CN102471803B

CN102471803B - 产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法

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Publication number: CN102471803B
Application number: CN201080031747.3A
Authority: CN
Inventors: 落谷孝广; 小坂展庆; 关根一则; 和泉裕久
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2030-07-14
Also published as: CA2759493A1; KR20130119521A; RU2545377C2; US20120093874A1; BRPI1013423A2; MY152301A; US20140086959A1; EP2455486A4; AU2010271781B2; JP2011140513A; EP2455486A1; NZ595800A; WO2011007815A1; KR20120032003A; CN102471803A; JP4774128B2; RU2013143797A; AU2010271781A1; RU2012105021A; JPWO2011007815A1

Abstract

公开了一种能够产生具有免疫调节作用的乳的食品的筛选方法、一种具有免疫调节作用的新型食品及其生产方法。能够产生具有免疫调节作用的母乳的食物或物质是通过以下来筛选的：通过使用乳的微小RNA谱与由哺乳动物摄取的所述食物或包含于所述食物中的物质之间的相关性作为指标，鉴定能够使包含于所述哺乳动物乳中的微小RNA的量增加或减少的食物或物质。

Description

产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法

技术领域

本发明涉及产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法，其适用于食品和动物饲料等领域。

背景技术

生物体免疫基本上是为了对抗外来攻击的“防御”目的而起作用。例如，相当于所述“防御”的癌细胞的防御和消除，和在此情况中有效作用的免疫的增强。

另一方面，免疫的反应过度，即“超免疫”，可不利地影响生物体。其实例包括过敏反应、自身免疫病和慢性炎症等。已知，在这种情况下，通过抑制炎性细胞因子(inflammatorycytokines)如IL-6、TNF-α和IL-1的产生来改善症状。

另外，逐渐变的明确的是，为了对抗外来攻击的“防御”目的而起作用的免疫增强作用和为了抑制由超免疫反应诱导的过敏反应、自身免疫病、慢性炎症等而起作用的免疫抑制作用受到微小RNA(microRNA)(下文还简称为“miRNA”)的调节。

在miRNA从基因组转录后，其进行两次切割变为约22个碱基的非编码小RNA。已知，作为其功能，miRNA以序列互补的方式结合至靶mRNA的3′非翻译区来抑制靶mRNA的翻译。一种miRNA抑制细胞中多种mRNA的翻译从而调节细胞的各种功能。特别是对其与癌症发生和进展的关系已进行许多报道，并且miRNA和疾病间的关系引起了关注。

例如，就miR-181而言，已报道其涉及B细胞的发育、T细胞的活化以及免疫的发育(非专利文献1至3)。

就miR-155而言，已知其通过活化先天免疫(非专利文献1和4)和调节T细胞和B细胞的分化和功能(非专利文献1和5)涉及免疫发育，通过，其通过调节Th1/Th2平衡(非专利文献1和6)以及维持调节T细胞(其抑制超免疫反应)的功能(非专利文献7)涉及抗过敏和抗炎作用。

miR-17和miR-92协同调节B细胞和T细胞的分化和发育，从而参与免疫发育(非专利文献1、8和9)。

已知miR-223通过控制嗜中性粒细胞的增殖和活化参与防御(非专利文献1和10)，miR-150通过抑制B细胞的分化参与防御(非专利文献1和11)，以及let-7i通过控制胆管细胞中TLR4的表达参与防御(非专利文献12)。

已知miR-125通过抑制TNF-α的产生参与抗炎作用(非专利文献1和13)。

已知miR-146通过负调控先天免疫参与防御(非专利文献1和14)，并且通过控制Th1/Th2平衡参与抗过敏(非专利文献15)。

最近已报道在细胞内作为翻译调节分子而起作用的miRNA存在于称为外泌体(exosome)的脂双层内，并分泌出细胞(非专利文献16)。由于还证实分泌的miRNA被其他细胞所吸收，提示存在依靠miRNA的细胞间相互作用。另外，已知外泌体存在于各种人体体液中。特别地，已报道在人血浆和血清中存在miRNA，已提出其作为前列腺癌或子宫癌的生物标记的可能用途(非专利文献17)。

除血浆和血清外，包含外泌体的体液包括唾液、尿、羊水和母乳(非专利文献17)。在这些中，母乳是由哺乳动物在特定时期产生的体液，并负责个体间即母婴间物质的转移。此外，母乳不仅是孩子的营养补给，而且还将母体获得的免疫物质给予孩子。

母乳包含分泌型IgA、乳铁蛋白、溶菌酶和细胞因子等，母乳被认为保护婴儿免受感染，并促进婴儿的免疫发育(非专利文献19)。实际上，已知依靠母乳成长的孩子，与不以此方式成长的孩子，涉及较低的支气管或肠道感染的风险。母乳包含显示抗菌活性的IgA、乳铁蛋白、糖蛋白、糖脂等，以及调节免疫细胞的细胞因子。然而，迄今研究中分析的对象主要为包含于母乳中的蛋白质，尽管有关于包含于母乳中的核酸的报道，但对包含于母乳并具有特定序列的核酸的研究还未报道。

此外，还已知受环氧酶2表达控制的乳腺细胞(mammaryglandularcell)的发育是由miR-101a调节的(非专利文献20)。然而，这并不表明miRNA存在于乳中。

另外，在本申请的优先权日后，有报道称微小RNA存在于来源于牛乳的微泡(microvesicle)中(非专利文献21)，并且在不同哺乳期的新鲜牛乳、商购液体乳和奶粉中鉴定出微小RNA(非专利文献22)。

现有技术文献

[非专利文献]

非专利文献1：Lindsay，M.A.，TrendsImmunol，29：343-351，2008

非专利文献2：Li，Qi-Jing等人，Cell，129：147-161，2007

非专利文献3：Chen，Chang-Zheng等人，Science，303：83-86，2004

非专利文献4：O′Connel，R.M.等人，PNAS，104(5)：1604-1609，2007

非专利文献5：Vigorito，E.等人，Immunity，27：847-859，2007

非专利文献6：Rodriguez，A.等人，Science，316：608-611，2007

非专利文献7：Kohlhaas，S.等人，J.Immunol.，182：2578-2582，2009

非专利文献8：Koralov，S.B.等人，Cell，132：860-874，2008

非专利文献9：Xiao，C.等人，Nat.Immunol.，9：405-414，2008

非专利文献10：Jonathan，B.等人，Nature，451：1125-1129，2008

非专利文献11：Zhou，B.等人，PNAS，104(17)：7080-7085，2007

非专利文献12：Chen，Xian-Ming等人，J.Biol.Chem.，282(39)：28929-28938，2007

非专利文献13：Tili，E.等人，J.Immunol.，179：5082-5089，2007

非专利文献14：Taganov，K.D.等人，PNAS，103(33)：12481-12486，2006

非专利文献15：Monticelli，S.等人，GenomeBiol.，6，R71，2005

非专利文献16：Valadi，H.等人，Nat.CellBiol.，9：654-659，2007

非专利文献17：Gilad，S.等人，PLoSOne，3(9)：e3148，2008

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非专利文献21：Hata，T.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，396(2)：528-533，2010

非专利文献22：Chen，X.等人，CellResearch，(2010)：1-10

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的为提供产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法、一种具有免疫调节作用的新型食品及其生产方法。

用于解决问题的方案

本发明的发明人根据注意到母乳影响婴儿免疫系统成熟的事实进行了研究。结果，他们发现与免疫相关的miRNA在母乳中高度表达，并且完成了本发明。

因此本发明提供食物或物质的筛选方法，所述食物或物质产生具有免疫调节作用的母乳，所述方法包括通过利用乳中微小RNA谱(profile)与由哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中的物质的相关性作为指标来鉴定使存在于所述哺乳动物乳中的微小RNA的量增加或减少的所述食物或物质。

在前述方法的实施方案中，所述免疫调节作用为免疫增强作用，并且当微小RNA的量增加时，判定为所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。

在前述方法的优选实施方案中，比较食物摄取前后所观察到的乳中的微小RNA谱，并且当摄取后所观察到的至少一种微小RNA的量高于摄取前所观察到的量时，判定所述食物使所述乳中的所述微小RNA的量增加。

在前述方法的另一优选实施方案中，比较所述乳中的微小RNA谱和血清或血浆中的微小RNA谱，当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小RNA的存在量在摄取所述食物后使包含于所述乳中的微小RNA的存在量是所述血清或血浆中的微小RNA的存在量的1.2倍以上时，判定所述食物使所述乳中的所述微小RNA的量增加。

在前述方法的另一实施方案中，所述免疫调节作用为免疫抑制作用，并且当所述微小RNA的量减少时，判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。

在前述方法的优选实施方案中，比较所述食物摄取前后所观察到的所述乳中的微小RNA谱，并且当摄取后所观察到的至少一种微小RNA的量低于摄取前所观察到的量时，判定所述食物使所述乳中的所述微小RNA的量减少。

在前述方法的优选实施方案中，比较所述乳中的微小RNA谱和血清或血浆中的微小RNA谱，当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小RNA的存在量在摄取所述食物后使所述乳中的微小RNA的存在量为在血清或血浆中的微小RNA的存在量的0.8倍以下时，判定所述食物使所述乳中的所述微小RNA的量减少。

在前述方法的优选实施方案中，所述哺乳动物为人类。

在前述方法的优选实施方案中，所述微小RNA谱由微小RNA的量组成，所述微小RNA选自由以下组成的组：miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7i。

在前述方法的优选实施方案中，所述微小RNA谱由微小RNA的量组成，所述微小RNA选自由以下组成的组：miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d和let-7i。

在前述方法的优选实施方案中，所述微小RNA谱由微小RNA的量组成，所述微小RNA选自由以下组成的组：miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d和let-7i。

本发明还提供一种生产具有免疫调节作用的乳或乳制品的方法，其包括给予哺乳动物(除人以外)食物或物质的步骤，所述食物或物质通过前述筛选方法被鉴定为使所述哺乳动物的乳中微小RNA的量增加或减少，以及收集所述哺乳动物的乳的步骤。

在前述方法的实施方案中，所述免疫调节作用为免疫增强作用，并且将所述食物或物质鉴定为使所述微小RNA的量增加。

在前述方法的实施方案中，所述免疫调节作用为免疫抑制作用，并且将所述食物或物质鉴定为使所述微小RNA的量减少。

本发明还提供一种具有免疫增强作用的口服摄取用组合物，其包括口服摄取用组合物的基质和添加至所述基质的微小RNA。

在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中，所述微小RNA选自由miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7i组成的组。

在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中，所述微小RNA选自由miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d和let-7i组成的组。

在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中，所述微小RNA选自由miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d和let-7i组成的组。

在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中，所述组合物为婴儿用食品或幼儿用食品。

在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中，所述婴儿用食品或幼儿用食品为婴儿配方(formula)或较大婴儿配方(follow-upformula)。

附图说明

图1示出通过微阵列分析(microarrayanalysis)获得的人母乳中miRNA的检测结果。

图2示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中miR-181a水平的比较。hsa表示人类，cel表示线虫(秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans)(下图应同样应用)。

图3示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中miR-155、miR-17和miR-92水平的比较。

图4示出人母乳和血清中免疫相关miRNA水平的比较

图5示出冻融前后所观察到的miRNA水平的比较。

图6示出低pH(pH1)下保存前后所观察到的miRNA水平的比较。

图7示出RNase处理后和无RNase处理所观察到的miRNA水平的比较。

具体实施方式

本发明的方法为食物或物质的筛选方法，所述食物或物质产生具有免疫调节作用的母乳，所述筛选方法包括基于乳中的微小RNA谱与哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中的物质的相关性来鉴定使存在于哺乳动物乳中的微小RNA的量增加或减少的所述食物或物质。

在本发明的前述方法的实施方案中，所述免疫调节作用为免疫增强作用，并且当微小RNA的量增加时，判定所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。在本发明的前述方法的另一实施方案中，所述免疫调节作用为免疫抑制作用，并且当所述微小RNA的量减少时，判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。

本发明基于以下观点：期望通过miRNA的口服给药来获得免疫调节作用，这是由于新发现miRNA包含于乳中，和即使在胃中的酸性条件下miRNA也可稳定地存在以及母乳促进摄取母乳的婴儿中免疫发育的事实(例如，BreastfeedMed.，2(4)：195-204，2007)。并且，基于乳中miRNA谱受饮食影响的预测，构想鉴定可使存在于乳中的miRNA的量增加或减少的食物或包含于食物的活性成分。

为本发明的筛选方法、乳和乳制品等所定义的免疫调节作用包括，例如，两种作用：为对抗外来攻击的“防御”目的而起作用的增加免疫增强作用的作用(免疫增强作用)和为对抗免疫过度反应即过敏反应、自身免疫病、慢性炎症等(其中“超免疫反应”不利地影响生物体)而起抑制作用的免疫抑制作用。

术语“免疫增强作用”和“免疫抑制作用”以相对含义使用。当对于某一哺乳动物母乳通常观察到的免疫增强作用在摄取食物或物质后增强时，所述母乳具有免疫增强作用，而当免疫增强作用降低时，所述母乳具有免疫抑制作用。当食物或物质被哺乳动物摄取后所观察到的免疫增强作用与摄取前所观察的作用相比增强时，所述哺乳动物的母乳具有免疫增强作用，而当免疫增强作用与摄取前所观察到的作用相比降低时，所述母乳具有免疫抑制作用。

可以例如以如下所述来研究哺乳动物乳中的miRNA谱和被所述哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中的物质的相关性。

收集来自摄取食物的哺乳动物的乳，检测乳中的miRNA谱。

所述哺乳动物不特别限定，实例包括人、牛、山羊、绵羊、猪、猿、狗、猫、大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠等。所述哺乳动物优选人或牛。

本发明中，所述miRNA谱由miRNA的种类和量组成。所述miRNA可由一种miRNA组成或由两种以上miRNA组成。miRNA的种类不特别限定，只要选择存在于乳中的那些即可，并且实例包括miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7i等。

这些miRNA为证实存在于或者人母乳、大鼠初乳或者牛初乳之一中的那些。如上所述，已知母乳促进摄取母乳的婴儿中的免疫发育(例如，BreastfeedMed.，2(4)：195-205，2007)。此外，已报道被认为对婴儿(包括动物幼仔)的免疫系统重要的许多组分通常包含于初乳中(J.Anim.Sci.，2009，87：(Suppl.1)：3-9)。因此，提示已证实存在于乳中的前述miRNA参与免疫作用。

在以上提及的那些中，优选的是miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d和let-7i。这些是已报道其免疫调节作用的miRNA、已证实存在于大鼠和牛二者的初乳中的miRNA或在服用双歧杆菌属(Bifidobacterium)细菌的大鼠的初乳中量增加的miRNA。

此外，在以上提及的miRNA中，特别优选的是miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d和let-7i。这些是已证实存在于大鼠和牛二者的初乳中的miRNA。

某些miRNA具有亚型，例如对于miR-181、miR-92、miR-125和miR-146等各自已知2至4种亚型，如分别为miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-92a、miR-92b、miR-125a、miR-125a-3P、miR-125a-5P、miR-125b、miR-146a、miR-146b、miR-146b-3P和miR-146b-5P。某些其他miRNA也具有亚型，并且在本发明中，miRNA可为这样的任何亚型。所述亚型的实例包括下文描述的实施例中(指实施例1、3、4和5)证实存在于乳中的那些。

人miR-155前体has-mir-155(MI0000681)，及其活性位点has-miR-155(MIMAT0009241)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：1和2。示于括号内的为miRNA数据库的登录号(miRBase::Sequences，http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)(以下描述应同样适用)。

牛miR-155前体bta-miR-155(MI0009752)，及其活性位点bta-miR-155(MIMAT0000646)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：3和4。

人miR-181前体hsa-mir-181a-1(MI0000289)和hsa-mir-181a-2(MI0000269)，及其活性位点hsa-miR-181a(MIMAT0000256)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：5、6和7。

人miR-181b前体hsa-mir-181b-1(MI0000270)和hsa-mir-181b-2(MI0000683)，及其活性位点hsa-miR-181b(MIMAT0000257)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：8、9和10。

牛miR-181a前体bta-mir-181a(MI0004757)和bta-mir-181a-1(MI0010484)，及其活性位点bta-miR-181a(MIMAT0003543)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：11、12和13。

牛miR-181b前体bta-mir-181b-1(MI0010485)和bta-mir-181b-2(MI0005013)，及其活性位点bta-miR-181b(MIMAT0003793)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：14、15和16。

人miR-223前体hsa-mir-223(MI0000300)，及其活性位点hsa-miR-223(MIMAT0000280)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：17和18。

牛miR-223前体bta-mir-223(MI0009782)，及其活性位点bta-miR-223(MIMAT0009270)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：19和20。

人miR-17前体的核苷酸序列hsa-mir-17(MI0000071)，及其活性位点hsa-miR-17(MIMAT0000070)(又称hsa-miR-17-5p)，分别示于SEQIDNOS：21和22。

牛miR-17前体bta-mir-17(MI0005031)及其活性位点bta-miR-17-5p(MIMAT0003815)和bta-miR-17-3p(MIMAT0003816)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：23、24和25。

人miR-92a前体hsa-mir-92a-1(MI0000093)和hsa-mir-92a-2(MI0000094)及其活性位点hsa-miR-92a(MIMAT0000092)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：26、27和28。

人miR-92b前体hsa-mir-92b(MI0003560)及其活性位点hsa-miR-92b(MIMAT0003218)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：29和30。

牛miR-92前体bta-mir-92(MI0005024)及其活性位点bta-miR-92(MIMAT0003808)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：31和32。

牛miR-92a前体bta-mir-92a(MI0009905)及其活性位点bta-miR-92a(MIMAT0009383)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：33和34。

牛miR-92b前体bta-mir-92b(MI0009906)及其活性位点bta-miR-92b(MIMAT0009384)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：35和36。

人let-7i前体hsa-let-7i(MI0000434)及其活性位点hsa-let-7i(MIMAT0000415)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：37和38。

牛let-7i前体bta-let-7i(MI0005065)及其活性位点bta-let-7i(MIMAT0003851)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：39和40。

人miR-125a前体hsa-mir-125a(MI0000469)及其活性位点hsa-miR-125a-5p(MIMAT0000443)和hsa-miR-125a-3p(MIMAT0004602)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：41、42和43。

人miR-125b前体hsa-mir-125b-1(MI0000446)和hsa-mir-125b-2(MI0000470)及其活性位点hsa-miR-125b(MIMAT0000423)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：44、45和46。

牛miR-125a前体bta-mir-125a(MI0004752)及其活性位点bta-miR-125a(MIMAT0003538)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：47和48。

牛miR-125b前体bta-mir-125b-1(MI0004753)和bta-mir-125b-2(MI0005457)及其活性位点bta-miR-125b(MIMAT0003539)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：49、50和51。

人miR-146a前体hsa-mir-146a(MI0000477)及其活性位点hsa-miR-146a(MIMAT0000449)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：52和53。

人miR-146b前体的核苷酸序列hsa-mir-146b(MI0003129)及其活性位点hsa-miR-146b-5p(MIMAT0002809)(也称为hsa-miR-146b)和hsa-miR-146b-3p(MIMAT0004766)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：54、55和56。

牛miR-146a前体bta-mir-146a(MI0009746)及其活性位点bta-miR-146a(MIMAT0009236)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：57和58。

牛miR-146b前体bta-mir-146b(MI0009745)及其活性位点bta-miR-146b(MIMAT0009235)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：59和60。

人miR-150前体hsa-mir-150(MI0000479)及其活性位点hsa-miR-150(MIMAT0000451)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：61和62。

牛miR-150前体bta-mir-150(MI0005058)及其活性位点bta-miR-150(MIMAT0003845)的核苷酸序列分别示于SEQIDNOS：63和64。

除前述miRNA外，将已证实存在于大鼠或牛的乳中的miRNA和与这些miRNA相应的其他动物的miRNA示于表1至10。

表1

表2

表3

表4

表5

表6

表7

表8

表9

表10

miRNA不限制为具有前述序列的那些，所述miRNA可包括一个或几个核苷酸的替换、缺失、插入、增添或倒位，只要miRNA具有作为miRNA的功能，即，miRNA可调节靶基因的表达即可。特别地，此类miRNA的实例包括具有与前述任一序列显示80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同源性的核苷酸序列的RNA。

miRNA的量可为绝对量或相对量。相对量可为基于动物中的平均量的相对量，或可为基于食物摄取前所观察到的量，在食物摄取后所观察到的相对量。对于核酸量的测定，可采用通常用于miRNA量测定的方法如定量逆转录PCR(qRT-PCR)。miRNA的量还可通过微阵列法测定。关于乳中miRNA的提取，可采用通常用于miRNA提取的方法，还可使用商购可得的miRNA分离试剂盒。

另外，存在于乳中的miRNA的量还可通过测定乳腺细胞中miRNA的表达量来间接测定。

检测哺乳动物乳中的miRNA谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中的物质的相关性。哺乳动物乳中的miRNA谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中的物质的相关性是指miRNA谱与所述物质的存在或缺失或者所述物质的量的相关性。例如，如果已摄取某一物质的动物的乳中一种以上miRNA的量大于或小于未摄取该物质的动物中所观察到的那些，则该物质和miRNA谱分别具有正或负相关性。另外，如果某一物质的摄取不影响miRNA谱，则该物质和miRNA谱互不相关。

具体地，例如，当比较食物摄取前后所观察到的乳中的miRNA谱时，摄取后所观察到的一种、优选两种以上、更优选五种以上miRNA的量大于摄取前所观察到的那些，则判定该食物使存在于乳中的miRNA的量增加。

另外，当比较食物摄取前后所观察到的乳中的miRNA谱时，摄取后所观察到的一种、优选两种以上、更优选五种以上miRNA的量小于摄取前所观察到的那些，则判定该食物使存在于乳中的miRNA的量降低。

此外，食物摄取前miRNA谱的测定并不是不可缺少的，食物和miRNA量的相关性还可通过比较在摄取食物后测定的miRNA谱与预先测定的对象哺乳动物的普通miRNA谱来测定。

在另一实施方案中，比较乳中的miRNA谱和血清或血浆中的miRNA谱，如果乳和血清或血浆二者中包含的miRNA的存在量，通过摄取食物使乳中所观察到的miRNA的存在量比血清或血浆中所观察到的miRNA的存在量更高的话，则判定该食物使存在于乳中的miRNA的存在量增加。与血清或血浆中的miRNA的存在量相比，乳中miRNA的存在量高的程度为例如1.2倍以上、优选2倍以上、更优选5倍以上、还更优选10倍以上。

另外，当比较乳中的miRNA谱和血清或血浆中的miRNA谱时，如果乳和血清或血浆二者中包含的miRNA的量，通过摄取食物而使乳中的量比血清或血浆中所观察到的量更低的话，则判定该食物使存在于乳中的miRNA的量减少。与血清或血浆中所观察到的miRNA存在量相比，乳中miRNA的存在量低的程度为例如0.8倍以下、优选0.5倍以下、更优选0.2倍以下、还更优选0.1倍以下。

所述食物可由单一物质组成或可为组合物，只要其可口服摄取即可。另外，“摄取前”和“摄取后”可意为“一次食物摄取之前和之后”或“两次以上食物摄取之前和之后”。另外，两次以上食物摄取可为两次以上相同食物的摄取，或两种以上食物的摄取。

所述食物可为根据既定计划摄取或自由摄取。后一种情况中，所述食物和乳中miRNA谱的相关性人类情况中可通过获取(hearing)所摄取的食物的含量来检测。当根据既定计划摄取或服用所述食物时，所述食物可被认为是“试样”。所述食物可为普通食物或包含试验物质的普通食物。摄取的食物量、摄取的时间和摄取的次数不特别限定。

如果选择使乳中miRNA的量增加的食物，则包含于所述食物并使乳中miRNA的量增加的物质可用如上述相同的方式鉴定。另外，如果选择使乳中miRNA的量减少的食物，则包含于所述食物并使乳中miRNA的量减少的物质可用如上述相同的方式鉴定。

如果鉴定出增加或减少乳中miRNA的量的食物或物质，则可设计使乳中miRNA的量增加或减少的食物。即，认为使乳中miRNA的量增加的食物或包含于其中的物质是产生具有免疫增强作用的乳所优选的，而使乳中miRNA的量减少的食物或包含于其中的物质不是产生具有免疫增强作用的乳所优选的。

另外，认为使乳中miRNA的量减少的食物或包含于其中的物质是产生具有免疫抑制作用的乳所优选的，而使乳中miRNA的量增加的食物或包含于其中的物质不是产生具有免疫抑制作用的乳所优选的。

可如上所述进行产生具有免疫调节作用的母乳的食物或物质，或不适于产生具有免疫调节作用的母乳的食物或物质的筛选。如下文所述实施例中所示，在大鼠和牛的初乳中证实存在各种miRNA。这支持了本发明的观点，即期望miRNA的口服给药提供免疫调节作用。另外，如下文所述实施例中所示，当将双歧杆菌属细菌(长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum))对大鼠口服给药时，52种miRNA的量增加。

已知双歧杆菌属细菌作为益生菌行使功能，并特别地具有免疫调节作用。因此，服用双歧杆菌属细菌使乳中miRNA的量增加的事实也支持乳中miRNA参与免疫调节。通过服用双歧杆菌属细菌诱导的乳中miRNA的量增加的论证，即双歧杆菌属细菌与miRNA谱的相关性，显示出本发明的筛选方法是可行的。另外，尽管还存在通过服用双歧杆菌属细菌不改变其在乳中的量的miRNA，但不否认可通过另一种食物或包含于其中的物质使那些miRNA的量增加的可能性。

作为双歧杆菌属细菌的益生菌功能，已知防御或改善呼吸道感染、急性感染性腹泻、抗生素相关性腹泻、艰难梭菌(Clostridiumdificile)相关性腹泻、坏死性肠结肠炎(necrotizingenterocolitis)、旅行者腹泻(traveler’sdiarrhea)和幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)感染等(TheJournalofNutrition，2010Mar；140(3)：698S-712SEpub2010Jan27)。表明通过服用双歧杆菌属细菌而使其在乳中的量增加的miRNA不仅调节免疫，而且在摄取双歧杆菌属细菌的动物中显示的功能类似于前述益生菌的功能。

通过给予哺乳动物如上所述选择的使乳中miRNA量增加的食物或物质，并从该动物中收集乳，可获得具有免疫增强作用的乳或其免疫增强作用增强的乳。另外，通过减少或避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中miRNA量减少的食物或物质，可增强乳的免疫增强作用，或可预防免疫增强作用的降低。

另外，可将使乳中miRNA量增加的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中miRNA量减少的食物或物质的摄取结合起来。另外，通过给予哺乳动物上述选择的使乳中miRNA量减少的食物或物质，并从该动物中收集乳，可获得具有免疫抑制作用的乳或其免疫增强作用减少的乳。另外，通过减少或避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中miRNA量增加的食物或物质，可增强乳的免疫抑制作用，或可降低乳的免疫增强作用。另外，可将使乳中miRNA量减少的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中miRNA量增加的食物或物质的摄取结合起来。

通过处理上述获得的具有免疫调节作用的乳，可产生具有免疫调节作用的乳制品。

乳制品的类型不特别限定，只要miRNA在维持其功能的情况下可存在于乳制品中即可，实例包括加工乳、婴儿配方、乳饮料、婴儿配方奶粉(powderedinfantformula)、发酵乳、奶油、黄油、奶酪和冰淇淋等。作为乳制品，优选婴儿或幼儿用乳制品。

根据本发明，已证实乳中miRNA的存在，特别是已知参与免疫增强例如免疫发育、抗过敏、抗炎和预防感染的miRNA。此外，众所周知，母乳对摄取其的婴儿给予免疫增强作用。因此，参与免疫调节的miRNA可调节摄取其的生物体例如人类的免疫是合理地预测。由于miRNA是调节各种基因表达的物质，因此认为此类调节分子从母体至婴儿的转移特别是对具有未发育的免疫系统的婴儿来说是极其重要的。

本发明的另一方面是具有免疫增强作用的口服摄取用组合物，其通过向口服摄取用组合物的基质中添加miRNA而制备。

所述miRNA的实例包括miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7i等。

在上述miRNA中，miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d和let-7i是优选的，而miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d和let-7i是更优选的。

所述miRNA可由单种miRNA组成或由任意的两种以上miRNA组成。

口服摄取用组合物的基质不特别限定，只要选择miRNA可在其中维持其功能而存在的口服摄取的或可给药的基质即可，实例包括食品、饮品、药品基质和动物饲料等。

食品可以为任何形式，并包括饮品。食品包括成人用食品、婴儿用食品和幼儿用食品等。

成人用食品的实例包括肠内营养物、流体食物例如浓缩的流体食物和营养增补食品等。

婴儿用食品或幼儿用食品的实例包括，例如调制乳类(modifiedmilk)(例如，婴儿配方、低出生体重(birthweight)婴儿用婴儿配方、较大婴儿配方等以及过敏型婴儿用婴儿配方、无乳糖乳、先天性代谢缺陷婴儿的特殊乳等，和由这些制备的奶粉)、母乳增补粉或婴儿配方奶粉和婴儿食品等。

此处所指的婴儿配方是通过使用乳或乳制品作为主原料并添加婴儿所需的营养物生产的食品，并主要用作婴儿期母乳的替代食品，以及作为幼年时期母乳的替代食品或营养补充食品。所述婴儿配方的其他实例包括为适合于具有特定的先天或后天疾病的婴儿有助于营养摄取为目的而生产的食品。

miRNA相对耐冻融、低pH如pH1的酸性条件和RNase如RNaseA和RNaseT，因而适合作为添加到食品中的活性成分。低pH下的稳定性表明miRNA分子耐婴儿胃内环境，并可被婴儿的主要免疫器官之一的肠道吸收，因此其可影响婴儿的免疫系统。另外，母乳的保存和冻融不会使miRNA变性，这对通常给予冷藏保存的母乳的低出生体重婴儿和住院婴儿在营养上是重要的。此外，miRNA对RNase的耐受性表明miRNA可存在于复合体例如母乳中的外泌体和微泡中。

从前述发现中，似乎母亲给予婴儿这样定制(custom-made)的母乳，婴儿便可适应环境。有报道表明源于母乳的外泌体使Foxp3+CD4+CD25+调节T细胞的数量增加。如果免疫相关的miRNA包含于母乳外泌体中，则其可能有助于婴儿消化道内Foxp3+CD4+CD25+调节T细胞的增加。这是由于母乳中检测出的免疫相关的miRNA如miR-181a和miR-181b高度表达，其参与T细胞的分化。此外，由于已知大量包含于母乳中的miR-181和miR-155诱导B细胞的分化，而抑制B细胞分化的miR-150在母乳中几乎不存在，因而母乳中的miRNA可诱导B细胞的分化。

尽管组合物中miRNA的含量不特别限定，并可适当选择，然而其总计例如为10至10,000ng/ml，优选20至10,000ng/ml，更优选50至10,000ng/ml。另外，摄取的miRNA的量，总计例如5μg至120mg/天，优选10μg至120mg/天，更优选25μg至120mg/天。

可通过制备部分双链RNA作为miRNA前体(pri-miRNA)并用Dicer酶消化来获得miRNA。作为Dicer酶，可使用商购可得的酶。双链RNA可通过例如使用具有互补序列的双链DNA作为模板的RNA聚合酶反应来制备。所述双链DNA可通过使用哺乳动物的染色体DNA作为模板以及为能够扩增miRNA序列而设计的引物基于PCR的扩增来制备。

可通过用Dicer酶等消化如上所述获得的双链RNA来获得miRNA。

另外，miRNA还可通过化学合成来制备。即，可通过合成正义链和反义链并将其退火来获得miRNA。

另外，可将允许通过哺乳动物的内源Dicer酶产生靶miRNA的双链RNA添加到口服摄取用组合物中。

当本发明的口服摄取用组合物为药剂时，可通过用药物学上可接受的口服给药用载体与miRNA组合来制备组合物。药物制剂的形式不特别限定，实例包括片剂、丸剂、散剂、溶液剂、悬浮剂(suspension)、乳剂、颗粒剂、胶囊剂和糖浆剂等。对于剂型，可使用广泛用于通常的药剂的添加剂作为口服给药用药物载体，如赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂(corrigent)、稀释剂和表面活性剂。另外，除非本发明的效果降低，否则miRNA可与另一具有免疫调节作用的药物一起使用。

尽管包含于药剂中的miRNA的量不特别限定，但其总计例如为2μg/kg至2mg/kg，优选4μg/kg至2mg/kg，更优选10μg/kg至2mg/kg。

当口服摄取用组合物为食品时，其可用于利用免疫增强作用的任何各种用途。所述用途的实例包括，例如作为适用于显示抵抗力低下人群的食品的用途和作为用于降低或消除由免疫低下引起的各种疾病的风险因素的食品或饮品的用途等。

本发明的食品或饮品可作为食品出售，并附有描述该食品用于免疫调节的指示。

前述术语“指示”包括告知消费者前述用途的所有行为，并且任何提醒或类推前述用途的指示落入本发明“指示”的范围内，而不管指示的目的、内容、对象物、媒体等如何。然而，所述指示优选用允许消费者直接识别前述用途的表述制成。具体实例包括在与本发明的食品相关的商品或商品包装上指示前述用途的行为，在上面指示了前述用途的该商品或商品的包装的分派(assigning)、交付(delivering)、为分派、交付目的的展示或进口行为，或者与商品相关的展示或分配广告、价格表或商业单据(businesspapers)、或者通过电磁法(互联网等)提供包括作为指示前述用途的内容的那些信息等的行为。

所述指示优选为经行政机构等批准的指示(例如，基于认可的形式的指示，该认可基于由行政机构提供的各种法律制度之一而授权)，特别优选在销售现场在广告材料上的指示，例如包装、容器、目录、宣传册和POP及其他文件等。

所述指示的实例进一步包括，例如，作为健康食品、功能性食品、肠道营养食品、特膳用途食品(foodforspecialdietaryuses)、具有营养功能声明的食品和准药(quasi-drug)等的指示，以及经卫生部、厚生劳动省(LaborandWelfare)批准的指示，例如基于特定保健用食品(foodforspecifiedhealthuses)体系及类似体系而批准的指示。后者的实例包括作为特定保健用食品的指示、作为具有授权的保健声明的特定保健用食品的指示、影响身体结构和功能的指示和减少疾病风险声明的指示等，更精确地，典型的实例包括在健康促进法(HealthPromotionLaw)实施条例(日本卫生部、厚生劳动省内部条例第86号，2003年4月30日)中提供的作为特定保健用食品的指示(特别是用于保健的指示)以及类似的指示。

实施例

以下将参考实施例进一步详细解释本发明。然而，本发明不受以下实施例的限定。

实施例1：母乳中miRNA的分析

将人母乳在2,000×g下离心10分钟以移除细胞和大沉淀物，进一步将除构成表层的脂质外的上清液在12,000×g下离心30分钟以移除细胞碎片和细胞尘(dust)。使用mirVanamiRNA分离试剂盒根据制造商的实验步骤(protocol)从上清液中提取总RNA。来自血清的RNA的提取以与对于母乳使用的相同的方式进行。

通过使用生物分析仪来分析提取的RNA。尽管相当大量的RNA包含于母乳中，但几乎不包含或根本不包含核糖体RNA(18SrRNA、28SrRNA)。

通过使用微阵列分析系统(使用由AgilentTechnologies生产的系统)来检测miRNA。通过使用GeneSpringGX11.0(由AgilentTechnologies生产)分析miRNA的表达水平。结果示于图1。结果，以显著水平检测出miR-181a、miR-181b、miR-155、miR-125b、miR-146b、miR-223和let-7i。无法检出控制T细胞和B细胞的miR-150。另外，几乎不能检测出多器官特异的miRNA如miR-122(肝脏)、miR-216、miR-217(胰腺)、miR-142-5p、miR-142-3p(造血细胞)。此外，检出小量miR-124(脑)。

通过定量RT-PCR分析的出生后前六个月(n＝5)和接下来的六个月(n＝13)的母乳中的miR-181a水平的比较结果示于图2。对miR-155、miR-17和miR-92a进行的类似分析的结果也示于图3中。为了使由RNA分离过程诱导的样品中的变化标准化，将变性的cel-miR-39(由Qiagen合成)(为线虫(秀丽隐杆线虫)的合成miRNA)添加到样品中(5ml总体积中寡核苷酸量为25fmol)，miRNA的量作为基于cel-miR-39的量的相对量来示出(以下实验应同样应用)。

结果，出生后前六个月的乳与接下来六个月的乳相比miR-181a的量较大(图2)。对于miR-155、miR-17和miR-92a也观察到类似的趋势(图3)。

作为RT-PCR用引物，使用由AppliedBiosystems生产并由以下AssayID鉴定的那些。

-miR-181a：000480

-miR-155：002623

-miR-17：002308

-miR-92a：000431

-Cel-miR-39：000200

产后6个月内七名健康人的母乳和血清中与免疫相关的miRNA水平的比较结果示于图4(母乳：n＝5、血清：n＝6)。母乳中miRNA谱不同于血清中的那些。例如，控制粒细胞的miRNAmiR-223在正常人血清和血浆中以最高水平存在，然而与血清中的相比其在母乳中的表达量极低。另外，不大量存在于血清中的miR-146b却大量地存在于母乳中。

另一方面，与血清中所观察到的那些相比，在表达量上母乳中大量存在miR-181和miR-155。有趣的是，在产后六个月(其为婴儿食品摄入前的阶段)的母乳中高度表达多种免疫相关的miRNA。

miRNA的细胞间转移表明miRNA不仅控制细胞内分子，还是在细胞间通讯中像细胞因子一样起作用的分子。前述结果表明miRNA为可从母体转移至孩子的“遗传物质(geneticmateral)”。据计算，约0.15pg/L/天(1.3×10⁷个拷贝/L/天)的miR-181经母乳被婴儿摄取。

此外，作为聚类分析的结果，已发现不同母亲的母乳的miRNA谱是相似的。

实施例2：miRNA的物理化学性质

将母乳在室温下静置24小时，或反复进行冷冻(-20℃)和融解至3次。通过TaqManqRT-PCR测定miRNA(miR-21、miR-181a)的水平。结果示于图5。另外，在低pH溶液(pH1)中处理母乳3小时，用TaqManqRT-PCR测定处理前后miRNA(miR-181a)的水平。结果示于图6。

另外，将RNaseA/T溶液(RNaseA(500U/ml)和RNaseT1(20,000U/ml)的混合溶液，由Ambion生产)以母乳的2％体积加入母乳中，37℃下处理混合物3小时，通过TaqManqRT-PCR测定处理前后miRNA(miR-181a)的水平。结果示于图7。

作为用于TaqManqRT-PCR的引物，使用由AppliedBiosystems生产并由以下AssayID鉴定的那些。

-miR-181a：000480

-miR-21：000397

-Cel-miR-39：000200

证实miRNA对冻融、低pH和RNase相对稳定。

实施例3：产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质的鉴定

购买怀孕9至10天的SD大鼠，在怀孕13至20天期间，以每只大鼠1ml/天的体积将双歧杆菌属细菌、长双歧杆菌BB536(ATCCBAA-999)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)(1×10⁹cfu/ml)悬浮液给药到试验组(n＝3)的大鼠。

另外，作为对照组(n＝3)，以每只大鼠1ml每天的体积给药PBS。长双歧杆菌(B.longum)ATCCBAA-999菌株可从美国模式培养物集存库(AmericanTypeCultureCollection)购买(地址：12301ParklawnDrive，罗克维尔市，马里兰州20852，美国)。

所有大鼠在怀孕21天时产仔，并且在其分娩后第一天在用乙醚麻醉下产奶。所获初乳样品离心两次来移除脂质层和细胞碎片，离心条件为1,200×g、4℃、10分钟。

随后，在21,500×g和4℃下离心上清液40分钟，并进一步在相同条件下离心1小时来移除酪蛋白组分，从而获得乳清。通过使用miRNeasy迷你试剂盒(MiniKit)(由Qiagen生产)从所获乳清样品中获得总RNA。

通过使用100ng所获RNA样品，使用微阵列系统(由AgilentTechnologies生产)以常规方式检测miRNA。通过使用GeneSpringGX11.0(由AgilentTechnologies生产)分析结果。

当通过使用GeneSpringGX11.0进行微阵列数据的统计学分析时，发现在检测微小RNA的试验组和对照组中已证实表达的微小RNA的类型数总计为155。这些微小RNA如下所示。此外，未检出miR-150。

在试验组和对照组中证实表达的微小RNA，155种：

miR-16、miR-17-5p、miR-18(miR-18a)、miR-19(miR-19b)、miR-20(miR-20a)、miR-21、miR-23(miR-23a)、miR-27(miR-27a、miR-27b)、miR-29(miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-29c*)、miR-30(miR-30a、miR-30c、miR-30d、miR-30e*)、miR-33、miR-34b、miR-92a、miR-93、miR-100、miR-101(miR-101a、miR-101b)、miR-106b、miR-130b、miR-140*、miR-141、miR-143、miR-146a、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200a、miR-205、miR-218、miR-219-5p、miR-221、miR-301a、miR-322、miR-340-5p、miR-361、miR-429、miR-455、miR-466b、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532-5p、miR-542-3p

let-7a、let-7a*、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7i、miR-10(miR-10a-5p、miR-10b)、miR-15(miR-15b)、miR-19(miR-19a)、miR-20(miR-20a*)、miR-22、miR-23(miR-23b)、miR-24、miR-25、miR-26(miR-26a，miR-26b)、miR-28、miR-30(miR-30a*、miR-30b-5p、miR-30c-1*、miR-30c-2*、miR-30e)、miR-31、miR-34(miR-34a)、miR-96、miR-98、miR-99(miR-99a、miR-99b)、miR-103、miR-107、miR-125(miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-3p、miR-125b-5p)、miR-128、miR-130(miR-130a)、miR-133(miR-133a、miR-133b)、miR-134、miR-139(miR-139-3p)、miR-140、miR-146(miR-146b)、miR-148(miR-148b-3p)、miR-151、miR-152、miR-181(miR-181a、miR-181a*、miR-181b、miR-181c、miR-181d)、miR-182、miR-183、miR-188、miR-196(miR-196c)、miR-199(miR-199a-3p)、miR-200(miR-200b、miR-200c)、miR-203、miR-204、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291(miR-291a-5p)、miR-292(miR-292-5p)、miR-294、miR-296(miR-296*)、miR-320、miR-324(miR-324-3p、miR-324-5p)、miR-327、miR-328、miR-331、miR-340(miR-340-3p)、miR-341、miR-342(miR-342-3p)、miR-345(miR-345-5p)、miR-347、miR-352、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378(miR-378、miR-378*)、miR-425、miR-465、miR-483、miR-484、miR-494、miR-542(miR-542-5p)、miR-652、miR-672、miR-685、miR-760(miR-760-3p)、miR-872、miR-874、miR-1224

在miR-序号后带括号说明的所列miRNA具有亚型，括号内所说明的亚型实际表达。

另外，当通过使用曼-惠特尼U检验(Mann-WhitneyU-test)在统计学上比较双歧杆菌属细菌BB536给药组和对照组中前述微小RNA的表达量时，发现以下52种微小RNA类型在双歧杆菌属细菌BB536给药组中以小于5％的概率水平增加。所述miRNA在表达上的变化倍率示于表11。

在双歧杆菌属细菌BB536给药组中证实增加的微小RNA，52种：

表11

从表11所示结果可看出，发现对于证实增加的所有52种微小RNA观察到的变化倍率为1.2倍以上。

即，发现基于这样的52种微小RNA的检测可将双歧杆菌属细菌BB536菌株筛选为产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质。

实施例4：大鼠初乳中表达的微小RNA的检测

购买三只怀孕14天的F344大鼠。所有购买的大鼠在怀孕21天时产仔，并且在其分娩后第二天在乙醚麻醉下产奶以收集初乳。

各初乳样品在1,200×g和4℃下离心10分钟两次来移除脂质层和细胞碎片。

随后，在21,500×g和4℃下离心上清液40分钟，并进一步在相同条件下离心1小时来移除酪蛋白组分，从而获得乳清。

通过使用miRNeasy迷你试剂盒(由Qiagen生产)从所获乳清样品中获得总RNA。

将100ng的量的所获RNA样品以常规方式用于微阵列(由AgilentTechnologies生产)实验。通过使用GeneSpringGX11.0(由AgilentTechnologies生产)分析微阵列实验结果。

结果，证实除了在实施例3中证实的155种微小RNA外，还表达四种微小RNA(miR-193*、miR-409-3p、miR-664、miR-877)。

实施例5：牛初乳中表达的微小RNA的检测

准备产后1至3天的荷斯坦牛(Holsteincow)的五个乳样品作为初乳样品。另外，准备产后8天至8个月的荷斯坦牛的五个乳样品作为正常乳样品。

各乳样品(初乳和正常乳)在1,200×g和4℃下离心10分钟两次来移除脂质层和细胞碎片。

将20ng的量的所获RNA样品以常规方式用于微阵列(由AgilentTechnologies生产)实验。通过使用GeneSpringGX11.0(由AgilentTechnologies生产)分析微阵列实验结果。

结果，在初乳样品和正常乳样品中证实总计表达102种miRNA。特别地，在该102种miRNA中，证实49种miRNA仅在初乳中表达。

证实仅在初乳中表达的49种微小RNA如下所述。

证实仅在初乳中表达的微小RNA，49种：

let-7d、let-7i、miR-15a、miR-15b、miR-16b、miR-17-3p、miR-19b、miR-21、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-26b、miR-27b、miR-30a-5p、miR-30c、miR-30f、miR-34a、miR-99a、miR-106、miR-106b、miR-107、miR-125b、miR-126、miR-129-3p、miR-130a、miR-130b、miR-140、miR-155、miR-181b、miR-184、miR-193a-3p、miR-193a-5p、miR-196a、miR-210、miR-222、miR-223、miR-338、miR-361、miR-362-5p、miR-370、miR-429、miR-452、miR-486、miR-500、miR-532、miR-584、miR-708、miR-877、miR-1300b、miR-1307

产业上的可利用性

根据本发明，可筛选产生具有免疫调节作用的乳的食物或包含于其中的物质。本发明还提供生产具有免疫调节作用的乳制品的方法。本发明的口服摄取用组合物具有免疫增强作用，并特别适用于婴儿。

Claims

1.一种筛选食物或物质的方法，所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳，所述方法包括通过利用哺乳动物乳中的微小RNA谱与由哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中的物质的相关性作为指标来鉴定使得存在于所述哺乳动物乳中的微小RNA的量增加的食物或物质，当微小RNA的量增加时，判定所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳，

比较所述食物摄取前后所观察到的所述乳中的微小RNA谱，并且当摄取后所观察到的至少一种微小RNA的量高于摄取前所观察到的量时，判定所述食物使所述乳中的所述微小RNA的量增加，

比较所述乳中的微小RNA谱和血清或血浆中的微小RNA谱，当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小RNA的量在摄取所述食物后使包含于所述乳中的微小RNA的量是所述血清或血浆中的微小RNA的量的1.2倍以上时，判定所述食物使所述乳中的所述微小RNA的量增加，

所述微小RNA谱为选自由miR-21、miR-92a和miR-146a组成的组的微小RNA的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物为人、大鼠或牛。

3.一种生产具有免疫增强作用的乳或乳制品的方法，其包括通过根据权利要求1所述的筛选方法鉴定使哺乳动物的乳中的微小RNA的量增加的食物或物质的步骤，给予除人以外的哺乳动物所述食物或物质的步骤和收集所述哺乳动物的乳的步骤。