核糖核酸的Real-time PCR实验

本实施例通过Real-time PCR技术发现并证明了动脉粥样硬化病人和正常人血清/血浆中细胞微粒子中miRNA表达量不同，具体步骤如下：

(1)抽取正常人和动脉粥样硬化病人的全血(抗凝)；

(2)参照实施例2中的差速离心法获得细胞微粒子。

(3)参照实施例3中的方法制备cDNA样品；

(3)Real-time PCR反应：选取血清/血浆细胞微粒子表达量较高的miR-125b、miR-16、miR-451、miR-142-3p及miR-150对正常人及动脉粥样硬化病人血清/血浆细胞微粒子中微小核糖核酸的表达量差异进行Real-time PCR验证。将cDNA按1/50稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，0.25μl 10μM正向引物，0.25μl 10μM通用反向引物，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM各种dNTP混合物(Takara公司)，1μl 20×EVA GREEN，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μlH₂O，20μl体系进行PCR。仪器使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪，反应条件为95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环；

(4)数据处理：数据处理方法为ΔC_T法，ΔC_T设为反应达到域值时的循环数，则两组样品微小核糖核酸的比较可以用方程2^-ΔCT表示，其中ΔC_T＝C_T组1-C_T组2。

结果如图4所示。从图4可以看出，血清/血浆细胞微粒子中的部分miRNA，如miR-125b、miR-16、miR-142-3p，特别是miR-451及miR-150的表达量在正常人和动脉粥样硬化病人之间有明显差别。提示在疾病状况下细胞微粒子中的微小核糖核酸的表达与正常情况下不同，即细胞微粒子中的微小核糖核酸与疾病相关。微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生。反之，如果抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量增加或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量减少都会导致下游一系列促进疾病进程的基因表达的下降，进而抑制疾病发生或发展。因此，微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点，通过抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸和过表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。提示可以通过调节细胞微粒子微小核糖核酸的含量，起到预防/治疗疾病的作用。

实施例5通过加入刺激物的方法调节细胞微粒子中的微小核糖核酸含量

本实施例通过向正常人全血中加入刺激物，证明刺激物作用下血细胞分泌的细胞微粒子中的微小核糖核酸的含量发生改变。

具体步骤如下：

(1)抽取人全血(抗凝)，将全血平均分成两份，在其中一份加入100ng/mL脂多糖(LPS)，于37℃温育1小时，另一份不加LPS作为对照；

(2)参照实施例2中的差速离心法，分别将上述两份全血差速离心得到脂多糖(LPS)处理的细胞微粒子(LPS处理)和未经脂多糖处理的细胞微粒子(对照)；

(3)参照实施例3中的方法制备cDNA样品；

(4)参照实施例4中的方法进行Real-time PCR反应；

(5)参照实施例4的方法进行数据分析。

结果如图5A所示。从图5A中可以看出，对正常人全血进行处理后，细胞微粒子中的部分miRNA上升，比较明显的是与免疫相关的miRNA，例如miR-181a、miR-146a、miR-150等。

另外，本实施例还证明了在其他刺激因子的作用下也能引发培养的细胞分泌的细胞微粒子中的微小核糖核酸的含量发生改变。

具体实验步骤如下：

(1)选择在炎症反应中起重要作用的人单核细胞/巨噬细胞系THP-1作为研究对象，THP-1细胞培养在添加了10％胎牛血清(Gibco，USA)的RPMI 1640培养基(Gibco，USA)中，5％CO₂、37℃下培养。分别用自由脂肪酸(FFAs，终浓度400μM)、高级糖基化终产物(AGEs，终浓度100μg/mL)和H₂O₂(终浓度100μM)刺激THP-1，BSA处理作为对照；

(2)将培养细胞1000转/分钟离心，收集细胞沉淀，其上清参照实施例3中的差速离心法，分别分离细胞微粒子；

(3)参照实施例3中的方法制备cDNA样品；

(4)参照实施例4中的方法进行Real-time PCR反应，采用miR-16作为标准品，绘制标准曲线；

(5)通过与标准曲线对照，得出所检测各种miRNA的绝对表达量，并进行统计学分析。

结果见图5B-D。从图可以看出，THP-1经过FFAs(即油酸(OA)/软脂酸(PA)处理，图5D)、AGEs(图5C)和H₂O₂(图5B)刺激后，细胞微粒子中微小核糖核酸的含量与刺激前完全不同。例如在H₂O₂的刺激下，细胞微粒子中miR-26a、miR-29a、miR-222表达量急剧下降，而miR-150、miR-181b含量上升。提示可以通过加入刺激改变细胞微粒中微小核糖核酸的含量。

实施例6通过导入微小核糖核酸前体(pre-miRNA)和反义核糖核酸(antisence RNA)改变细胞微粒子中微小核糖核酸含量。

本实施例通过人工在体外导入miR-150的pre-miRNA，升高细胞微粒中miR-150的含量。

具体包括以下步骤：

首先，通过采用脂质体(invetrogen公司Lipofectamine 2000)将pre-miRNA转染进入THP-1细胞，具体方法如下：

(1)THP-1细胞培养在添加了10％胎牛血清(Gibco，USA)的RPMI1640培养基(Gibco，USA)中，5％CO₂、37℃培养。

(2)将30μllipofectamine 2000和600pmol的阴性对照pre-RNA分别与1ml OPTI-MEM培养基(Gibco，USA)混合，形成混合物A和混合物B，室温下放置5min。

(3)将30μl lipofectamine 2000和600pmol的miR-150前体(pre-miR-150)分别与1ml OPTI-MEM培养基(Gibco，USA)混合，形成混合物C和混合物D，室温下放置5min。

(4)将混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。

(5)将混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。

(6)将混合物E和F分别加入对照组和实验组细胞中，补足OPTI-MEM培养基到15ml。5％ CO₂、37℃培养。

(7)6小时后更换成正常培养液。

(8)24h～48h后转染结束，收集细胞，参照实施例2分离制备微小核糖核酸的方法分离制备导入pre-miR-150后的细胞微粒子。

其次，参照实例4中Real time-PCR方法检测细胞微粒中miR-150的含量。

结果如图6A所示，转染过的细胞微粒子中的miR-150的含量显著提高，提示可以通过在体外导入微小核糖核酸前体的方式提高某种特异微小核糖核酸的含量。

通过导入miR-150 antisence RNA，降低细胞微粒子中miR-150含量的方法具体包括以下步骤：

首先，通过采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将miR-150 antisenceRNA转染进入THP-1细胞，具体方法如下：

(2)将30μl lipofectamine 2000和600pmol的阴性对照antisence RNA分别与1ml OPTI-MEM培养基(Gibco，USA)混合，形成混合物A和混合物B，室温下放置5min。

(3)将30μl lipofectamine 2000和600pmol的miR-150 antisence RNA分别与1ml OPTI-MEM培养基(Gibco，USA)混合，形成混合物C和混合物D，室温下放置5min。

(4)将混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。

(5)将混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。

(6)将混合物E和F分别加入对照组和实验组细胞中，补足OPTI-MEM培养基到15ml。5％CO2、37℃培养。

(7)6小时后更换成正常培养液。

(8)24h～48h后转染结束，收集细胞参照实施例2的方法分离制备微小核糖核酸。

结果如图6B所示，转染过的细胞微粒子中的miR-150含量显著降低，提示可以通过在体外导入某种特异微小核糖核酸的antisence RNA，降低其含量。

实施例7细胞微粒子及其所载微小核糖核酸与靶细胞的相互作用。

本实施例利用共聚焦显微镜技术、Real-time PCR技术、western blot技术和细胞迁移实验技术，发现并证明细胞微粒子所载微小核糖核酸可以在不相邻细胞间靶向、高效地传递，并对靶细胞的功能产生一定的影响。

首先，利用染料diI-C₁₆(1h，37℃)将THP-1细胞进行荧光标记(红色)，用AGEs刺激THP-1(6h，37℃)，离心分离THP-1细胞分泌的微粒子，将THP-1细胞分泌的微粒子加入毛细血管内皮细胞(HMEC-1)37℃温育6h HMEC-1培养在添加了10ng/mL表皮生长因子(Becton-Dickinson，USA)、10ng/mL氢化可的松(Sigma)和10％胎牛血清(Gibco，USA)的MCDB-131培养基中，5％CO₂、37℃下培养。共聚焦显微镜(FV1000，Olympus)下观察，结果见图7A，蓝色为HMEC-1细胞的细胞核染色。从图7A中可以发现，THP-1细胞微粒子能够进入毛细血管内皮细胞HMEC-1中和HMEC-1细胞发生特异性相互作用。

其次，细胞微粒子所载的miRNAs能够提高靶细胞中相应的miRNAs水平，例如miR-150。具体步骤为：

(1)筛选THP-1、293T和HMEC-1细胞的miRNA表达谱，结果如图7B所示。与HMEC-1细胞相比，THP-1细胞中各种miRNA的表达量有很大不同。特别是mir-150，其在THP-1中的表达量远远高于HMEC-1细胞，因此可以将其作为研究对象，研究细胞微粒子携带的miRNA与其靶细胞的相互作用。

(2)用100μg/mL AGEs刺激THP-1和293T细胞；

(3)参照实施例2中的差速离心法，分别离心分离THP-1和293T细胞的细胞微粒子；

(4)将分离到的细胞微粒子分别与HMEC-1在37℃温育6小时。

(5)分别提取未经细胞微粒子处理的的HMEC-1细胞和经THP-1和293T细胞来源的细胞微粒子温育的HMEC-1细胞的总RNA，参照实施例3中的方法制备cDNA样品；

(6)参照实施例4中的方法进行Real-time PCR反应；

(7)参照实施例4中的方法进行数据分析。

结果见图7C，从图中可以看出，高表达miR-150的THP-1的细胞微粒子处理HMEC-1，能使原先低表达miR-150的HMEC-1中的miR-150升高十多倍，而相对低表达miR-150的293T细胞的细胞微粒子处理HMEC-1不能明显提高HMEC-1中miR-150的含量，这表明HMEC-1的miR-150水平升高是由THP-1的细胞微粒子所载的高丰度的miR-150引起的，而不是由细胞微粒子转入引起miR-150的内源性升高引起的。

再次，通过细胞微粒子转入HMEC-1的miR-150能够下调HMEC-1中靶蛋白c-Myb的表达，从而增强HMEC-1的迁移能力。具体实验步骤为：

(1)100μg/mL AGEs刺激THP-1细胞；

(2)参照实施例2中的差速离心法，分离THP-1细胞微粒子；

(3)将THP-1细胞微粒子加入HMEC-1，37℃温育3h、6h、12h；

(4)分别提取总蛋白进行western blot检测，以未用THP-1细胞微粒子温育的HMEC-1的总蛋白为对照，以GAPDH为内参，结果见图7D。从该图中可以看出，转入THP-1细胞微粒子的HMEC-1的c-Myb蛋白明显下调，由于微小核糖核酸主要是通过阻断其靶基因蛋白质翻译过程，因此检测c-Myb蛋白含量就能间接证明细胞微粒子携带的miR-150在靶细胞中发挥作用。

由于c-Myb蛋白在细胞增殖、分化和迁移中起重要作用，因此还检测了经THP-1细胞微粒子温育的HMEC-1迁移能力的变化情况，具体步骤如下：

(1)将Transwell小室(Transwell Boyden Chamber，6.5mm，Costar，Cambridge，MA，USA)的上面小室底部的聚碳酸酯膜(8μm孔径)用0.1％的明胶覆盖；

(2)HMEC-1细胞用不含血清的培养基悬起，浓度控制在(1-10)×10⁵/mL；用THP-1细胞微粒子孵育细胞2小时，以未THP-1细胞微粒子孵育的细胞为对照，然后将细胞加入上面的小室，同时在下面的小室中加入0.5mL的含有10％胎牛血清的培养基，于5％CO₂的细胞培养箱孵育4h；

(3)将迁移到下层的细胞用90％乙醇在室温下固定15分钟，洗涤，用0.1％的结晶紫室温染色15分钟，将留在滤膜上的细胞小心地刮下，拍照(Olympus，BX51，Japan)，结果见图7E(未经THP-1细胞微粒子孵育的对照)和图7F(经THP-1细胞微粒子孵育)，显微镜下计数随机选择的5个视野中的细胞数目，结果见图7G。从拍照和计数的结果都可以看出，经过THP-1细胞微粒子处理的HMEC-1的迁移能力由于c-Myb蛋白的下调而明显增强。

通过以上的实验结果不难发现，不同的细胞可以分泌miRNAs到细胞微粒子中，通过细胞微粒子将miRNAs传递给其受体细胞并在受体细胞中发挥功能。提示可以将微粒子中的miRNA作为药物，利用微粒子与靶细胞的高亲和性特异性的递送到靶细胞中，通过影响参与疾病发病的靶细胞的功能，达到药物预防/治疗的目的。

另外，THP-1的细胞微粒子也传递其它miRNAs，如miR-136、miR-30c、miR-26a到HMEC-1中，同时，HMEC-1和293T细胞之间也有miRNAs的交换。因此，除了研究miR-150，研究THP-1MPs中其他miRNAs被递送到HMEC-1中所发挥的生物学功能以及THP-1、HMEC-1和293T细胞在各种病理生理条件下相互间的通信机制也很有意义。

本实施例还检测了细胞微粒子所载的微小核糖核酸在体内进入其靶细胞的能力。

首先，用荧光标记THP-1细胞微粒子，具体步骤包括：利用染料diI-C₁₆(1h，37℃)将THP-1细胞进行荧光标记(红色)，培养12小时，离心分离被荧光标记的THP-1细胞微粒子并静脉注射到C57BL/6小鼠体内，6h后，分离小鼠血管内皮层，荧光显微镜下观察。结果如图7H-I所示，与注射没有荧光标记的细胞微粒子(图7H左)的对照相比，注射过荧光标记的THP-1细胞微粒子(图7H右)的小鼠血管内皮层明显被荧光标记。说明，细胞微粒子在体内可以通过血液循环进入生物体，并高效进入其靶细胞中。

同时参照实施例4中的方法使用Real-time PCR技术检测小鼠血管组织中miRNAs的表达形式和水平，结果见图7I。从该图可以看出，miR-150、miR-138和miR-181a在小鼠静脉注射细胞微粒子6h后升高，表明细胞微粒子所包载的miRNAs在体内可以被递送到靶细胞或组织。

以上结果说明，细胞微粒子是一种优良的细胞间传递媒介。在体外和体内情况下，其都可以在细胞之间高效特异性的传递微小核糖核酸。依靠微小核糖核酸对其靶基因蛋白表达的抑制作用，特异性的影响细胞功能。因此，如果依靠细胞微粒子所载微小核糖核酸特意性地降低在疾病发生发展过程中起作用的基因的表达，就能在一定程度上起到预防/治疗疾病的作用。从而，载有微小核糖核酸的细胞微粒子就可以作为药物，在疾病的预防/治疗中发挥作用。

实施例8通过调节细胞微粒子内微小核糖核酸含量起到预防/治疗疾病的作用。

本实施例通过调节供体细胞细胞微粒子中微小核糖核酸的含量，检测其对受体细胞功能的影响，从而证明调节细胞微粒子中微小核糖核酸的含量能够起到阻碍疾病发生发展的作用。

本实施例以动脉粥样硬化疾病状况下的巨噬细胞和内皮细胞作为研究对象，研究携带微小核糖核酸的细胞微粒子对疾病发展的缓解作用。

由于在慢性炎症状态下细胞微粒子的种类和数量都会增高，并且血管内皮细胞的增殖和迁移是动脉粥样硬化症的主要过程，因此首先研究了严重的动脉粥样硬化症病人血清/血浆中细胞微粒子中的miRNA表达量是否发生改变以及能否增强HMEC-1细胞的迁移能力，具体包括以下两方面的内容：

一方面，比较正常人和动脉硬化症病人血清/血浆细胞微粒子中miR-150和其他miRNAs的表达水平，具体方法如下：

(1)参照实施例2中的差速离心法，分别分离正常人和动脉粥样硬化症病人血清/血浆中的细胞微粒子；

(2)参照实施例2中的方法制备cDNA样品；

(3)参照实施例4中的方法进行Real-time PCR反应；

(4)参照实施例4中的方法进行数据分析。

结果见图4。从图4中可以看出，相对于正常人血清/血浆细胞微粒子，动脉硬化症病人血清/血浆细胞微粒子中的miR-150以及miR-451显著的升高。

另一方面，研究动脉粥样硬化症病人血清/血浆中细胞微粒子对HMEC-1细胞迁移能力的影响，以不加血清/血浆细胞微粒子处理的HMEC-1作为对照，结果见图8A-C，其中图8A为对照的细胞迁移照片(对照)，图8B为正常人血清/血浆细胞微粒子处理的细胞迁移照片(正常人MV处理)，图8C为动脉粥样硬化症病人血清/血浆细胞微粒子处理的细胞迁移照片(病人MV处理)，对迁移细胞进行计数，结果如图8D所示。从该图中可以看出，相对于没有经过细胞微粒子处理的HMEC-1，经过动脉粥样硬化症病人血清/血浆细胞微粒子处理的HMEC-1迁移能力有显著增强，而正常人血清/血浆细胞微粒子对HMEC-1的迁移能力没有影响。

以上结果表明在各种生理病理条件下，巨噬细胞中miR-150的升高加速了血管内皮细胞的迁移，从而加速动脉粥样硬化及血管损伤导致的肥胖、高血糖和慢性炎症。

因此提示，如果降低巨噬细胞微粒子中miR-150的含量，就可以减少其对内皮细胞迁移的促进作用，进而延缓上述疾病的发生发展，从而对疾病起到治疗作用。

本实施例通过导入miR-150反义核糖核酸的方法，降低巨噬细胞系THP-1细胞微粒子中miR-150的含量，检测该微粒子对内皮细胞迁移能力的影响。

具体包括以下步骤：

(1)参照实施例6，通过导入反义核糖核酸的方法降低THP-1微粒子中miR-150的含量。

(2)参考实施例2分离制备THP-1细胞微粒子。

(3)THP-1细胞微粒子孵育HMEC-1细胞6小时。

(4)参考实施例7检测c-myb蛋白含量及HMEC-1迁移能力。

HMEC-1中c-myb蛋白的表达量如图8E所示，可见与正常的THP-1微粒子(对照)相比降低了miR-150含量的THP-1微粒子(反义RNA)能显著提高HMEC-1细胞中c-myb蛋白的表达。HMCE-1细胞的迁移能力如图8F所示，与正常的THP-1微粒子相比(对照)降低了miR-150含量的THP-1微粒子(反义RNA)能明显抑制HMEC-1细胞的迁移能力。

由于在粥样动脉硬化过程中，巨噬细胞微粒中miR-150的升高加速了血管内皮细胞的迁移，从而加速动脉粥样硬化的发生及血管损伤导致的肥胖、高血糖和慢性炎症。因此理论上，如果能降低巨噬细胞微粒子中miR-150的含量，就能阻碍动脉粥样硬化的发生发展从而起到对疾病的预防和治疗作用。我们选择了巨噬细胞系THP-1和内皮细胞系HMEC-1细胞模拟体内巨噬细胞与内皮细胞的相互作用，从结果可见，通过降低THP-1细胞中miR-150的含量，可以降低其靶细胞HMEC-1的迁移能力。

因此，可以通过调节(升高或降低)细胞微粒子中特定微小核糖核酸的含量，起到预防治疗疾病的作用。

Claims

1.一种调节生物体内微小核糖核酸含量的方法，该方法包括以下步骤：

(1)调节供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的含量；

(2)分离供体细胞细胞微粒子；

(3)将分离的细胞微粒子引入生物体内。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体细胞细胞微粒子的来源选自体液，优选为血液；细胞培养物；和组织中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述调节供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的含量步骤为增加或减少供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的表达量。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述增加供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的表达量的方法为施加外源性刺激和/或导入微小核糖核酸前体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述施加外源性刺激包括以下步骤：在体外培养的细胞中加入一种或多种能够影响细胞的炎症反应、代谢情况、生活周期和功能的外源性刺激物，例如激素、细胞因子、脂多糖、自由脂肪酸、高级糖基化终产物和过氧化氢，然后孵育。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述导入微小核糖核酸前体包括以下步骤：采用脂质体载体将相应的微小核糖核酸前体导入细胞内，然后孵育。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述减少供体细胞细胞微粒子中的微小核糖核酸的表达量的方法为施加外源性刺激和/或导入微小核糖核酸的反义RNA。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述施加外源性刺激包括以下步骤：在体外培养的细胞中加入一种或多种能够影响细胞的炎症反应、代谢情况、生活周期和功能的外源性刺激物，例如激素、细胞因子、脂多糖、自由脂肪酸、高级糖基化终产物和过氧化氢，然后孵育。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述导入微小核糖核酸的反义RNA包括以下步骤：采用脂质体载体将相应的微小核糖核酸的反义RNA导入细胞内，然后孵育。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离供体细胞细胞微粒子的方法选自差速离心法、免疫吸附法和超滤法中的一种或多种。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述差速离心法包括以下步骤：

(2)将上清以1500g的转速离心20分钟，取上清；

(3)将上清以10000g的转速离心30分钟，取上清；

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述免疫吸附法包括以下步骤：

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述超滤法包括以下步骤：

(2)将上清置于带有100KD滤膜的浓缩离心管中，在4000转/分钟的转速下离心、浓缩即得。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物体选自人；动物，例如软骨鱼、硬骨鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳类；微生物，例如细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、放线菌和病毒中的一种或多种。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒选自DNA病毒和RNA病毒，例如乙肝病毒、天花病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、SARS病毒和流感病毒中的一种或多种。

16.一种预防和/或治疗疾病的方法，该方法包括采用根据权利要求1至15中任一项所述的方法来调节人或动物体内与疾病相关的微小核糖核酸的含量。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述微小核糖核酸的含量增加或减少与疾病发生和/或发展相关。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述疾病选自肿瘤；急、慢性传染病，例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病和SARS等病毒性疾病，例如肺结核、细菌性肺炎等细菌性疾病，以及其它病原微生物导致的急、慢性传染病；呼吸系统疾病；免疫系统疾病；血液与造血系统疾病；循环系统疾病，例如心脑血管疾病；内分泌系统疾病；消化系统疾病；神经系统疾病；泌尿系统疾病；生殖系统疾病以及运动系统疾病中的一种或多种。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其特征在于，所述疾病选自动脉粥样硬化，血管损伤导致的肥胖、高血糖和慢性炎症中的一种或多种。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其特征在于，所述与疾病相关的微小核糖核酸选自let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a和miR-99b中的一种或多种，例如，miR-16、miR-26a、miR-29a、miR-30c、miR-125b、miR-138、miR-142-3p、miR-150、miR-181a、miR-181b、miR-136、miR-146a、miR-222和miR-451中的一种或多种。

21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其特征在于，所述与疾病相关的微小核糖核酸选自选自miR-125b、miR-16、miR-142-3p、miR-451和miR-150中的一种或多种，例如miR-451和miR-150，再如miR-150。