JP2014064570A - 組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】肝臓の組織傷害あるいは肝臓の細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離miR-122aを検出することを特徴とする、肝臓の組織傷害あるいは肝臓の細胞増殖性疾患の検出を補助する方法。
【選択図】なし
Description
miRNAはRNA polymerase IIにより転写され、primary-miRNA(以下、「pri-miRNA」という)が生合成される。pri-miRNAは通常、数百から千ヌクレオチドほどの長い配列を有している。pri-miRNAは通常、5'末端にキャップ構造、3'末端にポリアデニンが付加した構造をとり、タンパク質をコードするメッセンジャーRNA(以下、「mRNA」という)と類似の構造を有している。
miRNAはmRNA切断、翻訳抑制、あるいはmRNA分解により遺伝子発現調節に機能することが知られており、mRNA切断と翻訳抑制は同じ機構で行われる。
mRNA 3'末端のポリアデニン(以下、「ポリ(A)」という)はmRNAの安定性を増強してRNA分解を回避していることが知られている。miRNAは脱ポリ(A)反応に直接作用することにより、mRNA分解に関与することが明らかにされている。
また、miR-15a遺伝子、miR-16a遺伝子発現による遺伝子治療用ベクターが特許出願されている(特許文献1)。
また、let-7発現量の測定による肺がんの予後判定方法、let-7遺伝子発現による遺伝子治療用ベクターが特許出願されている(特許文献2)。
新たな検査材料として考えられるのが、体液中に浮遊する遊離核酸(以下、「遊離核酸」という)である。体液中には、微量であるものの検出可能なレベルの遊離核酸の存在が知られており、遊離DNA、及び遊離mRNAが検出されている。遊離核酸は、体液の種類によって分類されており、全血、血清、血漿、及び、リンパ液など、循環する体液に存在する遊離核酸は循環核酸、尿、痰、射精物、精液、涙、汗、唾液、気管支洗浄液、胸水、腹膜液、髄膜液、羊水、腺液、細針吸引物、乳頭吸引液、髄液、膣液、十二指腸液、膵液、胆柔、及び、脳脊髄液などの体液に存在する遊離核酸は細胞外核酸、または無細胞核酸と呼ばれている。
(1) 組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離microRNAを検出することを特徴とする、組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出方法。
(2) 遊離microRNAの検出が、組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の特定のmicroRNA量が、健常人から採取された
血清あるいは血漿中の同じmicroRNA量より多いことを指標とすることを特徴とする(1)に記載の方法。
(3) 組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出が、組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離microRNAを複数回に渡って検出し、該検出結果から、該被験者の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の状態をモニタリングすることを特徴とする(1)又は(2)に記載の方法。
(5) 遊離microRNAが、miR-9、及びmiR-124aから選択される1種以上であることを特徴とする(4)に記載の方法。
(6) 組織傷害あるいは細胞増殖性疾患が、肝臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患であり、遊離microRNAが、肝臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患に伴って放出されるものである(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(8) 遊離microRNAの検出が、逆転写反応リアルタイムPCR法、ノザンブロット法、マイクロアレイ法あるいはビーズアレイ法のいずれかの方法で行われることを特徴とする(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9) 遊離microRNA抽出手段、及び特定のmicroRNAの検出手段を少なくとも含む、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法を行うための検出キット。
本発明は、組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離microRNAを検出することを特徴とする、組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出方法である。
〔材料及び方法〕
採血および血漿分離
本研究への参加について同意を得られた健常人ボランティア1名より、ベノジェクトII真空採血管EDTA-2Na 採血量7mL(テルモ)を用いて採血を行った。採血管を遠心分離(2,400×g, 20℃ 10分間)して血漿を分画し、別の15mL遠心チューブに移注した。血漿を移注した15mL遠心チューブを遠心分離(20,000×g, 20℃ 10分間)し、沈殿物を吸引しないように血漿分画を回収した。回収した血漿を500μLずつ分注した後,Small RNA抽出まで-80℃で凍結保存した。
血漿500μLを初発材料に、mirVana PARIS Kit(Ambion)を用い、添付の操作手順書に記載されているEnrichment Procedure for Small RNAsに従い、Small RNAを抽出した。抽出後、滅菌蒸留水を加え、液量が125μLになるよう調整した。Small RNA抽出液はmicroRNA量の測定まで-80℃で凍結保存した。
Small RNA抽出液5μLを材料に、TaqMan MicroRNA Assays(Applied Biosystems)を用い、添付の操作手順書に従い157種類のmicroRNA量を、逆転写反応リアルタイムPCR法により測定した。測定にはSequence Detection System 7700(Applied Biosystems)を使用した。リアルタイムPCR法における立ち上がりサイクル数(Ct)値から240-Ct値を算出し、見かけのコピー数として定量値を示した。Ct値が36以上の場合は240-Ct値を算出するものの、定量限界以下として取扱いした。
健常人ボランティア1名の血漿2μL中に存在するmicroRNA 157種類の測定結果を図1に示した。グラフは、縦軸を見かけのコピー数(目盛は対数表示)、横軸をmicroRNAの種類とし、コピー数の高い順に表示した。
血漿2μLに存在するコピー数として100コピー以上のmicroRNAは調べた157種類のうち98種類であった。1万コピー以上のmicroRNAは31種類あり、10万を超えるものがそのうち3種類存在した。
〔材料及び方法〕
ヒト組織total RNA
Ambionより市販されているヒト組織由来のtotal RNA(食道、甲状腺、子宮、乳房、肝臓、肺、精巣、卵巣、腎臓、小腸、結腸、前立腺、膀胱、副腎、胃)を用いた。脳由来total RNA については、Ambion, BioChain, 及びStratageneより市販されているドナーの異なる脳由来total RNA 3種類を使用した。すい臓由来total RNAについては、Ambion, 及びStratageneより市販されているドナーの異なるtotal RNA 2種類を使用した。血球細胞由来のtotal RNAについては、健常人ボランティアよりPAXgene Blood Tube(Becton-Dickinson)を用いて採血した後、PAXgene Blood RNA Kit(QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。最終的にtotal RNA濃度を2ng/μLに調整した。
ヒト組織由来のtotal RNA抽出液5μL(10ng相当量)を材料に、TaqMan MicroRNA Assaysを用い、添付の操作手順書に従って157種類のmicroRNA量を、逆転写反応リアルタイムPCR法により測定した。測定にはSequence Detection System 7700を使用した。Ct値から240-Ct値を算出し、見かけのコピー数として定量値を表示した。Ct値が36以上の場合、240-Ct値を算出するものの、定量限界以下として取扱いした。
検討に用いたヒト各組織における157種類のmicroRNA測定値(Ct値)を用い、解析ソフトウェア(TIGR)を使用し、ユークリッド距離と平均リンケージを用いた解析により、階層的クラスタ解析を行った。
ヒト組織におけるmicroRNA発現量
ヒト各組織由来total RNA 10ngあたりのmicroRNA 157種類の測定結果を図2に示した。グラフは、縦軸を見かけのコピー数(目盛は対数表示)として各組織の値をプロットした。横軸をmicroRNAの種類とし、各組織における発現コピー数の中央値が高い順に表示した。
ヒト各組織におけるmicroRNA発現量に基づいたクラスタ解析の結果を図3に示した。発現量の高低をグレーの濃淡で表し,組織と組織の間で統計学的に近いものをデンドログラムで表示した。
クラスタ解析では、ドナーの異なる脳3種類、すい臓2種類がそれぞれ最も近いクラスに分類された。さらに、発生学的に類似している小腸と結腸が最も近いクラスに分類された。クラスタ解析で最も遠いクラスと分類された脳と血球は、発現パターンの違いが顕著であった。これらの知見から、microRNAの発現パターンは発生学における類似性、各組織の特異性を反映していることが判明した。
〔方法〕
ヒト各組織におけるmicroRNA発現量(実施例2での取得データ)を比較し、「発現量が1番高い組織での発現量が5万コピー以上、2番目の組織との発現比が10倍以上」であるmicroRNAを組織特異的microRNAと定義し、該当するmicroRNAを探索した。
その結果、miR-9, miR-124aは脳特異的であること、miR-122aは肝臓特異的であることが判明した。これらの組織別発現パターンを図4〜図6に示した。脳特異的microRNAとして見出したmiR-9は、発現量(見かけコピー数)が、脳1(71,220)、脳2(158,048)、脳3(124,864)であり、2番目に発現量の高い子宮(1,017)との発現比が70倍あった。同様に脳特異的であるmiR-124aは、脳1(115,698)、脳2(100,721)、脳3(84,111)であり、2番目に発現量の高い腎臓(175)との発現比が661倍あった。肝臓特異的microRNAとして見出したmiR-122aは、発現量が(102,837)であり、2番目に発現量の高い甲状腺(33)との発現比が3,116倍あった。
〔方法〕
血漿中に存在する遊離microRNA量(実施例1での取得データ)を用い、miR-9, miR-124a, miR-122a量を調べた。
〔結果〕
健常人ボランティア1名の血漿2μLにおける、miR-9, miR-124a, miR-122a量を図7に示した。見かけのコピー数として、健常人血漿2μL中のmiR-9量は63コピー、miR-124a量は定量限界以下(1コピー)、miR-122a量は385コピーであった。健常人血漿における前記3種類のmicroRNA量は低レベルであった。
〔材料及び方法〕
脳腫瘍患者血清
市販の脳腫瘍患者血清(ProMedDx)10例を使用した。
実施例1と同じ方法で調製した。
血清500μLを初発材料に、mirVana PARIS Kitを用い、添付の操作手順書に記載されているEnrichment Procedure for Small RNAsに従い、Small RNAを抽出した。抽出後、滅菌蒸留水を加え、液量が125μLになるよう調整した。Small RNA抽出液はmicroRNA量の測定まで-80℃で凍結保存した。
Small RNA抽出液5μLを材料に、TaqMan MicroRNA Assays(Applied Biosystems)を用い、添付の操作手順書に従いmiR-9量を、逆転写反応リアルタイムPCR法により測定した。測定にはSequence Detection System 7700を使用した。Ct値から240-Ct値を算出し、見かけのコピー数として定量値を表示した。Ct値が36以上の場合、240-Ct値を算出するものの、定量限界以下として取扱いした。
市販の脳腫瘍患者血清、及び健常人ボランティア1名の血清2μLあたりのmiR-9の測定結果を図8に示した。健常人血清中のmiR-9量は、見かけのコピー数として19コピーであるのに対し、脳腫瘍患者血清中のmiR-9量は、B01(10コピー), B02(定量限界以下;4コピー), B03(定量限界以下;3コピー), B04(206コピー), B05(定量限界以下;8コピー), B06(定量限界以下;4コピー), B07(定量限界以下;8コピー), B08(定量限界以下;6コピー), B09(定量限界以下;15コピー), B10(定量限界以下;6コピー)であり、10例中B04の1例においてmiR-9量が顕著に増加していた。
〔材料及び方法〕
肝臓がん患者血清
市販の肝臓がん患者血清(ProMedDx)5例を使用した。
実施例1と同じ方法で調製した。
血清500μLを初発材料に、mirVana PARIS Kitを用い、添付の操作手順書に記載されているEnrichment Procedure for Small RNAsに従い、Small RNAを抽出した。抽出後、滅菌蒸留水を加え、液量が125μLになるよう調整した。Small RNA抽出液はmicroRNA量の測定まで-80℃で凍結保存した。
Small RNA抽出液5μLを材料に、TaqMan MicroRNA Assays(Applied Biosystems)を用い、添付の操作手順書に従いmiR-122a量を、逆転写反応-リアルタイムPCR法により測定した。測定にはSequence Detection System 7700を使用した。Ct値から240-Ct値を算出し、見かけのコピー数として定量値を表示した。Ct値が36以上の場合、240-Ct値を算出するものの、定量限界以下として取扱いした。
市販の肝臓がん患者血清、及び健常人ボランティア1名の血清2μLあたりのmiR-122aの測定結果を図9に示した。健常人血清中のmiR-122a量は、見かけのコピー数として185コピーであるのに対し、肝臓がん患者血清中のmiR-122a量は、L01(3,558コピー)、 L02(175コピー)、 L03(3,835コピー)、 L04(521コピー)、 L05(56コピー)であり、5例中L01、 L03の2例おいてmiR-122a量が顕著に増加していた。
〔材料及び方法〕
症例
B型、C型慢性肝炎に、肝細胞がんを合併
B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルスともに陽性
動脈塞栓術を施行する直前、及び施行後に、経時、経日的に採血し、凝固反応後、直ちに血清分離した。回収した血清をSmall RNA抽出まで-80℃で凍結保存した。
血清500μLを初発材料に、mirVana PARIS Kitを用い、添付の操作手順書Enrichment Procedure for Small RNAsに従い、Small RNAを抽出した。抽出後、滅菌蒸留水を加え、液量が125μLになるよう調整した。Small RNA抽出液はmicroRNA量の測定まで-80℃で凍結保存した。
Small RNA抽出液5μLを材料に、TaqMan MicroRNA Assays(Applied Biosystems)を用い、添付の操作手順書に従いmiR-122a量を、逆転写反応-リアルタイムPCR法により測定した。測定にはSequence Detection System 7700を使用した。Ct値から240-Ct値を算出し、見かけのコピー数として定量値を表示した。Ct値が36以上の場合、240-Ct値を算出するものの、定量限界以下として取扱いした。
ALTはUV法(JSCC準拠法)により測定し、単位はIU/I/37℃で示した。CRPはラテックス凝集比濁法により測定し、単位はmg/dLで示した。
健常人ボランティア1名の血清、及び肝臓がん患者への動脈塞栓術施行例(第1例)における血清2μLあたりのmiR-122aの測定結果を図10に示した。健常人ボランティアの血清におけるmiR-122a量は、見かけのコピー数として233コピーであるのに対し、肝臓がん患者血清中のmiR-122a量は、直前(3,841コピー)、直後(3,662コピー)、3時間後(5,692コピー)、7時間後(3,278コピー)、10時間後(9,953コピー)、1日後(28,143コピー)、2日後(3,515コピー)、4日後(1,450コピー)、5日後(2,908コピー)、6日後(1,573コピー)、7日後(2,660コピー)であった。
〔材料及び方法〕
症例
B型、C型慢性肝炎に、肝細胞がんを合併
B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルスともに陽性
実施例7と同じ方法で行った。
実施例7と同じ方法で行った。
microRNA量の測定
実施例7と同じ方法で行った。
ALT、及びCRP量の測定
実施例7と同じ方法で行った。
健常人ボランティア1名の血清、及び肝臓がん患者への動脈塞栓術施行例(第2例)における血清2μLあたりのmiR-122aの測定結果を図13に示した。健常人ボランティアの血清におけるmiR-122a量は、見かけのコピー数として313コピーであるのに対し、肝臓がん患者血清中のmiR-122a量は、施行前日(160コピー)、2時間後(1,060コピー)、8時間後(1,010コピー)、17時間後(43,238コピー)、2日後(2,402コピー)、3日後(744コピー)、5日後(63コピー) 、8日後(82コピー)であった。
動脈塞栓術の施行は、細胞の壊死が起きるため、その細胞に含まれる様々なmicroRNAが放出され、血清中で検出される可能性が考えられる。また、動脈塞栓術により様々な臓器が二次的に刺激を受け、一部で炎症が起こる可能性がある。そこで、上記実施例8の表4に記載のID01、ID04を用いて、血清2μLあたりのmicroRNA 16種類の量を測定した。なお、microRNA 16種類の各々が5万コピー以上発現している組織の種類について、表5に示した。特に、肝臓組織における発現に関しては、発現量が5万コピー以上であるものを+、5万コピー以下であるものを−で示す。
肝臓がん患者への動脈塞栓術施行例(第2例)の施行前日および施行17時間後における、患者血清中のmicroRNA 16種類の測定結果を図16に示した。miR-122aのように施行17時間後の採取血清でmicroRNAが顕著に増加したものは、miR-99a、miR-135a、miR-204、miR-214、およびmiR-296の5種類であり、残11種類は増加しなかった。これは血清中のmicroRNA量が動脈塞栓術によりどれでも増加するのではないことを示している。このことから、microRNAが細胞の壊死によって放出される機構、あるいは放出された後の存在機構は、microRNAの種類毎に異なることが考えられる。
実施例7、8、9の結果から、肝臓特異的な発現を示すmiR-122aによって、肝臓における組織傷害を好適に検出できることが示された。
Claims (5)
- 肝臓の組織傷害あるいは肝臓の細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離miR-122aを検出することを特徴とする、肝臓の組織傷害あるいは肝臓の細胞増殖性疾患の検出を補助する方法。
- 遊離miR-122aの検出が、肝臓の組織傷害あるいは肝臓の細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中のmiR-122a量が、健常人から採取された血清あるいは血漿中のmiR-122a量より多いことを指標とすることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 肝臓の組織傷害あるいは肝臓の細胞増殖性疾患の検出が、肝臓の組織傷害あるいは肝臓の細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離miR-122aを複数回に渡って検出し、該検出結果から、該被験者の肝臓の組織傷害あるいは肝臓の細胞増殖性疾患の状態をモニタリングすることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 遊離miR-122aの検出が、逆転写反応リアルタイムPCR法、ノザンブロット法、マイクロアレイ法、あるいはビーズアレイ法のいずれかの方法で行われることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 遊離microRNA抽出手段、及びmiR-122aの検出手段を少なくとも含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法を行うための検出キット。
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