KR101693649B1

KR101693649B1 - 마이크로rna 프로파일을 이용한 간내 선암의 원발부위 예측방법

Info

Publication number: KR101693649B1
Application number: KR1020140066145A
Authority: KR
Inventors: 김학균
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2017-01-06
Also published as: KR20150138575A

Abstract

본 발명은 원발부위를 알고 있는 간내 선암의 조직 시료로부터 하나 이상의 마이크로RNA의 발현 프로파일 측정하는 단계; 상기 측정된 발현 프로파일에서 유의적인 차이를 나타내는 마이크로RNA를 선별하는 단계; 선별된 마이크로RNA의 발현 프로파일을 각각의 원발부위에 따른 참조 발현 프로파일을 설정하는 단계; 검체 시료로부터 상기 단계에서 선별된 마이크로RNA의 발현 프로파일을 측정하는 단계; 및 상기 발현 프로파일과 참조 발현 프로파일을 비교하는 단계를 포함하는 간내 선암의 원발부위를 예측하는 방법에 관한 것이다.

Description

마이크로RNA 프로파일을 이용한 간내 선암의 원발부위 예측방법 {Methods of predicting the tissue origin for adenocarcinomas in the liver using microRNA profiles}

본 발명은 마이크로RNA 프로파일을 이용한 간내 선암의 원발부위 예측방법에 관한 것으로, 생검 조직의 시료로부터 마이크로RNA 프로파일 정보를 얻은 후 이를 분석하여 간내 선암의 조직 기원을 예측하는 방법에 관한 것이다.

조직 기원을 예측하는 것은 전이성 암(metastatic cancers)을 가진 환자의 임상관리에 중요하다. 마이크로RNA 프로파일링은 종양 전이(metastases)의 조직 기원을 예측하는데 성공적으로 사용되어 왔다 (Lu J, et al. Nature 2005; 435(7043):834-8). 주요 논문에서는, 1세대 로제타 게노믹 마이크로RNA 분석을 이용하여 89%의 예측정확도를 보고하였다 (Rosenfeld N, et al. Nat Biotechnol 2008; 26(4):462-9). 2세대 로제타 게노믹 마이크로RNA 분석을 이용해서는, 독립된 샘플 세트에서 단일-응답 방식(single-answer cases)에 대하여 전체적으로 85% 정확도와 90% 민감도가 보고되었다 (Meiri E, et al. Oncologist 2012; 17(6):801-12). 47개 마이크로RNA-기반 분석을 이용해서는, 원발성 암(primary cancers) 및 전이(metastases)에 대해 각각 100%와 78%의 예측정확도가 보고되었다 (Ferracin M, et al. J Pathol 2011; 225(1):43-53). 132개 마이크로RNA-기반 분석을 이용해서는 전이의 88%에서 조직 기원을 정확하게 예측되었다 (Sokilde R, et al. J Mol Diagn 2014; 16(1):106-15). 이전 연구들은 암의 조직 기원을 예측하는데 있어서 마이크로RNA의 유용성을 설명하고는 있지만, 마이크로RNA-기반 분석은 간 전이에 대한 조직 기원을 정확히 예측하기 위해 더 최적화될 필요가 있다.

간은 암 전이의 통상적인 부위이기 때문에 간암의 기원 및 유형을 확인하는 것은 중요하며, 최적의 환자 관리를 계획하기 위해서는 원발성 간암으로부터 전이성 암을 구별해내는 것이 임상적으로 중요하다. 그러나 간내담도암(intrahepatic cholangiocarcinomas)과 간전이(liver metastases) 사이의 감별진단은 전통적인 방법으로는 어려운 경우가 종종 있다. 간세포암(hepatocellular carcinoma)은 가장 흔한 원발성 간암이긴 하지만, 원발성 간암의 4-6%는 담도 상피(biliary epithelium)에서 발생한 간내담도암이다 (Parkin DM, et al. J Clin 2005; 55(2):74-108). 조직학적으로, 원발성 간내담도암은 대장 선암 또는 전립선 선암과 같은 일반적인 고형 종양의 전이와 비슷한 선암(adenocarcinomas)이다 (Sasaki A, et al. J Surg Oncol 1999; 70(2):103-8). 치료 계획 및 예후가 어렵기 때문에 이러한 두 질환을 구별하는 것은 매우 중요하나, 아직 간내 담도암에 특이적인 면역조직화학 마커들은 없다. 이전 보고에 따르면, CK7-양성/CK20-음성 염색에서 담도암(cholangiocarcinomas)은 12의 1(8%), 그리고 대장암전이(colorectal cancer metastases)는 25의 20(80%)으로 나타났다 (Chiu CT, et al. Dig Liver Dis 2008; 40(9):749-54). 대장암에 대한 CDX2의 민감도는 99%이지만, CDX2는 간내담도암의 21%에 이르기까지 역시 발현되었다 (Panarelli NC, et al. Am J Clin Pathol 2012; 138(2):211-22). 또한, 마이크로RNA-기반 분석은 소화기관의 암, 특히 담도암에 대한 조직 기원을 예측하는데 상대적으로 취약한 성과를 나타내었다. 이전 연구의 마이크로RNA 분류법은 대부분의 간전이의 조직 기원을 예측하는데 실패했지만, 그것을 담도암으로는 분류하였다. 따라서 이 연구 저자들은 전이 부위가 원발성 종양으로 분류될 수 없는 그들의 분류법에 규칙을 추가하였다 (Sokilde R, et al. J Mol Diagn 2014; 16(1):106-15). 담도암(cholangiocarcinomas)이 로제타 게노믹스(Rosetta Genomics) 마이크로RNA 분석인 2세대에 최근 포함되지는 했지만, 담도암(biliary tract cancer) 13의 4(30.8%)가 이 분석에 의해 잘못 분류되거나 췌장담도암(pancreatobiliary cancers)으로 모호하게 예측되었다. 또한 단일-응답 췌장암(pancreatic adenocarcinomas)(55.5%)이 잘못 분류되거나 췌장담도암으로 모호하게 예측되었다 (Meiri E, et al. Oncologist 2012; 17(6):801-12). 췌장암과 간내담도암을 비교한 하나의 마이크로RNA 연구가 주목을 받았지만, 췌장암의 샘플(n=9)이 적은 한계가 있었다 (Collins AL, et al. Ann Surg Oncol 2014; 21(1):133-8). 더욱이, 이 저자들은 췌장암과 담도암을 직접적으로 비교하지 않고, 암의 각 타입과 인접한 정상 조직 사이를 비교하였다. 따라서 이러한 결과는 전이의 조직 기원을 결정하는데 직접적으로 사용될 수가 없다.

본 발명자들은 소화기관의 암에 대한 진단 또는 예측 바이오마커로서 마이크로RNA의 역할을 평가해 왔으나(Kim CH, et al. BMC Med Genomics 2011; 4:79), 국내에서 간내담도암이 상대적으로 높게 발생함을 고려하여 (Shin HR, et al. Korea . J Korean Med Sci 2010; 25(7):1011-6), 간에서 선암에 대한 조직 기원을 더 잘 예측할 수 있는 마이크로RNA 분석법을 개발하고자 하였다. 이러한 목적에 따라, 본 발명자들은 폐, 췌장, 담도계(hepatobiliary tree), 신장, 창자(bowel), 생식계통(genital system) 및 위(stomach)에서 기원한 동결된 원발성 종양에 대한 마이크로RNA 프로파일링을 수행하였으며, 부검 연구에 따르면 가장 흔한 원인은 원발부위불명의 암종이었다 (Pentheroudakis G, et al. Eur J Cancer 2007; 43(14):2026-36). 이에 본 발명자는 간에 전이할 수 있는 원발성 종양 및 간내담도암에 대하여 조사하고, 조직 기원에 따라 간에서 선암을 정확하게 구별하는 마이크로RNA 분석법을 개발하였다.

따라서 본 발명의 목적은 간에서 발생한 선암이 간에서 기원한 원발암인지 다른 장기에서 기원한 전이암인지 여부를 감별하고, 전이암이라면 어느 장기에서 유래하여 간으로 전이되었는지를 마이크로RNA 발현 프로파일 정보를 통해 예측하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

a) 원발부위를 알고 있는 간내 선암의 조직 시료로부터 하나 이상의 마이크로RNA의 발현 프로파일을 측정하는 단계;

b) 상기 측정된 발현 프로파일에서 유의적인 차이를 나타내는 마이크로RNA를 선별하는 단계;

c) 상기 선별된 마이크로RNA의 발현 프로파일을 각각의 원발부위에 따른 참조 발현 프로파일로 설정하는 단계;

d) 검체 시료로부터 상기 b) 단계에서 선별된 마이크로RNA의 발현 프로파일을 측정하는 단계; 및

e) 상기 d)단계의 발현 프로파일과 참조 발현 프로파일을 비교하는 단계를 포함하는 간내 선암의 원발부위를 예측하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 시료는 간내 선암, 원발부위 불명암, 원발암 또는 전이암을 가진 대상으로부터 수득되는 생물학적 시료로서 암에 대한 조직 시료이다. 이러한 조직 시료는 신선한 조직, 동결된 조직, 고정된 조직, 왁스 포매된 조직 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 조직일 수 있다.

본 명세서의 용어 ‘마이크로RNA(microRNA, miRNA)’는 21-25 nt의 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA(messengerRNA)의 3’-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질이다 (Cell. 2004 Jan 23;116(2):281-297). 또한 본 명세서에 기재된 miRNA의 넘버는 작은 RNA(small RNA)의 발견된 순서에 따라 부여된 번호로서, 예들 들어 miR-122는 122번째에 발견된 miRNA를 의미하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통용되는 용어이다 (http://www.mirbase.org).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 원발부위는 간내담도암, 대장암, 위암, 췌장암, 간세포암, 폐선암, 소세포폐암, 유방암, 자궁내막암, 난소암, 신장암, 전립선암, 갑상선암 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계에서 선별된 마이크로RNA는 본 명세서에 개시된 175개의 마이크로RNA로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 e) 단계의 발현 프로파일과 참조 발현 프로파일의 비교는 k-니어리스트 네이버(nearest neighbor), k-니어리스트 센트로이드(nearest centroid), 이진결정트리(binary decision tree) 또는 이들의 조합 알고리즘에 대입하여 이루어질 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 k-니어리스트 네이버는 1-니어리스트 네이버일 수 있다.

본 발명의 일실시예로서, 본 명세서 표 6에 기술된 Affymetrix microRNA microarray version 2에 이용된 probe set를 사용하여 구한 해당 검체의 175개 microRNA 발현양(signal)에 t-value 가중치를 곱한 값들을 합산하여 1-니어리스트 네이버 알고리즘에 의해 그 합이 가장 가까운 원발부위를 간전이병소의 원발부위로 판정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 이진결정트리는 본 명세서에 개시된 13개의 노드(node) 중에서 선택되는 노드에 포함되는 각각의 마이크로RNA들에 대한 검체 시료의 발현 프로파일 측정 결과를 k-니어리스트 네이버(nearest neighbor), k-니어리스트 센트로이드(nearest centroid) 알고리즘에 대입하여, 하기 표 7에 기재된 결과와 비교한 뒤 유사한 쪽의 리브(leave)를 따라 진행하는 방식으로 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예로서, 본 명세서 표 7에 열거된 각 13개 노드에 해당하는 마이크로RNA 각각의 발현양을 microarray 또는 RT-PCR 등의 방법을 통해 분석하고 (도 1a 참조), 해당 발현양에 t-value를 곱한 값을 합산하여 1-니어리스트 네이버 알고리즘에 의거 합이 유사한 쪽의 리브(leave)를 따라 진행하는 방식으로 간전이병소의 원발부위를 예측할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 t-value 가중치를 이용하여 k-니어리스트 네이버를 사용하는 방법은 이진결정트리 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 즉, 양 결과가 일치하는 경우에 원발부위가 더 정확히 예측된 것으로 판정할 수 있다.

본 발명의 k-니어리스트 네이버(nearest neighbor) 및 이진결정 트리(binary decision tree)-기반 마이크로RNA 분석은 조합하여 사용됨으로써 간에서 선암의 조직 기원을 효과적으로 정확하게 예측하였다. 뿐만 아니라, 원발성과 전이성 선암 사이의 명백한 구별은 이러한 두 방법 중 하나로도 가능하였다. 따라서 본 발명의 예측 방법은 임상 적용 가능성이 매우 높은 장점이 있다.

도 1a는 트레이닝세트 샘플에 대한 결정 트리 분석을 나타낸다. 0.001의 특징 선택(feature selection) P 컷오프에서 서로 다르게 발현되는 마이크로RNA들은 결정 트리의 각 노드(node)에서 조직 기원을 예측하는데 사용되었다. 노드(node) no. 6 (검정 파선으로 둘러진 곳)에 대한 샘플들은 도 1b와 1c에서 추가로 평가되었다.
도 1b는 913 마이크로RNA들에 기초한, 도 1a의 노드 no. 6에서 샘플에 대한 PCA 플롯을 나타낸다. 각 구형(sphere)은 각 샘플을 나타내고 ‘1-correlation’이 거리척도(distance metric)로 사용되었다. 담도암(빨간색으로 나타남), 위/췌장 암(초록색으로 나타남), 및 비-소화기관 암(파란색으로 나타남)은 차별적인 클러스터를 형성하였다.
도 1c는 트레이닝세트(left)에서 도 1a의 노드 no. 6 및 검증세트(METS_CH, right)에서 두 담도암 샘플의 마이크로RNA들에 대한 발현 프로파일을 나타낸다. 특징 선택 P<0.001로 소화기관 및 비-소화기관에서 간외암과 비교하여 담도암에서 과발현된 14개의 마이크로RNA (상부 패널), 및 6개의 저발현된 마이크로RNA(하부 패널). 담도암에서 miR-122의 명백한 과발현이 아마도 샘플에서 간세포 오염에 기인한 것으로 보이므로, 본 발명은 결정 트리의 노드 no. 6을 포함하는 차별적인 마이크로RNA들의 세트로부터 miR-122를 제외시키기로 결정하였다. 히트맵(heatmap)은 마이크로RNA 센터링과 함께 log₂-의사컬러 이미지(pseudocolor image)를 이용하여 생성하였다. 빨간색과 파란색은 마이크로RNA의 높고 낮은 발현을 표시한다. log₂-발현에 대한 스케일 바는 하단에 나타내었다.
도 2는 트레이닝세트와 검증세트(METS_CH, METS_CO, METS_OV)에서 각 노드의 선택된 차별적인 마이크로RNA들의 발현 프로파일이다. 차별적인 마이크로RNA들은 p<0.001에서 결정 트리의 각 노드에서 두 가지(branches) 사이에서 서로 다르게 발현되는 마이크로RNA들로서 정의되었다.
도 3은 CDX2, CK20 및 CK7 염색이 전이성 대장선암을 대표하지 않음을 나타낸다. No. 8과 No. 23은 CK20의 발현이 음성(negative)임을 나타낸다. No. 29는 CDX2의 불분명한 핵 발현 및 CK7의 강력한 세포질 발현ㄴ을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 마이크로RNA 마이크로어레이

샘플들은 2001년에서 2013년까지 국립암센터, 서울아산병원 및 순천향대학교병원의 암 환자로부터 외과수술 시에 수집하였다. 표본은 분석 시까지 액체질소에서 동결 상태로 유지하였다.

트레이닝세트(training set)는 선암(adenocarcinomas) 또는 선암과 구별되는 후보들(신경내분비 또는 혈액 암)인 14개 종양 타입의 201개 동결된 원발성 종양 샘플로 구성되었다. 원발성 종양들은 23 간내담도암(2001과 2007 사이에 획득), 29 대장선암(colorectal adenocarcinomas), 6 위선암(gastric adenocarcinomas), 19 췌장관선암(pancreatic ductal adenocarcinoma), 10 간세포암(hepatocellular carcinomas, HCCs), 26 폐선암(lung adenocarcinomas), 6 소세포폐암(small cell lung cancers, SCLCs), 23 유방선암(breast adenocarcinomas), 12 자궁내막의 자궁내막양 선암(endometrial endometrioid adenocarcinomas), 11 난소 장액성 선암(ovarian serous adenocarcinomas), 9 신세포암(renal cell carcinomas, RCCs), 8 전립선암(prostate adenocarcinomas), 11 갑상선 유두상 선암(thyroid papillary adenocarcinomas), 및 8 급성 백혈병(acute leukemias)을 포함하였다 (표 1). 검증세트(validation set)는 2 간내담도암(2011년에 획득) 및 대장(n=29) 및 난소(n=2)에서 기원한 31 간전이(liver metastases)로 구성되었다. 하기 표 1은 종양 샘플들의 임상병리학적 프로파일을 나타낸다.

10 μm-두꺼운 탑 슬라이드(thick top slide)는 헤마톡실린과 에오신으로 염색되었다. 상기 탑 슬라이드에 의해 가이드되어, 남아있는 조직을 절개하여(macrodissected) 비-종양성 기질성분(stromal components)을 잘라내었다. 절개되고, 동결된 조직 샘플(>50% tumor content)을 액체질소에서 기계적으로 뭉개고(crushed), 균질화하여(homogenized), 제조사의 설명서에 따라 TRI 시약을 이용하여 RNA 분리에 사용하였다. 그런 다음 총 RNA를 DNAase 처리하였다. 리보솜 RNA 밴드가 손상되지 않은 것을 확인한 후, 500 ng의 총 RNA에 대하여 poly-A 테일링(tailing)을 수행하였다. 플래쉬태그 바이오틴 HSR 라벨링 키트(FlashTag Biotin HSR Labeling Kit; Genisphere LLC, Hatfield, PA)는 DNA 리가아제를 이용하여 3’ 말단에 상업적인 바이오틴-표지된 덴드리머 분자(dendrimer molecule)를 연결하는데 사용하였다. 표지된 샘플들을 48℃에서 16시간 동안 miRNA 마이크로어레이(GeneChip miRNA 2.0 microarrays; Affymetrix, Santa Clara, CA)에 혼성화하고, 세척한 후, 스트렙토아비딘-PE 용액으로 염색한 다음, 스캔하였다. 상기 miRA 마이크로어레이는 miRbase version 15에 기초하며 131 생물체(organisms)의 15,644 성숙한 마이크로RNA 프로브 세트를 포함한다. 모든 cell files는 RMA(robust multiarray average)-정규화되었다. 별모양(star form) 마이크로RNA를 걸러낸 후, 913 인간 마이크로RNA를 사용하여 추가로 분석하였다.

실시예 2. 면역조직화학 분석

검증세트(validation set)의 전체 케이스를 페록시다아제 검출시스템(ImmPRESS peroxidase detection system; Vector Laboratories, MP-7401 and MP-7402)을 사용하여, CDX2, CK20, CK7 및 CA125를 검출하였다. 실험에 사용된 항체들은 다음과 같다: 마우스 단클론 항 CK7 항체 (1:100; Thermo scientific, MA1-06316), 토끼 단클론 항 CK20 항체 (1:100; Abcam, ab76126), 마우스 단클론 항 CDX2 항체 (1:100; BioGenex, MU392-UC), 및 마우스 단클론 항 CA125 (1:50; Thermo scientific, MA5-11579). 간략히 설명하면, 동결된 절편을 아세톤으로 10분간 고정하고, 3% 과산화수소(hydrogen peroxide)에서 10분간 담가(immersed), 내인성 페록시다아제 활성을 차단하였다. PBS에서 세척한 후, 상기 절편을 상기 키트에 제공된 정상 블로킹 혈청(normal blocking serum)에서 반응시켰다. 그런 다음, 상기 절편을 실온에서 희석된 일차항체들과 30분간 반응시켰다. 음성대조군은 일차항체를 빼고 희석제로 대체함으로써 수행되었다. 그 후 상기 절편을 페록시다아제(horseradish peroxidase)와 컨쥬게이트된 적절한 이차항체와 실온에서 30분간 반응시켰다. 이어서, 상기 절편을 ImmPact DAB substrate (Vector Laboratories, SK-4105)로 비색검출(colorimetri detection)하였다. 상기 슬라이드를 Mayer’s 헤마톡실린으로 10초간 카운터염색(counterstained)하였다. 면역조직화학적 평가는 임상정보를 알지 못하는 두 명의 병리학자에 의해 수행되었다. CDX2에 대한 핵 염색과, CK20, CK7, 및 CA125에 대한 세포질 염색이 종양세포에서 검출되었다. 양성으로 염색된 종양세포의 비율(percentage)에 따라 스코어를 3 그룹으로 분류하였다: 음성(negative), 5% 미만; 불분명(equivocal), 5%에서 50%; 양성(positive), 50% 이상.

실시예 3. 통계분석

BRB-어레이툴 소프트웨어 (version 4.3, NCI, Bethesda, MD)를 무감독 및 감독 분석을 수행하는데 사용하였다 (Simon R, et al. Cancer Inform 2007; 3:11-7). 주요요소분석(Principal component analyses, PCA)은 거리척도(distance metric)로서 1-correlation을 이용하여 수행되었다. 교차-검증된 오분류 확률(misclassification rate)은 트레이닝세트에서 1-니어리스트 네이버(1-nearest neighbor, 1-NN)에 대해 컴퓨터로 계산되었다. 본 발명자들은 트레이닝세트를 두 개의 서브세트(training and test)로 2:1(2-to-1) 비율로 랜덤하게 나눔으로써 원발성 종양에 대한 조직 기원을 예측하였고, 1-NN 분류기(classifier)를 랜덤 데이터세트에 적용하였다. 100 랜덤 트레이닝-테스트 분할(training to-test partitions)의 각각에 대해, 트레이닝세트에서 서로 다르게 발현된 마이크로RNA들이 테스트세트에서 조직 기원을 예측하는데 적용되었다. 예측의 중간 정확도(median accuracy)는 100 랜덤 데이터세트에서 결정되었다. 다음으로, 상기 1-NN classifier 및 트레이닝세트에서 종양 타입 중에서 서로 다르게 발현된 마이크로RNA들을 검증세트에서 샘플의 조직 기원을 예측하는데 적용하였다. 또한 이진결정트리(Binary decision tree) 분석은 조직 기원을 예측하기 위한 마이크로RNA 모델을 수립하는데 사용되었다. 가지들(branches)은 1-NN classifiers 및 두 가지 타입의 종양 사이에서 p<0.001로 서로 다르게 발현되는 마이크로RNA들을 이용하여 상기 결정 트리의 각 노드(node)에서 선택되었다 (도 1a).

실험결과 1. 1- 니어리스트 네이버(1- NN ) 예측

1a. 원발성 종양에 대한 조직 기원

분류 예측 분석은 초기에 2:1(2-to-1) 비율로 두 서브세트(training and test)에서 201 원발성 종양을 랜덤하게 나눔으로써 수행되어 종양 타입에 따라 서로 다른 발현을 나타내는 마이크로RNA 프로파일의 예측력을 평가하였다. 100 랜덤 트레이닝-테스트 분할의 각각에 대해, 상기 트레이닝세트로부터 얻은 마이크로RNA 프로파일을 1-NN 알고리즘을 이용하여 해당 테스트세트에서 샘플의 종양 타입을 예측하는데 적용하였다. 상기 1-NN은 그 예측 정확도가 교차-검증 과정 시 높기 때문에 선택되었다. p<10^-10에서 특징 선택 세트를 이용하여, 조직 기원 예측의 중간 정확도는 이전에 보고된 것(Meiri E, et al. Oncologist 2012; 17(6):801-12)과 동등한, 원발성 종양에 대한 100개의 랜덤하게 배치된(permuted) 데이터세트에서 88.1% (59 of 67)였다. 상기 예측에 사용된 차별적인(discriminatory) 마이크로RNA들의 중간 수(median number)는 152였다.

1b. 검증세트에 대한 조직-기원 예측

트레이닝세트에서 201 원발성 종양 중 서로 다르게 발현되는 마이크로RNA들이 검증세트에 적용될 때, 상기 예측 정확도는 10^-6 내지 10^-15 범위의 p-값에서 90.9% 내지 97.0%의 범위에 있었다 (표 2). 하기 표 2는 특징 선택(feature selection)을 위한 P 컷오프에 따라 조직 기원에 대한 1-NN predictor의 성과를 나타낸다.

상기 표 2의 p<10^-15에서 종양 타입들 중 서로 다르게 발현되는 175 마이크로RNA를 이용함으로써 (하기 표 6 참조), 검증세트 샘플의 93.9%(31 of 33)는 조직 기원에 대해 정확하게 확인되었다. 여기서, 2개의 오분류된 샘플이 있었다: 난소암전이(간내담도암으로 예측됨) 및 대장암전이(위암전이로 예측됨).

이러한 결과는 2001년 및 2007년 사이에 획득된 23 간내담도암이 트레이닝세트에 할당되고 2011년에 획득된 2 간내담도암이 검증세트에 할당되었을 경우에 얻은 것이었다. 오버피팅(overfitting)의 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 상기 트레이닝세트에 대한 간내담도암의 차이나는 수를 할당하고 동일한 1-NN 예측을 수행하였다 (at p<10^-15). 하기 표 3에서 볼 수 있듯이, 상기 전반적인 예측 정확도는 하나를 제외하고 모든 트레이닝-검증 할당 설계(training-to-validation allocation schemes)를 이용한 93.9% 보다 높았다. 이러한 결과는 본 발명의 마이크로RNA 프로파일이 간에서 선암에 대한 조직 기원을 강력하게 예측함을 의미한다.

실험결과 2. 결정 트리 분석( Decision tree analyses )

2a. 백혈병, 갑상선 및 전립선 암 , RCC 및 HCC (노드 no . 1-5)

본 발명의 마이크로RNA 프로파일의 임상적 사용 가능성을 높이기 위해, 본 발명자들은 유사한 설계의 일부 변형이 있는 분류에 기초한 이진 결정 트리(binary decision tree)도 적용하였다 (Meiri E, et al. Oncologist 2012; 17(6):801-12). 이러한 접근법에서, 조직 기원은 p<0.001에서 1-NN 알고리즘 및 두 가지(branches) 사이에서 서로 다르게 발현되는 마이크로RNA들을 이용하여, 각 노드(node)에서 두 가지(branches) 중 하나를 선택함으로써 할당된다. 특별 관리(special care)는 간전이에 대한 예측을 최적화하기 위한 것이다.

본 발명의 무감독(unsupervised) PCA 분석에 따르면, 백혈병, 갑상선 및 전립선 암, RCCs 및 HCCs는 그 자체가 별개의 클러스터(distinct cluster)를 형성한다 (데이터 미도시). 결정 트리 설계의 초기 단계에 따라, 별개의 마이크로RNA 프로파일을 갖는 이들 5개 종양 타입 각각은 각 노드로부터 갈라지는 두 그룹 사이에서 특징 선택(feature selection) p<0.001에서 서로 다르게 발현되는 마이크로RNA들을 이용하여, 샘플들의 나머지 부분으로부터 구별되었다 (도 1a). 결정 트리의 각 노드에서 차별적인 마이크로RNA들은 하기 표 7에 정리되어 있다.

결정 트리의 노드 no. 1에서, miR-181 패밀리는 선암과 비교하여 백혈병에서 매우 풍부하였다 (도 2) (Cichocki F, et al. J Immunol 2011; 187(12):6171-5). 노드 no. 2에서, miR-138과 miR-146b-5p는 갑상선-특이적이었다 (Zhang J, et al. Int J Med Sci 2013; 10(5):585-92). 노드 no. 3에서, miR-133a와 miR-133b는 전립선암에서 가장 풍부하였다 (Tao J, et al. Oncol Rep 2012; 27(6):1967-75). 노드 no. 4 및 no. 5에서, miR-204와 miR-122는 각각 RCCs 및 HCCs에서 가장 풍부하였다 (Mikhaylova O, et al. Cancer Cell 2012; 21(4):532-46; Saito Y, et al. Front Genet 2011; 2:66).

2b. 간내담도암 (노드 no . 6)

PCA 분석에 따르면, 소화기관 선암(담도암 및 위/췌장 암)은 (폐, 유방, 자궁내막 및 난소에서 기원한) 비-소화기관 선암과 차별적인 클러스터를 형성하였다 (도 1b). 단발성 병변(solitary lesions)이 원발성 종양으로 판명된 환자에서 발견되는 경우, 보통 간 생검(liver biopsy)을 수행하여 원발성과 전이성 간암을 구별하게 된다. HCCs와 달리, 간내담도암은 췌장, 위(stomach) 또는 대장(colon)으로부터 기원한, 종양들과 비슷한 선암이다. 치료 전략(국소 vs 전신 치료)에서의 차이를 감안하면, 두 전략 사이를 구별하는 것은 임상적으로 유의한 것이다. 따라서 상기 결정 트리의 no. 6(담도암-특이적 마이크로RNA)에 대하여 광범위한 조사를 수행하였다. 도 1c는 소화기관 및 비-소화기관의 담도암과 간외암(extrahepatic cancers) 사이에서 p<0.001로 서로 다르게 발현되는 20 마이크로RNA의 발현 프로파일을 도시한다 (표 4 참조).

miR-122와 miR-30a의 과발현 및 miR-200 패밀리(miR-141 및 miR-200c)의 저발현은 담도암의 특징을 나타내었다 (Govaere O, et al. Gut 2014; 63(4):674-85). miR-122의 발현은 간 조직 및 HCCs에서 특이적으로 높았으나 (Saito Y, et al. Front Genet 2011; 2:66), 담도암 세포주에서는 상대적으로 낮았다 (Meng F, et al. Gastroenterology 2006; 130(7):2113-29). 요컨대, 담도암에서 miR-122의 명백한 과발현은 아마 샘플에서 간세포(hepatocytes)를 오염시켰기 때문일 것이다. 따라서 본 발명자들은 노드 no. 6을 포함하는 차별적인 마이크로RNA들의 세트로부터 miR-122를 제외시키기로 결정하였다. miR-30 패밀리의 발현은 RCC에서 가장 높았으며, 다음으로 갑상선암이다. RCCs와 갑상선암은 제외하고, 소화기관 암 중 특히, 담도암은 가장 높은 수준의 miR-30 패밀리를 발현하였다. 이러한 결과는 제브라피쉬 유생(zebrafish larva)에서 miR-30a의 넉다운이 결함이 있는 담도형성(defective biliary morphogenesis)을 초래한다는 보고와 일치한다 (Hand NJ, et al. Gastroenterology 2009; 136(3):1081-90).

본 발명자들은 마이크로RNA 발현 프로파일에서 유사성이 높다고 알려진 (Sokilde R, et al. J Mol Diagn 2014; 16(1):106-15), 소화기관의 각각의 암으로부터 간내담도암을 구별할 수 있는 마이크로RNA 프로파일의 목록을 만들고자 하였다. 도 1c에서 볼 수 있듯이, 췌장암에 이어 위암이 마이크로RNA 프로파일에서 담도암과 가장 유사하였다. 췌장암과 비교하면, 담도암은 miR-122 (p<10^-7) 및 miR-331-5p (p=0.0005)를 과발현하였다. 또한 담도암은 miR-30a/30b/30c (p=0.007), miR-193a (p=0.007), 및 miR-455-5p (p=0.002)를 과발현하였다. 위암과 비교하면, 담도암은 miR-122 (p=0.0001), miR-193a-5p (p=0.0006), 및 miR-933 (p=0.0002)을 과발현하였다. 또한 miR-885 (p=0.002)와 miR-331-5p (p=0.003)의 발현은 위암에서 보다 담도암에서 더 높았다. 담도암에서 miR-30c 및 miR-30b의 과발현은 경계선상 유의성(borderline significance)이 있었다 (각각 p=0.02 및 0.038). 대장암과 비교하면, 담도암은 miR-30a (p<10^-7), miR-30d (p=2×10^-5), miR-30c (p=9×10^-5), miR-30b (p=0.0002), miR-122 (p<10^-7), miR-331 (p<10^-7), miR-193a (p=8×10^-7), miR-223 (p=5×10^-6), miR-455-5p (p=6×10^-6), miR-24 (p=3× 10^-5), miR-1250 (p=0.0004), miR-933 (p=0.005), 및 miR-2116 (p=0.001)의 과발현을 나타내었다. 한편, miR-20c는 췌장암, 위암 및 대장암과 비교하면 (각각 p=0.005, p=0.04, 및 p=2×10^-5) 담도암에서 저발현되었다.

miR-122, miR-30, miR-200, 및 miR-193과 같은, 이들 마이크로RNA의 일부는 이전 연구에서 담도 조직(biliary tissue)에 대한 마이크로RNA classifier에 포함되어 있긴 하지만 (Meiri E, et al. Oncologist 2012; 17(6):801-12), 본 발명의 결정 트리의 노드 no. 6을 포함하는 대부분의 마이크로RNA들은 신규한 담도암-특이적 마이크로RNA들이다. 가장 중요한 것은, 이들 담도암-특이적 마이크로RNA의 결합된 발현(combined expression)이 간에서 원발성과 전이성 선암 사이에서 정확한 구별을 가능하게 한다는 것이다.

2c. 소화기관 (노드 no . 7-9)

일단 원발성 선암의 가능성이 배제되면, 전이성 선암의 조직 기원을 결정하는 것은 체계적인 치료 계획을 선택하기 위한 다음 단계이다. 본 발명자들은 마이크로RNA 발현 프로파일에서 서로 유사하다고 알려진 (Sokilde R, et al. J Mol Diagn 2014; 16(1):106-15), 소화기관의 각 암에 대해 특이적인 마이크로RNA들을 확인하고자 하였다. 결정 트리의 노드 no. 7에서, miR-194와 miR-192는 대장암 및 위암에서 풍부하였다 (Schee K, et al. PLoS One 2013; 8(6):e66165). miR-1281은 대장암에서 가장 풍부하였으며, 위암을 포함한 다른 종양으로부터 대장암을 구별하였다. 노드 no. 8에서, miR-215는 상대적으로 위-특이적이었다. 노드 no. 9에서, miR-214는 췌장암에서 상대적으로 풍부하였다.

2d. 비-소화기관 (노드 no . 10-13)

PCA 분석에 따르면, 비-소화기관 암은 소화기관 암들과 차별적인 클러스터를 형성하였다. 폐 선암은 마이크로RNA 발현 프로파일에서 상대적으로 이질성(heterogeneous) 이었으며, 이는 이 질병의 마이크로RNA 발현의 이질성 및 돌연변이 프로파일에 대한 이전 보고(Kandoth C, et al. Nature 2013; 502(7471):333-9)와 일치하는 것이다. 상기 결정 트리의 노드 11에서, 갑상선-특이적인 마이크로RNA인, miR-138은 폐암에서도 상대적으로 풍부하였다. 결정 트리의 노드 no. 12에서, miR-196a는 유방암에서 풍부한 반면, miR-449a 및 miR-449b는 자궁내막암 및 난소암에서 일반적으로 풍부하였다 (Li Y, et al. Cancer Res 2010; 70(20):7894-904). miR-510은 상대적으로 난소-특이적이었다 (노드 no. 13).

2e. 검증세트에 대한 결정 트리의 적용

본 발명의 결정 트리를 검증세트에 적용하면, 예측 정확도는 90.9% (30 of 33)이었다. 두 대장암 전이 (노드 no. 7) 및 난소암 전이 (노드 no. 12)는 오분류되었다. 세 오분류 중 하나는 1-NN 예측으로부터 얻은 결과와 일치하였다. 1-NN 예측이 결정 트리 방법을 능가하지만, 결정 트리 방법은 특정 임상 세팅, 예들 들어 전이로부터 간내담도암의 차별적인 진단이 분석의 주요한 이유인 경우에서 유리한 점이 있을 수 있다. 본 발명은 두 방법을 결합하는 것이 조직 기원의 예측을 위한 가장 좋은 임상 전략일 수 있음을 제안한다. 본 발명의 검증세트에서, 30 샘플 (90.9%) 및 이들 30 중 29 샘플 (96.7%)에서 일치된 1-NN 및 결정 트리 predictor들은 조직 기원에 대해 정확하게 예측하였다.

본 발명은 검증세트에서 면역조직화학 염색을 수행하여 마이크로RNA-기반 분석이 전통적인 면역조직화학 방법을 보완하는 지를 평가하였다 (표 5).

CDX2+/CK20+/CK7- 면역표현형이 매우 특이적이고 대장 기원의 감수성 마커(sensitive marker)이므로 (Bayrak R, et al. Diagn Pathol 2012; 7:9), 이러한 표현형을 나타내는 29 전이성 암 중 26개는 높은 정확도에서 대장 기원인 것으로 예측될 수 있다. 이러한 29 샘플 중 3개는 CK20- 또는 CK7+ 또는 불분명한 CDX2 염색을 나타내었으며, 이는 이들의 경우가 대장 기원으로 명확하게 진단될 수 없음을 의미하였다 (도 3). 그러나 이들 3개의 경우는 마이크로RNA-기반 예측을 통해 대장 기원으로서 정확하게 예측되었다. 두 원발성 담도암 모두는 CK20-/CK7+/CDX2-/CA125- 면역표현형을 나타내었으며, 이는 대장, 난소 및 췌장 기원일 가능성이 낮음을 의미한다 (Dennis JL, et al. Clin Cancer Res 2005; 11(10):3766-72). 면역조직화학 결과는 간내담도암에 대한 특이적이 면역조직화학 마커들이 없기 때문에 최종 결정에 이를 수 없으나, 마이크로RNA-기반 분석은 그 기원을 정확하게 예측할 수 있다. 종합하면, 이러한 결과는 마이크로RNA 프로파일이 간전이에 대한 조직 기원의 예측에서 면역조직화학을 보완할 수 있음을 시사한다.

결론

본 발명의 1-NN 및 결정 트리-기반 마이크로RNA 분석은 두 예측이 일치될 경우 30 샘플 중 29 (96.7%)를 정확하게 예측함으로써, 간에서 선암의 조직 기원을 예측하는데 있어서 현저한 성과를 입증하였다. 더욱이, 원발성과 전이성 선암 사이의 명백한 구별은 이러한 두 방법 중 하나로 가능하였다. 이러한 목적에 따라, 결정 트리 분석을 1-NN에 추가함으로써 임상적 유용성의 가능성을 증가시킬 수 있다.

소화기관의 간외암들로부터 간내담도암의 정확한 확인 및 구별은 이전의 마이크로RNA 분석으로는 다소 어려웠다. 이전에 개발된 마이크로RNA 분석은 대부분의 간전이를 담도암으로 예측하였으므로, 간에서 원발성과 전이성 선암을 구별해 낼 수 없었다 (Sokilde R, J Mol Diagn 2014; 16(1):106-15). 담도암 및 췌장암의 상당한 부분(Appreciable fraction)이 이전에 수행된 연구에서 오분류되거나 췌장담도암(pancreatobiliary cancers)으로 불분명하게 예측되었다 (Meiri E, et al. Oncologist 2012; 17(6):801-12). 본 발명의 독특하고 간단한 방법은 전이성 선암으로부터 간내담도암을 구별하고 간전이에 대한 조직 기원을 예측하는데 있어서 이러한 이전의 마이크로RNA 분석을 능가하였다. 또한 본 발명은 몇몇 신규한 기관-특이적 마이크로RNA들을 동정하였다. miR-204의 RCC-특이성, miR-133의 전립선-특이성, miR-1281의 대장-특이성, 및 miR-215의 위-특이성이 그 예이다. 이러한 신규한 조직-특이적 마이크로RNA들을 포함하여, 비교적 다수의 마이크로RNA들의 사용이 높은 신뢰도로서 간에서 전이성 선암을 구별하는데 필요하였다. 신규한 조직-특이적 마이크로RNA의 발견이 동결된 조직 샘플의 사용으로 인해 부분적으로 가능했던 반면, 이전의 마이크로RA-기반 조직 기원 예측 분석은 포르말린-고정되고, 파라핀-포매된 샘플을 사용하였다. 그러나 본 발명은 조직 타입의 면에서 보면 검증세트의 좁은 스펙트럼에 의해 제한되었고, 이는 임상 세팅에서 적절한 동결 조직 샘플의 입수가능성에 달려 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 예측 정확도는 조직 기원에 대한 이전의 다른 어떤 예측 방법들 보다 더 높다.

보충 자료

하기 표 6은 특징 선택 p<10^-15에서 트레이닝세트에서 종양 타입에 따라 서로 다르게 발현되는 175 차별적인 마이크로RNA들의 발현 프로파일을 나타낸다.

또한, 하기 표 7은 특징 선택 p<0.001에서 결정 트리(decision tree)의 각 노드(node)의 두 가지(branches) 사이에서 서로 다르게 발현되는 차별적인 마이크로RNA들을 나타낸다.

Node no. 1
ProbeSet	P	t-value	Leukemia	Non- leukemia	Ratio
miR-142-5p_st	< 1e-07	13.1	14	3	5.5
miR-1291_st	< 1e-07	11.2	72	5	15.6
miR-766_st	< 1e-07	10.4	218	20	11.0
miR-551a_st	< 1e-07	8.5	30	4	8.0
miR-181a_st	< 1e-07	8.3	18545	3836	4.8
miR-181c_st	< 1e-07	8.0	1282	79	16.2
miR-128_st	< 1e-07	7.8	1017	147	6.9
miR-181b_st	< 1e-07	7.6	9599	1710	5.6
miR-4253_st	< 1e-07	6.7	92	13	7.3
miR-223_st	< 1e-07	6.5	1131	83	13.7
miR-466_st	< 1e-07	6.4	36	4	8.1
miR-3163_st	< 1e-07	6.2	6	3	2.0
miR-142-3p_st	< 1e-07	6.2	3	2	1.5
miR-181d_st	< 1e-07	6.2	1235	194	6.4
miR-550_st	< 1e-07	6.0	84	21	4.1
miR-3144-3p_st	< 1e-07	5.9	3	2	1.5
miR-1304_st	< 1e-07	5.6	4	2	1.7
miR-1201_st	< 1e-07	5.6	139	12	11.2
miR-146a_st	< 1e-07	5.6	6301	1061	5.9
miR-643_st	1.00E-07	5.5	3	2	1.6
miR-671-5p_st	1.00E-07	5.5	266	104	2.6
miR-548u_st	1.00E-07	5.5	6	3	2.1
miR-1273_st	2.00E-07	5.4	4	3	1.6
miR-663b_st	3.00E-07	5.3	191	26	7.4
miR-1323_st	3.00E-07	5.3	11	4	2.6
miR-578_st	4.00E-07	5.3	5	3	1.6
miR-652_st	4.00E-07	5.3	1425	519	2.7
miR-548i_st	4.00E-07	5.2	3	2	1.4
miR-512-3p_st	5.00E-07	5.2	7	3	2.3
miR-92a_st	7.00E-07	5.1	11644	5781	2.0
miR-627_st	7.00E-07	5.1	5	3	1.9
miR-3175_st	7.00E-07	5.1	510	76	6.8
miR-1273d_st	9.00E-07	5.1	59	14	4.3
miR-340_st	1.10E-06	5.0	10	4	2.8
miR-155_st	1.40E-06	5.0	5841	1731	3.4
miR-324-3p_st	1.40E-06	5.0	410	171	2.4
miR-936_st	1.60E-06	4.9	21	5	4.2
miR-19a_st	2.20E-06	4.9	428	76	5.7
miR-941_st	2.40E-06	4.9	50	11	4.6
miR-423-5p_st	3.10E-06	4.8	718	300	2.4
miR-3164_st	3.30E-06	4.8	3	2	1.5
miR-222_st	3.50E-06	4.8	10300	3699	2.8
miR-1972_st	4.50E-06	4.7	147	32	4.6
miR-140-3p_st	5.40E-06	4.7	3110	1266	2.5
miR-1275_st	7.20E-06	4.6	326	120	2.7
miR-3121_st	8.10E-06	4.6	5	3	1.7
miR-648_st	8.20E-06	4.6	8	5	1.7
miR-191_st	9.50E-06	4.5	14261	8707	1.6
miR-20b_st	1.12E-05	4.5	3895	1011	3.9
miR-25_st	1.13E-05	4.5	3354	1610	2.1
miR-2113_st	1.55E-05	4.4	3	2	1.4
miR-874_st	1.86E-05	4.4	293	104	2.8
miR-1263_st	1.89E-05	4.4	12	5	2.4
miR-1267_st	1.91E-05	4.4	4	3	1.5
miR-150_st	2.05E-05	4.4	4905	946	5.2
miR-130b_st	2.17E-05	4.4	1905	654	2.9
miR-3157_st	2.36E-05	4.3	5	3	1.8
miR-345_st	2.53E-05	4.3	921	269	3.4
miR-1285_st	2.77E-05	4.3	56	18	3.1
miR-18b_st	2.84E-05	4.3	441	88	5.0
miR-1246_st	2.86E-05	4.3	1280	183	7.0
miR-625_st	2.96E-05	4.3	793	213	3.7
miR-1272_st	4.98E-05	4.1	7	3	2.2
miR-26b_st	5.63E-05	4.1	357	111	3.2
miR-423-3p_st	5.97E-05	4.1	1449	777	1.9
miR-3162_st	6.01E-05	4.1	432	149	2.9
miR-939_st	6.44E-05	4.1	173	65	2.7
miR-16_st	7.06E-05	4.1	16430	10458	1.6
miR-17_st	7.52E-05	4.0	12323	5616	2.2
miR-548x_st	8.59E-05	4.0	9	4	2.1
miR-15a_st	8.87E-05	4.0	2396	673	3.6
miR-635_st	9.03E-05	4.0	5	3	1.8
miR-484_st	9.41E-05	4.0	148	40	3.7
miR-4323_st	0.0001042	4.0	6	3	1.8
miR-425_st	0.0001066	4.0	4786	2058	2.3
miR-106a_st	0.0001074	4.0	10737	4911	2.2
miR-3173_st	0.0001214	3.9	6	3	1.7
miR-221_st	0.0001227	3.9	9837	4510	2.2
miR-342-5p_st	0.0001301	3.9	545	121	4.5
miR-363_st	0.0001377	3.9	462	43	10.7
miR-1286_st	0.0001405	3.9	3	2	1.3
miR-20a_st	0.000149	3.9	11788	4107	2.9
miR-641_st	0.0001898	3.8	14	5	3.0
miR-769-5p_st	0.0002095	3.8	85	27	3.1
miR-153_st	0.0002145	3.8	6	3	2.1
miR-140-5p_st	0.0002284	3.8	319	67	4.8
miR-645_st	0.0002453	3.7	2	2	1.2
miR-32_st	0.0002542	3.7	5	3	1.7
miR-4287_st	0.0002571	3.7	4	2	1.5
miR-603_st	0.0002977	3.7	6	3	1.9
miR-197_st	0.0003073	3.7	361	142	2.6
miR-1202_st	0.0004909	3.5	184	49	3.7
miR-4288_st	0.0005353	3.5	6	4	1.5
miR-339-5p_st	0.0005691	3.5	510	253	2.0
miR-30e_st	0.0006175	3.5	959	253	3.8
miR-454_st	0.0006507	3.5	74	21	3.5
miR-320e_st	0.0006597	3.5	556	296	1.9
miR-3160_st	0.0006926	3.4	3	2	1.3
miR-4312_st	0.0007002	3.4	4	3	1.6
miR-4327_st	0.000808	3.4	15	7	2.2
miR-371-5p_st	0.0008556	3.4	12	5	2.2
miR-1826_st	0.0008699	3.4	17592	11142	1.6
miR-3166_st	0.0008912	3.4	4	3	1.3
miR-378c_st	0.0009819	3.3	1262	502	2.5
let-7b_st	0.0007858	-3.4	12644	19051	0.7
miR-196a_st	0.0007247	-3.4	3	39	0.1
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miR-214_st	< 1e-07	-16.7	7	1589	0.0

Node no . 2
ProbeSet	P	t- value	Thyroid	Non - thyroid	Ratio
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Node no . 3
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miR-181b_st	< 1e-07	-6.1	481	1720	0.3

Node no . 4
ProbeSet	P	t- value	RCC	Non - RCC	Ratio
miR-204_st	< 1e-07	15.2	336	4	76.9
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miR-3129_st	4.70E-06	4.7	3	2	1.4
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miR-210_st	9.50E-06	4.6	2739	522	5.3
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miR-203_st	1.00E-06	-5.1	37	456	0.1
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miR-182_st	< 1e-07	-7.3	163	1709	0.1
miR-375_st	< 1e-07	-8.6	3	797	0.0
miR-200c_st	< 1e-07	-9.3	92	8617	0.0

Node no . 5
ProbeSet	P	t- value	HCC	non - HCC	Ratio
miR-885-5p_st	< 1e-07	11.3	911	22	42.3
miR-122_st	< 1e-07	8.3	25197	24	1048.9
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miR-1265_st	< 1e-07	5.7	5	3	1.7
miR-616_st	1.00E-07	5.6	5	3	1.9
miR-204_st	2.00E-07	5.4	15	4	4.0
miR-455-3p_st	3.00E-07	5.4	4005	919	4.4
miR-139-5p_st	1.60E-06	5.0	408	61	6.7
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miR-412_st	7.20E-06	4.6	3	2	1.6
miR-675_st	2.01E-05	4.4	81	19	4.2
miR-496_st	6.80E-05	4.1	3	2	1.4
miR-1295_st	7.11E-05	4.1	6	3	2.1
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miR-640_st	0.0009057	3.4	4	3	1.4
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miR-886-3p_st	0.0001321	-3.9	56	260	0.2
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miR-203_st	9.00E-06	-4.6	64	520	0.1
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miR-183_st	< 1e-07	-5.8	31	270	0.1
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miR-182_st	< 1e-07	-6.9	299	1912	0.2
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miR-200b_st	< 1e-07	-14.4	60	2021	0.0

Node no . 6
ProbeSet	P	t- value	CholangioCa	Non - cholangioCa	Ratio
miR-30a_st	3.70E-06	4.8	2285	722	3.2
miR-455-5p_st	4.35E-05	4.2	68	22	3.1
miR-193a-3p_st	4.85E-05	4.2	114	41	2.8
miR-331-5p_st	6.85E-05	4.1	50	22	2.3
miR-223_st	7.72E-05	4.1	217	75	2.9
miR-933_st	0.0001388	3.9	60	34	1.8
miR-1265_st	0.0003595	3.7	3	3	1.3
miR-1250_st	0.0003624	3.6	4	3	1.4
miR-24_st	0.0003918	3.6	15369	12430	1.2
miR-2116_st	0.000599	3.5	5	3	1.5
miR-137_st	0.0006122	3.5	3	2	1.3
miR-193a-5p_st	0.0006878	3.5	475	269	1.8
miR-885-5p_st	0.0009685	3.4	40	19	2.1
miR-652_st	0.0002969	-3.7	369	583	0.6
miR-200b_st	0.0002571	-3.7	1244	2199	0.6
miR-191_st	0.0001981	-3.8	7398	9470	0.8
miR-425_st	6.00E-06	-4.7	1451	2521	0.6
miR-141_st	2.00E-07	-5.4	83	588	0.1
miR-200c_st	< 1e-07	-9.6	2464	14573	0.2

Node no . 7
ProbeSet	P	t- value	Colorectal	Non - colorectal	Ratio
miR-552_st	< 1e-07	14.6	71	3	24.5
miR-192_st	< 1e-07	9.8	11276	457	24.7
miR-194_st	< 1e-07	9.6	15900	929	17.1
miR-215_st	< 1e-07	8.4	100	6	17.8
miR-4270_st	< 1e-07	7.7	2195	840	2.6
miR-1915_st	< 1e-07	7.5	11077	4747	2.3
miR-1825_st	< 1e-07	7.4	43	12	3.5
miR-622_st	< 1e-07	7.2	23	5	5.1
miR-4281_st	< 1e-07	7.1	1962	772	2.5
miR-1281_st	< 1e-07	7.0	260	60	4.3
miR-1202_st	< 1e-07	6.7	160	41	4.0
miR-2861_st	< 1e-07	6.6	9170	4261	2.2
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miR-940_st	< 1e-07	6.3	40	17	2.4
miR-3162_st	< 1e-07	6.3	336	132	2.5
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miR-3187_st	< 1e-07	6.0	73	24	3.0
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miR-3185_st	< 1e-07	5.9	2169	859	2.5
miR-663_st	< 1e-07	5.7	1663	820	2.0
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miR-3198_st	0.0000026	4.9	5	3	1.5
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miR-1826_st	0.0000157	4.5	14700	10776	1.4
miR-1308_st	0.0000158	4.5	5990	2468	2.4
miR-203_st	0.0000276	4.3	1367	435	3.1
miR-3196_st	0.0000374	4.3	6483	4206	1.5
miR-144_st	0.0000396	4.3	2	2	1.2
miR-548l_st	0.0000483	4.2	3	2	1.2
miR-548a-3p_st	0.0000487	4.2	14	7	1.9
miR-559_st	0.0000754	4.1	4	3	1.4
miR-3152_st	0.0000826	4.1	4	3	1.4
miR-3181_st	0.0000852	4.1	6	4	1.5
miR-581_st	0.0000867	4.1	2	2	1.1
miR-3125_st	0.0000953	4.0	2	2	1.2
miR-18b_st	0.0001124	4.0	192	78	2.5
miR-19a_st	0.0001392	3.9	138	61	2.3
miR-1280_st	0.0001593	3.9	223	134	1.7
miR-3161_st	0.0001776	3.9	3	2	1.2
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miR-4327_st	0.0002042	3.8	11	6	1.7
miR-3155_st	0.0002099	3.8	2	2	1.2
miR-1231_st	0.0003984	3.6	210	115	1.8
miR-200a_st	0.000399	3.6	2162	1018	2.1
miR-936_st	0.0004431	3.6	9	5	1.9
miR-1272_st	0.0004745	3.6	5	3	1.5
miR-623_st	0.0005573	3.5	5	4	1.4
miR-1273d_st	0.0006269	3.5	23	13	1.8
miR-603_st	0.0006336	3.5	4	3	1.4
miR-544_st	0.0006415	3.5	2	2	1.1
miR-3173_st	0.0007308	3.5	4	3	1.4
miR-3141_st	0.0007363	3.5	646	419	1.5
miR-921_st	0.0007428	3.5	4	3	1.3
miR-429_st	0.0009342	3.4	83	35	2.4
miR-766_st	0.0009973	-3.4	13	21	0.6
miR-593_st	0.0009397	-3.4	2	2	0.9
miR-4278_st	0.000934	-3.4	2	2	0.9
miR-148b_st	0.0009155	-3.4	66	123	0.5
miR-139-3p_st	0.0008505	-3.4	3	5	0.6
miR-323-3p_st	0.000803	-3.4	2	4	0.7
miR-150_st	0.0007124	-3.5	530	1175	0.5
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miR-486-3p_st	0.0007015	-3.5	3	5	0.6
miR-503_st	0.0006377	-3.5	76	150	0.5
miR-433_st	0.0005887	-3.5	5	14	0.4
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let-7d_st	< 1e-07	-6.9	5504	8113	0.7
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miR-361-3p_st	< 1e-07	-6.9	5	14	0.4
miR-363_st	< 1e-07	-6.9	7	55	0.1
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miR-330-3p_st	< 1e-07	-7.1	23	70	0.3
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miR-92b_st	< 1e-07	-7.8	134	349	0.4
miR-197_st	< 1e-07	-7.9	54	166	0.3
let-7b_st	< 1e-07	-8.1	13397	21059	0.6
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miR-205_st	< 1e-07	-8.4	4	286	0.0
miR-342-3p_st	< 1e-07	-8.5	1125	3003	0.4
miR-1271_st	< 1e-07	-8.7	18	89	0.2
miR-628-3p_st	< 1e-07	-9.2	11	52	0.2
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let-7a_st	< 1e-07	-10.0	9060	14604	0.6
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miR-1301_st	< 1e-07	-10.1	37	152	0.2
miR-99b_st	< 1e-07	-10.4	1197	3152	0.4
let-7e_st	< 1e-07	-10.6	1882	5620	0.3
miR-125a-3p_st	< 1e-07	-10.7	15	74	0.2
miR-331-3p_st	< 1e-07	-10.7	38	191	0.2
miR-125b_st	< 1e-07	-10.9	1952	7152	0.3
miR-342-5p_st	< 1e-07	-11.5	21	182	0.1
let-7c_st	< 1e-07	-11.7	7239	13476	0.5
miR-99a_st	< 1e-07	-12.8	208	1896	0.1

Node no . 8
ProbeSet	P	t- value	Gastric	Non - gastric	Ratio
miR-552_st	< 1e-07	8.9	30	3	11.9
miR-215_st	< 1e-07	8.1	322	4	73.3
miR-192_st	1.90E-06	5.1	10527	376	28.0
miR-194_st	2.50E-06	5.0	15761	780	20.2
miR-133a_st	7.14E-05	4.1	13	4	3.2
miR-548t_st	7.74E-05	4.1	2	2	1.3
miR-584_st	8.73E-05	4.1	75	12	6.5
miR-527_st	0.0002543	3.8	3	2	1.4
miR-597_st	0.000273	3.8	2	2	1.3
miR-1297_st	0.0004832	3.6	2	2	1.2
miR-500_st	0.0005154	3.6	448	188	2.4
miR-767-3p_st	0.0005597	3.6	3	2	1.4
miR-492_st	0.0005849	3.6	15	4	3.4
miR-561_st	0.0006018	3.5	2	2	1.3
miR-105_st	0.000628	3.5	18	3	5.9
miR-767-5p_st	0.0008927	3.4	16	3	5.9
miR-99b_st	0.0004564	-3.6	1801	3263	0.6
miR-205_st	2.66E-05	-4.4	4	373	0.0

Node no . 9
ProbeSet	P	t- value	Pancreatic	Non - pancreatic	Ratio
miR-1247_st	< 1e-07	10.0	26	4	6.3
miR-215_st	< 1e-07	8.7	22	3	7.7
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miR-194_st	< 1e-07	7.9	4974	496	10.0
miR-192_st	< 1e-07	7.8	2851	230	12.3
miR-132_st	7.00E-07	5.3	957	469	2.0
miR-7_st	1.35E-05	4.6	57	10	5.6
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miR-433_st	2.65E-05	4.4	44	10	4.2
miR-552_st	3.75E-05	4.3	4	2	1.6
miR-485-5p_st	4.48E-05	4.3	39	10	3.8
miR-584_st	5.29E-05	4.2	28	9	3.0
miR-31_st	5.89E-05	4.2	2853	617	4.5
miR-4301_st	6.10E-05	4.2	3	2	1.3
miR-409-5p_st	0.0001147	4.0	53	18	2.9
miR-134_st	0.0001355	4.0	196	72	2.7
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miR-127-3p_st	0.0003258	3.7	1059	424	2.5
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miR-96_st	0.0005245	-3.6	4	8	0.4
miR-3200_st	0.0004199	-3.7	7	18	0.4
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miR-4316_st	0.00017	-3.9	2	3	0.8
miR-92a_st	9.96E-05	-4.1	4128	5865	0.7
miR-103_st	8.08E-05	-4.1	8347	10428	0.8
miR-3192_st	5.96E-05	-4.2	2	3	0.7
miR-363_st	3.92E-05	-4.3	17	78	0.2
miR-17_st	3.56E-05	-4.3	3152	5598	0.6
miR-449c_st	3.19E-05	-4.4	2	28	0.1
miR-449a_st	2.14E-05	-4.5	2	32	0.1
miR-106a_st	1.95E-05	-4.5	2653	4917	0.5
miR-449b_st	1.62E-05	-4.5	3	34	0.1
miR-769-3p_st	7.30E-06	-4.7	6	15	0.4
miR-187_st	2.80E-06	-5.0	9	93	0.1
miR-1301_st	2.50E-06	-5.0	92	173	0.5
miR-425_st	3.00E-07	-5.5	1326	2757	0.5
miR-345_st	3.00E-07	-5.5	151	356	0.4
miR-183_st	2.00E-07	-5.6	126	439	0.3
miR-25_st	2.00E-07	-5.6	998	1929	0.5
miR-182_st	1.00E-07	-5.7	931	2750	0.3
miR-205_st	< 1e-07	-6.7	22	745	0.0
miR-200c_st	< 1e-07	-6.8	10011	15956	0.6
miR-93_st	< 1e-07	-6.8	2356	5033	0.5
miR-191_st	< 1e-07	-7.0	6787	10655	0.6

Node no . 10
ProbeSet	P	t- value	SCLC	Non - SCLC	Ratio
miR-216a_st	< 1e-07	19.0	655	3	238.1
miR-217_st	< 1e-07	17.6	1540	3	526.3
miR-216b_st	< 1e-07	13.3	606	7	90.9
miR-486-3p_st	< 1e-07	11.0	69	4	16.1
miR-124_st	< 1e-07	8.9	69	3	23.8
miR-486-5p_st	< 1e-07	8.5	4679	147	32.3
miR-873_st	< 1e-07	7.7	7	2	3.2
miR-297_st	< 1e-07	7.2	12	2	5.0
miR-301b_st	< 1e-07	7.0	6	2	2.6
miR-592_st	< 1e-07	6.7	41	3	12.5
miR-130b_st	< 1e-07	6.7	3024	658	4.5
miR-153_st	< 1e-07	6.5	7	2	2.9
miR-93_st	1.00E-07	5.8	12270	4672	2.6
miR-610_st	3.30E-06	5.0	4	2	2.0
miR-18a_st	3.40E-06	5.0	2735	441	6.3
miR-1255b_st	3.50E-06	5.0	4	2	2.0
miR-1251_st	4.00E-06	5.0	6	2	2.7
miR-1246_st	7.20E-06	4.8	1495	141	10.6
miR-185_st	9.90E-06	4.7	4590	1744	2.6
miR-548b-5p_st	1.22E-05	4.7	3	2	1.7
miR-25_st	1.30E-05	4.7	4240	1807	2.3
miR-129-5p_st	1.56E-05	4.6	15	5	3.1
miR-106a_st	1.91E-05	4.6	11326	4587	2.5
miR-7_st	2.46E-05	4.5	94	9	10.8
miR-1201_st	3.99E-05	4.4	49	8	5.9
miR-345_st	6.34E-05	4.2	925	329	2.8
miR-17_st	8.25E-05	4.2	11915	5256	2.3
miR-138_st	0.0001011	4.1	265	19	13.7
miR-95_st	0.0001108	4.1	11	4	3.2
miR-137_st	0.0001266	4.0	3	2	1.6
miR-219-2-3p_st	0.0001554	4.0	5	2	2.0
miR-1273d_st	0.0001881	3.9	34	12	2.7
miR-20a_st	0.0002404	3.9	9708	3614	2.7
miR-3148_st	0.0002564	3.8	8	3	2.2
miR-575_st	0.0002661	3.8	16	6	2.8
miR-1250_st	0.0002683	3.8	5	3	1.7
miR-3157_st	0.0002761	3.8	4	3	1.7
miR-3175_st	0.000278	3.8	273	63	4.3
miR-375_st	0.0002812	3.8	10355	586	17.5
miR-302d_st	0.0003888	3.7	4	2	2.0
miR-20b_st	0.0005042	3.6	2712	911	2.9
miR-4295_st	0.0005332	3.6	3	2	1.4
miR-3122_st	0.0006521	3.6	4	3	1.6
miR-451_st	0.0007141	3.5	1134	135	8.3
miR-2110_st	0.0008008	-3.5	34	90	0.4
miR-30b_st	0.0007584	-3.5	563	1622	0.3
miR-146a_st	0.0007277	-3.5	244	1049	0.2
miR-532-3p_st	0.0005045	-3.6	95	259	0.4
miR-146b-5p_st	0.000489	-3.6	324	1116	0.3
miR-26a_st	0.0004079	-3.7	13190	16418	0.8
let-7e_st	0.0003807	-3.7	3371	6121	0.5
miR-4286_st	0.0003307	-3.8	23	65	0.4
miR-146b-3p_st	0.000328	-3.8	4	17	0.2
miR-27b_st	0.000266	-3.8	649	2617	0.2
miR-224_st	0.0002541	-3.8	3	52	0.1
miR-4298_st	0.0001639	-4.0	260	670	0.4
miR-455-5p_st	8.71E-05	-4.1	4	28	0.1
miR-195_st	8.70E-05	-4.1	982	3291	0.3
miR-193a-5p_st	8.24E-05	-4.2	100	367	0.3
miR-422a_st	5.17E-05	-4.3	46	229	0.2
miR-30c_st	2.11E-05	-4.5	588	2129	0.3
miR-193b_st	2.05E-05	-4.5	216	1021	0.2
miR-339-5p_st	2.02E-05	-4.5	88	282	0.3
miR-4269_st	9.10E-06	-4.8	3	18	0.2
miR-452_st	7.40E-06	-4.8	3	46	0.1
miR-23b_st	6.10E-06	-4.9	6064	10913	0.6
miR-148a_st	5.00E-06	-4.9	47	363	0.1
miR-125a-5p_st	4.80E-06	-4.9	1572	5266	0.3
miR-193a-3p_st	4.70E-06	-4.9	7	56	0.1
miR-886-5p_st	3.40E-06	-5.0	25	158	0.2
miR-4317_st	9.00E-07	-5.4	6	18	0.4
miR-199b-5p_st	4.00E-07	-5.5	3	30	0.1
miR-214_st	< 1e-07	-6.0	212	1879	0.1
miR-21_st	< 1e-07	-6.0	237	1688	0.1
miR-125b_st	< 1e-07	-6.0	2373	7384	0.3
miR-145_st	< 1e-07	-6.1	1566	6933	0.2
miR-30a_st	< 1e-07	-6.1	117	1116	0.1
miR-29a_st	< 1e-07	-6.2	613	2965	0.2
miR-143_st	< 1e-07	-6.2	1373	5067	0.3
miR-203_st	< 1e-07	-6.3	24	514	0.0
miR-100_st	< 1e-07	-6.3	174	1751	0.1
miR-27a_st	< 1e-07	-6.9	373	3494	0.1
miR-28-5p_st	< 1e-07	-6.9	128	762	0.2
miR-34a_st	< 1e-07	-7.1	119	1355	0.1
miR-28-3p_st	< 1e-07	-7.1	128	547	0.2
miR-574-3p_st	< 1e-07	-7.1	294	1521	0.2
miR-152_st	< 1e-07	-7.6	73	778	0.1
miR-24_st	< 1e-07	-8.8	5875	12748	0.5
miR-455-3p_st	< 1e-07	-9.5	72	1030	0.1
miR-199b-3p_st	< 1e-07	-9.7	185	4333	0.0
miR-199a-5p_st	< 1e-07	-9.8	74	1691	0.0
miR-199a-3p_st	< 1e-07	-10.0	234	4207	0.1
miR-23a_st	< 1e-07	-15.0	3948	13421	0.3

Node no . 11
ProbeSet	P	t- value	Lung	Non - lung	Ratio
miR-326_st	< 1e-07	6.3	14	5	2.7
miR-133a_st	1.10E-06	5.3	6	3	2.0
miR-628-3p_st	2.00E-06	5.2	91	40	2.3
miR-146a_st	7.20E-06	4.9	1951	738	2.6
miR-574-5p_st	1.22E-05	4.7	233	139	1.7
miR-138_st	1.42E-05	4.7	52	11	4.7
miR-146b-3p_st	1.93E-05	4.6	32	12	2.7
miR-652_st	2.38E-05	4.5	890	489	1.8
miR-28-3p_st	2.67E-05	4.5	713	471	1.5
miR-28-5p_st	3.79E-05	4.4	954	671	1.4
miR-29a_st	4.88E-05	4.3	4241	2422	1.8
miR-146b-5p_st	6.04E-05	4.3	1816	847	2.1
miR-1_st	6.70E-05	4.2	3	2	1.3
miR-4288_st	7.16E-05	4.2	5	4	1.3
miR-338-5p_st	8.23E-05	4.2	24	7	3.3
miR-185_st	9.06E-05	4.2	2290	1495	1.5
miR-452_st	9.65E-05	4.1	99	30	3.3
miR-3065-5p_st	0.0001793	4.0	43	13	3.2
let-7d_st	0.0001865	3.9	9670	7503	1.3
miR-3065-3p_st	0.0002569	3.9	20	6	3.2
miR-4306_st	0.0002821	3.8	48	29	1.6
miR-222_st	0.0002851	3.8	4645	2750	1.7
miR-642_st	0.0003093	3.8	3	2	1.3
miR-139-5p_st	0.0003673	3.7	132	56	2.3
miR-211_st	0.000384	3.7	3	2	1.3
miR-24_st	0.0003964	3.7	14118	12034	1.2
miR-216b_st	0.000405	3.7	9	6	1.6
miR-34a_st	0.000416	3.7	1965	1098	1.8
miR-150_st	0.0004227	3.7	2103	766	2.7
miR-133b_st	0.0004428	3.7	4	3	1.6
miR-126_st	0.0007192	3.5	5139	3591	1.4
miR-223_st	0.0007275	3.5	124	47	2.6
miR-513a-3p_st	0.0007388	3.5	2	2	1.1
miR-4256_st	0.0007596	3.5	2	2	1.1
miR-23b_st	0.0008092	3.5	12252	10222	1.2
miR-2276_st	0.0006735	-3.6	6	9	0.7
miR-760_st	0.0006179	-3.6	7	11	0.6
miR-198_st	0.0005882	-3.6	3	5	0.7
miR-129-5p_st	0.0004792	-3.7	4	6	0.6
miR-498_st	0.0001391	-4.0	6	13	0.4
miR-1299_st	9.97E-05	-4.1	3	6	0.5
miR-149_st	9.30E-05	-4.1	87	248	0.4
miR-665_st	8.50E-05	-4.2	18	38	0.5
miR-191_st	6.20E-05	-4.3	9260	11879	0.8
miR-1972_st	5.52E-05	-4.3	19	41	0.5
miR-3198_st	2.62E-05	-4.5	3	4	0.7
miR-1296_st	2.46E-05	-4.5	6	13	0.5
miR-93_st	2.42E-05	-4.5	3627	5391	0.7
miR-615-3p_st	2.10E-05	-4.6	7	25	0.3
miR-3148_st	1.67E-05	-4.6	3	4	0.7
miR-1308_st	9.70E-06	-4.8	1483	4204	0.4
miR-196b_st	6.30E-06	-4.9	4	22	0.2
miR-425_st	5.40E-06	-4.9	1867	3377	0.6
miR-675_st	4.90E-06	-5.0	11	34	0.3
miR-188-5p_st	2.20E-06	-5.2	11	29	0.4
miR-371-5p_st	8.00E-07	-5.4	4	7	0.6
miR-663b_st	2.00E-07	-5.7	12	36	0.3
miR-885-5p_st	< 1e-07	-6.2	11	35	0.3
miR-10b_st	< 1e-07	-7.7	82	531	0.2

Node no . 12
ProbeSet	P	t- value	Breast	Non - breast	Ratio
miR-196a_st	< 1e-07	8.4	522	9	58.7
miR-193a-5p_st	< 1e-07	8.1	737	223	3.3
miR-615-3p_st	< 1e-07	7.3	68	9	7.6
miR-193b_st	< 1e-07	6.9	2141	638	3.4
miR-342-3p_st	< 1e-07	6.4	4686	1949	2.4
miR-342-5p_st	4.00E-07	6.0	306	94	3.3
miR-423-5p_st	9.10E-06	5.0	377	190	2.0
miR-214_st	1.54E-05	4.9	2993	1013	3.0
miR-1280_st	1.87E-05	4.8	197	101	1.9
miR-181b_st	3.17E-05	4.6	2689	1568	1.7
miR-181a_st	3.74E-05	4.6	5480	3224	1.7
miR-4298_st	0.000191	4.1	903	500	1.8
miR-185_st	0.0002546	4.0	1896	1179	1.6
miR-1260b_st	0.0002622	4.0	128	74	1.7
miR-574-5p_st	0.0002823	3.9	176	110	1.6
miR-193a-3p_st	0.0003384	3.9	118	46	2.5
miR-766_st	0.0003554	3.9	26	13	1.9
miR-3195_st	0.0004174	3.8	228	113	2.0
miR-513c_st	0.0009793	-3.5	2	15	0.1
miR-188-5p_st	0.0009476	-3.5	21	40	0.5
miR-514b-5p_st	0.0008468	-3.6	4	30	0.1
miR-451_st	0.0007406	-3.6	67	247	0.3
miR-218_st	0.000723	-3.6	3	6	0.4
miR-3144-5p_st	0.0005587	-3.7	2	3	0.8
miR-30a_st	0.000513	-3.8	832	1814	0.5
miR-490-5p_st	0.0004708	-3.8	3	4	0.7
miR-221_st	0.000418	-3.8	2615	4697	0.6
miR-204_st	0.000378	-3.9	3	7	0.5
miR-324-5p_st	0.0003457	-3.9	275	494	0.6
miR-551a_st	0.0002935	-3.9	3	8	0.4
miR-641_st	0.0001868	-4.1	3	6	0.6
miR-509-3-5p_st	0.0001592	-4.1	2	32	0.1
miR-95_st	0.0001202	-4.2	3	5	0.5
miR-3200_st	0.0001194	-4.2	11	31	0.4
miR-19b_st	9.83E-05	-4.3	1850	3546	0.5
miR-34c-3p_st	7.42E-05	-4.4	13	69	0.2
miR-200b_st	7.34E-05	-4.4	1250	2603	0.5
miR-200c_st	7.11E-05	-4.4	14797	19515	0.8
miR-27b_st	7.03E-05	-4.4	1682	3295	0.5
miR-34b_st	5.14E-05	-4.5	3	11	0.3
miR-509-3p_st	2.90E-05	-4.7	3	68	0.1
miR-502-5p_st	1.59E-05	-4.8	4	11	0.4
miR-200a_st	1.33E-05	-4.9	620	1832	0.3
miR-362-3p_st	8.50E-06	-5.0	4	11	0.4
miR-23b_st	7.60E-06	-5.1	8887	11757	0.8
miR-429_st	3.10E-06	-5.3	20	84	0.2
miR-449c_st	3.10E-06	-5.3	8	243	0.0
miR-335_st	1.50E-06	-5.6	27	94	0.3
miR-449b_st	5.00E-07	-5.9	10	314	0.0
miR-449a_st	3.00E-07	-6.0	8	358	0.0
miR-34c-5p_st	2.00E-07	-6.2	7	101	0.1
miR-130a_st	< 1e-07	-7.7	532	1875	0.3

Node no . 13
ProbeSet	P	t- value	Endometrial	Ovarian	Ratio
miR-196b_st	< 1e-07	8.3	120	3	35.4
miR-1280_st	0.0003267	4.3	139	72	2.0
miR-3196_st	0.0004018	4.2	5961	2956	2.0
miR-154_st	0.0008618	-3.9	10	47	0.2
miR-510_st	0.0008217	-3.9	3	57	0.0
miR-654-3p_st	0.0007116	-4.0	8	37	0.2
miR-376a_st	0.0006762	-4.0	3	21	0.2
miR-548q_st	0.0006094	-4.0	4	12	0.4
miR-99b_st	0.0003842	-4.2	2869	4601	0.6
miR-130a_st	0.0002941	-4.3	1236	2954	0.4
miR-422a_st	0.0002283	-4.4	188	667	0.3
miR-149_st	0.0001675	-4.6	96	322	0.3
miR-221_st	0.0001556	-4.6	3052	7517	0.4
miR-485-3p_st	9.36E-05	-4.8	3	9	0.4
miR-378c_st	8.81E-05	-4.8	356	1309	0.3
miR-378_st	7.26E-05	-4.9	667	2189	0.3
miR-222_st	4.31E-05	-5.1	1933	6015	0.3
miR-551a_st	< 1e-07	-8.7	3	20	0.2

Claims

a) 간내담도암, 대장암, 위암, 췌장암, 간세포암, 폐선암, 소세포폐암, 유방암, 자궁내막암, 난소암, 신장암, 전립선암, 갑상선암 및 백혈병으로 구성된 원발부위를 알고 있는 간내 선암의 201개 원발성 종양의 조직 시료로부터 마이크로 RNA의 발현 프로파일을 측정하는 단계;
b) 상기 측정된 마이크로RNA 발현 프로파일 전체를 비교하여 간내 선암 유형 별로 유의적인 차이를 나타내는 하기 표 6에 기재된 마이크로RNA를 선별하는 단계;
c) 상기 a)단계의 201개 원발성 종양으로 구성된 트레이닝 세트를 2:1 비율의 두 서브 세트(트레이닝 및 테스트)로 랜덤하게 분할하고 상기 b)단계에서 선별된 마이크로RNA를 1-니어리스트 네이버(1-nearest neighbor) 알고리즘에 적용하여 참조 발현 프로파일로 설정하는 단계;
d) 검체 시료로부터 상기 b) 단계에서 선별된 마이크로RNA의 발현 프로파일을 측정하는 단계; 및
e) 상기 d) 단계의 발현 프로파일과 참조 발현 프로파일을 비교하는 단계를 포함하는 간내 선암의 원발부위를 예측하는 방법으로,
상기 e) 단계의 발현 프로파일과 참조 발현 프로파일의 비교는 k-니어리스트 네이버(nearest neighbor), k-니어리스트 센트로이드(nearest centroid), 이진결정트리(binary decision tree) 또는 이들의 조합 알고리즘에 대입하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.

[표 6]
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 k-니어리스트 네이버는 1-니어리스트 네이버인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 이진결정트리는 하기 표 7에 기재된 13개의 노드(node) 중에서 선택되는 노드에 포함되는 각각의 마이크로RNA들에 대한 검체 시료의 발현 프로파일 측정 결과를 k-니어리스트 네이버(nearest neighbor), k-니어리스트 센트로이드(nearest centroid) 알고리즘에 대입하여, 하기 표 7에 기재된 결과와 비교한 뒤 유사한 쪽의 리브(leave)를 따라 진행하는 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
[표 7]
제 1항에 있어서, 상기 k-니어리스트 네이버에 따른 결과와 이진결정트리에 따른 결과가 일치하는 경우에 원발부위가 더 정확히 예측된 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.