CN114196759B

CN114196759B - 一种尿液样本的胰腺癌生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN114196759B
Application number: CN202111665827.0A
Authority: CN
Inventors: 许明炎; 张晓妮; 林郁松; 李慧; 周书雄
Original assignee: Haplox Biotechnology Shenzhen Co ltd
Current assignee: Haplox Biotechnology Shenzhen Co ltd
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114196759A

Abstract

本申请公开了一种尿液样本的胰腺癌生物标志物及其应用。本申请的尿液样本的胰腺癌生物标志物为Seq ID No.1所示序列的miRNA。本申请的尿液样本的胰腺癌生物标志物，在胰腺癌患者的尿液中高水平表达，而在正常的健康人的尿液中表达水平显著较低；因此，可以通过检测尿液样本中的本申请胰腺癌生物标志物的表达水平，判断胰腺癌。本申请的生物标志物为胰腺癌检测提供了一种新的方案和途径，尤其适用于胰腺癌的早期筛查和大规模筛查。

Description

一种尿液样本的胰腺癌生物标志物及其应用

技术领域

本申请涉及胰腺癌生物标志物技术领域，特别是涉及一种尿液样本的胰腺癌生物标志物及其应用。

背景技术

胰腺癌(Pancreatic cancer，PCa)是最为致命的一种癌症，每年新增病例约460,000例，死亡约430,000例，对人类的生命健康构成了严重威胁。现阶段胰腺癌缺乏有效的筛查手段，发现时多处于晚期，预后较差。寻找一种早筛胰腺癌的生物标志物，是有效提高胰腺癌患者生存率与预后的方法。

MicroRNA(miRNA)，是一类长度约20nt，进化上保守的单链非编码RNA分子，它通过碱基互补配对作用，结合目标信使RNA(mRNA)，并通过引导目标mRNA的降解或抑制目标mRNA的翻译，从而阻止目标蛋白质的产生。

miRNA在细胞中表达失调会导致胰腺癌在内的多种疾病的发生，最新研究表明，一些miRNA在胰腺癌患者的血液中异常表达，但何种miRNA与胰腺癌的发生、发展有关仍未达成共识。因此有必要寻找与胰腺癌发生、发展有关的miRNA，从而为临床上判断和治疗胰腺癌提供一种有效手段。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的适用于尿液样本的胰腺癌生物标志物及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种尿液样本的胰腺癌生物标志物，该胰腺癌生物标志物为Seq ID No.1所示序列的miRNA；

Seq ID No.1：5’-UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU-3’。

需要说明的是，本申请对比分析提取自胰腺癌和健康人尿液的miRNA，研究发现了一种新的胰腺癌生物标志物，即Seq ID No.1所示序列的miRNA，该胰腺癌生物标志物在胰腺癌患者的尿液中高水平表达，而在正常的健康人的尿液中表达水平显著较低。本申请的胰腺癌生物标志物，为通过尿液检测胰腺癌提供了一种新的方案和途径。并且，尿液是肾脏产生，经尿路排出的液体代谢废物；作为一种新型生物样本，它具有无创采集、易于获得、便于大量采用的特点。本申请的胰腺癌生物标志物在尿液中具有显著的表达差异，能够用于胰腺癌的早筛和大规模筛查；相比于通过血液样本进行胰腺癌检测的方法，基于本申请的胰腺癌生物标志物进行尿液样本检测筛查胰腺癌，采样更方便。

本申请的另一方面公开了一种克隆载体，该克隆载体中含有本申请的胰腺癌生物标志物或其表达基因。

可以理解，为了便于本申请的胰腺癌生物标志物的使用，可以将本申请的胰腺癌生物标志物或其表达基因克隆到合适的载体中。

本申请的再一方面公开了一种细胞或囊泡，该细胞或囊泡含有本申请的胰腺癌生物标志物或其表达基因，或者含有本申请的克隆载体。

可以理解，为了便于保存，可以将本申请的胰腺癌生物标志物或其表达基因，或者含有本申请的胰腺癌生物标志物或其表达基因的克隆载体，导入细胞或囊泡中。

本申请的再一方面公开了本申请的胰腺癌生物标志物、本申请的克隆载体或者本申请的细胞或囊泡在制备检测胰腺癌的试剂中的应用。

需要说明的是，本申请的应用主要包括，例如，根据本申请的胰腺癌生物标志物设计特异性检测的引物和/或探针，又或者，将本申请的克隆载体作为阳性对照等，在此不作具体限定。

本申请的一种实现方式中，本申请的应用中提到的检测胰腺癌的试剂，主要为通过尿液样本检测胰腺癌的试剂。

本申请的再一方面公开了一种miRNA或含有该miRNA的克隆载体、细胞或囊泡作为通过尿液样本检测胰腺癌的生物标志物的应用，该miRNA为Seq ID No.1所示序列。

本申请的再一方面公开了一种检测胰腺癌的试剂盒，该试剂盒包括能够特异性的检测本申请的胰腺癌生物标志物的试剂。

本申请的一种实现方式中，本申请试剂盒所指的能够特异性的检测本申请的胰腺癌生物标志物的试剂为针对Seq ID No.1所示序列的miRNA设计的特异性引物和/或探针。

可以理解，针对Seq ID No.1所示序列的miRNA设计特异性引物和/或探针，只是检测本申请的胰腺癌生物标志物的一种方式，不排除还可以采用其他方式进行检测，只要是能够特异性的检测本申请的胰腺癌生物标志物的试剂都可以组装到本申请的试剂盒中。

本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括本申请的克隆载体和/或本申请的细胞或囊泡。

可以理解，本申请的克隆载体和/或本申请的细胞或囊泡，可以作为阳性对照组装到试剂盒中。

本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括提取尿液miRNA的试剂。

可以理解，本申请的试剂盒主要是通过检测尿液样本中的本申请的胰腺癌生物标志物的表达，以此实现检测胰腺癌；因此，为了使用方便，可以将所需的提取尿液miRNA的试剂组装到试剂盒中。当然，提取尿液miRNA的试剂也可以另行购买。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的胰腺癌生物标志物，在胰腺癌患者的尿液中高水平表达，而在正常的健康人的尿液中表达水平显著较低；通过检测本申请的胰腺癌生物标志物，可以实现直接采用尿液样本检测胰腺癌，为胰腺癌检测提供了一种新的方案和途径，尤其适用于胰腺癌的早期筛查和大规模筛查。

附图说明

图1是本申请实施例中胰腺癌患者与健康人尿液样本中miRNA的表达水平对比分析结果。

具体实施方式

虽然现有的研究显示一些miRNA在胰腺癌患者的血液中异常表达；但是，具体何种miRNA与胰腺癌的发生、发展有关仍未达成共识；并且，利用血液样本进行胰腺癌早期筛查或大规模筛查，存在取样不便的问题。

本申请首先通过既有文献资料，筛选多组理论上与胰腺癌具有相关关系，且表达上调或下调的miRNA，作为目标miRNA库。然后，收集健康人与胰腺癌患者的尿液进行miRNA提取分离、测序分析，将测序结果与上述目标miRNA库以及miRbase数据库进行对比分析，并比较各miRNA在正常人与胰腺癌患者中表达水平的差异，筛选出尿液样本中合适的miRNA胰腺癌早筛生物标志物，即本申请的Seq ID No.1所示序列的miRNA。

采用本申请的胰腺癌生物标志物，可以直接通过尿液样本检测胰腺癌；而尿液具有无创采集、易于获得、便于大量采用等优点；为胰腺癌的早期筛查和大规模筛查提供了一种新的生物标志物。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本实施例通过既有文献资料，筛选多组理论上与胰腺癌具有相关关系，且表达上调或下调的miRNA，作为目标miRNA库。本例共筛选171个miRNA序列，名称如表1所示。

表1目标miRNA库

let-7a	mir-182-5p	mir-335	mir-138-5p	mir-23a-5p	mir-637
						let-7a-1	mir-182	mir-337	mir-141	mir-27a	mir-661
let-7a-2	mir-182-3p	mir-33a	mir-142-5p	mir-27b	mir-663a
						let-7a-3	mir-186	mir-340	mir-143	mir-29a	mir-663b
let-7b	mir-18a	mir-345-5p	mir-144	mir-29b	mir-675
						let-7c	mir-191	mir-34a	mir-145	mir-29b-1	mir-7
let-7d	mir-192	mir-34b	mir-146a	mir-29b-2	mir-7-5p
						let-7e	mir-193a-3p	mir-34c	mir-148a	mir-29c	mir-708-5p
let-7f-1	mir-194	mir-367	mir-148b	mir-300	mir-744
						let-7f-2	mir-195	mir-369-5p	mir-150	mir-301a	mir-873
let-7g	mir-196a	mir-373	mir-150*	mir-301a-3p	mir-876-3p
						let-7i	mir-196b	mir-374a	mir-150-5p	mir-301b	mir-9
mir-101	mir-198	mir-375	mir-152	mir-30a	mir-9-5p
						mir-107	mir-19b-3p	mir-376a	mir-15a	mir-30b-5p	mir-92
mir-10a	mir-200a	mir-377	mir-15b	mir-31	mir-940
						mir-10b	mir-200b	mir-378a-3p	mir-16	mir-320a	mir-96
mir-1178	mir-200c	mir-410	mir-17-5p	mir-323-3p	mir-98
						mir-1181	mir-200c-3p	mir-424-5p	mir-181a	mir-329	mir-98-5p
mir-124	mir-203	mir-429	mir-181c	mir-331-3p	mir-99a
						mir-1247	mir-205	mir-431	mir-1297	mir-216b-5p	mir-506
mir-125a-3p	mir-21	mir-448	mir-132	mir-217	mir-509-5p
						mir-125a-5p	mir-212	mir-449a	mir-133a	mir-218	mir-539
mir-126	mir-214	mir-451	mir-135a	mir-221	mir-541
						mir-126-3p	mir-215	mir-451a	mir-135a-1	mir-221-3p	mir-613
mir-127	mir-216a	mir-455-3p	mir-135a-2	mir-222	mir-615-5p
						mir-1271	mir-216a-3p	mir-4787-5p	mir-135b	mir-223	mir-629
mir-128	mir-216a-5p	mir-493	mir-135b-5p	mir-224	mir-630
						mir-1290	mir-216b	mir-494	mir-137	mir-23a	mir-634
mir-1291	mir-216b-3p	mir-497

采用miRbase数据库以及表1所示的目标miRNA库作为参考序列，对提取自尿液样本的miRNA的测序结果进行比对分析，将胰腺癌患者与正常健康人尿液中表达水平存在显著差异的miRNA，作为本例的胰腺癌生物标志物。

miRbase数据库网址：https://mirbase.org/

本实施各收集10例健康人与10例胰腺癌患者的尿液样本进行miRNA提取和测序。所有尿液样本均由深圳市海普洛斯生物科技有限公司提供和保存。

分离尿液细胞外囊泡并使用trizol reagent提取miRNA，具体步骤如下：

1)配置3×Buffer EI：包括采用相对分子质量6000～10000的聚乙二醇、氯化钠和水，配置成聚乙二醇浓度为450g/L、氯化钠浓度为1.5mol/L的溶液。配置20×Buffer NP：包括采用乙酸钠、乙酸、水，配置成pH＝5.2的3mol/L乙酸钠溶液。

2)取尿液样本15mL，在4℃2000g下离心15min，取上清液作为第一上清液。

3)将第一上清液在4℃20000g下离心15min，取上清液作为第二上清液。

4)取第二上清液10mL，与5mL的3×Buffer EI混合，混匀，于4℃静置16h。

5)取步骤4)静置后的混合液，在4℃20000g离心30min，去上清，获取沉淀，即为细胞外囊泡。

6)向上述细胞外囊泡中加入1mL的Trizol reagent，充分震荡，室温静置20min。

7)加入200μL的1-溴，3-氯丙烷，充分震荡，静置10min，在4℃，20000g离心20min，取上清液为第三上清液。

8)向第三上清液中加入700μL的-20℃预冷的异丙醇，加入70μL的20×Buffer NP，加入7μL聚丙烯酸。

9)将步骤8)的混合液轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min。

10)在4℃20000g离心20min，去上清，保留沉淀。

11)向步骤10)的沉淀中加入预冷的75％乙醇1mL，震荡涡旋使沉淀悬浮。

12)在4℃20000g离心10min，去上清，保留沉淀。

13)向步骤12)的沉淀中加入预冷的75％乙醇1mL，震荡涡旋使沉淀悬浮。

14)经在4℃20000g离心10min，去上清，保留沉淀。

15)将步骤14)的沉淀在室温晾干，加入无RNA酶水30μL，混匀溶解，即为miRNA溶液。

使用Invitrogen Qubit microRNA检测试剂盒对提取的miRNA溶液进行质控，miRNA浓度≥10,000ng/mL为合格样本。10例健康人与10例胰腺癌患者的尿液样本提取的miRNA浓度测试结果如表2所示。

表2提取miRNA溶液的浓度测试结果

使用Vazyme公司的small RNA library preparation kit for Illumina文库制备试剂盒，对提取自10例健康人与10例胰腺癌患者尿液样本的miRNA进行miRNA文库制备。

然后，使用Illumina Novaseq 6000测序仪对制备的miRNA文库进行高通量测序，测序数据量为3Gb，使用fastq程序进行高通量测序数据分析。

本例具体分析了健康人和胰腺癌患者的以下三个miRNA：

1)miR-182-5p，即Seq ID No.1所示序列的miRNA，

Seq ID No.1：5’-UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU-3’；

2)mir-182，即Seq ID No.2所示序列的miRNA，

Seq ID No.2：

5’-GAGCUGCUUGCCUCCCCCCGUUUUUGGCAAUGGUAGAACUCACACUGGUGAGGUAACAGGAUCCGGUGGUUCUAGACUUGCCAACUAUGGGGCGAGGACUCAGCCGGCAC-3’；

3)miR-182-3p，即Seq ID No.3所示序列的miRNA，

Seq ID No.3：5’-UGGUUCUAGACUUGCCAACUA-3’。

其中，mir-182是miR-182-5p和miR-182-3p的前体miRNA。

对比分析结果如表3、表4和图1所示。

表3三组miRNA表达量的单因素方差分析结果

miRNA	平方和	df	均方	F	P
						miR-182-5p	13590905.02	1	13590905.02	7940.485	<0.01
miR-182-3p	0.037	1	0.037	0.51	0.481
						mir-182	745.434	1	745.434	0.092	0.764

表4三组miRNA表达量的均值统计结果

表3、表4和图1的结果显示，胰腺癌患者尿液中miR-182-5p表达水平显著高于健康人尿液，而作为miR-182-5p前体miRNA的mir-182，以及mir-182的另一成熟体miR-182-3p则没有表现出明显的表达差异。因此，将Seq ID No.1所示序列的miRNA，即miR-182-5p，作为尿液样本的胰腺癌生物标志物。

根据以上结果可见，miR-182-5p可以作为尿液样本的胰腺癌生物标志物。如果待测对象的尿液样本中miR-182-5p的表达水平显著高于作为对照的健康人的尿液样本，则可以判断待测对象患有胰腺癌。

采用本例获得的尿液样本的胰腺癌生物标志物，按照以上方法，对78例发生黄疸、腹痛或营养不良的早筛对象的尿液样本进行检测。与此同时，通过多层螺旋增强CT、增强MRI，必要时进行活检，诊断检测对象是否患有胰腺癌。结果显示，通过本例的尿液样本的胰腺癌生物标志物进行分析判断，有12例检测对象患有胰腺癌，其余66例检测对象未患胰腺癌；检测结果与影像学及组织活检结果对比，灵敏度达100％，特异性有98.5％。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市海普洛斯生物科技有限公司

<120> 一种尿液样本的胰腺癌生物标志物及其应用

<130> 21I33107

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> RNA

<213> miR-182-5p序列

<400> 1

uuuggcaaug guagaacuca cacu 24

<210> 2

<211> 110

<212> RNA

<213> mir-182序列

<400> 2

gagcugcuug ccuccccccg uuuuuggcaa ugguagaacu cacacuggug agguaacagg 60

auccgguggu ucuagacuug ccaacuaugg ggcgaggacu cagccggcac 110

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> miR-182-3p

<400> 3

ugguucuaga cuugccaacu a 21

Claims

1.检测尿液中miRNA的试剂在制备通过尿液样本检测胰腺癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA为Seq ID No.1所示序列；

Seq ID No.1：5’-UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU-3’。