ITMI20091538A1 - Profili di espressione di micro-rna nel sangue periferico di pazienti affetti da epatocarcinoma o cirrosi epatica e loro usi - Google Patents

Profili di espressione di micro-rna nel sangue periferico di pazienti affetti da epatocarcinoma o cirrosi epatica e loro usi Download PDF

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ITMI20091538A1
ITMI20091538A1 IT001538A ITMI20091538A ITMI20091538A1 IT MI20091538 A1 ITMI20091538 A1 IT MI20091538A1 IT 001538 A IT001538 A IT 001538A IT MI20091538 A ITMI20091538 A IT MI20091538A IT MI20091538 A1 ITMI20091538 A1 IT MI20091538A1
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hepatocarcinoma
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Sergio Abrignani
Francesco Raffaele De
Massimiliano Pagani
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Istituto Naz Di Genetica Mole Colare Ingm
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Description

DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo:
"PROFILI DI ESPRESSIONE DI MICRO-RNA NEL SANGUE PERIFERICO DI PAZIENTI AFFETTI DA EPATOCARCINOMA 0 CIRROSI EPATICA E LORO USI"
La presente invenzione si riferisce ad un metodo per diagnosticare o prognosticare un epatocarcinoma, anche a stadi precoci, oppure per valutare il rischio di sviluppare un epatocarcinoma o per monitorare l'efficacia di una terapia antitumorale contro un epatocarcinoma .
L'epatocarcinoma è una delle neoplasie umane più aggressive e diffuse al mondo, caratterizzato da un decorso spesso sfavorevole. Le principali terapie a cui si ricorre in caso di epatocarcinoma riguardano la resezione chirurgica o il trapianto di fegato. Tuttavia, la ridotta percentuale di sopravvivenza postoperatoria (30-40% dopo cinque anni) e la frequente ricomparsa post-chirurgica di metastasi, nei pazienti soggetti ad un trattamento di resezione chirurgica, complicano notevolmente l'approccio clinico nei confronti dell<1>epatocarcinoma. Questo limite è ulteriormente esasperato dalla ridotta possibilità di un trattamento chirurgico che, infatti, è riservato solo ad una piccola percentuale di pazienti (circa il 20% dei pazienti con epatocarcinoma) , in particolare quei pazienti in cui si riscontrano ridotte lesioni e parametri epatici relativamente normali.
Il trapianto di fegato come soluzione terapeutica efficace per 1'epatocarcinoma è un argomento ancora oggi molto dibattuto e le opinioni in merito sono controverse a causa della bassa disponibilità di organi, ma soprattutto per la difficoltà di classificare ed individuare i candidati adeguati al trattamento, principalmente quando la patologia è nelle sue fasi iniziali.
Nonostante oggi per molte forme tumorali siano disponibili metodi di classificazione della progressione patologica, ben codificati e generalmente accettati, 1 'epatocarcinoma rappresenta un'eccezione. La classificazione clinica dell'epatocarcinoma e le indicazioni terapeutiche correlate sono procedure molto complesse e dipendono sia dal grado di progressione tumorale, sia dalla funzione epatica residua. Esistono diversi sistemi di classificazione e stadiazione clinica per il carcinoma epatico, tuttavia, la comunità scientifica non si è ancora pronunciata in merito al metodo più appropriato ed efficace. Pertanto, l'identificazione di specifici marcatori prognostici, in grado di rappresentare nuovi criteri di classificazione e stadiazione applicabili ai pazienti affetti da epatocarcinoma, rappresenta un obiettivo indispensabile soprattutto perché da esso dipende la scelta del trattamento terapeutico più adeguato al paziente.
L’obiettivo di una stadiazione universalmente accettata è potenzialmente utile per migliorare l'accuratezza della prognosi nel singolo paziente, favorire la selezione dei pazienti alle diverse terapie ed infine per conformare gruppi di pazienti in base all'efficacia terapeutica .
L'identificazione di bio-marcatori molecolari potrebbe offrire una speranza per il miglioramento della diagnosi o prognosi dell'epatocarcinoma, per valutare il rischio di sviluppare un epatocarcinoma e per monitorare l'efficacia di un trattamento terapeutico contro 1'epatocarcinoma.
In questo contesto, il problema tecnico alla base della presente invenzione è di mettere a disposizione un metodo per la classificazione e la stadiazione di un epatocarcinoma che sia non invasivo, semplice e veloce, ma al tempo stesso accurato e riproducibile e che possa rispondere all'esigenza di una classificazione e stadiazione "universale", utile a garantire la scelta del miglior trattamento terapeutico per ogni singolo paziente. Il termine "non invasivo" nel contesto della presente invenzione indica la possibilità, mediante un semplice test del sangue, di realizzare cure su misura per i singoli pazienti a fronte di svantaggiose metodiche con immagini costose ed a biopsie invasive che ad oggi rappresentano il classico approccio clinico per la diagnosi, prognosi e quindi terapia del cancro. In particolare un pannello specifico di biomarcatori, presenti e stabili nel circolo sanguigno, possono essere utilizzati come "impronta digitale" molecolare dell 'epatocarcinoma.
Tale problema tecnico è risolto da un metodo per diagnosticare o prognosticare un epatocarcinoma, anche a stadi precoci, per valutare il rischio di sviluppare un epatocarcinoma o per monitorare l'efficacia di una terapia antitumorale contro un epatocarcinoma come delineato nelle annesse rivendicazioni.
La presente invenzione riguarda un metodo per diagnosticare o prognosticare un epatocarcinoma, anche a stadi precoci, oppure per valutare il rischio di sviluppare un epatocarcinoma o per monitorare l'efficacia di una terapia antitumorale contro 1'epatocarcinoma, comprendente la misurazione, preferibilmente mediante RT-PCR quantitativa, del livello di espressione di almeno un prodotto genico di un microRNA (miRNA) in un campione di sangue periferico oppure in un campione di fluido biologico, ed il confronto di detto livello di espressione misurato con un livello di riferimento.
L'alterazione dei livelli di espressione del prodotto genico di un miRNA in un campione del soggetto in analisi, rispetto ad un campione controllo, è indicativa del fatto che il soggetto è affetto da epatocarcinoma o ha un aumentato rischio di sviluppare un epatocarcinoma. Inoltre, l'alterazione dei livelli di espressione del prodotto genico di un miRNA in un campione del soggetto in analisi, rispetto ad un campione controllo è indicativa dell'efficacia, evoluzione ed esito di una terapia contro 1'epatocarcinoma.
L'alterazione dei livelli di espressione del prodotto genico di un miRNA in un campione del soggetto in analisi, rispetto a un campione controllo è anche indicativa dell'evoluzione della malattia e quindi della sua prognosi.
Tale metodo può essere anche impiegato per diagnosticare o valutare il rischio di sviluppare una cirrosi epatica in pazienti, per esempio affetti da epatite cronica oppure sani, oppure per prognosticare l'evolversi di una cirrosi in pazienti affetti da cirrosi, oppure per monitorare l'efficacia di una terapia farmacologica contro la cirrosi epatica.
In questo caso, il metodo comprende la misurazione, preferibilmente mediante RT-PCR quantitativa, del livello di espressione di almeno un prodotto genico di un microRNA (miRNA) in un campione di sangue periferico oppure in un campione di fluido biologico, ed il confronto di detto livello di espressione misurato con un livello di riferimento. L'alterazione dei livelli di espressione del prodotto genico di un miRNA in un campione del soggetto in analisi, rispetto a un campione controllo è indicativa del fatto che il soggetto è affetto da cirrosi epatica o ha un aumentato rischio di sviluppare una cirrosa epatica, per esempio in pazienti affetti da epatite cronica.
Tale alterazione è anche indicativa dell'efficacia, evoluzione ed esito di una terapia contro la cirrosi epatica .
Tale alterazione dei livelli è anche indicativa dell'evoluzione della malattia e quindi della sua prognosi.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi del metodo secondo la presente invenzione appariranno maggiormente chiari dai risultati sperimentali illustrati nelle unite figure, in cui:
- la Figura 1 mostra un grafico dei valori del rapporto dell'espressione relativa tra campioni di sangue di soggetti affetti da epatocarcinoma (HCC) e campioni di sangue di soggetti sani (controllo-HD); i valori tra 0 e 1 indicano miRNA iperespressi nei campioni di soggetti sani, mentre i valori maggiori di 1 si riferiscono a miRNA iperespressi nei campioni di soggetti affetti da epatocarcinoma ;
la Figura 2 mostra una rappresentazione grafica mediante gradiente di colore (heatmap) dei valori di ACt (Ct: Ciclo soglia) per i 62 miRNA differenzialmente espressi in maniera significativa secondo l'analisi ttest tra 10 campioni di soggetti sani e 10 campioni di soggetti con epatocarcinoma HCC non accoppiati (p-value <0.05);
- la Figura 3 mostra il grafico dei valori del rapporto dell'espressione relativa tra campioni di sangue di soggetti affetti da cirrosi epatica e campioni di sangue degli stessi soggetti cirrotici che hanno successivamente sviluppato epatocarcinoma; i valori tra 0 e 1 indicano i miRNA iperespressi nei campioni di soggetti cirrotici, mentre valori maggiori di 1 si riferiscono a miRNA iperespressi nei campioni di soggetti con epatocarcinoma;
la Figura 4 mostra una rappresentazione grafica, mediante gradiente di colore (heatmap), dei valori di ACt per gli 11 miRNA differenzialmente espressi in maniera significativa nell'analisi di t-test appaiato tra 5 campioni di sangue di soggetti affetti da cirrosi epatica e 5 campioni di sangue degli stessi soggetti cirrotici che hanno successivamente sviluppato epatocarcinoma.
1 miRNA sono molecole naturalmente presenti in molti organismi inclusi animali, piante e virus e svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dell'espressione genica, regolando, in modo specifico, la stabilità e la traduzione degli RNA messaggeri (mRNA). I miRNA sono espressi inizialmente come lunghe molecole di RNA precursori, i pri-miRNA che, attraverso un complesso meccanismo di processamento nucleo-citoplasmatico, vengono trasformati nella forma matura (miRNA) caratterizzata da una lunghezza di 17-24 nucleotidi. La funzione di molti miRNA non è nota; tuttavia, diversi studi hanno dimostrato il ruolo chiave che i miRNA hanno nella regolazione genica in molte funzioni biologiche fondamentali come, l'apoptosi, lo sviluppo ematopoietico e il differenziamento cellulare.
La rilevanza biologica e clinica dei profili dell'espressione dei miRNA è stata dimostrata nei tumori solidi umani (come il tumore alla mammella) e nella leucemia linfatica cronica.
Ulteriore prerogativa dei miRNA è la loro presenza, in una forma stabile RNA resistente, nel sangue (siero e plasma) e in diversi altri fluidi biologici, infatti recentemente è stato dimostrato che il sangue di pazienti affetti da carcinoma alla prostata o cancro ovario evidenziano dei profili di espressione di miRNA peculiari.
Per gli scopi della presente invenzione, 1<1>almeno un prodotto genico di un miRNA utilizzato nel metodo è almeno un miRNA.
L’almeno un prodotto genico di un miRNA è scelto, singolarmente od in combinazione, nel gruppo costituito da SEQ ID NO 1-69.
In una forma preferita dell'invenzione, 1 'almeno un prodotto genico di un miRNA è selezionato, singolarmente od in combinazione, nel gruppo costituito da SEQ ID NO 1-19 e SEQ ID NO 63-66 e SEQ ID 69, più preferibilmente è scelto nel gruppo costituito da: SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e SEQ ID NO 65.
Tali sequenze di miRNA sono caratterizzate da un livello di espressione relativa maggiore in un campione di un soggetto affetto da epatocarcinoma rispetto ad un controllo, che può essere un soggetto sano o cirrotico. In un'altra forma preferita di realizzazione della presente invenzione, 1<1>almeno un prodotto genico di un miRNA è selezionato, singolarmente od in combinazione, nel gruppo costituito da SEQ.ID NO 20-62 e SEQ.ID NO 67-68, più preferibilmente è scelto nel gruppo costituito da:, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, , SEQ ID NO 41 e SEQ ID NO 67.
Tali sequenze di miRNA sono caratterizzate da un livello di espressione relativa minore in campioni di soggetti affetti da epatocarcinoma rispetto ad un controllo, che può essere un soggetto sano o cirrotico.
In una forma preferita di realizzazione della presente invenzione 1<1>almeno un prodotto genico di un miRNA è selezionato, singolarmente od in combinazione, tra le sequenze: SEQ ID NO 6, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 23, 28, 30, 31, 33, 36, 37, 39, 40, 41, 65 e 67.
II metodo, oggetto della presente invenzione, è preferibilmente realizzato in vitro, in particolare su campioni di sangue o fluido biologico di un soggetto umano .
Il campione di sangue periferico oggetto dell'indagine può essere sangue intero, cellule mononucleate periferiche del sangue, siero o plasma isolati (ex vivo).
Il campione oggetto dell'indagine può essere anche un qualsiasi fluido biologico, per esempio urina o saliva. Il metodo descritto si riferisce all'epatocarcinoma, in uno stadio avanzato o anche precoce, in particolare all'epatocarcinoma trabecolare, pseudoghiandolare, compatto, o scirroso, con diversi gradi di differenziazione .
Il metodo dell'invenzione è impiegato per diagnosticare se un soggetto è affetto da epatocarcinoma oppure se è a rischio di sviluppare tale patologia verificando l'eventuale alterazione dei livelli di espressione del prodotto genico di un miRNA in un campione di sangue periferico o di fluido biologico del soggetto in analisi, rispetto ad un campione controllo.
Il metodo dell'invenzione è anche impiegato per definire la prognosi di un epatocarcinoma mediante la comparazione dei livelli di espressione di almeno un prodotto genico di un miRNA in un campione di sangue periferico o di fluido biologico di un soggetto affetto da epatocarcinoma ed un livello di riferimento. L'alterazione dei livelli di espressione dell'almeno un prodotto genico di un miRNA in un campione del soggetto in analisi, rispetto a un campione di riferimento è indicativa del grado di avanzamento del tumore dal quale è possibile dedurre la prognosi della malattia.
Il metodo dell'invenzione viene anche utilizzato per monitorare l'efficacia di un trattamento terapeutico anti-tumorale, in particolare un trattamento chemio/radio-terapico. In questo caso il metodo comprende la comparazione dei livelli di espressione di almeno un prodotto genico di un miRNA in un campione di sangue periferico o di fluido biologico del soggetto in analisi con un campione di riferimento. L'alterazione dei livelli di espressione dell'almeno un prodotto genico di un miRNA in un campione del soggetto in analisi, rispetto a un campione dello stesso soggetto in fasi diverse del trattamento terapeutico in oggetto, è indicativa dell'efficacia del trattamento stesso.
In alternativa, il metodo per determinare l'efficacia di un trattamento terapeutico anti-tumorale comprende la comparazione di campioni di sangue periferico di pazienti, affetti da epatocarcinoma e soggetti a trattamento terapeutico anti- tumorale, e campioni di pazienti affetti da epatocarcinoma, ma non soggetti a trattamento terapeutico anti-tumorale. L'alterazione dei livelli di espressione del prodotto genico di un miRNA tra i due gruppi di pazienti è indicativa della validità e dell'efficacia o meno di un nuovo metodo di trattamento terapeutico anti-tumorale.
In una forma alternativa di realizzazione, il metodo dell'invenzione può essere anche impiegato per diagnosticare o valutare il rischio di sviluppare una cirrosi epatica, per esempio in pazienti affetti da epatite cronica o in pazienti sani, oppure per prognosticare l'evolversi di una cirrosi in pazienti affetti da cirrosi, oppure per monitorare l'efficacia di una terapia farmacologica contro la cirrosi epatica.
In questo caso, il metodo comprende la misurazione, preferibilmente mediante RT-PCR quantitativa, del livello di espressione di almeno un prodotto genico di un microRNA (miRNA) in un campione di sangue periferico oppure in un campione di fluido biologico, ed il confronto di detto livello di espressione misurato con un livello di riferimento. L'alterazione dei livelli di espressione del prodotto genico di un miRNA in un campione del soggetto in analisi, rispetto a un campione controllo è indicativa del fatto che il soggetto è affetto da cirrosi epatica o ha un aumentato rischio di sviluppare una cirrosa epatica, per esempio in pazienti affetti da epatite cronica.
Tale alterazione è anche indicativa dell'efficacia, evoluzione ed esito di una terapia contro la cirrosi epatica .
Tale alterazione dei livelli è anche indicativa dell'evoluzione della malattia e quindi della sua prognosi.
In questo forma di realizzazione il prodotto genico di un miRNA è come indicato in precedenza.
In un'altra forma di realizzazione, il metodo secondo la presente invenzione può anche essere utilizzato in combinazione con altri metodi diagnostici/prognosti attualmente in uso, integrando validamente tali tecniche di indagine.
Per esempio, il metodo può essere applicato in combinazione con: microarray, analisi proteomiche ed immunologiche , analisi di sequenziamento di specifiche sequenze di DNA, allo scopo di poter definire un approccio terapeutico ad hoc per il singolo paziente. Il completamento delle informazioni cliniche provenienti dalle tecniche di indagine note e quella oggetto della presente invenzione aiuterebbe ad affrontare la cura del paziente, affetto da epatocarcinoma o da cirrosi, in maniera completamente personalizzata e vantaggiosa sia per quanto riguarda la diagnosi, sia per la prognosi e la terapia.
In un'altra forma di realizzazione, il metodo dell'invenzione può essere utilizzato per identificare nuovi bersagli terapeutici.
Infatti, ciascun miRNA ha la capacità di regolare l'espressione di centinaia di geni e quindi può modulare l'attività di molte vie molecolari di trasduzione del segnale all'interno della cellula. Pertanto, i pannelli di miRNA identificati nel sangue periferico di un soggetto affetto da tumore, riflettono la biologia del tumore primario.
Tali miRNA sono utili come biomarcatori nell'identificazione della patologia, per definire la risposta alle terapie e per la sorveglianza di eventuali ricorrenze dell'epatocarcinoma . Tali miRNA sono anche utili per definire le vie molecolari alterate nell 'epatocarcinoma e contribuire, quindi, a identificare nuovi bersagli terapeutici.
La presente invenzione si riferisce anche ad una composizione farmaceutica, per trattare un epatocarcinoma o la cirrosi epatica, comprendente un carrier farmaceuticamente accettabile ed almeno un prodotto genico di miRNA isolato, e/o un acido nucleico ad esso complementare, che risulta essere up o down regolato nel sangue periferico di un soggetto affetto da un epatocarcinoma o da cirrosi epatica, rispetto ad un campione di controllo adatto. L'almeno un prodotto genico di miRNA isolato è scelto, singolarmente od in diverse combinazioni, tra le sequenze identificate precedentemente .
La presente invenzione si riferisce ulteriormente ad un metodo per identificare un agente anti-epatocarcinoma o anti-cirrosi epatica che comprende un passaggio in cui si somministra una sostanza test a cellule isolate (exvivo). Dopo la somministrazione, si misura il livello di almeno un prodotto genico di un miRNA e la cui aumentata espressione è associata all 'epatocarcinoma o alla cirrosi epatica.
Successivamente si confronta il livello di espressione di detto almeno un prodotto genico di un miRNA nelle cellule trattate rispetto a cellule di controllo. Un abbassamento di detto livello di espressione, è indicativo del fatto che la sostanza test è un antiepatocarcinoma o un anti-cirrosi epatica.
PARTE SPERIMENTALE ESEMPIO 1
Le indagini sono state effettuate su dieci soggetti affetti da epatocarcinoma.
Il tessuto analizzato è costituito da sangue periferico ed il controllo sperimentale è rappresentato dal sangue periferico di dieci soggetti privi dei sintomi e di tracce di tumore.
L'RNA totale è stato estratto utilizzando il kit mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Cat# AM1561- Ambion). Come normalizzatore quantitativo è stato aggiunto l'RNA sintetico ath-miR159a (3 fmoli per aliquota di siero), microRNA di Arabidopsis thaliana non espresso nell'uomo. Un'aliquota di campione (3 pL dei 50 pL totali di RNA estratto) è stata sottoposta alla reazione di retrotrascrizione condotta, utilizzando il kit TaqMan<®>MicroRNA Reverse Transcription, in presenza di una soluzione di MgCl25 mM (Part no. 4366597 - Applied Biosystems). Come primers per la retrotrascrizione sono stati utilizzati MegaplexTM RT Primers, un set di 2 pools predefiniti (Pool A e Pool B) di 380 RT primers ognuno, che permette la sintesi simultanea di cDNAs da mi RNA maturi (MegaplexTM RT Primers Human Pool A, Part No.: 4399966; Human Pool B, Part No.: 4399968 - Applied Biosystems). Volume finale di reazione (pL): 7.5.
Condizioni di incubazione per un ciclo di reazione:
16 °C 2 min
42 °C 1 min
50 °C 1 sec
85 °C 5 min
4 °C ∞
(per 40 cicli)
Il cDNA, così prodotto, è stato pre-amplificato (2.5 pL dei 7.5) utilizzando TaqMan PreAmp Master Mix (2x) (Part No. : 4384266 - Applied Biosystems) e MegaplexTM PreAmp Primers, un set di 2 pools di primers gene-specifici, forward e reverse (Megaplex™ PreAmp Primers, Human Pool A, Part no. 4399233; Human Pool B (Part no. 4399201 -Applied Biosystems). Volume finale di reazione (pL): 25.
Condizioni di incubazione:
95 °C 10 min
55 °C 2 min
72 °C 2 min
95 °C 15 sec
60 °C 4 min x 12 cicli
4 °C °°
Il cDNA pre-amplif icato è stato utilizzato per la reazione di real-time PCR. La reazione è stata condotta utilizzando TaqMan Universal PCR Master Mix, No Amperase UNG, 2X (Part No: 4326614 - Applied Biosystems) in 900 pL finali e caricata su 2 set di cards di microfluidica , TaqMan<®>Human MicroRNA Low Density Arrays (Part No.: 4400238 - Applied Biosystems) , a 384 pozzetti ognuna, contenenti sonde TaqMan. Tale analisi (Array A e Array B) consente la quantificazione dei livelli di espressione genica di 665 miRNA e dei relativi controlli (http://www3.appliedbiosysterns.com/cir)s/qroups/portal/docurrients/aene raldocuments/cms 052) 33.xls).
Il controllo interno ath-miR159a può essere usato per calcolare la relativa espressione genica. L'espressione relativa di ogni miRNA può essere calcolata utilizzando l'equazione 2<"Act>, dove ACt = CtmiRNA - Ctath-miR159a.
L'espressione relativa di ogni miRNA, calcolata attraverso la PCR, può essere analizzata utilizzando metodi statistici, come t test o ANOVA. I dati di ACt sono sottoposti ad analisi "Hierarchical clustering" e i relativi risultati visualizzati in un grafico "heatmap" (vedi Fig . 2).
L'analisi per "RT quantitative PCR" ha mostrato la presenza di 62 miRNA, elencati nella Tabella 1, che sono presenti in quantità maggiore o inferiore nei soggetti con epatocarcinoma rispetto ai controlli.
Tabella 1:
In particolare nella Tabella 2 sono riportati i miRNA presenti in quantità maggiore nei campioni dei soggetti affetti da epatocarcinoma rispetto ai controlli sani: Tabella 2:
In particolare nella Tabella 3 sono riportati i miRNA presenti in quantità minore nei soggetti affetti da epatocarcinoma rispetto ai controlli sani:
Tabella 3:
Nella Figura 1 sono riportati i valori di rapporto dell'espressione relativa dei miRNA tra campioni di soggetti affetti da epatocarcinoma (HCC) e campioni di soggetti controllo sani (HD). Valori tra 0 e 1 indicano miRNA iperespressi nei campioni sani, mentre valori maggiori di 1 si riferiscono a miRNA iperespressi nei campioni di epatocarcinoma.
Nella Figura 2 è riportata la rappresentazione grafica mediante gradiente di colore (heatmap) dei valori di ACt per i 62 miRNA differenzialmente espressi in maniera significativa secondo l'analisi t-test tra 10 campioni di pazienti sani e 10 campioni di pazienti affetti da epatocarcinoma HCC non accoppiati (p-value <0.05). Il gradiente di valore va dal bianco (massima espressione, basso valore di ACt) al nero (minima espressione, massimo valore di ACt). Colonne: i 20 campioni considerati, 10 campioni da donatori sani (codice "DctHD#" ) e 10 da donatori affetti da epatocarcinoma (codice "DctHCC#") dove "#" indica l'ID del campione.
Righe : i 62 miRNA significativi con relativi nomi standard. Relazioni di similitudine tra campioni e tra miRNA in base ai loro valori di espressione sono espressi graficamente dai dendrogrammi in Figura 2, calcolati in maniera automatica (unsupervised) con il metodo della distanza euclidea.
ESEMPIO 2
E' stata analizzata la presenza di miRNA nel sangue periferico di cinque soggetti con epatocarcinoma e come controllo si è usato il sangue periferico degli stessi soggetti prelevato prima dello sviluppo dell 'epatocarcinoma quando evidenziavano un profilo clinico cirrotico.
Un'analisi per "RT quantitative PCR", condotta ed analizzata come riportato nell'esempio 1, ha mostrato la presenza di 11 miRNA, descritti nella Tabella 4, che sono presenti in quantità maggiore o inferiore nei soggetti con epatocarcinoma rispetto ai controlli.
Tabella 4:
In particolare i miRNA riportati nella Tabella 5 sono presenti in quantità maggiore nei campioni dei soggetti affetti da epatocarcinoma rispetto ai campioni dei soggetti cirrotici (controllo) :
Tabella 5:
In particolare i miRNA riportati nella Tabella 6 sono presenti in quantità minore nei campioni dei soggetti affetti da epatocarcinoma rispetto ai campioni dei soggetti cirrotici (controlli):
Tabella 6:
Nella Figura 3 sono riportati i valori di rapporto dell'espressione relativa dei miRNA differenzialmente espressi nei soggetti cirrotici prima e dopo la comparsa dell'epatocarcinoma . Valori tra 0 e 1 indicano i miRNA iperespressi nei campioni sani, mentre valori maggiori di 1 si riferiscono a miRNA iperespressi nei campioni di soggetti affetti da epatocarcinoma.
Nella Figura 4 è riportata la rappresentazione grafica, mediante gradiente di colore (heatmap), dei valori di ACt per gli 11 miRNA differenzialmente espressi in maniera significativa nell'analisi t-test tra 5 campioni di sangue di soggetti affetti da cirrosi epatica e 5 campioni di sangue degli stessi soggetti cirrotici che hanno successivamente sviluppato epatocarcinoma.
Il gradiente di valore va dal bianco (massima espressione, basso valore di ACt) al nero (minima espressione, massimo valore di ACt) . Colonne: i 10 campioni considerati, 5 cirrotici (codice "Dctcirr#") e 5 epatocarcinomi (codice "DctHCC#") dove "#" indica l'ID del campione. Righe: gli 11 miRNA significativi con relativi nomi standard.
Relazioni di similitudine tra campioni e tra miRNA in base ai loro valori di espressione sono espressi graficamente dai dendrogrammi in Figura 4, calcolati in maniera automatica (unsupervised) con il metodo della distanza euclidea.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per diagnosticare o prognosticare un epatocarcinoma, anche a stadi precoci, oppure per valutare il rischio di sviluppare un epatocarcinoma o per monitorare l'efficacia di una terapia antitumorale contro 1'epatocarcinoma comprendente i seguenti step: a) misurare in un campione isolato di sangue periferico o fluido biologico il livello di espressione di almeno un prodotto genico di un miRNA; b) confrontare detto livello di espressione misurato con un livello di riferimento.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto almeno un prodotto genico di un miRNA è scelto nel gruppo costituito da SEQ ID NO 1-69 o loro combinazioni .
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto almeno un prodotto genico di un miRNA è scelto nel gruppo costituito da SEQ ID NO 6, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 23, 28, 30, 31, 33, 36, 37, 39, 40, 41, 65 e 67 .
  4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 3, in cui detto almeno un prodotto genico di un miRNA è scelto nel gruppo costituito da SEQ ID NO 1-19 e SEQ ID NO 63-66 e SEQ ID 69 o loro combinazioni, preferibilmente nel gruppo costituito da SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 e SEQ ID NO 65.
  5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 4, in cui detto almeno un prodotto genico di un miRNA è scelto nel gruppo costituito da SEQ.ID NO 20-62 e SEQ.ID NO 67-68 o loro combinazioni, preferibilmente nel gruppo costituito da SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 e SEQ ID NO 67.
  6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 5, in cui detto campione di sangue periferico è scelto tra sangue intero, cellule mononucleate periferiche del sangue, siero o plasma; detto campione di fluido biologico è scelto tra urina o saliva .
  7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 6, in cui detto metodo per monitorare l'efficacia di un trattamento terapeutico antitumorale, comprende la misurazione dell'alterazione dei livelli di espressione dell'almeno un prodotto genico di un miRNA in un campione del soggetto in analisi, rispetto ad un campione dello stesso soggetto in fasi diverse del trattamento terapeutico anti-tumorale.
  8. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 6, in cui detto metodo per monitorare l'efficacia di un trattamento terapeutico antitumorale, comprende la comparazione di campioni di sangue periferico di pazienti, affetti da epatocarcinoma e soggetti a trattamento terapeutico antitumorale, e campioni di pazienti affetti da epatocarcinoma, ma non soggetti a trattamento terapeutico antitumorale e la misurazione dell'alterazione dei livelli di espressione del prodotto genico di un miRNA tra i due gruppi di pazienti.
  9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 8, in cui detto metodo è un metodo per diagnosticare o valutare il rischio di sviluppare una cirrosi epatica, oppure per prognosticare l'evolversi di una cirrosi epatica in pazienti affetti da cirrosi, oppure per monitorare l'efficacia di una terapia farmacologica contro la cirrosi epatica.
  10. 10. Uso del metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 9 per identificare nuovi bersagli terapeutici.
  11. 11. Composizione farmaceutica comprendente un carrier farmaceuticamente accettabile ed almeno un prodotto genico di miRNA, isolato, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 2 alla 5 e/o un acido nucleico ad esso complementare.
  12. 12. Composizione secondo la rivendicazione 11 per l'uso nel trattamento di un epatocarcinoma o per il trattamento della cirrosi epatica.
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