KR20130029079A

KR20130029079A - 플라즈마 마크로알엔에이로 구성된 간암 진단 마커 및 간암 진단의 새로운 방법

Info

Publication number: KR20130029079A
Application number: KR1020127029798A
Authority: KR
Inventors: 지아 판; 지안 조; 지 대; 르에 위; 제이 후; 증 왕
Original assignee: 중산 호스피탈 푸단 유니버시티
Priority date: 2011-05-06
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2013-03-21
Also published as: EP2596136A1; US20130237456A1; JP2013538583A; EP2596136A4; EP2596136B1; WO2012151736A1; HK1177229A1; KR101532210B1; JP5753905B2

Abstract

본 발명은 일종의 플라즈마 microRNA로 구성되고 상기 마커의 키트가 포함된 간암 진단 마커 및 간암(특히 간세포암) 진단의 새로운 방법 관한 것이다. 상기 간암 진단 마커는 다양한 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하며, 바람직하게는 인코딩 된 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a, hsa-miR-801 및 hsa-miR-1228의 핵산 분자로 구성된다. 상기 키트는 간세포암 진단에 사용되며, 특히 초기 간세포암 또는 적어도 1개의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 1개의 건강 개체의 플라즈마, 적어도 1개의 만성 B형 간염 환자의 플라즈마 또는 적어도 1개의 간경화 환자의 플라즈마 진단에 사용될 수 있다.

Description

플라즈마 마크로알엔에이로 구성된 간암 진단 마커 및 간암 진단의 새로운 방법 {MARKER CONSISTING OF PLASMA MICRORNA AND A NEW METHOD FOR DIAGNOSIS OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA}

본 발명은 일종의 플라즈마 microRNA로 구성된 간암 진단 마커 및 간암 진단의 새로운 방법(특히 초기 간암)에 관한 것으로서, 상기 플라즈마 microRNA는 hsa-miR-122, hsa-miR-192，hsa-miR-21，hsa-miR-223，hsa-miR-26a，hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801을 포함한다.

간세포암(Hepatocellular carcinoma，HCC)은 전 세계에서 일반적으로 나타나는 치명적인 악성 종양의 한 종류이다. 상기 간암은 간암의 주요 조직학적 유형을 대표하며, 전체 암 원인의 70%~85%를 점유하고 있다. 전 세계적으로 대략 연간 60만 건의 새로운 병례가 발생하며, 이는 사망으로 이어지는 경우가 대부분으로, 이러한 사실은 상기 간암에 대한 효과적인 조기 진단과 치료 옵션의 부족함을 반영하고 있다. (Thorgeirsson, S.S. and Grisham, J.W. (2002) Nat Genet 31, 339-346; Jemal A et al. (2011) CA Cancer J Clin 61: 69-90.; Bosch F.X. et al (2004) Gastroenterology 127, S5-S16; Perz J.F. et al. (2006) J Hepatol 45, 529-538)

간세포암은 예후가 매우 좋지 않은 질병 중 하나로, 상기 환자의 예후는 진단 시기가 크게 영향을 미친다. 수술하지 않은 HCC 환자의 5년 생존율은 < 5%, 수술 후 생존율은 60%~70%에 달한다. 종양 크기가 < 2㎝에 외과적 수술 조치가 이뤄지게 되면, 5년 생존율은 86%에 달한다. 하지만 그 어떤 치료도 받지 않은 초기 암 환자 (종양 크기 < 5㎝)의 3 년 생존율은 17%~21%에 불과하다. 이는 조기 암 발견이 암 치료 및 환자의 생존율을 높이는데 매우 중요하다는 것을 증명하고 있다. (Tang, Z.Y. (2001) World J Gastroenterol 7, 445-454; Chambers, A.F. et al. (2002) Nat Rev Cancer 2, 563-572; Motola-Kuba D. et al. (2006) Annals of Hepatology 5, 16-24)

간암의 명확한 진단은 일반적으로 조직학적 확인에 기반을 두고 있으며, 상기 조직은 세침 흡인술 검사로 샘플링된다. 일부 간암은 잘 분화되는데, 이는 그들이 거의 완전하게 발달, 성숙된 간세포로 구성되어 있음을 의미한다. 따라서 상기 암은 현미경으로 관찰했을 때 비간암 조직과 매우 유사해 보인다. 또한, 모든 병리학자들이 분화가 잘 된 간암과 정상 간조직 간의 미묘한 차이를 식별할 수 있는 것이 아니기 때문에 일부 병리학자들이 간암을 간선암으로 오진할 수 있다. 선암은 일종의 다른 유형의 암으로 간 외부에서 발병한다. 전이성 선암과 원발성 간암의 치료 방법은 다르기 때문에 조기 암 발견을 통해 서로 다른 종류의 종양을 구분하여 HCC 환자를 치료함으로써 환자의 장기 생존율을 개선 시킨다.

간 세침 흡인술 검사에서 가장 흔한 리스크는 출혈 현상으로, 이는 간암이 매우 많은 혈관을 포함하고 있는 종양이기 때문이다. 많은 경우 조직 검사 또는 세침 흡인이 필요치 않다. 환자가 간암에 대한 위험 요소(간경화, 만성 B형 간염, 만성 C형 간염 등)를 보유하고 있는 경우, 플라즈마 중 a-페토 프로테인(AFP)의 수준이 크게 증가하며, 또한 이에 부합하는 영상학 진단에 의해 검사를 하지 않아도 의사가 간암 여부를 확진할 수 있다. 현재 AFP는 간암 조기 진단에 사용되는 유일한 혈청은 마커이다. (Mizejewski, G.J. (2003) Expert Rev Anticancer Ther 2, 709-735; Paul, S.B. et al. (2007) Oncology 72, Suppl. 1, 117-123)

그러나 이 단일 마커는 감도가 낮고 또한 종종 가양성 결과가 나타나기도 한다. 예를 들면 많은 간경화 환자의 AFP가 상승할 수 있다. 이 밖에도, 혈청 AFP 검사는 간암 환자 발견률이 60% 정도에 불과하다. 따라서 HCC 조기 발견을 위한 새로운 분자 진단 마커 및 민감한 검측 방법의 개발은 매우 중요한 의미를 가진다.

바르셀로나 임상간암(BCLC)(Llovet, J.M. (2003) Lancet 362, 1907-1917)은 최근 몇 년 사이 등장한 HCC 환자의 병기 구분이다. BCLC 병기 구분은 종양의 단계와 권장 치료 전략을 연계하여, 각 종양의 병기 구분을 정의한 관리 표준이다. (Llovet, J.M. (2008) J Natl Cancer Inst 100, 698-711) 극 초기 HCC 환자(0기)에게는 절제술이 가장 적합하다. 초기 HCC 환자(A기)에게는 방사선 치료 (간 종양 절제, 간 이식 또는 국부 용해)가 가장 적합하며, 중기 HCC 환자(B기)에게는 간동맥 화학색전술(TACE)이 적합하다. 또한 중말기 HCC 환자(C기)에게는 소라페닙(Sorafenib) 치료를, 말기 환자(D기)에게는 증상 치료를 진행할 수 있다.

microRNA(miRNA)는 작은 내원성 비코딩 RNA 분자로, 20-25개의 핵산 크기이다. 이러한 작은 miRNA 일반 표적은 한 개 또는 여러 개의 mRNA이며, 번역 수준의 억제 또는 단열을 통해 mRNA를 표적으로 하고 유전자 발현을 조절한다. 그들은 약 10 년 전 이미 세포 발육, 분화, 증식 및 사멸에 중요한 작용을 한다는 것을 발견했다.(Bartel, D.P. (2004) Cell 116, 281-297, Ambros, V. (2004) Nature 431, 350-355; He, L. et al. (2004) Nat Rev Genet 5, 522-531)

miRNA는 체외에서 매우 안정적이기 때문에 mRNA에 비해 종양 바이오 마커로 우수하다. (Lu, J. et al., (2005) Nature 435, 834-838; Lim, L.P. et al., (2005) Nature 433, 769-773)

miRNA는 초기 전사체(pri-miRNA)에서 생성되며, pri-miRNA는 RNase III Drosha에 의해 줄기-루프 구조의 전체 (pri-miRNA)로 가공된다. 이어서 Dicer(일종의 RNase III)의 작용 하에, 머리 핀 형태의 pre-miRNA가 세포질 중 진일보하여 잘려져 성숙된 miRNA가 생성되는데, 이러한 성숙된 miRNA와 기타 단백질이 함께 miRNA-단백질 복합체(miRNP)로 구성된다. miRNA는 miRNP를 그들의 표적인 mRNA로 안내하며, 이 곳에서 각자의 기능을 발휘한다.(종합 참조 예 Bartel, D.P. (2004) Cell 23, 281-292；He, L. and Hannon, G.J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5, 522-531）

miRNA와 그 표적 mRNA 사이의 상호 보완성 정도에 근거하여, miRNA는 다른 조절 과정을 안내할 수 있다. miRNA와 고도의 상호 보완되는 표적 mRNA는 RNA 방해(RNAi)와 동일한 메커니즘을 통해 독특하게 분해된다. 따라서, 이러한 상황 하에서 miRNA는 작은 방해 RNA(siRNA)의 역할을 하고 있다. miRNA와의 상호 보완성이 비교적 낮은 표적 mRNA는 세포 분해 진입 경로로 안내되거나 또는 단백질 번역 수준에서는 저지되지만 mRNA 수준에는 영향을 받지 않는다. 하지만 현재 miRNA가 억제하고 있는 그 표적 mRNA 번역에 대한 메커니즘은 여전히 논쟁이 되고 있다.

고속 대량 microRNA 정량 기술(microRNA 마이크로어레이와 같은)은 실시간 정량 PCR을 기반으로 하는 microRNA 검측으로, 암 게놈에서 microRNA 표현을 연구하는데 효과적인 도구를 제공한다. 획득 가능한 기존의 데이터는 miRNA 표현의 불균형을 표명하며, 특정 암의 발생 및/또는 발전과 관련된다. 예를 들면, hsa-miR-15 및 hsa-miR-16-1은 모두 만성 림프성 백혈병(CLL)에서 제거된 유전자 위치에 배치되어 있다는 연구 결과가 있으며, 대략 70%의 CLL 환자에게 상기 두 종류의 microRNA 유전자가 제거되거나 떨어진다. 또한 결장암에서는 has-miR-143 및 has-miR-145 표현이 떨어지며, miRNA let-7의 표현은 폐암에서 종종 떨어진다. (Michael, M.Z. et al. (2003) Mol Cancer Res 1, 882-891; Mayr, C. et al. (2007) Science 315, 1576-1579)

사실, 보통 암은 종종 관련된 표현 변경이 존재하며, 또한 microRNA는 일반적으로 암과 관련된 게놈 지역에 위치함으로써 miRNA가 암 유전자와 암 유전자의 이중 작용을 막는 작용을 한다고 추측할 수 있다. (Esquela-Kerscher, A. and Slack, F.J (2006) Nat Rev Cancer 6, 259-269; Calin, G.A. and Croce, C.M. (2007) J Clin Invest 117, 2059-2066; Blenkiron, C. and Miska, E.A. (2007) Hum Mol Genet 16, R106-R113) 이미 확인된 microRNA는 인간 암 중의 이상 표현에서 바이오 마커 진단과 예후의 잠재적 응용 가치를 더욱 강조한다.

오늘날 일부 학자들이 인간 간세포암 중 microRNA 표현 차트를 발표했다. (Murakami, Y. et al. (2006) Oncogene 25, 2537-2545; Li, W. et al. (2008) Int J Cancer 123, 1616-1622; Huang, Y.S. et al. (2008) Hepatology 23, 87-94; Ladeiro, Y. et al. (2008) Hepatology 47, 1955-1963; Jiang, J. et al. (2008) Clin Cancer Res 14, 419-427) 이러한 연구는 모두 정상 간세포 또는 조직과 비교하였을 때, 특정한 microRNA는 악성 세포 또는 조직에서 이상 표현이 나타난다는 것을 표명함으로써 종양의 악성 변화와 발전 과정에 대해 보다 심도있는 식견을 제공한다.

다양한 유형의 샘플 중에서는, 혈액 확보가 용이하기 때문에 임상 조작이 간단하고, 상처가 작으며, 환자가 받는 리스크 및 고통이 작아 고 위험군을 선별하는데 가장 적합하여, 이로서 종양 환자를 조기 발견하고 진단, 치료한다. 종양에서 파생된 microRNA는 인간의 플라즈마 또는 혈청에서 매우 안정적 형태로 존재하는 것으로 증명되었으며, 내생 RNase 활동의 영향을 받지 않는다. 이러한 혈청 또는 플라즈마 중의 혈장에서 종양에서 파생된 microRNA는 충분히 검측 될 수 있어 종양 바이오 마커로 사용될 수 있다. 또한 플라즈마 또는 혈청의 microRNA 수준은 밀접한 관련이 있기 때문에 플라즈마 또는 혈청 중의 microRNA는 모두 종양 진단 마커로 사용될 수 있으며, 임상 응용에도 적합하다. (Mitchell, P.S. et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 10513-10518; Gilad, S. et al. (2008) PLoS ONE 3, e3148; Chen, X. et al. (2008) Cell Res 18, 997-1006)

최근, HCC 환자의 혈청 microRNA에 대한 세 가지 연구 보고가 발표되었다. QU 등(Qu, KZ. et al (2011) J Clin Gastroenterol 45:355-60)은 283개 샘플 상에서의 혈청 hsa-miR-16, hsa-miR-195 및 hsa-miR-196a의 진단 가치를 연구하였고, hsa-miR-16이 가장 우수한 진단 효능을 구비하고 있다는 것을 발견해 냈으며, 감도와 특이성은 각각 72.1%와 88.8%로 나타났다. Xu 등 (Xu, J. et al (2011) Molecular Carcinogenesis 50:136-42)은 혈액 중 hsa-miR-21, hsa-miR-122와 hsa-miR-223이 HCC와 건강한 개체를 구분하는 잠재적 마커임을 발견했다. 그러나 상기 microRNA는 HCC와 B형 간염 환자를 구분할 수는 없다. Li 등(Li, LM. et al (2010) Cancer Res 70, 9798-807)은 혈청 microRNA는 분명한 진단 가치를 가지며, hsa-miR-375의 감도와 특이성은 각각 96%, 100%며, hsa-miR-375, hsa-miR-25 및 hsa-let-7f 연합 응용 후, 감도와 특이성은 각각 97.9%, 99.1%로 나타난다고 발표했다. 이상의 결과에서 혈청 microRNA는 HCC 진단이 가능한 것을 알 수 있지만, 이러한 연구는 선별에 쓰이는 microRNA 데이터가 제한되고, 샘플량이 적거나 또는 독립적 검증이 부족한 현상 등과 같은 많은 결함이 있다. 따라서 여전히 HCC 환자의 플라즈마 또는 혈청 중 진단 가치를 가지고 있는 microRNA 바이오 마커를 발견해야 한다. 여러 microRNA 바이오 마커의 연합 응용은 HCC 환자를 보다 신속, 정확하고 낮은 원가로 조기 진단해 낼 수 있다.

본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 제 1 목적은 새로운 간세포암(특히 초기 간세포암 BCLC 0기와 A기) 진단 마커를 제공함으로써, 일종의 새로운 간암 진단 방법을 제공하는 것이다;

본 발명의 제 2 목적은 일종의 간세포암 진단(특히 초기 간세포암 BCLC 0기와 A기)에 사용되는 키트를 제공하는 것이다;

본 발명의 제 3 목적은 일종의 간세포암 환자의 플라즈마와 건강한 사람의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 제 4 목적은 일종의 간세포암 환자의 플라즈마와 만성 B형 간염 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 제 5 목적은 일종의 간세포암 환자의 플라즈마와 간경화 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 제 6 목적은 일종의 간암 진단 마커를 확정하는 방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 다음의 설명을 통해 명백해 질 것이다. 그들은 독립항의 주제에 의해 실현된다. 본 발명의 일부 바람직한 실시예는 종속항의 주제에 의해 한정된다.

본 발명의 제 1 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 간세포암 진단 마커는 다종 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는다.

일실시예로서, 상기 다종의 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자를 포함하며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마 중에 차이가 나게 표현된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마 중에 차이가 나게 표현되는 상기 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자로부터 선택되며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정된다. 또한, 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 일종의 hsa-miR-801, hsa-miR-192 또는 hsa-miR-21을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며, 또한 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-122, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이가 없게 표현되는 상기 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-1228을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택된다.

가장 바람직하게는, 상기 다종의 핵산 분자는 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a, hsa-miR-801 및 hsa-miR-1228을 인코딩하는 8개의 핵산 분자를 포함한다.

바람직하게는, 적어도 한 종류의 대조플라즈마는 건강 개체, 만성 B형 간염 환자 또는 간경화 환자로부터 채취된다.

일실시예로서, 상기 간세포암은 초기 간세포암이다.(BCLC 0기와 A기)

본 발명의 제 2 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 간세포암 진단 키트는 일종의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 간세포암 진단 마커는 다종 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩한다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이가 나게 표현되는 상기 적어도 한 종류가 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 적어도 한 종류의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정된다. 또한, 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 적어도 한 종류가 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-801, hsa-miR-192 또는 hsa-miR-21을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며, 또한 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-122, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택된다.

일실시예로서, 상기 다종의 핵산 분자는 또한 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자를 포함하며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마 중에 차이가 없게 표현된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이가 없게 표현되는 상기 적어도 한 종류가 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-1228을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택된다.

가장 바람직하게는, 상기 다종의 핵산 분자는 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a, hsa-miR-801 및 hsa-miR-1228을 인코딩하는 8개의 핵산 분자를 포함한다. 상기 키트는 또한 logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801과 같은 회귀 모델을 포함한다. 그 중 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801의 표현 수준은 hsa-miR-1228을 내부 검측하여 얻어내며, 모델 중의 logit（p=HCC）값은 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 대조플라즈마는 건강 개체, 만성 B형 간염 환자 또는 간경화 환자로부터 채취된다.

본 발명의 제 3 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 건강 개체의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트는 일종의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 간세포암 진단 마커는 다종 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하며, 상기 다종의 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자를 포함하며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이를 표현하며, 상기 적어도 한 종류의 대조플라즈마는 건강 개체로부터 채취된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이가 나게 표현되는 상기 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정된다. 또한, 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 적어도 한 종류가 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-122, hsa-miR-801, hsa-miR-192 또는 hsa-miR-21을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며, 또한 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택된다.

일실시예로서, 상기 다종의 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자를 포함하며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마 중에 차이가 없게 표현된다.

본 발명의 제 4 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 본 발명의 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 만성 B형 간염 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트는 일종의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 간세포암 진단 마커는 다종 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하며, 상기 다종의 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자를 포함하며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이를 표현하며, 상기 적어도 한 종류의 대조플라즈마는 만성 B형 간염 환자로부터 채취된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이가 나게 표현되는 상기 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정된다. 또한, 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는, 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-801 또는 hsa-miR-21을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며, 또한 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-122, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이가 없게 표현되는 상기 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 일종의 hsa-miR-1228을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택된다.

가장 바람직하게는, 상기 다종의 핵산 분자는 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a, hsa-miR-801 및 hsa-miR-1228을 인코딩하는 8개의 핵산 분자의 조합을 포함한다. 상기 키트는 또한 logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801과 같은 회귀 모델을 포함한다. 그 중 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801의 표현 수준은 hsa-miR-1228을 내부 검측하여 얻어내며, 모델 중의 logit（p=HCC）값은 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정된다.

본 발명의 제 5 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 간경화 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트는 일종의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 간세포암 진단 마커는 다종 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하며, 상기 다종의 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자를 포함하며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이를 표현하며, 상기 적어도 한 종류의 대조플라즈마는 간경화 환자로부터 채취된다.

바람직하게는, 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-801을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며, 또한 상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 일종의 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택된다.

본 발명의 제 6 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 간암 진단 마커를 확정하는 방법은 다음과 같은 내용을 포함한다.

(a) 하나 또는 다수의 표적플라즈마 중 다수의 핵산 분자의 표현 수준을 확정하며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩한다.

(b) 하나 또는 다수의 대조플라즈마 중 상기 다수의 핵산 분자의 표현 수준을 확정한다.

(C) 상기(a)단계와 상기(b)단계에서 얻은 다수의 핵산 분자에 상응하는 표현 수준을 대비, 상기 다수의 핵산 분자로부터 상기 표적플라즈마와 상기 대조플라즈마 중 차이가 나타나는 하나 또는 다수의 핵산 분자를 감정하고, 상기 표적플라즈마와 상기 대조플라즈마 중 차이가 나타나는 하나 또는 다수의 핵산 분자를 간암 진단 마커로 한다.

본 발명의 기타 실시예는 아래 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 더욱 자세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 일종의 플라즈마 microRNA로 구성된 간암 진단 마커 및 간암 진단의 새로운 방법(특히 초기 간암)을 공개하며, 상기 플라즈마 microRNA는 hsa-miR-122, hsa-miR-192，hsa-miR-21，hsa-miR-223，hsa-miR-26a，hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801을 포함하는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 적어도 1개의 간세포암 표적플라즈마를 식별하는데 쓰이며, 특히 초기 간세포암(BCLC 0기와 A기) 단계에 존재하는 microRNA 조합의 선별, 훈련 및 검증 단계에 있는 실험의 설계 흐름도;
도 2는 본 발명의 간세포암을 진단을 확정하는데 쓰이며, 특히 초기 간세포암(BCLC 0기와 A기) 환자의 혈액 중 microRNA 조합의 주요 방식 단계도; 대조 그룹에는 건강, 만성 B형 간염과 간경화 시험자가 포함된다.
도 3은 본 발명의 적어도 1개의 간세포암 표적플라즈마를 확정하는데 사용되는 바람직한 microRNA 조합（hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a와 hsa-miR-801）의 논리 회귀 모델을 설명한다. A)훈련 그룹(n=407)에서 HCC 그룹과 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.76)와 비교, microRNA 조합은 HCC 그룹 플라즈마와 대조 그룹 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.86) B) 검증 그룹(n=390)에서 HCC 그룹과 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.68)와 비교, microRNA 조합은 HCC 그룹 플라즈마와 대조 그룹 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.89)
도 4는 본 발명의 간세포암 환자 플라즈마와 건강 개체, 만성 B형 간염 환자 또는 간경화 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 바람직한 microRNA 조합（hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a와 hsa-miR-801）의 논리 회귀 모델을 설명한다. A)검증 그룹(n=390)에서 HCC 그룹과 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.64)와 비교, microRNA 조합은 HCC 환자 플라즈마와 건강 개체 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.95) B) 검증 그룹(n=390)에서 HCC 그룹과 만성 B형 간염 그룹 비교 시, microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.62)와 비교, microRNA 조합은 HCC 환자 플라즈마와 만성 B형 간염 환자의 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.85) C) 검증 그룹(n=390)에서 HCC 그룹과 간경화 그룹 비교 시, microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.78)와 비교, microRNA 조합은 HCC 환자 플라즈마와 간경화 환자의 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.89)
도 5는 본 발명의 다른 BCLC 병기 구분을 나누는 간세포암의 적어도 한 개의 표적플라즈마를 구분하는데 사용되는 바람직한 microRNA 조합（hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a와 hsa-miR-801）의 논리 회귀 모델을 설명한다. A)극 초기 HCC(BCLC 0)와 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.68)와 비교, microRNA 조합은 극초기 HCC 환자 플라즈마와 대조 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.94) B) 초기 HCC(BCLC A)와 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.65)와 비교, microRNA 조합은 초기 HCC 환자 플라즈마와 대조 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.90) C) 중기 HCC(BCLC B)와 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.74)와 비교, microRNA 조합은 중기 HCC 환자 플라즈마와 대조 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.85)
D) 진전기 HCC(BCLC C)와 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.79)와 비교, microRNA 조합은 중기 HCC 환자 플라즈마와 대조 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.80)
도 6은 본 발명의 AFP≤20ng/ml 및 AFP > 20ng/ml의 간세포암의 적어도 한 개의 표적플라즈마를 구분하는데 사용되는 바람직한 microRNA 조합（hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a와 hsa-miR-801）의 논리 회귀 모델을 설명한다. A) AFP≤20ng/ml의 HCC 그룹과 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.63)와 비교, microRNA 조합은 AFP≤20ng/ml의 HCC 그룹 플라즈마와 대조 그룹 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.87)B) AFP > 20ng/ml의 HCC 그룹과 대조 그룹 비교 시 microRNA 조합의 진단 가치인 ROC 곡선도. AFP(AUC=0.69)와 비교, microRNA 조합은 AFP > 20ng/ml의 HCC 그룹 플라즈마와 대조 그룹 플라즈마 구분 시, 현저히 높은 진단 정확도를 구비하고 있다.(AUC=0.90)
도 7은 7개의 선별된 microRNA와 AFP 수술 기간 변화의 구조도. 수술 전과 수술 후의 여섯째 날, 간 절제 수술을 받은 54명의 HCC 환자의 혈액 샘플을 추출했다. 수술 후 여섯째 날, AFP와 3개의 microRNA（hsa-miR-21, hsa-miR-192와 hsa-miR-223）의 표현 수준에 명확하게 변화가 있었다. 외과 절제 수술 후, AFP와 2개의 microRNA(hsa-miR-21과 hsa-miR-192)의 표현 수준은 현저히 떨어졌고, hsa-miR-223의 표현은 현저히 증가하였다.

도면을 참고하여 본 발명의 예상치 못한 발견을 기반으로 하는, 정확도가 높은 간세포암 진단 마커에 대해 자세히 설명한다. 전형적으로, 이 곳에서 정의하고 있는 간암 진단 마커는 상향 조정, 하향 조정된 인간의 microRNA를 포함하고 있다. 더욱 자세하게는, 플라즈마 중의 모든 microRNA 표현 모델 및/또는 하나의 microRNA 표현 수준을 분석, 상기 간암 진단 마커로 하여금 간세포암을 초기 상태에서도 검측되게 하며, 간세포암 환자의 플라즈마와 건강 개체, 만성 B형 간염 환자 및 간경화 환자의 플라즈마를 구분한다.

다음과 같이 예를 들어 설명된 본 발명은 본문 중 삭제되어 나타나지 않은 부분에서 특별히 게시된 모든 하나 또는 다수의 원소 또는 제한의 조건 하에 적절히 실시될 수 있다.

본 발명은 특정 실시예에 근거하며, 첨부 도를 참조하여 설명하지만, 청구 범위에만 국한되지 않는다. 상기 도면들은 개략적이며 제한 없는 것으로 간주된다.

'포함'이라는 용어가 본 발명의 명세서와 청구항에서 사용될 때, 기타 요소 또는 단계를 제외하지 않는다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해, '~으로 구성되다'라는 용어는 '포함'이라는 용어의 바람직한 실시예로 간주된다. 만약 아래 문장에서 어떤 한 그룹이 적어도 한 데이터를 포함한 실시예로 정의되면, 이러한 실시예 그룹으로 구성되어 있는 그룹이 바람직한 실시예로 이해되어 게시된다.

특별한 성명이 없다면, 단수형 명사가 언급될 때는 부정관사 또는 예를 들어 '한개', '일종', '상기'등의 정관사가 사용되며, 상기 명사의 복수 형식을 포함하고 있다.

본 발명 중의 '대략'이라는 용어는 당업자에게 있어서, 기능 문제의 기술적 효과를 보장하기 위해 이해되는 정확도의 간격을 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 ±10%의 수치 편차가 나타나는데, 바람직하게는 ±5이다.

또한, 본 발명의 명세서와 청구항에서 쓰이는 제 1, 제 2, 제3, (a), (b), (c) 를 비롯한 이와 같은 류의 용어들은 유사한 원소를 구분하는 데 사용되는 것으로, 순서 또는 시간의 순서에 따르는 데 사용되는 것이 아니다. 또한 이렇게 사용된 용어들은 적절한 환경에서 상호 교환되며, 본 발명의 실시예는 본문에서 설명하거나 또는 예를 들어 설명하는 기타 순서의 실시와는 다르다.

용어가 사용되는 맥락에서 용어의 정의가 다음과 같이 추가로 제공된다.

다음의 용어 또는 정의들은 단지 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것이다. 이러한 정의는 당업자의 이해 범위보다 그 범위가 작은 것으로 이해되어서만은 안된다.

본문 중 사용되는 '암'이라는 용어는 일반적으로 모든 유형의 악성 혹을 나타내며, 아직 영향을 받지 않은(건강한) 야생형 대조 세포에 비해 암 발생 특징 경향이 나타나거나 또는 구비된 표적 세포의 모든 형태학 및/또는 생리학의 변경이다(유전자 재배치 기반). 이러한 변경들은 세포 크기와 형태(확대 또는 축소), 세포 증식 (세포 수 증가), 세포 분화 (생리학 상태 변화), 사멸(프로그램성 세포 사망) 또는 세포 생존 등에서 언급된다.

본문 중 사용되는 '간세포'라는 용어는 '간장의 세포'를 가리킨다. 따라서, '간세포암'이라는 용어 역시 간장 부위에 생겨나는 암을 가리킨다.

간암의 가장 일반적인 유형은 간세포암(간암, 일반적으로 HCC로 표기)이다. 본문 중 사용되는 '간세포암'이라는 용어는 간장에서 비롯된 악성 종양을 나타낸다. HCC의 대부분의 경우는 바이러스성 감염 (B형 간염 또는 C형 간염) 또는 간경화(알코올 중독이 간경화의 가장 일반적인 원인)에 이어 발병된다. 간염이 지방병이 아닌 국가에서는 대부분의 간장 악성암 근원이 HCC가 아니라 예를 들면 결장의 암이 전이(확산)되는 등 신체 기타 부분에서 발원한다. HCC의 치료 선택과 예후는 여러 요소에 달려 있지만, 특히 종양 크기와 병기에 따라 달라진다. 일반적으로 간세포암의 결과가 좋지 않은 원인은 10~20%의 간세포암만이 수술을 통해 제거 될 수 있기 때문이다. 암을 완전히 제거할 수 없는 경우, 상기 질병은 일반적으로 3~6개월 내 치명적인 결과를 가져온다.

다른 암과 마찬가지로, 간세포암은 세포의 고속 복제 및/또는 세포 사멸 방지를 유도하는 세포 돌연변이 시 발병된다. 특히, B형 간염 및/또는 C형 간염의 만성 바이러스 감염이 반복적으로 신체의 자기 면역 체계의 간세포를 공격하여(그 중 일부 바이러스만 감염되고, 기타는 방관), 간세포암의 발생을 촉진시킨다. 이러한 손상-회복-재손상의 순환은 회복 기간의 실수를 초래하고, 결국 암으로 변하게 하지만, 현재 이러한 가설은 C형 간염에 더욱 적절히 적용된다. 그러나 B형 간염 중 바이러스 게놈에 감염된 세포에서는 악성 종양 발생에 가장 관련 깊은 요소이다. 또한, 반복적인 대량 음주 습관 역시 유사한 작용을 한다.

바르셀로나 임상간암(BCLC) 병기 구분은 5단계로 나뉜다. 극 초기(0기)에는 임상 증후가 없는 단일 HCC <2cm 환자가 포함된다. 초기(A기)에는 임상 증후가 없는 단일 또는 세 개의 HCC <= 3cm 환자가 포함된다. 중기(B기)에는 임상 증후가 없는 다수의 HCC 결절 환자가 포함된다. 진전기(C기)에는 임상 증후가 있는 종양 및/또는 침략성 모델(혈관 침략 또는 간 외부 확산) 환자가 포함된다. 말기(D기)에는 매우 염려되는 예후가 사료되는 환자가 포함된다.

따라서 본 발명의 범위에서는, B형 간염 감염 또는 간경화를 단순히 종양 병인학에 대한 위험 요소로만 간주하는 것이 아니라, 종양 발전의 초기/중기('암 전상태'를 뜻함)가 비침략성 혹의 과도한 증식성 그룹 생성(HCC와 같은 지속 발전 가능한 악성 종양)을 야기시키는(주로 양성)데 관련이 있다고 보고 있다.

이러한 악성 종양은 기타 조직을 공격하고 전이시킨다. 악성 세포는 일반적으로 진전성과 억제 불가한 성장 특징을 가지고 있다. 육안으로 볼 때, HCC는 결절성 또는 침윤성 종양으로 보여진다. 결절형 종양은 단발성(부피가 큼) 또는 다발성(경화로 발전되고 합병증이 생길 때)이다. 종양 결절은 원형에서 타원형으로 경계가 뚜렷하기는 하지만 막은 없다. 가득 찬 경계는 불분명하며, 문정맥을 침윤하고, 간정맥을 소량 침윤한다.

본 발명에 채택된 포유류의 표적플라즈마는 인간 또는 비인간에서 기원될 수 있다. 그러나 본 발명은 일반적으로 인간의 플라즈마를 채택하고있다. 본문 중에서 사용되는 '하나 또는 다수의 플라즈마'라는 용어는 개인 플라즈마만을 포함하는 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다. 본문 중에서 사용되는 '표적플라즈마'라는 용어는 적어도 간세포암의 플라즈마를 인정하는 것을 가리키며, 또한 '대조 플라즈마'는 일반적으로 건강 개체, 만성 B형 간염 환자 및 간경화 환자로부터 얻은 이러한 암 특징을 구비하지 않은 플라즈마이다. 그러나 일부 사용 중, 예를 들어 다른 암 유형의 플라즈마와 비교하였을 때, 간세포암 표본을 구비하지 않은 플라즈마는 일반적으로 '대조 플라즈마'로 간주된다.

본 발명 중의 사용되는 '플라즈마'라는 용어는 혈액 중의 황색 액체 성분을 뜻하는 것으로, 그 중 전체 혈액 중의 혈액 세포는 일반적으로 부유상태로 존재한다. 그것은 일반적으로 전체 혈액의 약 55%를 차지한다. 그것은 대부분 물 (전체의 90%)이며, 용해된 단백질, 포도당, 응혈 인자, 미네랄 이온, 호르몬 및 이산화탄소(플라즈마는 배설물 운반의 주요 경로)를 함유한다. 플라즈마는 일반적으로 한 튜브의 선혈을 원심 분리기 중 회전을 통해 혈구 깊은 튜브 밑까지 닿게 하고 뒤따라 플라즈마를 뒤집거나 또는 추출하는 방법을 통해 제조한다. 플라즈마의 밀도는 대략 1025kg/m3 또는 1.025 kg/l이다. 최근 연구에 따르면 microRNA는 플라즈마에서 안정적이다. '플라즈마 샘플'이라는 용어는 검측된 개인 또는 대조로부터 얻은 플라즈마를 지칭한다.

본 발명 중의 사용되는 '환자'라는 용어는 적어도 간세포암 질병을 가진 인간을 가리키며, 본 발명 중의 사용되는 '표적플라즈마'는 환자로부터 채집된 플라즈마를 가리킨다. '건강 개체'라는 용어는 일반적으로 암 질병이 없는 건강한 사람을 지칭한다. 본 발명 중의 사용되는 '표적플라즈마'는 건강 개체, 만성 B형 간염 환자 및 간경화 환자로부터 채집된 플라즈마를 가리킨다. 그러나 일부 사용 중, 예를 들어 다른 암 유형과 비교하였을 때, 기타 암 유형을 가진 개체 및 이러한 개체로부터 채집된 플라즈마는 일반적으로 대조로 간주된다.

일반적으로 사용되는 플라즈마 샘플은 간세포암의 존재를 진단받은 시험자들로부터 채집된 생물 표본에서 파생된다. 또한, 획득한 데이터를 확증하기 위해 대비 샘플을 이미 질병 상태를 알고 있는 시험자들로부터 채집할 수 있다. 상기 생물학 샘플은 신체 조직 및 조직, 혈청, 혈구, 가래, 소변 등과 같은 액체를 포함할 수 있으며, 또한 생물학 샘플은 간세포암을 가지고 있거나 또는 암이 의심되는 신체로부터 획득할 수 있다. 또한 상기 샘플은 필요 시, 획득한 신체 조직 또는 액체로부터 정제 후 생물학 샘플로 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명 중 핵산 마커의 표현 수준은 대상에서 파생된 생물학적 샘플 중 확정된다.

본 발명의 체외 방법 중 검측에 사용된 샘플은 일반적으로 임상적으로 수용 가능한 방식으로 채집하여야하며, 바람직하게는 핵산(특히 RNA) 또는 단백질 방식으로 보존된다. 분석 대기 샘플을 일반적으로 혈액에서 채취된다. 또한, 간 조직 또는 기타 유형의 샘플 역시 사용할 수 있다. 샘플은 특히 초기 가공 후 합병된다. 그러나 합병되지 않은 샘플 역시 사용할 수 있다.

본 발명 중의 사용되는 "microRNA"(또는 "miRNA")라는 용어는, 그것이 상기 영역 중에서의 보통 함의를 구비한다.(Bartel, D.P. (2004) Cell 23, 281-292; He, L. and Hannon, G.J. (2004) Nat Rev Genet 5, 522-531) 따라서 'microRNA'는 게놈 위치에서 파생된 RNA 분자를 나타내며, 형성 가능한 국부 RNA 전체 miRNA 구조의 복사물을 통해 가공하여 나타난다. 성숙 miRNA의 일반적인 길이는 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 핵산이며, 예를 들어 18, 19, 26 또는 27개의 핵산과 같은 기타 데이터의 핵산 역시 존재한다.

miRNA 인코딩 서열은 Flanking genomic 서열과 상대되는 잠재력을 구비하고 있어, 성숙 miRNA를 안전하지 못한 상대인 RNA 이중 연결체 내(본문 역시 줄기-루프 또는 머리핀 구조 또는 pre-miRNA로 칭함)에 배치하며, 상기 이중 연결체는 더욱 긴 전체 복사물로부터 miRNA 가공된 중간체이다. 상기 가공은 일반적으로 각각 Drosha와 Dicer로 불려지는 두 가지 내부 단절 핵산 효소의 연속 작용을 통해 발생된다. Drosha는 초급 복사물로부터(본문 역시 "pre-miRNA"로 칭함) 일반적으로 머리 핀이나 줄기 루프 구조로 접힌 miRNA 전체(본문 역시 "pre-miRNA"로 칭함)로 생성한다. Dicer 방식을 채택할 경우에는 이 miRNA 전체를 잘라 miRNA의 이중 연결체를 얻어, 상기 머리 핀 또는 줄기-루프 구조의 한 암은 성숙 miRNA를 포함하고, 다른 한 쪽 암은 유사한 크기의 조각을 포함한다.(일반적으로 miRNA*로 칭함) 상기 miRNA는 이어서 그 표적 mRNA에 안내되어 기능을 발휘하고, 또한, miRNA* 분해된다. 또한 miRNA는 일반적으로 예측된 단백질 인코딩 구역과 다른 게놈 조각으로부터 파생된다.

본 발명 중의 사용되는 'miRNA 전체'(또는 전체 'miRNA' 또는 'pre-miRNA')라는 용어는 miRNA 초급 복사물의 일부분을 가리키며, 성숙 miRNA는 상기 miRNA 초급 복사물로서 가공되어 얻어진다. 일반적으로 'pre-miRNA'는 안정적으로 머리 핀이나 줄기 루프 구조로 접혀있다. 머리 핀 구조의 일반적인 길이는 50-80개의 핵산이며, 바람직하게는 60-70개의 핵산이다.(miRNA 잔류물, miRNA와 상대되는 잔류물 및 모든 있는 페어링, 따라 끼워진 모든 조각을 포함하여 계산하지만, 더욱 멀리 있는 서열은 제외)

본 발명 중의 사용되는 'microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자'라는 용어는 인코딩 된 microRNA(miRNA)의 모든 핵산 분자를 지칭한다. 따라서 상기 용어는 성숙 miRNA뿐만 아니라, 예를 들면 상기 전체 miRNA 및 초급 miRNA 복사물과 같은 이에 상응하는 것들 역시 지칭하고 있다. 또한, 본 발명은 RNA 분자에 국한되지 않고, 예를 들면 miRNA 서열을 역복사하여 생성된 DNA 분자처럼 상응하는 microRNA의 DNA 분자 또한 포함하고 있다. 본 발명의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 일반적으로 하나의 miRNA 서열(개체 miRNA)을 인코딩한다. 그러나 이러한 핵산 분자는 두 개 또는 다수의 miRNA 서열을 인코딩 할 수도 있는데(2개 또는 다수의 miRNA), 예를 들면 하나의 복사 단위는 서열을 상용 조절하는 조작인 또는 복사 해지자의 통제 하에 두 개 또는 다수의 서열을 포함한다.

본 발명 중의 사용되는 'microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자'라는 용어는 또한 '유의 핵산 분자'(핵산 서열(5'->3') 정합 또는 상응하는 상기 인코딩된 miRNA (5'->3') 서열의 분자) 및 '반의 핵산 분자'(핵산 서열 상호 보완되는 상기 인코딩 된 miRNA (5'->3') 서열 또는 다시 말해, 정하는 상기 인코딩된 miRNA 서열의 반대 방향 상호 보완 서열(3'->5')의 분자)를 포함한다. 본 발명 중의 사용되는 '상호 보완'이라는 용어는 '반의' 핵산 분자 서열과 상응하는 '유의' 핵산 분자 서열(상호 보완되는 반의 서열의 서열을 구비) 형성의 기본 페어(바람직하게는 Watson-Crick의 기본 페어) 능력을 지칭한다.

본 발명의 범위 내에서, 두 개의 핵산 분자('유의'와 '반의' 분자)는 안전하게 상호 보완되며, 그들은 그 어떤 기본 불일치 및/또는 별도의 또는 결함 있는 핵산을 함유하지 않는다. 두 개의 분자는 하나 또는 다수의 기본 불일치를 포함하거나 또는 그들의 핵산 총수 상에서 다른 점을 나타낸다.(첨가 또는 결손으로 야기되는) 바람직하게는, '상호 보완' 핵산 분자 포함에 상응하는 '유의' 핵산 분자에 포함된 서열은 안전하게 상호 보완된 적어도 10 연속의 핵산을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 진단 키트에 포함되어 있는 miRNA 서열을 인코딩하는 다수의 핵산 분자는 하나의 또는 다수의 '유의 핵산 분자' 및／또는 하나의 또는 다수의 '반의 핵산 분자'를 포함한다. 어떤 경우, 상기 진단 키트는 하나 또는 다수의 '유의 핵산 분자'(miRNA 서열자체)를 포함하며, 상기 분자는 차이를 표현하는 miRNA(분자마커)의 전체 또는 적어도 하나의 제 2 집합 그룹으로 간주되며, 상기 차이 표현인 miRNA는 특정 상황 존재 또는 발생 경향의 지표 증거로, 상기 특정상황은 본 발명 중 간세포암을 지칭한다. 또한 진단 키트가 하나 또는 다수의 '반의 핵산 분자'(miRNA 서열과 상호 보완되는 서열)를 포함할 때, 상기 분자는 검측을 하는데 적합하거나 또는 샘플의 정량을 낼 때, 하나 또는 다수의 특정(상호보완) miRNA 서열의 탐침 분자(교잡측정에 사용) 및／또는 모자란 핵산 촉매(예를 들어 역복사에 또는 PCR응용에 사용되는 것) 등을 포함할 수 있다.

본 발명 중 정의된 다수의 핵산 분자는 적어도 2개, 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 500개, 적어도 1000개, 적어도 10000개 또는 적어도 100000개의 핵산 분자를 포함하며, 각 분자는 적어도 하나의 miRNA 서열을 인코딩한다.

본 발명 중의 사용되는 '차이나게 표현된다'라는 말은 특정 microRNA가 표적플라즈마 중의 표현 수준과 대조 플라즈마에서의 표현을 비교할 때의 변화를 지칭하며, 상기 대조 플라즈마는 건강 개체의 플라즈마 또는 기타 유형 질병 환자의 플라즈마일 수 있고, 상향 조정(표적플라즈마 중 microRNA 농도 증가) 또는 하향 조정(표적플라즈마 중 microRNA 농도 감소 및 소멸)될 수 있다. 달리 말하면 핵산 분자는 표적플라즈마 중에서 대조 플라즈마 중에 비해 더욱 높거나 또는 더욱 낮은 수준으로 활성화된다.

본 발명의 범위 내에서 만약 핵산 분자가 표적플라즈마와 대조 플라즈마 중의 상응하는 표현 수준의 일반적인 편차가 적어도 5% 또는 적어도 10%이고, 바람직하게는 적어도 20% 또는 적어도 25%이며, 가장 바람직하게는 적어도 30% 또는 적어도 50%라면, 이는 상기 핵산 분자가 차이나게 표현된 것으로 간주된 것이다. 따라서 후자의 값에 상응하는 핵산 분자 값이 표적플라즈마 중의 표현 수준과 대조 세포와 비교할 때, 적어도 1.3배 또는 적어도 1.5배로 상향 조정되거나 또는 이와 반대로 표적플라즈마 중의 표현 수준이 적어도 0.7배 또는 적어도 0.5배로 하향 조정 될 수 있다. 본 발명 중의 사용되는 '표현 수준'은 특정한 microRNA 서열이 그 게놈 유전자 현장에서 복사되어 온 정도를 지칭하며, miRNA는 하나 또는 다수의 분석된 플라즈마 중의 농도이다.

전술한 바와 같이, '대조 플라즈마는'라는 용어는 일반적으로 간세포암 인자 특징을 가지지 않은 개체로부터 채집된 플라즈마이다. 그러나 일부 사용 중, 예를 들면 다른 암과 비교할 때, 기타 암 환자로부터 채집된 플라즈마는 일반적으로 '대조 플라즈마'로 간주된다. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley & Sons, Hoboken, NJ) 상기 RNA 수준에서 측정 가능한, 예를 들면 miRNA 특이한 탐침을 사용하여 Northern 흔적을 분석하거나 또는 RNA 역복사(클론) 후의 DNA 수준에서 진행하는데, 예를 들면 PCR 측정 또는 실시간 PCR 기술 등이 있다. 본 발명에서 사용되는 '측정'이라는 용어는 상기 적어도 1개의 microRNA 서열을 인코딩하는 모든 핵산 분자의 분석을 포함한다. 하지만 pri-miRNA 및 re-mRNA의 반감기가 짧기 때문에, 일반적으로 성숙 miRNA의 농도가 측정된다.

바람직하게는, 하나의 샘플에 대한 몇 차례의 독립 측량(예를 들어, 2차, 3차, 5차 또는 10차 측량) 및/또는 몇 차례의 표적플라즈마 또는 대조 플라즈마 내의 몇 차례 측량 중 얻은 표현 수준의 표준값은 분석에 사용된다. 표준값은 본 발명이 속한 기술 분야에서 알려진 모든 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 평균값 ±2SD (표준 편차) 또는 평균값 ±3SD의 범위는 표준값으로 사용될 수 있다.

획득한 표적플라즈마와 대조 플라즈마의 표현 수준 간의 차이는 대조 핵산으로 표준화 될 수 있는데, 예를 들면 집사 유전자의 표현 수준은 이미 집사 유전자의 표현 수준을 알고 있지만 샘플의 개체의 질병 상태에 근거하지 않아 다르다. 일반적인 집사 유전자는, b -액틴, 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소와 리보솜 단백질 P1 등이 포함된다.

일실시예에서, 대조 핵산은 다른 비 암과 암(전) 상태에서 채집된 샘플의 개체 중 안정적으로 표현되는 또 다른 miRNA이다.

하지만, 대체되어 모든 실험 중 하나 또는 다수의 플라즈마 샘플을 확정하는 표현 수준은, 역시 실험 증거 와/또는 기존 기술 데이터 정의에 대한 특정 질병 유형(질병 상태)에 기반한 하나 또는 다수의 임계값이다. 이러한 상황 중, 하나 또는 다수 표적플라즈마의 상응 표현 수준은 하나의 안정된 표현의 대조 miRNA를 사용하여 표준화시켜 확정할 수 있다. 만약 계산된 '표준화' 표현 수준이 상응 정의된 임계값보다 높다면, 이는 곧 유전자 표현이 상향 조정 되었음을 설명한다. 반대로, 만약 계산된 '표준화'의 표현 수준이 상응 정의된 임계값보다 낮다면, 이는 곧 microRNA의 표현이 하향 조정 되었음을 나타낸다.

본 발명 중의 사용되는 '감세포암 식별 및/또는 기타의 HBV 감염 관련 질병 구분'은 예측 및 확률 분석('진단'의 의미에서)을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조합물과 방식의 의미는 임상 응용에 있고, 치료 형식 결정에는 치료적 개입, 질병 단계와 같은 진단 표준, 질병 통제와 질병 감시와 같은 내용이 포함된다. 본 발명에 따르면, 대상의 상태를 검사하기 위한 중간 결과가 제공될 수 있다. 이러한 중간 결과는 별도 정보와의 조합을 통해 의사, 간호사 또는 기타 관련 종사자들에게 상기 대상 환자와 상기 질병 진단에 도움을 준다. 또는 본 발명은 플라즈마 샘플을 통해 암 변화를 감지하고, 진단에 유용한 정보를 의사에게 제공할 수 있다. 본 발명은 또한 간세포암과 만성 B형 간염과 간경화를 포함한 기타 HBV 감염 관련 질병을 구분하는 데 사용된다.

본 발명에서는, 측정된 하나 또는 다수의 차이나게 표현되는 모든 핵산 분자가 함께 마커를 대표하며, 상기 마커는 플라즈마 샘플 중 간세포암의 증거이다. 본 발명에서 사용되는 '마커'라는 용어는 한 세트의 핵산 분자(예를 들면 miRNA)를 지칭하며, 그 중 각각의 핵산 분자의 표현 수준은 간세포암 환자 플라즈마와 대조 플라즈마 사이에서 다르게 나타난다. 본 발명 중, 상기 마커는 한 세트의 마커를 지칭하며 또한 가장 낮은 숫자의(다른) 핵산 분자를 대표하며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 측정 가능한 개체의 상태인 microRNA 서열을 인코딩한다.

본 발명의 제 1 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 간세포암 진단 마커는 다양한 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩한다.

일반적으로 간세포 암 진단 마커 중의 핵산 분자는 인간의 서열을 포함하며, 아래 문장에서 'has'(호모 사피엔스) 로 칭한다.

바람직하게는, 상기 다양한 핵산 분자는 hsa-miR-122 (SEQ ID NO:1), hsa-miR-192 (SEQ ID NO:2), hsa-miR-21 (SEQ ID NO:3), hsa-miR-223 (SEQ ID NO:4), hsa-miR-26a (SEQ ID NO:5), hsa-miR-27a (SEQ ID NO:6), hsa-miR-801(SEQ ID NO:7) 및 내부 참고 hsa-miR-1228 (SEQ ID NO:8)을 인코딩하는 하나 또는 다수의 핵산 분자를 포함한다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

microRNA	서열 (5' -> 3')
hsa - miR -122	uggagugugacaaugguguuug
hsa-miR-192	cugaccuaugaauugacagcc
hsa-miR-21	uagcuuaucagacugauguuga
hsa-miR-223	ugucaguuugucaaauacccca
hsa-miR-26a	uucaaguaauccaggauaggcu
hsa-miR-27a	uucacaguggcuaaguuccgc
hsa-miR-801	gauugcucugcgugcggaaucgac
hsa-miR-1228	ucacaccugccucgcccccc

본 발명에서 공개하고 있는 모든 microRNA 서열은 모두 이미 miRBase 데이터 베이스(http://microrna.sanger.ac.uk/, 참고 Griffiths-Jones S. et al. (2008) Nucl. Acids Res. 36, D154-D158)에 저장되어 있다.

hsa-miR-801, hsa-miR-192 또는 hsa-miR-21을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되며, hsa-miR-122, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되며, hsa-miR-1228을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 변화가 없다.

본 발명 중의 사용되는 '모든 하나 또는 다수의 핵산 분자' 또는 '상기 다수의 핵산 분자 중의 하나 또는 다수'는 상기 다수 핵산 분자의 모든 하나의 하위 그룹을 지칭하는데, 예를 들면 모든 하나, 모든 두 개, 모든 세 개, 모든 네 개, 모든 다섯, 모든 여섯, 모든 일곱, 모든 여덟, 모든 아홉, 모든 열, 등의 핵산 분자로, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩한다.

가장 바람직하게는, 상기 다양한 종류의 핵산 분자는 각각 hsa-miR-122 (SEQ ID NO:1), hsa-miR-192 (SEQ ID NO:2), hsa-miR-21 (SEQ ID NO:3), hsa-miR-223 (SEQ ID NO:4), hsa-miR-26a (SEQ ID NO:5), hsa-miR-27a (SEQ ID NO:6), hsa-miR-801 (SEQ ID NO:7) 및 hsa-miR-1228(SEQ ID NO:8)을 인코딩하는 8개의 핵산 분자 조합을 포함한다. 상기 8개의 핵산 분자 조합은 다음과 같은 회귀 모델을 포함한다.logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209* hsa-miR-801. 그 중 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801의 표현 수준은 hsa-miR-1228을 내부 검측하여 얻어낸다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다

상기 모델 중의 logit (P = HCC) 값은 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되며, hsa-miR-1228은 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 변화가 없다.

본 발명 중의 사용되는 '핵산 분자 조합'은 적어도 두 핵산 표현 수준을 하나의 총체적인 사용으로 여기는 것을 가리킨다.

본 발명의 제 2 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 간세포암 진단 키트는 일종의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 간세포암 진단 마커는 다양한 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩한다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

가장 바람직하게는, 상기 다양한 종류의 핵산 분자는 각각 hsa-miR-122 (SEQ ID NO:1), hsa-miR-192 (SEQ ID NO:2), hsa-miR-21 (SEQ ID NO:3), hsa-miR-223 (SEQ ID NO:4), hsa-miR-26a (SEQ ID NO:5), hsa-miR-27a (SEQ ID NO:6), hsa-miR-801 (SEQ ID NO:7) 및 hsa-miR-1228(SEQ ID NO:8)을 인코딩하는 8개의 핵산 분자 조합을 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 상기 8개의 핵산 분자의 조합의 회귀 모델을 포함한다.

logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209* hsa-miR-801. 그 중 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801의 표현 수준은 hsa-miR-1228을 내부 검측하여 얻어낸다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

본 발명의 제 3 목적을 달성하기 위해 본 발명의 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 건강개체의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트는 일종의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 간세포암 진단 마커는 다양한 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하며, 상기 다양한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류가 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 그것은 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이를 표현하며, 상기 적어도 한 종류의 대조플라즈마는 건강 개체로부터 채취된다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

hsa-miR-122, hsa-miR-801, hsa-miR-192 또는 hsa-miR-21을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되며, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되며, hsa-miR-1228을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 변화가 없다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

본 발명의 제 4 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 만성 B형 간염 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트는 일종의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 간세포암 진단 마커는 다양한 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하며, 상기 다양한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류가 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 그것은 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이를 표현하며, 상기 적어도 한 종류의 대조플라즈마는 만성 B형 간염 환자로부터 채취된다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

hsa-miR-122, hsa-miR-801 또는 hsa-miR-21을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되며, hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되며, hsa-miR-1228을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 변화가 없다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

본 발명의 제 5 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 간경화 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트는 일종의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 간세포암 진단 마커는 다양한 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하며, 상기 다양한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류가 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 그것은 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 차이를 표현하며, 상기 적어도 한 종류의 대조플라즈마는 간경화 환자로부터 채취된다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

hsa-miR-801을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 상향 조정되며, hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 하향 조정되며, hsa-miR-1228을 인코딩하는 모든 하나 또는 다수의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현을 비교할 때 변화가 없다.

전술한 microRNA의 핵산 서열은 표 1에 나열되어 있다.

본 발명의 제 6 목적을 달성하기 위해본 발명의 간암 진단 마커를 확정하는 방법은 다음과 같은 내용을 포함한다.

(C) (a)단계와 (b)단계에서 얻은 다수의 핵산 분자에 상응하는 표현 수준을 대비, 상기 다수의 핵산 분자로부터 상기 표적플라즈마와 상기 대조플라즈마 중의 차이나게 표현되는 하나 또는 다수의 핵산 분자를 감정하고, 상기 표적플라즈마와 상기 대조플라즈마 중 차이나게 표현되는 하나 또는 다수의 핵산 분자를 간암 진단 마커로 한다.

도면과 아래 실시예들을 참고하여 본 발명에 대해 더욱 자세히 설명한다. 상기 도면과 실시예는 전술한 구성 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

실시예 1 : 플라즈마 샘플 채집 및 제조

본 발명의 실험은 이미 중국 윤리 위원회의 비준을 받았으며, 환자들의 적극적인 지지를 받았다. 본 발명의 microRNA 바이오 마커의 선별 단계, 훈련 단계 및 실험 설계는 도 1에 도시되어있다. 추천된 플라즈마 microRNA 조합으로 간세포암 환자의 플라즈마 샘플을 감별하는 주요 방법 단계는 도 2에 도시되어 있다.

2008년 8월부터 2010년 6월까지, 934개의 합격 표준(도 2)을 만족하는 혈액 샘플을 상해중산의원과 공공위생센터로부터 사전에 채집하였다. 이러한 샘플들은 167명의 건강 기증자(건강 그룹), 169명의 만성 B형 간염 환자(CHB 그룹), 141명의 HBV 감염 후 간경화 환자(간경화 그룹) 및 457명의 HBV 감염 관련 HCC 환자(HCC 그룹)로부터 채집되었다. 이러한 샘플들을 시간의 전, 후 순서에 근거하여 3가지 단계로 나누었다.(도 1) 환자의 임상 표현은 표3과 표 4에서 총체적으로 나타냈다.

환자의 합격 기준 선정

공통 기준

1.연령 =18 세 =90 세

2.현재 감옥, 요양원 또는 수용소와 같은 공공기관에 거주하지 않음

3.중환자실에 입원을 요하는 등의 중증환자가 아님

4.적극적인 지지 능력을 구비
5.008년 8월부터 2010년 6월까지 발생

건강 기증자(건강 그룹）

1.중산의원에서의 검진 여부

2.일반적으로 건강한 상태, 악성 종양 미보균자

만성 B형 간염 환자( CHB 그룹)

1.만성 B형 간염 진단（6개월이 초과한 HBsAg+、HBeAg+，또는 HBeAg가 나타남-그러나 휴대 검측이 가능한 HBV DNA）

HBV 감염 후 간경화 환자(간경화 그룹）

1. HBV 감염

2.경험 있는 의사 2명의 진단

3.만약 사용 가능한 조직이 없다면, 진단은 반드시 2개의 영향을 미치는 보고（Ｂ초음파, CT 또는 MRI）와/또는 AFP를 지원해야 함

HBV 감염 관련 HCC 환자( HCC 그룹）

1.HBV 감염

2.경험 있는 의사 2명의 진단

4. 수술 전 화학 요법, 방사선 치료, 간동맥 화학색전술 또는 용해

마이크로어레이(microarrays ) 실험 대상자 특징

변수		선별단계( Discovery Phase)（n=137）
건강 그룹 수량(%）
연령(평균값±기준차）-세		43 ±14
성별-수량（%）	남	13 （39）
	여	20 （61）
ALT-수량（%）	= 40 U/L	25 （76）
	> 40 U/L	3 （9）
	부족	5 （15）
AFP-수량（%）	= 20 ng/ml	33 （100）
	부족	0
CHB 그룹 수량 （%）
연령(평균값±기준차)-세		42 ±11
성별-수량（%）	남	18 （82）
	여	3 （14）
	부족	1 （5）
ALT-수량（%）	= 40 U/L	5 （23）
	> 40 U/L	15 （68）
	부족	2 （9）
AFP-수량（%）	= 20 ng/ml	17 （77）
	> 20 ng/ml	4 （18）
	부족	1 （5）
간경화 그룹 수량 （%）
연령(평균값±기준차）-세		49 ±11
성별-수량（%）	남	19 （76）
	여	6 （24）
ALT-수량 （%）	= 40 U/L	10 （40）
	> 40 U/L	11 （44）
	부족	4 （16）
AFP-수량 （%）	= 20 ng/ml	21 （84）
	> 20 ng/ml	4 （16）
	부족	0
HCC 그룹 수량 （%）
연령(평균값±기준차）-세		48 ±10
성별-수량（%）	남	49 （86）
	여	8 （14）
ALT-수량（%）	= 40 U/L	22 （39）
	> 40 U/L	27 （47）
	부족	8 （14）
AFP-수량（%）	= 20 ng/ml	18 （32）
	> 20 ng/ml	39 （68）
	부족	0
종양크기-수량（%）	= 3cm	15 （26）
	> 3cm	41 （72）
	부족	1 （2）
다발성종양-수량（%）	YES	12 （21）
	NO	44 （77）
	부족	1 （2）
BCLC 병기-수량(%)	0	5 （9）
	A	8 （14）
	B	35 （61）
	C	8 （14）
	D	0
	부족	1 （2）
병리등급-수량 %）	I，I-II or II	30 （53）
	II-III or III	23 （40）
	부족	4 （7）
혈관침입-수량（%）	YES	30 （53）
	No	23 （40）
	부족	4 （7）

훈련 그룹과 실험 그룹 실험 대상자 특징

변수		훈련그룹 （n=407）	훈련그룹（ n=390）	P 값
건강 그룹 수량（%）
연령(평균값±기준차)-세		44 ±11	45 ±12	0.71
성별	男	35 （49）	43 （65）	0.11
	女	33 （51）	23 （35）
ALT	= 40 U/L	56 （82）	53 （80）	0.76
	> 40 U/L	12 （18）	13 （20）
AFP	= 20 ng/ml	68 （100）	66 （100）
CHB 그룹 수량（%）
연령(평균값±기준차)-세		39 ±13	39 ±14	0.93
성별	男	48 （64）	35 （49）	0.06
	女	27 （36）	37 （51）
ALT	= 40 U/L	40 （53）	42 （58）	0.54
	> 40 U/L	35 （47）	30 （42）
AFP	= 20 ng/ml	60 （80）	41 （57）	0.003
	> 20 ng/ml	15 （20）	31 （43）
간경화 그룹 수량（%）
연령(평균값±기준차)-세		53±3	50±0	0.13
성별	男	43（72）	40（71）	0.98
	女	17（27）	16（29）
ALT	= 40 U/L	39（65）	22（39）	0.01
	> 40 U/L	21（35）	34（61）
AFP	= 20 ng/ml	55（92）	48（56）	0.31
	> 20 ng/ml	5（8）	8（14）
HCC 그룹 수량（%）
연령(평균값±기준차)-세		53±2	53±2	0.95
성별	男	168（82）	166（85）	0.53
	女	36（18）	30（15）
ALT	= 40 U/L	135（66）	148（76）	0.04
	> 40 U/L	69（34）	48（24）
AFP	= 20 ng/ml	82（40）	79（40）	0.98
	> 20 ng/ml	122（60）	117（60）
종양크기	= 3cm	71（33）	93（45）	0.02
	> 3cm	133（66）	106（53）
다발성 종양	YES	32（16）	44（22）	0.25
	NO	168（82）	151（76）
	부족	4（2）	4（2）
BCLC 병기	0	26（13）	36（18）	0.25
	A	132（65）	111（57）
	B	31（15）	38（19）
	C	14（7）	11（6）
	D	1（0.5）	0（0）
병리등급	I，or II	138（68）	135（69）	0.78
	III	51（25）	50（26）
	부족	15（7）	11（6）
혈관침입	YES	67（33）	68（35）	0.50
	NO	122（60）	122（61）
	부족	15（7）	9（5）

말초혈(4ml)을 추출하여 EDTA 튜브에 넣고, 30분 내, EDTA 튜브를 820g의 조건에서 10분 동안 중심에서 떨어뜨린다. 그 후 1ml 1 플라즈마를 1.5ml 1 튜브로 옮겨와 16,000g에서 10분동안 중심에서 떨어뜨려 남아있는 세포 파편을 제거한다. 그 후, 표면에 혈액을 깨끗한 튜브로 옮기고 -80도에서 저장한다.

mirVana PARIS microRNA 분리 키트（mirVana PARIS miRNA Isolation kit）를 사용하여 공장（NanoDrop Technologies，Waltham，MA）에서 제공하는 사용 설명서에 따라 총 RNA를 추출하였으며, NanoDrop 1000 분광 광도계（NanoDropTechnologies，Waltham，MA）를 사용하여 그 농도를 측정한다.

실시예 2 : microRNA 마이크로어레이(microarrays) 분석

Agilent microRNA microarray platform을 사용하여(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA) 특정 플라즈마 샘플 중의 microRNA에 대해 정성 분석을 실시한다. 상기 마이크로 어레이는 Sanger database v.10.1의 723명의 인간으로부터 생성된 microRNA의 탐침을 포함한다. 137개 플라즈마로부터 생성된 샘플 중 한 개의 총 RNA(100ng)를 단색 CY3에 섞어 표기한다. XDR 스캐너(PMT100，PMT5）를 사용해 유전자 칩을 스캐닝하고, Agilent microRNA 마이크로어레이 시스템의 규정에 따라 표기하고 교잡한다. Feature Extraction Software Rev. 9.5.3（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）를 통해 마이크로어레이 이미지 정보를 광점 강도값으로 전환시킨다. 배경을 제거한 후의 신호는 안정적인 hsa-miR-1228 내부 참고 표준화에 사용한다. 그 후 밑 수 2의 log로 전환한다. 한 서열 상의 중복점의 조각 사이에 변이 계수(CV)가 15%를 초과하거나 또는 검측된 신호가 5%보다 작으면 샘플로 사용될 수 없으므로, 샘플로 사용될 수 없는 점들을 제거한 후, 분석을 실시한다.

실험 대상자들의 인구학적 특징은 묘사적 통계로 보고한다. 카드형 또는 T실험은 훈련 그룹과 검증 그룹간의 비교(표 5)에 사용된다. Kruskal-Wallis 검증은 HCC 그룹, 건강 그룹, CHB 그룹 및 간경화 그룹 사이의 총체적인 비교에 쓰인다. Mann-Whitney 미페어링 검증은 두 그룹간의 비교에 쓰인다. 이러한 검증에서 얻은 p값 전부는 Benjamini-Hochberg 방식을 통해 다중 검증 교정된다. 모든 p값은 두 측면이다.

다음과 같은 기준을 채택, 마이크로어레이 상에 있는 검측 가능한 신호 후보 microRNA를 선택하여 검증한다.

(1）HCC 그룹, 건강 그룹, CHB 그룹 및 간경화 그룹 사이에서 Kruskal-Wallis 검증을 통한 교정 후의 p값 < 0.001；

(2) HCC 그룹과 건강 그룹 사이에서 Mann-Whitney 미페어링 검증을 통한 교정 후의 p값< 0.05

(3) HCC 그룹과 CHB 그룹 사이에서 Mann-Whitney 미페어링 검증을 통한 교정 후의 p값 < 0.00000001

(4) HCC 그룹과 간경화 그룹 사이에서 Mann-Whitney 미페어링 검증을 통한 교정 후의 p값 < 0.0001

실시예 3： 137개 샘플의 마이크로어레이 데이터

진일보된 검증에 사용되는 15개의 후보 microRNA는 마이크로어레이 분석 중 표 5와 같이 도시되며, 선택 기준을 만족하는 microRNA는 고딕활자로 표시하였다(표 5 15개의 후보 microRNA의 마이크로어레이 중 표현).

실시예 ４：102개의 플라즈마 샘플을 통해 후보 microRNA를 평가

102개의 플라즈마 샘플의 독립군 조직 및 다른 기술 플랫폼을 채택하여 마이크로어레이에 대한 15개 후보 microRNA를 선별하여 평가한다. TaqMan MicroRNA 검측 키트（TaqMan MicroRNA assay kit，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）를 사용, 공장의 사용 설명서에 근거하여 조작한다. 모든 검측은 3번씩 중복한다. hsa-miR-1228의 표현 수준을 내부 참고로 한다. 102개 샘플의 20% 초과 중 나타나는 CT값이 35개의 순환되는 microRNA보다 크면 제거되며, 다시는 분석하지 않는다.

Kruskal-Wallis 검측은 HCC 그룹, 건강 그룹, CHB 그룹 및 간경화 그룹 사이의 총체적인 비교에 쓰인다. Mann-Whitney 검증은 두 그룹간의 비교에 쓰인다. 이러한 검증에서 얻은 p값 전부는 Benjamini-Hochberg 방식을 통해 다중 검증 교정된다. 모든 p값은 두 측면이다.

15개의 후보 microRNA는 마이크로어레이 분석 중 표 5와 같이 도시되며, 15개의 후보 microRNA 중의 12개는 질량 통제 과정을 거친다. 그들 중의 7개（hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a와 hsa-miR-801）는 HCC 그룹과 대조 그룹 사이의 표현 수준에서 현저히 차이가 난다. 15개의 후보 microRNA는 정량 RT-PCR상의 표현 차트에서 표 6과 같이 도시된다. 특히 바람직하게 microRNA（SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7）는 고딕활자로 표시하였다.

102개 샘플 중 15개 후보 microRNA 정량RT-PCR 상의 표현 차트

	HCC그룹과 대조 그룹 비교		HCC그룹과 건강 그룹 비교		HCC 그룹과 CHB그룹 비교		HCC 그룹과 간경화 그룹 비교
	P값	배수 변화	P값	배수 변화	P값	배수 변화	P값	배수변화
hsa - miR -122	1.5E-07	0.9	9.9E-04	0.9	2.2E-03	0.1	4.4E-01	0.7
hsa - miR -801	1.1E-06	4.9	1.8E-05	4.9	1.3E-01	1.9	1.0E-04	5.9
hsa-miR-194	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
hsa - miR -223	1.4E-03	0.3	8.4E-01	0.3	4.5E-02	0.3	2.7E-03	0.1
hsa - miR -21	1.1E-06	1.7	4.6E-04	1.7	1.8E-01	2.0	1.1E-01	0.3
hsa-miR-23b	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
hsa-miR-192	1.1E-06	1.1	2.1E-04	1.1	1.3E-01	0.4	4.4E-01	0.5
hsa-miR-101	7.6E-01	1.2	5.2E-01	1.2	9.6E-01	0.9	4.5E-01	1.9
hsa-miR-122*	8.7E-02	1.3	2.5E-01	1.3	7.0E-01	2.0	3.5E-01	0.4
hsa-miR-19a	7.6E-01	1.6	5.2E-01	1.6	3.9E-01	1.8	4.4E-01	2.1
hsa-miR-19b	7.6E-01	1.6	6.0E-01	1.6	5.1E-01	1.6	4.4E-01	2.4
hsa-miR-29c	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
hsa - miR -27a	3.8E-05	0.2	8.4E-01	0.2	1.4E-02	0.2	1.0E-04	0.1
hsa-miR-181d	2.3E-01	1.3	2.5E-01	1.3	9.0E-01	1.3	4.4E-01	0.6
hsa - miR -26a	2.6E-05	0.2	4.6E-01	0.2	3.2E-03	0.1	1.0E-04	0.1

대조 그룹은 건강 개체, CHB환자 및 간경화 환자를 포함한다. HCC 그룹과 대조 그룹 중 차이를 표현한 microRNA는 고딕활자로 표시한다. 상기 microRNA가 질량 통제 과정을 거치지 않았기 때문에 ND표시는 확정할 수 없다.

실시예 5 : 407개의 샘플을 포함하고 있는 훈련 그룹 중 하나의 microRNA 진단 모델을 수립한다.

다른 305개의 플라즈마 샘플 상에서 정량 RT-PCR검측 방법을 사용하여 7개의 차이 표현의 microRNA 표현 차트를 평가한다.

407개의 플라즈마 샘플은 결합되어 훈련 집단에 사용되어 HCC 진단 microRNA 조합을 구성한다. 동일하게 Kruskal-Wallis검증은 HCC그룹, 건강 그룹, CHB 그룹 및 간경화 그룹 사이의 총체적 비교에 사용된다. Mann-Whitney 미페어링 검증은 두 그룹간의 비교에 쓰인다. 이러한 검증에서 얻은 p값 전부는 Benjamini-Hochberg 방식을 통해 다중 검증 교정된다. 모든 p값은 두 측면이다.

점진적인 논리 회귀 모델은 훈련 집단이 선택한 microRNA를 기반으로 한 진단 마커에 사용된다.

7개 후보 microRNA의 훈련 그룹 중의 표현 차트와 진단 효능은 표 6에서 도시된다. MicroRNA 조합의AUC는 명확하게 AFP의 AUC보다 크다.(0.86 vs. 0.76，p<0.001，도 3A）

조 microRNA	HCC 그룹과 대조 그룹 비교			HCC 그룹과 건강 그룹 비교			HCC 그룹과 CHB 그룹 비교			HCC 그룹과 간경화그룹 비교
조 microRNA	P값	배수변화	AUC	P값	배수변화	AUC	P값	배수변화	AUC	P값	배수변화	AUC
hsa-miR-122	3.0E-12	0.8	0.55	3.8E-04	2.6	0.65	4.0E-07	0.3	0.71	3.0E-02	0.6	0.60
hsa-miR-192	5.6E-10	1.4	0.57	1.6E-08	4.0	0.74	5.8E-01	1.1	0.52	1.1E-01	0.7	0.57
hsa-miR-21	<1.0E-12	1.8	0.63	1.6E-08	3.5	0.74	6.3E-09	3.2	0.74	1.4E-03	0.5	0.64
hsa-miR-223	3.0E-12	0.3	0.64	1.0E-03	0.4	0.64	5.8E-01	0.7	0.52	7.3E-12	0.1	0.80
hsa-miR-26a	<1.0E-12	0.2	0.67	1.5E-02	0.4	0.60	3.0E-01	0.5	0.56	<1.0E-12	0.04	0.87
has-miR-27a	<1.0E-12	0.3	0.64	3.6E-03	0.4	0.62	5.8E-01	0.9	0.52	<1.0E-12	0.1	0.86
has-miR-801	1.9E-09	2.1	0.63	3.6E-03	2.2	0.62	5.8E-01	1.2	0.53	1.9E-09	3.6	0.76
microRNA 조합* AUC 0.86 (0.83，0.90) logit(p=HCC)= -1.424-0.292 hsa-miR-122+0.4511* hsa-miR-192+0.6112* hsa-miR-21-0.1796* hsa-miR-223-0.2487* hsa-miR-26a-0.3542* hsa-miR-27a+0.209* hsa-miR-801

# 대조 그룹은 건강 개체, B형 간염 환자 및 간경화 환자를 포함한다.

실시예 6：390개 샘플의 검증 그룹에서는 상기 microRNA 조합을 검증한다.

훈련 그룹에서 예상된 계수는 독립적인 검증 그룹(390 플라즈마 샘플) 상에서 HCC의 발병 확률을 진단하는 데 사용된다. 같은 맥락에서, 정량 RT-PCR검측 방법으로 실험을 진행한다. 예측 확률은 실험 대상자들의 작업 특징 곡선 건립에 쓰인다.

MicroRNA 조합과 AFP 간의 AUC는 실험 그룹 중의 비교는 microRNA 조합의 진단 정확도가 현저히 AFP보다 높다는 것을 표명한다.(AUC: 0.89 vs. 0.68，p<0.001，도 3B）

MicroRNA 조합과 AFP는 HCC 그룹과 건강 그룹, CHB 그룹 및 간경화 그룹의 효능 역시 비교한다(도 4) 상기 분석은 MicroRNA 조합과 AFP 모두 HCC 그룹과 비 HCC로 그룹으로 구분된다는 것을 증명한다. 그러나 MicroRNA 조합의AUC는 AFP보다 현저히 크다（HCC와 건강 그룹: 0.95 vs. 0.64，p<0.001，HCC와CHB: 0.85 vs. 0.62，p<0.001 and HCC와 간경화 그룹 : 0.89 vs. 0.78，p=0.002）

실시예 7：MicroRNA 조합과 AFP는 다른 BCLC 병기 구분의 진단에서 나타난다. MicroRNA 조합과 AFP는 다른 BCLC 병기 구분의 진단에서 진일보된 평가로 표현된다.(도 ５）진단 초기와 중기HCC（BCLC 0, A, B기）에 있어서, MicroRNA조합의 진단은 AFP보다 현저히 높게 표현되었다.(BCLC 0기，AUC 0.94 vs. 0.68，p<0.001; BCLC A기，AUC 0.90 vs. 0.65，p<0.001; BCLC B期，AUC 0.85 vs. 0.74，p<0.001; 도 5A，5B and 5 C）MicroRNA 조합과 AFP 사이의 비교는 집중적으로 BCLC C기 환자일 때, 그 진단 표현의 명확한 차이가 없다.(AUC 0.80 vs. 0.79，p=0.24，도 5D）

실시예 8 : MicroRNA 조합은 AFP 정상（<_-20ng/ml）그룹과 고AFP（>20ng/ml）그룹 중의 진단을 AFP 수준에 의거하여 MicroRNA 조합 진단 정확도를 예측하는 것을 표현한다. AFP 정상(>20ng/ml）그룹 중, MicroRNA 조합의 AUC는 AFP의 AUC보다 현저히 크다.（0.87 vs. 0.63，p<0.001，도6A）고AFP（>20ng/ml）그룹 중, MicroRNA 조합의 AUC 역시 여전히 AFP의 AUC보다 현저히 크다.（0.90 vs. 0.69，p<0.001，도 6B）

실시예 9 : HCC절제술 전, 후의 표현 변화

간 절제술을 받은 54명의 HCC 환자로부터 수술 전, 후의 여섯째 날의 혈액 샘플을 추출하였다. 정량 RT-PCR을 사용하여 microRNA 표현 차트의 변화를 관리 감독하였다. 모든 검측은 3차례씩 중복함으로써, 오차를 감소시켰다. Hsa-miR-1228의 표현 수준은 내부 참고로 쓰였다.

관찰에서 얻은 결과는 Hsa-miR-21, hsa-miR-192와 AFP의 표현 수준이 HCC 절제술 후 현저히 떨어졌다.(평균차 각각 0.77, 1.74와 6.66 / p값 각각 p<0.001, p=0.03과 p<0.001，도 7）Hsa-miR-223, hsa-miR-26a와 hsa-miR-27a의 수술 후 표현 수준과 수술 전 표현 수준을 비교해보니 다소 증가하였다.(평균차 각각 -0.61, -0.81과 -0.55 / p값 각각 p=0.02, 0.06과 0.06) Hsa-miR-122와 hsa-miR-801의 표현 수준은 수술로 야기된 뚜렷한 변화가 없었다.

획득한 결과로 증명해보면, microRNA는 간세포암 환자 플라즈마 중의 특이성 표현이다. 따라서 여기서 규정하고 있는 microRNA 그룹은 독특한 microRNA 바이오 마커로 간주될 수 있으며, 간세포암 플라즈마 microRNA 표현 차트의 분석을 통해, 초기에 간세포암 발생을 진단 받을 수 있을 뿐만 아니라 간세포암과 만성 B형 간염 및 간경화와도 구분이 가능하게 한다.

본 발명은 일종의 플라즈마 microRNA로 구성되고 상기 마커의 키트가 포함된 간세포암 진단 마커 및 간암(특히 간세포암) 진단의 새로운 방법 관한 것이다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 구성 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 상술한 실시 예 방식은 상징적인 것일 뿐, 제한이 있는 것이 아니다.

본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

Claims

다종 핵산 분자로 구성되며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 1항에 있어서,
상기 다종의 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자를 포함하며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조플라즈마 중에 차이가 나게 표현되는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 2항에 있어서,
상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중에서 차이가 나게 표현되며, 상기 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자 중에 선택되며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조플라즈마에서의 표현은 비교할 때 상향 조정되되;및
microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중의 표현을 비교할 때 하향 조정되는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 3항에 있어서,
상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 적어도 한 종류의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-801, hsa-miR-192 또는 hsa-miR-21을 인코딩하는 핵산 분자 중에 선택되며;
상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중의 표현을 비교할 때 하향 조정되는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자는 hsa-miR-122, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 또는 hsa-miR-223을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자 중에 선택되는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 1항에 있어서,
상기 다종의 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자를 포함하며, 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중의 표현은 변화가 없는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 5항에 있어서,
상기 적어도 한 종류의 표적플라즈마와 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중에 차이가 없게 표현되는 상기 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하는 상기 적어도 한 종류의 핵산 분자는 적어도 한 종류의 hsa-miR-1228을 인코딩하는 적어도 한 종류의 핵산 분자 중에 선택되는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 1항에 있어서,
상기 다종의 핵산 분자는 hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a, hsa-miR-801 및 hsa-miR-1228을 인코딩하는 8개의 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 2항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 한 종류의 대조 플라즈마는 건강 개체, 만성 B형 간염 환자 또는 간경화 환자로부터 채취되는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 간세포간암은 초기 간세포암인 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
제 8항에 있어서,
상기 간세포간암은 초기 간세포암인 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 마커.
청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항의 간세포암 진단 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 키트.
제 11항에 있어서,
logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801와 같은 회귀모델을 더 포함하며;
hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801의 표현 수준은 hsa-miR-1228을 내부 검측하여 얻어내며, 모델 중의 logit（p=HCC）값은 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 키트.
제 11항에 있어서,
상기 간세포간암은 초기 간세포암인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 간세포암 진단 키트.
청구항 2 내지 3, 청구항 4 내지 7 중의 어느 한 항의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 적어도 한 종류의 대조 플라즈마는 건강 개체로부터 채취되는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 건강 개체의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
제 14항에 있어서,
logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801과 같은 회귀 모델을 포함하며;
hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801의 표현 수준은 hsa-miR-1228을 내부 검측하여 얻어내며, 모델 중의 logit（p=HCC）값은 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 건강 개체의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
제 14항에 있어서,
상기 간세포간암은 초기 간세포암인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 만성 B형 간염 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
청구항 2 내지 3, 청구항 4 내지 7 중의 어느 한 항의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 적어도 한 종류의 대조 플라즈마는 만성 B형 간염 환자로부터 채취되는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 만성 B형 간염 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
제 17항에 있어서,
logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801과 같은 회귀 모델을 포함하며;
hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801의 표현 수준은 hsa-miR-1228을 내부 검측하여 얻어내며, 모델 중의 logit（p=HCC）값은 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 만성 B형 간염 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
제 17항에 있어서,
상기 간세포간암은 초기 간세포암인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 만성 B형 간염 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
청구항 2 내지 3, 청구항 4 내지 7 중의 어느 한 항의 간세포암 진단 마커를 포함하며, 상기 적어도 한 종류의 대조 플라즈마는 간경화 환자로부터 채취되는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 간경화 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
제 20항에 있어서,
logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801과 같은 회귀 모델을 포함하며;
hsa-miR-122, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-223, hsa-miR-26a, hsa-miR-27a 및 hsa-miR-801의 표현 수준은 hsa-miR-1228을 내부 검측하여 얻어내며, 모델 중의 logit（p=HCC）값은 적어도 한 종류의 표적플라즈마 중의 표현과 적어도 한 종류의 대조 플라즈마 중의 표현을 비교할 때 상향 조정되는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 간경화 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
제 20항에 있어서,
상기 간세포간암은 초기 간세포암인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 간세포암 환자의 플라즈마와 적어도 하나의 간경화 환자의 플라즈마를 구분하는데 사용되는 키트.
(a) 하나 또는 다수의 표적플라즈마 중 다수의 핵산 분자의 표현 수준을 확정하며, 각 핵산 분자는 적어도 하나의 microRNA 서열을 인코딩하며;
(b) 하나 또는 다수의 대조 플라즈마 중 상기 다수의 핵산 분자의 표현 수준을 확정하며;
(C) 상기 (a)단계와 상기 (b)단계에서 얻은 다수의 핵산 분자에 상응하는 표현 수준을 대비, 상기 다수의 핵산 분자로부터 상기 표적플라즈마와 상기 대조플라즈마 중 차이가 나타나는 하나 또는 다수의 핵산 분자를 감정하고, 상기 표적플라즈마와 상기 대조플라즈마 중 차이가 나타나는 하나 또는 다수의 핵산 분자를 간암 진단 마커로 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 마커를 확정하는 방법.