CN107937621A - miRNA的应用、应用其的产品及检测方法 - Google Patents

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CN107937621A CN201810030051.7A CN201810030051A CN107937621A CN 107937621 A CN107937621 A CN 107937621A CN 201810030051 A CN201810030051 A CN 201810030051A CN 107937621 A CN107937621 A CN 107937621A
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Abstract

本发明提供了一种miRNA的应用、应用其的产品及检测方法，涉及生物技术领域，本发明中提供的miR‑195、miR‑1204或miR‑101可以作为梅毒感染相关疾病的生物标志物，并研制相应的疾病进展监测、辅助诊断试剂盒，用于梅毒感染的风险预估与检测，对我国梅毒的预防及治疗必定有很好的帮助。另外，本发明还提供了上述miR‑195、miR‑1204或miR‑101的检测方法，借助于实时定量PCR的技术来统计微小RNA变化，具有分析样本需要量小、自动化程度高、避免污染等优点。

Description

miRNA的应用、应用其的产品及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种miRNA的应用、应用其的产品及检测方法。
背景技术
梅毒在我国高发，并且正在增加。潜伏梅毒比例逐渐上升，临床中潜伏梅毒甲苯胺红不加热血清试验(tolulized red unheated serum test，TRUST)滴度较低，甚至有部分患者TRUST阴性。同时，据统计梅毒治疗后30％左右的患者出现血清固定的情况，流行病学结果显示潜伏梅毒治疗后发生血清固定的概率最高。综上所述，TRUST作为判断梅毒活动性的诊断准确性不够。
目前正在使用的诊断技术：
梅毒的诊断目前主要有暗视野显微镜观察和血清学检测。
1)暗视野显微镜：从一期梅毒硬下疳渗出液中，可以用暗视野显微镜观察到梅毒螺旋体。本方法是最直接的诊断方法。但是本方法有很大的局限性，机体梅毒螺旋体感染后，在组织和血液中很难再用本方法找到螺旋体。
2)血清学检测：目前主要使用的检测方法，分为梅毒螺旋体特异性抗体检测和非梅毒螺旋体抗体特异性检测。当机体感染梅毒后，可以检测到梅毒螺旋体特异性抗体阳性，但是多数感染了梅毒螺旋体的患者，梅毒螺旋体特异性抗体终身阳性，即使治疗后也不会降低或转阴。非梅毒螺旋体抗体检测目前主要被用于疾病活动性检测，一般认为正规青霉素治疗后，大部分患者能达到临床治愈和血清治愈，治疗后3个月降低4倍，6个月降低8倍，但有部分患者的非梅毒螺旋体抗体降到某个滴度(一般≤1∶8)时不再下降，维持在低滴度3个月以上，甚至终生阳性，称为血清固定。
MicroRNAs(即miRNAs)是今年来分子生物学研究领域的一份热点，它的成熟状态是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，进化上具有高度的保守性，可在转录后水平上对基因表达进行调节，并参与哺乳动物几乎所有的病理和生理活动，如个体发育、组织分化、细胞凋亡和免疫调节等，与许多疾病的发生、发展存在着紧密的联系。已有许多研究显示，在一些慢性感染疾病中，病原体会影响宿主的miRNAs表达。miRNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，并且存在显著的疾病特异性。综上所述，miRNAs可作为梅毒感染的潜在分子标志物。
但是，目前没有关于外周血单个核细胞(PBMCs)中miRNAs用于梅毒感染的诊断标志物及预后的辅助判断等方面的报道。
因此，开发能够作为诊断梅毒感染的标志物的miRNAs尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供miR-195、miR-1204或miR-101任意一种或多种物质在制备用于诊断梅毒的产品中的应用，以缓解现有技术中存在的对梅毒感染相关的特定小RNA研究尚有不足的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种用于诊断梅毒的试剂。
本发明的第三个目的在于提供一种用于诊断梅毒的试剂盒。
本发明的第四个目的在于提供miR-195、miR-1204或miR-101任意一种或多种物质的检测方法，以缓解现有技术中对上述三种小RNA的检测特异性不够强的技术问题。
本发明提供了如下(a)-(c)任意一种或多种物质在制备用于诊断梅毒的产品中的应用：
(a)miR-195；
(b)miR-1204；
(c)miR-101。
进一步地，所述miR-195的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述miR-1204的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述miR-101的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步地，所述用于诊断梅毒的产品为试剂或试剂盒。
本发明还提供了一种用于诊断梅毒感染的试剂，所述试剂包括如下(A)-(C)任意一种或多种物质：
(A)用于检测miR-195的引物；
(B)用于检测miR-1204的引物；
(C)用于检测miR-101的引物。
本发明还提供了一种用于诊断梅毒感染的试剂盒，所述试剂盒包括如下(A)-(C)任意一种或多种物质或权利要求4所述的试剂：
(A)用于检测miR-195的引物；
(B)用于检测miR-1204的引物；
(C)用于检测miR-101的引物。
进一步地，
所述用于检测miR-195的引物具有如SEQ ID No.4所示序列的上游引物和如SEQID No.5所示序列的下游引物；
所述用于检测miR-1204的引物具有如SEQ ID No.6所示序列的上游引物和如SEQID No.7所示序列的下游引物；
所述用于检测miR-101的引物具有如SEQ ID No.8所示序列的上游引物和如SEQID No.9所示序列的下游引物。
进一步地，所述试剂盒还包括miR-195标准品、miR-1204标准品、miR-101标准品和试剂。
进一步地，所述试剂为逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶。
另外，本发明还提供了一种如下(a)-(c)任意一种或多种物质的检测方法，所检测述方法包括：提取样本RNA进行荧光定量qPCR反应，得到所述(a)-(c)任意一种或多种物质的相对表达量；
所述(a)-(c)为：
(a)miR-195；
(b)miR-1204；
(c)miR-101。
进一步地，所述样本RNA为外周血单个核细胞的RNA。
本发明提供的miR-195、miR-1204或miR-101通过实验筛选发现在患有梅毒感染的患者的外周血单个核细胞中特异性表达，且表达显著上升。因此本发明中提供的miR-195、miR-1204或miR-101可以作为梅毒感染相关疾病的生物标志物，并研制相应的疾病进展监测、辅助诊断试剂盒，用于梅毒感染的风险预估与检测，对我国梅毒的预防及治疗必定有很好的帮助。另外，研究这些与梅毒相关的miRNAs表达对于梅毒免疫机制的研究也提供了理论基础，找到血清固定发生的潜在机制，从而开发具有潜在治疗价值的新型小分子药物。另外，本发明还提供了上述miR-195、miR-1204或miR-101的检测方法，借助于实时定量PCR的技术来统计微小RNA变化，具有分析样本需要量小、自动化程度高、避免污染等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4提供的利用荧光定量PCR方法检测miR-195在各组待测血液样本中的含量的结果图；
图2为本发明实施例4提供的利用荧光定量PCR方法检测miR-1204在各组待测血液样本中的含量的结果图；
图3为本发明实施例4提供的利用荧光定量PCR方法检测miR-101在各组待测血液样本中的含量的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了如下(a)-(c)任意一种或多种物质在制备用于诊断梅毒的产品中的应用：
(a)miR-195；
(b)miR-1204；
(c)miR-101。
本发明提供的miR-195、miR-1204或miR-101通过实验筛选发现在患有梅毒感染的患者的外周血单个核细胞中特异性表达，且表达显著上升。因此本发明中提供的miR-195、miR-1204或miR-101可以作为梅毒感染相关疾病的生物标志物，并研制相应的疾病进展监测、辅助诊断试剂盒，用于梅毒感染的风险预估与检测，对我国梅毒的预防及治疗必定有很好的帮助。另外，研究这些与梅毒相关的miRNAs表达对于梅毒免疫机制的研究也提供了理论基础，找到血清固定发生的潜在机制，从而开发具有潜在治疗价值的新型小分子药物。
其中，单独的miR-195或miR-1204或miR-101均可分别用于检测梅毒；两两组合，即miR-195与miR-1204，或miR-195与miR-101，或miR-1204与miR-101均可分别用于检测梅毒；三种miRNA组合，即miR-195、miR-1204与miR-101组合也可用于检测梅毒。
在一个优选的实施方式中，miR-195的核苷酸序列为：5’-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3’(SEQ ID No.1)；miR-1204的核苷酸序列为：5’-UCGUGGCCUGGUCUCCAUUAU-3’(SEQ ID No.2)；miR-101的核苷酸序列为：5’-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3’(SEQ ID No.3)。
其中，本发明中涉及的miR-195可以为：与SEQ ID NO.1所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.1所示序列的序列，或者SEQ ID NO.1所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.1所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.1所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.1所示序列完全相同的序列。
本发明中涉及的miR-1204可以为：与SEQ ID NO.2所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.2所示序列的序列，或者SEQ ID NO.2所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.2所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.2所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.2所示序列完全相同的序列。
本发明中涉及的miR-101可以为：与SEQ ID NO.3所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.3所示序列的序列，或者SEQ ID NO.3所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.3所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.3所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.3所示序列完全相同的序列。
在一个优选的实施方式中，用于诊断梅毒的产品为试剂或试剂盒。
本发明还提供了一种用于诊断梅毒感染的试剂，包括如下(A)-(C)任意一种或多种物质：
(A)用于检测miR-195的引物；
(B)用于检测miR-1204的引物；
(C)用于检测miR-101的引物。
本发明还提供了一种用于诊断梅毒感染的试剂盒，包括如下(A)-(C)任意一种或多种物质或上述的试剂：
(A)用于检测miR-195的引物；
(B)用于检测miR-1204的引物；
(C)用于检测miR-101的引物。
本试剂或试剂盒中提供的用于检测miR-195的引物能够特异性的检测miR-195，用于检测miR-1204的引物能够特异性的检测miR-1204，用于检测miR-101的引物能够特异性的检测miR-101，引物特异性好，灵敏度高，扩增结果准确。
上述引物的核苷酸序列如下表所示：
引物名称 序列(5’-3’) 序号
miR-195的引物 TAGCAGCACAGAAATATTGGC SEQ ID No.4
miR-1204的引物 CGTGGCCTGGTCTCCATTAT SEQ ID No.5
miR-101的引物 CGCTGGACTGTGATAACTGAA SEQ ID No.6
在一个优选的实施方式中，试剂盒还包括miR-195标准品、miR-1204标准品、miR-101标准品和试剂。
其中，miR-195标准品具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，miR-1204标准品具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，miR-101标准品具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
在一个优选的实施方式中，试剂为逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶。
另外，本发明还提供了一种如下(a)-(c)任意一种或多种物质的检测方法，包括：提取样本RNA进行荧光定量qPCR反应，得到所述(a)-(c)任意一种或多种物质的相对表达量；
其中(a)-(c)为：
(a)miR-195；
(b)miR-1204；
(c)miR-101。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述样本RNA为外周血单个核细胞的RNA。
本发明还提供了上述miR-195、miR-1204或miR-101的检测方法，借助于实时定量PCR的技术来统计微小RNA变化，具有分析样本需要量小、自动化程度高、避免污染等优点。
在一个优选的实施方式中，如下(a)-(c)任意一种或多种物质的检测方法，包括：
步骤(a)：临床样本的收集及病例排除标准；
步骤(b)：临床样本的处理，包括血浆分离、微小核糖核酸的收集、定性定量分析；
步骤(c)：荧光定量PCR反应；
步骤(d)：数据的统计分析。
在一个优选的实施方式中，样本RNA为外周血单个核细胞的RNA。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。
本实施例中所用的待测样本为选取了南方医科大学皮肤病医院感染梅毒患者的血液样本，所有病例均从病人本人或家属获得知情同意，相关病人信息完整并按规定建立临床资料数据库。其中，血液样本包括：未感染梅毒者的血液样本、感染梅毒未治疗患者的血液样本、治疗后血清固定患者的血液样本和治疗后血清治愈者的血液样本。
实施例1 PBMC分离
1.准备实验耗材：15ml BD离心管、50ml BD离心管、2ml Corning冻存管、1640培养液(含10％FBS)、淋巴细胞分离液、生理盐水。将以上耗材放入超净台内，30min紫外消毒。
2.将5ml淋巴细胞分离液加入15ml离心管，共8管，瞬时离心。
3.将分离血浆后的8个EDTA管摇匀后，分装17ml两组未感染梅毒者的血液样本、两组感染梅毒未治疗患者的血液样本、两组治疗后血清固定患者的血液样本和两组治疗后血清治愈者的血液样本至50ml离心管内，加入生理盐水至40ml。
4.将摇匀混合的40ml血液稀释液缓慢加入15ml离心管。
5.把15ml离心管放入离心机，800g离心30min，保持室温为18-26℃。
6.离心后看到的白膜层即为PBMC。
7.去除PBMC层1cm以上的血浆，将4管PBMC尽可能多的转移至新的15ml离心管(大约吸取5ml左右)，另外4管PBMC做相同处理。
8.含PBMC的离心管内加入培养液至10ml，轻轻倒置混匀。
9.将15ml离心管放入离心机，800g离心10min。
10.去除上清，摇晃管底重悬细胞。
11.加入5ml培养液重悬细胞，800g离心10min。
12.去除上清，摇晃管底重悬细胞。
13.加入5ml培养液重悬细胞。
14.取重悬细胞溶液90μl至1.5ml EP管，加入台盼蓝工作液10μl并混匀，取10μl至细胞计数板，显微镜下计数。
15.取1.5ml EP管内加入2×105个细胞，加50μl 1％HAS人血清白蛋白，随后通过培养液加至200μl，按血涂片方法制作PBMC细胞涂片。
16.将含有重悬细胞溶液的15ml离心管放入离心机，800g离心10min。
实施例2 RNA提取
1.将本发明实施例1中提取好的PBMC细胞，用1ml trizol裂解，裂解后冰上孵育5min。
2.加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，冰上孵育5min，4℃12000rpm离心15min。
3.收集上层水相，切勿吸到中层沉淀与下层有机相。加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀。室温放置20min。
4. 4℃12000rpm离心10分钟。小心去掉上清，加入1ml 75％乙醇，洗去盐离子。
5. 4℃ 12000rpm离心5分钟。小心弃掉上清，室温烘干5min，30μl DEPC水溶解RNA备用。
实施例3 荧光定量qPCR反应
一、反转录
1.使用Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis试剂盒对RNA进行反转录。
2.在去RNA酶的PCR管中，加入以下体系：
3.PCR反应：37℃1小时，85℃5min。
4.加入90水至PCR产物中，-80℃保存备用。
二、实时荧光定量PCR：
1.使用qRT-PCR User Manual试剂盒进行PCR反应。
2.反应体系如下：
试剂 使用量(μL)
ddH2O 9
SYBR Advantage Premix(2×) 12.5
ROX Dye(50×) 0.5
miRNA-specific Primer(10μM) 0.5
mRQ 3’Primer 0.5
cDNA 2.0
Total volume 25
内参反应体系如下：
试剂 使用量(μL)
ddH2O 9
SYBR Advantage Premix(2×) 12.5
ROX Dye(50×) 0.5
U6Forward Primer(10μM) 0.5
U6Reverse Primer(10μM) 0.5
cDNA 2.0
Total volume 25
其中，U6Forward Primer的引物序列为：5’-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3’(SEQID No.7)，U6Reverse Primer的引物序列为：5’-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3’(SEQ IDNo.8)。
反应条件如下：
根据溶解曲线分析PCR扩增反应的特异性，获得每个样品的Ct值。用U6作为内参，其中，U6Forward Primer的引物序列为：5’-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3’(SEQ ID No.9)，U6Reverse Primer的引物序列为：5’-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3’(SEQ ID No.10)，根据2-ΔΔCT方法计算基因相对定量的表达。
实施例4统计分析
统计学分析使用GraphPad Prism 5统计软件或SPSSwin软件或medcalc软件在windows系统支持下进行统计分析。
结果如图1、图2和图3所示。图1为利用荧光定量PCR方法检测miR-195在未感染梅毒者的血液样本、感染梅毒未治疗患者的血液样本、治疗后血清固定患者的血液样本和治疗后血清治愈者的血液样本中的含量的结果图，其中，一期梅毒为-2.268±1.260，二期梅毒为-4.306±0.2563，早期潜伏为-5.596±0.7496，晚期潜伏为-4.902±0.8317，血清固定为对治疗后血清固定患者的血液样本的检测结果，血清治愈为对治疗后血清治愈者的血液样本的检测结果。从结果中可以看出miR-195在血清固定中表达显著高于血清治愈组，一期梅毒高于健康人，血清固定高于健康人，说明miR-195可能与梅毒和血清固定的发生存在一定的关系。图2为利用荧光定量PCR方法检测miR-1204在未感染梅毒者的血液样本、感染梅毒未治疗患者的血液样本、治疗后血清固定患者的血液样本和治疗后血清治愈者的血液样本中的含量的结果图，其中，一期梅毒为-14.64±1.236，二期梅毒为-18.25±0.2989，早期潜伏为-17.53±0.3962，晚期潜伏为-17.69±0.6306，血清固定为对治疗后血清固定患者的血液样本的检测结果，血清治愈为对治疗后血清治愈者的血液样本的检测结果。从结果中可以看出miR-1204在一期梅毒中的表达显著高于健康对照和二期梅毒，并且在血清固定中表达显著高于血清治愈和健康人，说明miR-1204可能与梅毒和血清固定的发生存在一定的关系。图3为利用荧光定量PCR方法检测miR-101在未感染梅毒者的血液样本、感染梅毒未治疗患者的血液样本、治疗后血清固定患者的血液样本和治疗后血清治愈者的血液样本中的含量的结果图，其中，一期梅毒为11.97±0.6716，二期梅毒为13.39±0.2743，早期潜伏为12.95±0.3130，晚期潜伏为13.12±0.3949，血清固定为对治疗后血清固定患者的血液样本的检测结果，血清治愈为对治疗后血清治愈者的血液样本的检测结果。从结果中可以看出miR-101在一期梅毒中的表达显著高于健康对照和二期梅毒，并且在血清固定中表达显著高于血清治愈和健康人，说明miR-101可能与梅毒和血清固定的发生存在一定的关系。
综上所述，本发明提供的miR-195、miR-1204或miR-101在患有梅毒感染的患者的外周血单个核细胞中特异性表达，且表达显著上升。因此本发明中提供的miR-195、miR-1204或miR-101可以作为梅毒感染相关疾病的生物标志物，用于梅毒感染的风险预估与检测，对我国梅毒的预防及治疗必定有很好的帮助。另外，本发明提供的上述miR-195、miR-1204或miR-101的检测方法，借助于实时定量PCR的技术来统计微小RNA变化，具有分析样本需要量小、自动化程度高、避免污染等优点。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.如下(a)-(c)任意一种或多种物质在制备用于诊断梅毒的产品中的应用：
(a)miR-195；
(b)miR-1204；
(c)miR-101。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-195的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述miR-1204的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述miR-101的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于诊断梅毒的产品为试剂或试剂盒。
4.一种用于诊断梅毒感染的试剂，其特征在于，所述试剂包括如下(A)-(C)任意一种或多种物质：
(A)用于检测miR-195的引物；
(B)用于检测miR-1204的引物；
(C)用于检测miR-101的引物。
5.一种用于诊断梅毒感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下(A)-(C)任意一种或多种物质或权利要求4所述的试剂：
(A)用于检测miR-195的引物；
(B)用于检测miR-1204的引物；
(C)用于检测miR-101的引物。
6.根据权利要求4所述的试剂或权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，
所述用于检测miR-195的引物具有如SEQ ID No.4所示序列的上游引物和如SEQ IDNo.5所示序列的下游引物；
所述用于检测miR-1204的引物具有如SEQ ID No.6所示序列的上游引物和如SEQ IDNo.7所示序列的下游引物；
所述用于检测miR-101的引物具有如SEQ ID No.8所示序列的上游引物和如SEQ IDNo.9所示序列的下游引物。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括miR-195标准品、miR-1204标准品、miR-101标准品和试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶。
9.一种如下(a)-(c)任意一种或多种物质的检测方法，其特征在于，所检测述方法包括：提取样本RNA进行荧光定量qPCR反应，得到所述(a)-(c)任意一种或多种物质的相对表达量；
所述(a)-(c)为：
(a)miR-195；
(b)miR-1204；
(c)miR-101。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述样本RNA为外周血单个核细胞的RNA。
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