CN102321625A - 从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群及制备方法和用途，是以核糖核酸酶T1、脱氧核糖核酸酶I、核糖核酸酶III中至少二者的混合液，以噬杀质粒的酵母总RNA为底物制得的小分子双链RNA群。可用于制备防癌、抗癌及抗病毒保健品。本发明制备方法简便，易操作。

Description

从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群的制备方法及用途。

背景技术

Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。

目前，在哺乳动物及人类中已经发现的人TIRs家族成员有11个。根据染色体的位置、基因结构和氨基酸序列，人的TLRs受体可以分为5个亚科，即TLR2，TLR3，TLR4，TLR5和TLR9。TLR2亚科有TLR1，TLR2，TLR6和TLR10；TLR9亚科有TLR7，TLR8和TLR9；TLR3，TLR4和TLR5各自形成一个亚科。

TLR如同天然免疫的眼睛，监视与识别各种不同的疾病相关分子模式(PAMP)，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。其中TLR4可以识别革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)，还可识别宿主坏死细胞释放的热休克蛋白(heatshockproteins，HSP)，体内类肝素硫酸盐和透明质酸盐降解的多糖部分以及局部的内源性酶的级联活化反应也可激活TLR4。TLR2的配体较TLR4的广泛，包括脂蛋白，脂多肽，脂壁酸(LTA)阿拉伯甘聚糖(LAM)及酵母多糖等。TLR5可以识别鞭毛蛋白，鞭毛蛋白是目前发现的TLR5的惟一配体。具有鞭毛蛋白的L型细菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门菌等可被TLR5识别。TLR7识别咪喹啉家族低分子量的咪唑莫特、R848和R847等。TLR9识别细菌的CpGDNA(含有胞嘧啶-鸟嘌呤模体的未甲基化DNA片段，)，激活B细胞和APC的免疫刺激特性。

TLR3特异识别病毒复制的中间产物双链RNA，从而激活NFκB和干扰素IFNβ前体。DoyleSE等证实，抗TLR3单克隆抗体能抑制成纤维细胞IFNβ的产生。ChristopherA等证实TLR3还具有调控鼻病毒对人支气管细胞感染的能力，这也说明了TLR3在宿主抵抗活病毒中发挥重要的作用。TLR3表达于免疫细胞和某些非免疫细胞如皮肤角质化细胞、纤维母细胞和肺上皮细胞等，近年来发现人肿瘤组织中也有TLR3表达。TLR3配体双链RNA能直接激活自然杀伤细胞，增强抗原特异性CD8+T细胞应答，促进树突状细胞的抗原呈递激活。

双链RNA也能通过激活多条信号转导途径，即：诱生干扰素(IFN)、激活双链RNA激活蛋白激酶(PKR)、激活2′，5′A合成酶(2′，5′oligoadenylate synthetase)、抑制蛋白质合成、刺激前列腺素E的合成、促进白细胞的分化、促进巨噬细胞、NK细胞及特异性细胞毒T淋巴细胞的活性，诱导抗原呈递细胞产生各种细胞因子，抑制化学致突变剂的作用，恢复细胞间的接触抑制等。

从肿瘤生长和转移的的内环境而言，均依赖于丰富的血管形成，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以引起肿瘤血管生成，并导致肿瘤组织的快速生长。TLR3配体双链RNA能通过刺激体内干扰素生成，发挥抗肿瘤血管生成的作用，是抑制肿瘤的生成与转移的另一个重要因素。

双链RNA作为体内干扰素(IFN)诱生剂而言经济而实惠。从植物、微生物到不同种类的动物，其细胞内的dsRNA组份都具有干扰素诱生活性。目前干扰素已经用于治疗许多慢性病毒性疾病和肿瘤，但基本上都是使用基因工程干扰素或从人的细胞组织培养中经诱生、纯化而生产的干扰素制品。前者不仅价格昂贵，而且一般只含有单一亚型，抗病毒效果不尽完全；组织细胞培养干扰素价格亦较昂贵，而且经常存在批间差别、外源性污染和纯度等问题，这些外源性干扰素反复使用还经常会出现抗干扰素抗体，从而大大降低了干扰素再使用的效果。以天然dsRNA为干扰素诱生剂直接用于机体，在体内诱生的自身干扰素是广谱的，而且双链RNA是免疫调节剂(immune modulator)，已经证实双链RNA还可诱生其他一些细胞因子。因此，双链RNA作用于机体以后的生物学活性远远超出了单纯的干扰素诱生活性，而且自身干扰素在体内不会产生抗体，因此可表现出更好的治疗效果。

TLR3激动剂是不需要大分子(长链)dsRNA的，小分子dsRNA完全可以有效的激活TLR3。人们早就利用人工合成的双链RNA聚合物-聚肌胞(Poly I:C；由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多核苷酸链)作为免疫佐剂已应用到某些肿瘤的辅助性免疫治疗。由于Poly I:C的急性毒性较大，且非天然品，故不适合用于保健品类产品的的开发。近年来也证实：人工合成小分子dsRNA可以作为TLR3有效的激动剂而抗血管新生等(WG Cho，PNAS 2009)。由于dsRNA作为配体激活TLR3为广谱的(何序列度可以作为配体而激活TLR3)，只要满足功能性长度19-25bp即可作激活TLR3受体(ME Kleinman，Nature 2008)，但原料造价昂贵，每克达数万元，目前无法满足大规模产业化的要求。

天然酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。最常提到的酵母为酿酒酵母(也称面包酵母)(，Saccharomyces cerevisiae)，自从几千年前人类就用其发酵面包和酒类，在全球范围都被认定为食品。酵母菌属于单细胞真核生物。大多数酵母菌在生存竞争中都有相互嗜杀特性。具有这种特性的酵母为嗜杀酵母。其遗传物质基础为这种酵母细胞核外具有自我复制能力的双链RNA嗜杀质粒。利用天然酵母菌中的双链RNA(dsRNA)为原料，将其制备为小分子dsRNA作为TLR3配体(激动剂)，激活人体各种组织细胞膜表面的TLR3发挥其局部及提高全身免疫力用于防癌、抗癌、抗病毒保健品开发具有广阔的使用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方法简便的从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群及制备方法和用途。

本发明的技术解决方案是：

一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群，其特征是：是以核糖核酸酶T1、脱氧核糖核酸酶I、核糖核酸酶III中至少二者的混合液，以噬杀质粒的酵母总RNA为底物制得的小分子双链RNA群。

所述小分子双链RNA的长度为19-25bp。

所述嗜杀质粒的酵母至少含有如下之一的嗜杀质粒dsRNA：大分子dsRNA、中等分子dsRNA。

一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群的制备方法，其特征是：以核糖核酸酶T1、脱氧核糖核酸酶I、核糖核酸酶III中至少二者的混合液，以嗜杀质粒的酵母总RNA为底物，反应制得小分子双链RNA群。

一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群在制备防癌、抗癌及抗病毒保健品中的应用，是作为通过TLR3激活下游细胞活性物质或作为抑制动脉环内皮细胞增生能力的物质。

发明原理：

在嗜杀酵母细胞中，有两种核外双链RNA所编码的蛋白质和嗜杀现象有关：一种是分子量约为2.5X10⁶道尔顿的大分子双链RNA(Large dsRNA，简称LdsRNA，长度约为4.5kb)，占90％以上；另一种是分子量约为1～1.4X10⁶道尔顿的中等分子双链RNA(MediumdsRNA，简称MdsRNA，长度约为1.8kb)，占6％左右。两者的总和约占嗜杀酵母细胞全部核酸的0.1％。虽然这两种大、中分子的dsRNA可以作为Toll样受体3(TLR3)的激动剂，但生物利用度不高。最新的研究表明，长度为19～25bp的小分子dsRNA即可以作为TLR3的配体，有效的激活TLR3而发挥其应有的生理功能(ME Kleinman，Nature 2008)。利用酵母小分子dsRNA TLR3的激动剂开发新一代的天然健康产品不但可以使酵母天然的大分子及中分子dsRNA生物利用率提高～20倍，而且更加安全(理论上普遍认为，分子量越大越易引起过敏反应)。

本发明以嗜杀酵母细胞总体RNA为底物，以核糖核酸酶T1(RNase T1)与III型核糖核酸酶(RNase III)及脱氧核糖核酸酶1(DNase 1)三种生物工具酶为手段，完成如下的反应：

1.)DNase 1仅消化DNA而对RNA没有消化作用，用来消化嗜杀酵母细胞总体RNA抽提中的DNA污染；

2.)RNase T1仅消化消化嗜杀酵母细胞总体RNA中的单链RNA(ssRNA)：包括核糖体RNA(rRNA)；信使RNA(mRNA)以及转运RNA(tRNA)。保留反应液中嗜杀质粒大、中分子dsRNA(LdsRNA和MdsRNA)进行下一步反应；

3.)RNaseIII由于仅作用于dsRNA，以LdsRNA和MdsRNA进行限制性切割成19～25bp的小分子dsRNA。

实施中，反应体系核酸酶组合如如下通式样：

通式-1：酶混合液同时含有X+Y+Z

“X”代表DNase 1的任何浓度；“Y”代表RNaseT1的任何浓度；“Z”代表RNaseIII(或Dicer酶)的任何浓度，以“鸡尾酒”形式同时加入到反应体系中。

通式-2：X+Y-＞Z

即先加DNase 1和RNaseT1，灭活后，在反应体系中再加RNaseIII(或Dicer酶)。

通式-3：X-＞Y+Z

即先加DNase 1，灭活后，在反应体系中再加和RNaseT1和RNaseIII(或Dicer酶)“鸡尾酒”(酶混合液)。

通式-4：X-＞Y-＞Z

DNase I；RNaseT1及RNaseIII(或Dicer酶)分别入到反应体系中，每加一种酶前，先将前一种酶灭活。

以上各种实施方式所得到的19-25bp的小分子dsRNA群，可以作为TLR3的配体激活人体各种组织细胞膜表面的TLR3，发挥其局部及提高全身免疫力，起防癌、抗癌、抗病毒的等作用。其用途在于开发如下新一代的天然健康产品：

1、皮肤贴片用于提高全身免疫力，防癌、抗癌、抗病毒的等。

2、局部冲洗液可以对口腔、阴道、膀胱等器官的癌症及病毒的防治作用。

3、呼吸道喷雾剂可以防治鼻腔、气管，肺癌症与病毒疾病。

4、防病毒眼药水。

5、口服液或胶囊，提高局部及全身免疫力起到防癌、抗癌、抗病毒的作用。

6、其他等。

本发明制备方法简便，易操作。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是三种RNA酶(RNase1、RNaseT1及RNaseA)对ssRNA和dsRNA消化作用的电泳分析(20％聚丙烯凝胶)图。

图1中：行列：“ss”和”ds”分别为合成的“21bp单链RNA“和“21bp双链RNA”消化前样品；行列：1、3、5以ssRNA为底物消化后标品；行列：2、4、6以dsRNA为底物消化后标品。结果显示：RNaseI和RNaseA对ssRNA和dsRNA均有消化作用(行列：1、2、5、6)；而RNase T1仅对ssRNA有消化作用(行列1)，对dsRNA无明显作用(行列4)。

图2是三种RNA酶(RNaseI、RNaseT1及RNaseA)对酵母小分子总RNA消化作用的电泳分析(1％琼脂糖凝胶)图。

图2中：行列M为小分子Marker(NEB公司)；行列0：酵母小分子总RNA(内含各种ssRNA和dsRNA；秋之友生物技术公司产品)；行列：A、B、C分别为RNaseI、RNaseT1及RNaseA消化后样品。结果显示：RNaseI和RNaseA对全部RNA(ssRNA和dsRNA)均有消化作用(行列：A和C)；而RNase T1仅对ssRNA有消化作用，对dsRNA则无消化作用(行列B)。

图3是酿酒酵母的总RNA 1％琼脂糖凝胶电泳图。

图3中：电泳条带从上至下为：

DNA(酵母染色体DNA)；

LdsRNA  (酵母嗜杀质粒的大分子双链RNA)；

28SrRNA和MdsRNA(酵母嗜杀质粒的中分子双链RNA)的重叠带；

18SrRNA；

tRNA和5SrRNA的重叠带。

行列1：常温下离心；行列2：置于4℃离心。

图4是酿酒酵母总RNA经DNaseI和RNase T1处理后LdsRNA和MdsRNA的1％琼脂糖凝胶电泳图。

图5是酿酒酵母总RNA经DNase1、RNase T1及RNaseIII混合液消化后的电泳图(20％聚丙烯凝胶)。

图5中：行列1：dsRNA长度标示样品；行列2：小分子dsRNA群(21～23bp)。

图6是pNF-κB-TA-luc质粒图。

图7是各组之间萤火虫荧光素酶的RLU值海参荧光素酶的RLU的比值图。

图8是主动脉环血管向外生长迁出抑制试验显微镜观察图。

图8中：(A)酵母小分子dsRNA群处理；(B)Avastin处理(阳性对照)；C.5％葡萄糖处理(阴性对照)。如图所示：与阴性对照比较，酵母小分子dsRNA群与Avastin对血管环向外生长迁出受到明显的抑制。

图9是各处理组动脉环内皮细胞向外生长迁出的节点数统计学分析结果图。

图9中：每组6个动脉环分别进行单独评分，然后对各组评分的均数进行比较。如图所示：酵母小dsRNA群处理组和阳性对照(Avastin)组均有显著抑制动脉环内皮细胞增生的能力，其差异有显著的统计学意义(**P＜0.01)。

具体实施方式

主要仪器：

超净工作台(SW-CJ-2F苏州净化设备厂)；75L高压蒸气灭菌器(上海博讯实业有限公司)；低温冰箱(-80℃，DF-U4086S，日本三洋)；恒温水浴箱(Labnet D1200，深圳赛泰克)；高速低温离心机(5415c，Eppendorf，德国)；电热鼓风干燥箱(DZF-6050，上海新苗)；电子天平(OHAUS，美国)；电泳仪(Bio-rad，美国)；凝胶成像系统(Biosens，美国)；相差显微镜(OLYMPUS，日本)；全自动显微镜数码摄像系统(OL YMPU S，日本)；荧光显微镜(50i，NIKKON，日本)；去离子水装置(密理博中国有限公司)；紫外分光光度计及分析工作站(岛津Shimadazi，日本)；加样器(Biohit，芬兰)；二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技，美国)；蛋白质电泳装置及转移系统(Bio-rad，美国)。

一般试剂：

胰化蛋白胨及酵母提取物(上海生工)；琼脂糖及琼脂粉(大连宝生物工程公司)；RISO^TM RNA提取试剂(百奥迈科)；DNA MarkerDL2000Ladder DNA marker(Takara，日本)；溴化乙锭、琼脂糖、SD S、TEMED、丙烯酰胺、N，N-二甲基双丙烯酰胺、MTT、DTT、DMSO和Poly(I:C)(Sigma，美国)；DEPC(Merk，德国)；IMDM培养基为(Hyclone，美国)；新生牛血清(杭州四季青公司)。

实施例1

单、双链RNA消化试验

实验目的旨在观察三种RNA酶(RNaseT1；RNaseI和RNaseA)以ssRNA和dsRNA以及高复性的天然酵母总RNA为底物的消化作用，挑选出本发明的最佳组合酶选。

1主要试剂和材料

1.1主要试剂：三种RNA酶购于Fermentas公司(中国代理)，其中：RNaseT1为1000,000U/mL；RNaseI，10,000U/mL；RNaseA，10mg/mL。DNaseI(5000U/mL)购于Takara日本。

1.2主要材料：热带假丝酵母小分子总RNA(秋之友生物科技；保存号为：CGMCC No.3558。酵母总RNA出厂时已经不完全降解成小分子。本实验用以观察RNA酶对其中高复性ssRNA与dsRNA消化结果)；化学合成RNA Oligo(上海生工生物)，合成序列如下：

Oligo代号        序列(5’→3’)

ss-UP    正义    AGAGAGAAAGUAGAGAAGGGC

ss-DN    反义    GCCCUUCUCUACUUUCUCUCU

(其中RNA碱基：U为尿嘧啶，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤，A为腺嘌呤)。本实验的双链(ds)RNA为上述两条单链(ss)RNA Oligo退火而成；取ss-UP作单链(ss)RNA实验。

2.ssRNA及dsRNA的RNA酶消化实验：

RNA酶消化的反应系如下：20μL的液中含有1μL(1μg)RNA；1μLRNA酶；2μL 10XTE buffer，16μL无菌水。37℃反应30min，加2μLEDTA(250mM)中止反应，72℃加热20min灭活酶活性。各取51μL电泳分析。并用取1μL酵母dsRNA加入1XTE缓冲液99μL(1OO倍稀释)，紫外分光光度计检测OD260及OD280比值(此值在1.8～2.0之间为双链RNA)。

3.结果分析：

三种RNA酶(RNaseI、RNaseT1、RNaseA)中，仅RNaseT1对化学合成的单一ssRNA(图-1)和混杂在酵母总RNA中ssRNA(图-2)均有选择性的消化作用，保全的dsRNA在胶图上清晰可见；RNaseI和RNaseA则消化所有的单、双链RNA。

RNaseT1消化后的酵母RNA产物经紫外分光光度计下测得OD260及OD280比值为1.88，证实为dsRNA。

实施例2

1.酵母菌培养：将冻存的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeAS21416，购于中国科学院微生物所菌种保藏中心)按1-3％浓度接种于3ml YPD液体培养基(IOg酵母提取物；20g胰蛋白胨；20g葡萄糖；加水至1000mL)中，于33℃下振荡过夜，培养至对数生长后期。将该菌悬液以1∶50的比例接种于100mL YPD液体培养基中，33℃振荡培养2-3h至OD600达0.45-0.55，中止培养。加1％蜗牛酶(北京惠宝联化科技有限公司)于培养液，于30℃振荡反应1h。

2.酵母总RNA的提取：取酵母菌5000离心10min，弃上清收集菌体沉淀物。酵母菌沉淀物用百奥迈科公司RISO^TM RNA提取液(朱远源；中国专利号ZL01113523.9)提取液提取酵母总体RNA，离心(12000rpm)10min沉淀总RNA，用1xTE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA；pH 7.4)溶解，电泳鉴定(图3)。粗品中含有各种核酸条带：DNA；LdsRNA；28SrRNA和MdsRNA(重叠)；18SrRNA；tRNA和5SrRNA(重叠)。其中28S；18S；5S rRNA以及tRNA为ssRNA(单链RNA)。

实施例3

酵母总RNA的DNaseI与RNase T1混合液消化

1.RNaseT1与DNase 1(厂家同实施例1)混合液按1∶0.001(V∶V)混合。酶混合液消化的反应系如下：200μL的液中含有20μL(20μg)RNA；10μL RNaseT1与DNaseI酶混合液；20μL 10XTE buffer，150μL无菌水。37℃反应1h，加20μL EDTA(250mM)中止反应，72℃加热20min灭活酶。取2X5μL电泳分析(两泳道平行重复鉴定)。并用取1μL酵母dsRNA加入99μL的1xTE缓冲液(100倍稀释)，紫外分光光度计检测OD260及OD280比值(此值在1.8～2.0之间为双链RNA)。

2.电泳分析消化产物：

酿酒酵母总RNA经DNaseI和RNaseT1处理后消化产物电泳结果如(图-4)所示，4.5kb LdsRNA和1.8kb MdsRNA。无DNA及其他单链RNA所见。

3.紫外分光光度计检测：测得OD260及OD280比值为1.9，证实为dsRNA。

实施例4

酵母总RNA的DNase 1与RNaseT1及RNAseIII混合液消化

1.主要试剂和材料：RNaseIII(为美国NEB产品；1,300U/mL)能在含有锰离子的反应缓冲液下，将较长双链RNA切割成一组由21-23bp组成的小分子dsRNA。10X RNaseIII反应缓冲液(500mMTris-HCl，10mM DTT，200mM MnCl₂；pH 7.5)。RNaseT1和DNaseI(同前)。无RNA酶污染的肝糖(上海瑞齐生物科技)。

2.RNaseT1、RNaseIII及DNase1混合液配置：比例为1∶0.5∶0.001(V∶V∶V)。

3.酶混合液消化的反应系：100μL的液中含有10μL(1.0μg)RNA；5μL三酶混合液；10μL 10X RNaseIII反应缓冲液，75μL无菌水。37℃反应2h，加20μL EDTA(250mM)中止反应。

4离心沉淀消化产物：加入1/10体积的3M NaOAc(pH5.5)，2μL无RNA酶污染的肝糖和3体积90％的冰乙醇，于-70℃条件下放置30分钟或-20℃条件下放置2小时。以14,000rpm的速度离心15分钟。去掉上清，沉淀中加入2体积80％的乙醇，室温温育10分钟，离心5分钟，清空离心管中液体。空气干燥沉淀物。加入40μL无菌水溶解RNA。

5.电泳分析消化产物：酿酒酵母总RNA经RNaseT1、RNaseIII及DNaseI混合液消化产物电泳结果如(图-5)所示，酵母小分子dsRNA群主要分布在21-23bp。

6.紫外分光光度计检测：取1μL酵母dsRNA加入99μL的1TE缓冲液(100倍稀释)，紫外分光光度计检测OD260及OD280比值，测得该值为1.8，证实为dsRNA。

实施例5

检测酵母小分子dsRNA群介导的TLR3对NFκB靶向激活

1.原理：dsRNA能够介导TLR3激活NF-κB，导致IFN-γ等细胞因子的分泌。本实验通过检测酵母小分子dsRNA群处理SMCC7721细胞后的NF-κB活性，来检测其小分子dsRNA群对TLR3的激活能力。实验以报道的Poly(I:C)作为阳性对照。用于检测NFκB转录活性水平的报告基因质粒为pNF-κB-TA-luc，可以高灵敏度地检测NFκB的激活水平。本实验通过将含有NF-κB结合位点的pNF-κB-TA-luc质粒(图-6)转染SMCC7721细胞。pNF-κB-TA-luc质粒在NF-κB结合位点的下游有报告基因Luciferase，激活的NF-κB能够与该质粒的NF-κB结合位点结合，从而诱导Luciferase的表达。

2.材料与仪器：人肝癌细胞株SMMC7721购于美国Sciencell。pNF-κB-TA-Luc和Renilla(海参)荧光素酶报告基因质粒、胎牛血清(FBS)购自美国Clontech，脂质体转染试剂Lipofectamine^TM2000购自美国Gibco公司，双荧光素酶检测试剂盒(dual luciferase assay kit)与生物发光检测仪luminometer购自美国Promega。

3.细胞培养与NF-κB相对活性测定：人肝癌细胞株SMMC7721行细胞常规培养于含10％FBS的DMEM培养液中(美国Invitrogen)。取对数生长期的细胞，按4.0×10⁴/mL接种于96孔板，每孔接种200μL，继续培养24h。根据依照Lipofectamine转染试剂的操作指南，将pNF-κB-TA-luc与Renilla荧光素酶报告基因质粒瞬时共转染到SMMC7721细胞中，Renilla荧光素酶报告基因作为内参。转染后6h更换新鲜培养基，同时在培养中分别进行如下处理以刺激细胞(分为4组，每组12孔)：每孔加20μL(2μg)Poly(I:C)(阳性对照组；n＝12)；20μL 5％葡萄糖(阴性对照组；n＝12)；20μL(2μg)化学合成的小分子dsRNA(ss-UP/ssDN；n＝12)和20μL(2μg)酵母小分子dsRNA(n＝12)。继续培养24h后，NF-κB的活性用双荧光素酶检测试剂盒根据厂家操作指南在生物发光检测仪(luminometer)上进行检测。

4.结果：各组之间萤火虫荧光素酶的相对发光值(relative lightunit，RLU)海参荧光素酶的RLU的比值如图-7所示。经单因素方差分析，酵母小分子dsRNA群与合成的单序列小dsRNA之间无显著差异(P＞0.05)；此两组荧光素酶的比值较Poly(I:C)阳性对照组及阴性对照组明显增高，存在统计学的显著差异(**P＜0.001)，表明：酵母小dsRNA(群)较Poly(I:C)更有效的通过TLR3激活NF-κB的活性。

实施例6

动脉环内皮细胞生长

1.溶液配制

1.1纤维蛋白原溶液：纤维蛋白原溶解于MCDB131无血清培养液中，质量浓度3g/L。

1.2牛凝血酶溶液：牛凝血酶溶解于灭菌的蒸馏水中，浓度为50NIHU/mL；

1.3D-Hanks液：氯化钠8.0g，磷酸氢二钠(NaZHP04.H2O)0.06g，氯化钾0.4g，磷酸二氢钾0.06g，碳酸氢钠0.35g溶解于三蒸水1000mL中，高温灭菌后4℃备用。

2实验方法

2.1取材：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠，大剂量2％戊巴比妥钠麻醉断头处处死，将处死后的大鼠浸入75％酒精中，放入超净台。无菌条件下切取胸主动脉，立即放入D-Hanks液中，在解剖显微镜观察下，用眼科手术剪及镊子小心地去除血管外纤维和脂肪组织，切成1mm长的动脉环，置D-Hanks液中冲洗数次备用，48孔板每孔加入10uL 50NIH U/mL牛凝血酶溶液，然后加入0.4mL的3g/L纤维蛋白原溶液，立即垂直放人动脉环，使其沉于底部正中部位。大约10min，纤维蛋白凝固。预实验过程中，在孔中加入含有不同浓度胎牛血清的MCDB131培养液，在培养液中加入抑制纤维蛋白水解的6一氨基己酸150ug/mL，每3天换液一次。放入培养箱中培养动脉环，隔天观察动脉环血管生成的情况并计数。血管生长的分枝顶点被认为分枝形成。

2.1计数：新生血管生长迁出的分枝算作为一个“节点”，代表新的血管形成(图8)。根据预实验结果，选择含5％血清的MCDB131培养基培养大鼠主动脉环。实验分为3组：阴性对照组用含5％血清的MCDB131培养基，阳性对照组用含5％血清的MCDB131培养基+阿瓦斯汀(Avastin；美国罗氏公司)10μg/mL培养，酵母小dsRNA组用5％血清的MCDB131培养基+酵母小dsRNA群(10μg/mL)培养，方法同前述。隔天计数新生血管数。实验重复3次。

3.实验结果

按照动脉环外内皮细胞生长迁出的节点数对各组进行评分，每组有6个动脉环分别单独评分，然后对各组评分的均数进行比较。实验结果表明：酵母小dsRNA群的投与组和阳性对照的Avastin组均有显著抑制动脉环内皮细胞增生的能力(图9)。单因素方差分析表明酵母小dsRNA群的投与组与5％葡萄糖对照组存在显著差异(P＜0.01)。

Claims (6)

1. 一种从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群，其特征是：以核糖核酸酶T1、脱氧核糖核酸酶I、核糖核酸酶III 中至少二者的混合液，以嗜杀质粒的酵母总RNA为底物制得的小分子双链RNA群。

2. 根据权利要求1所述的从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群，其特征是：所述小分子双链RNA的长度为19-25bp。

3. 根据权利要求1所述的从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群，其特征是：所述嗜杀质粒的酵母至少含有如下之一的嗜杀质粒dsRNA： 大分子dsRNA 、中等分子dsRNA。

4. 一种权利要求1所述的从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群的制备方法，其特征是：以核糖核酸酶T1、脱氧核糖核酸酶I、核糖核酸酶III 中至少二者的混合液，以嗜杀质粒的酵母总RNA为底物，反应制得小分子双链RNA群。

5. 一种权利要求1所述的从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群在制备防癌、抗癌及抗病毒保健品中的应用。

6. 根据权利要求5所述的从酵母中制备的小分子双链核糖核酸群在制备防癌、抗癌及抗病毒保健品中的应用，其特征是：是作为通过TLR3激活下游细胞活性物质或作为抑制动脉环内皮细胞增生能力的物质。

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