KR20230074829A

KR20230074829A - 내염성 유산균, 내염성 유산균의 배양 방법, 및 면역 부활제

Info

Publication number: KR20230074829A
Application number: KR1020237016509A
Authority: KR
Inventors: 토시히코 쿠마자와; 아츠히사 니시무라; 노리유키 아사이; 타카히로 아다치
Original assignee: 이치비키 가부시키가이샤; 고쿠리츠 다이가쿠호우징 도쿄이카시카다이가쿠
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2023-05-31
Also published as: US20210283200A1; EP3511409A4; CN110088268B; JP6337262B2; WO2018047979A1; CN110088268A; EP3511409A1; KR20190046858A; JP2018042557A; US11260085B2

Abstract

식품 적성이 높고, 제조하기 쉬우며, 면역 부활작용을 갖는 내염성 유산균을 제공한다. B세포의 생존능 및 활성화능을 갖는 면역 부활 작용을 갖는 내염성 유산균.

Description

내염성 유산균, 내염성 유산균의 배양 방법, 및 면역 부활제 {SALT-TOLERANT LACTOBACILLUS, METHOD OF CULTURING SALT-TOLERANT LACTOBACILLUS, AND IMMUNOSTIMULANT}

본 발명은 내염성 유산균, 내염성 유산균의 배양 방법, 및 면역 부활(賦活)제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 식품 적성이 높고, 제조하기 용이하며, 또한, 면역 부활 작용을 갖는 내염성 유산균, 내염성 유산균의 배양 방법, 및 면역 부활제에 관한 것이다.

종래, 유산균은 여러 가지 작용이 있는 것이 알려졌으며, 정장(整腸) 작용·장내 세균총 개선, 콜레스테롤 저감, 항비만 효과, 인지 기능 개선 효과, 미용 효과 등이 보고되어 있다. 또한, 유산균은 면역 개선(알레르기 개선, 암예방, 감염 방어) 효과의 보고예도 많다.

이러한 유산균에 의한 건강 효과를 기대하여 식품 분야에서는, 드링크(음료), 요구르트, 서플리먼트, 과자 등 여러 가지 형태로 유산균이 배합된 상품이 판매되고 있다. 또한, 유산균은 생균, 살균 균체, 유산균 생산물질 등의 여러 가지 형상으로 효과를 발휘하기 때문에, 상기 여러가지 형태의 상품이 존재하고 있다.

그리고 현재, 면역에 관여하는 유산균으로서는 구체적으로는, (1) 플라즈마사이토이드 수상(樹狀) 세포(pDC)를 직접 활성화하여, 항바이러스 효과 등을 발휘하는 「플라스마 유산균(락토코쿠스·락티스 JCM5805주)」, (2) NK활성 증강 효과가 있고, 감기 이환 리스크를 저감하는 것이 실증되어 있는 「1073R－1주(락토바실러스·불가리쿠스 OLL1073R－1)」, (3) 대식세포(macrophage)를 활성화하여, 장관 면역에 작용하는 것이 알려진 「FK－23균(엔터로코쿠스·패칼리스 FK－23)」, (4) Th1와 Th2 세포에 직접 작용하여 IgE 항체를 제어하는 기능이 있고, 알레르기 증상으로의 유효성이 실증되어 있는 「L－92 유산균(락토바실러스·애시도필루스 L－92주)」(예를 들면, 특허 문헌 1 참조) 등이 보고되어 있다.

또, 예를 들면, 일본의 전통적 발효식품인 된장에는 그 발효에 유산균이 관련되어 있다. 이 유산균은 식염에 대해서 내성이 있는 유산균이며, 그 주된 유산균은, 테트라게노코쿠스·할로필러스(Tetragenococcus halophilus)이다. 일본인은 예로부터 된장을 먹는 것으로 내염성 유산균도 섭취해 왔다.

그리고 내염성 유산균인 테트라게노코쿠스·할로필러스는 된장 외에도, 간장, 어간장, 젓갈, 묵은 채소 절임 등의 탄수화물을 포함한 식염 농도가 높은 식품으로부터 널리 일반적으로 분리되어 있다. 또, 특히 간장의 양조에서 테트라게노코쿠스·할로필러스는 스타터로서 사용되고 있다. 이와 같이, 테트라게노코쿠스·할로필러스를 주로 하는 내염성 유산균은 일본의 식생활에 예로부터 관계가 있다.

이 내염성 유산균에 관해서는 상기 내염성 유산균을 염분에 의한 스트레스 조건하에서 배양함으로써 2개 쇄 RNA를 산생한다. 그리고 이 2개 쇄 RNA는 Toll 유사 수용체 3(Toll-like receptor 3; TRL3)를 통해 수상 세포에 작용하여 면역 세포를 활성화하는 것이 보고되어 있다(특허 문헌 2, 3 참조).

또, 내염성 유산균의 일종으로서 Th1형 사이토카인인 인터류킨 12(IL－12) 및 인터페론-γ(INF－γ)의 산생 유발능을 가지며, 또한, IgE의 산생 억제능을 갖는 것이 보고되어 있다(특허 문헌 4 참조).

특허 문헌 1 JP 2004－026729 A 특허 문헌 2 JP 5099649 B 특허 문헌 3 JP 5312322 B 특허 문헌 4 JP 2011－004731 A

그러나, 특허 문헌 1에 기재된 유산균은 생육 환경을 충분히 정리할 필요가 있거나 다량으로 제조할 때에 살균할 수 있는 대규모 탱크 등의 설비가 필요하거나 배양액의 처리가 필요하거나 하는 등 제조에 번거로움이나 비용이 든다는 문제가 있다.

또, 특허 문헌 2, 3에 기재된 2개 쇄 RNA는, 가열이나 유산균의 사멸에 의해 파괴되기 쉽기 때문에, 공업 레벨로의 제조에서는 고도의 기술(예를 들면, 제조 단계에서 가열되지 않도록 충분한 온도 관리가 필요하게 되며, 또, 유산균의 사멸에 의한 2개 쇄 RNA의 손상을 완화하기 위한 제어장치가 필요하게 되는 등)이 필요하다.

특허 문헌 4에 기재된 내염성 유산균은, 인터류킨 12 및 인터페론-γ의 산생 유발능 등을 갖는 것이다. 이 내염성 유산균은 된장 유래의 것이기 때문에 식품 적성이 높고, 살균과 보온을 할 수 있는 설비가 있으면 좋기 때문에 배양이 간단하여 제조하기 쉽다고 생각된다.

이와 같이 내염성 유산균은 식품 적성이 높고, 제조하기 쉬운 것이기 때문에, 내염성 유산균의 더욱 큰 효능, 효과를 발견할 수 있다면, 상기 효능, 효과를 갖는 유산균을 용이하게 제조할 수 있게 된다.

본 발명은 B세포에 직접 작용하는 것에 의해서 B세포의 생존능과 활성화능을 향상시키는 것으로 면역 부활 효과를 발휘하는 내염성 유산균을 제공하는 것이다.

그리고 본 발명의 내염성 유산균은 식품 적성이 높고(즉, 안전성이 높고), 배양이 간단하기 때문에 제조하기 쉬운 것이다.

또한, 본 발명은 내염성 스타필로코쿠스(Staphylococcus)속 세균보다 증균(증식) 속도가 빠른 내염성 유산균을 제공하는 것이다.

구체적으로는, 상업적인 유산균 제조에서는 18w/v% 초과의 염분 농도로 배양하면, 오염균이 증균하지 않게 되지만, 배양 날짜가 길어지고, 또, 최종 수량도 낮아진다(예를 들면, 1.0×10⁹cfu/㎖ 정도). 이 때문에, 18w/v% 초과의 염분 농도로 배양하는 방법은 반드시, 염가이며 또한 효율적이라는 조건은 아니다. 한편, 배양 날짜를 단축하고, 수량을 올리는 것을 목적으로 하여, 염분 농도를 18w/v% 초과에서 12∼14w/v%로 내리면, 내염성이 높은 오염균(특히, 스타필로코쿠스속 세균의 일부의 것(내염성 스타필로코쿠스속 세균)이 증식해 버린다는 문제점이 있다.

따라서, 12∼14w/v%와 같은 18w/v% 이하의 염분 농도에서, 내염성 스타필로코쿠스속 세균보다 증균 속도가 빠른 내염성 유산균(테트라제노콕카스속)을 찾아내는 것이 요구되고 있었다.

본 발명에 의하면, 이하에 나타내는 내염성 유산균, 내염성 유산균의 배양 방법, 및 면역 부활제가 제공된다.

［1］B세포의 생존능 및 활성화능을 갖는 면역 부활 작용을 갖는, 내염성 유산균.

［2］된장의 양조 공정에서 단리되는 상기［1］에 기재된 내염성 유산균.

［3］수탁 번호 NITE BP－02318의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02319의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02320의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02321의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02322의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02323의 내염성 유산균, 또는 수탁 번호 NITE BP－02324의 내염성 유산균인 상기［1］또는［2］에 기재된 내염성 유산균.

［4］인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생을 유도하는 상기［1］∼［3］중 어느 하나에 기재된 내염성 유산균.

［5］상기［1］∼［4］중 어느 하나에 기재된 내염성 유산균을, 염분 농도 11∼18w/v%인 배지에서 배양하는 내염성 유산균의 배양 방법.

［6］상기［1］∼［4］ 중 어느 하나에 기재된 내염성 유산균을 함유하는 면역 부활제.

본 발명의 내염성 유산균은 식품 적성(예를 들면 된장 유래의 유산균으로 할 수 있음)이 높고(즉, 안전성이 높고), 배양이 간단하기 때문에 제조하기 쉬우며, 또한, 면역 부활 작용을 갖는 것이다.

본 발명의 내염성 유산균의 배양 방법에 의하면, 본 발명의 내염성 유산균을 간단하면서도 양호하게 배양할 수 있다.

본 발명의 면역 부활제는, 식품 적성(예를 들면 된장 유래의 유산균으로 할 수 있음)이 높고(즉, 안전성이 높고), 배양이 간단하기 때문에 제조하기 쉬우며, 또한, 면역 부활 작용을 갖는 것이다.

도 1은 실시예 1에 있어서의 비장 B세포의 생존능의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1에 있어서의 비장 B세포의 활성화능의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 2에 있어서의 전비장 세포의 생존능의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 2에 있어서의 비장 B세포의 생존능의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 2에 있어서의 비장 T세포의 생존능의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 2에 있어서의 비장 B세포의 활성화능의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 2에 있어서의 비장 T세포의 활성화능의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예 5에 있어서의 유세포 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 5에 있어서의 인터류킨 22의 측정 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 실시예 5에 있어서의 인터류킨 22의 측정 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 실시예 5에 있어서의 인터류킨 10의 측정 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 실시예 5에 있어서의 인터류킨 10의 측정 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 실시예 5에 있어서의 인터페론-γ의 측정 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 실시예 5에 있어서의 인터페론-γ의 측정 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 실시예 5에 있어서의 유세포 분석(flow cytometry)의 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 실시예 5에 있어서의 유세포 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은 실시예 5에 있어서의 유세포 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 실시예 6에 있어서의 마우스의 혈청 IgA의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 실시예 6에 있어서의 마우스의 혈청 IgA의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시의 형태로 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 범위에서, 당업자의 통상의 지식에 근거하여 이하의 실시의 형태에 대해 적절히 변경, 개량 등이 더해진 것도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해된다.

［1］내염성 유산균：

본 발명의 내염성 유산균은 B세포의 생존능 및 활성화능을 갖는 것이다. 본 발명의 내염성 유산균은 예를 들면, 된장의 양조 공정에서 단리된 것으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 내염성 유산균은 테트라게노코쿠스·할로필러스로 할 수 있다.

이러한 내염성 유산균은 안전성이 높고(즉, 식품 적성이 높고), 배양이 간단하기 때문에 제조하기 쉬우며, B세포에 직접 작용하는 것에 의해서 B세포에 있어서의 생존능 및 활성화능을 향상시킬 수 있고 면역계를 부활화할 수 있다(즉, 면역 부활 작용을 가짐). 또한, 종래, 내염성 유산균 안에는 림프구 T세포나 수상 세포에 작용하는 것이 알려져 있다.

여기서, B세포는 액성 면역에 중심적인 역할을 완수하고, 병원체 등 이물(항원)에 대해서 항체를 산생할 수 있는 유일한 세포이지만, 유산균에 의한 작용에 관해서는 거의 알려지지 않았다. 또, B세포는 T세포에 항원을 제시하는 세포로, 활성화 T세포의 유지에 필요 불가결한 세포인 것이 알려졌다. 이 때문에, B세포의 기능을 강하게 하는 것은, T세포의 기능도 보강하게 되어, 면역 부활 효과를 면역계의 세포 전체에서 강하게 하게 한다. 본 발명에서 「B세포의 활성화능」이란, 항체산생의 능력과 항원 제시의 능력의 양쪽 모두가 활성화하는 것을 말한다.

그리고 항체를 산생하여 이물을 공격할 수 있는 B세포의 기능을 인위적으로 강화하는 등, B세포를 직접 컨트롤하는 것이 가능하다면, 항체에 의한 기능이 영향을 주는 알레르기 질환이나 감염증, 자기면역 질환 등의 면역계 질환의 예방이나 완화, 치료로 이어지는 것을 기대할 수 있다.

본 명세서에서 「B세포의 생존능을 갖는다」란, 실험용 마우스 비장 세포로부터 단리한 B세포(비장 B세포)를 사용하여, 유산균을 첨가하고 있지 않은 시료 중에 있어서의, 총 세포의 수에 대한 생존하는 B세포의 수의 비율을 기준(기준치 100)으로 했을 때, 유산균을 첨가한 시료 중에 있어서의, 총 세포의 수에 대한 생존하는 B세포의 수의 비율의 값(측정값)이 100 초과가 되는 것을 말한다(단, 상기 기준치 및 측정치는 각각, 평균값으로부터 표준 오차를 뺀 값이다). 항B220 항체에 반응하는 세포를 B세포로 하고, 그 「총 세포의 수」는, 유세포 분석에 의해 정량하여 구할 수 있다.「생존하는 B세포(생 세포)의 수」는, 총 세포의 수로부터, Propidium Iodide(PI) 핵염색액으로 염색된 세포(죽은 세포)의 수를 뺀 값이다.

또한, 「B세포의 생존능을 갖는다」란 상기와 같지만 구체적으로는 실시예 1에 나타내는 방법(즉, (2) B세포의 조제, (3) 세포 배양, (4) B세포의 생존능 및 활성화능의 측정의 「B세포의 생존능」의 순서)에 의해서 얻어지는 값(측정치)이 100 초과가 되는 것을 말한다.

본 명세서에서 「B세포의 활성화능을 갖는다」란 비장 세포로부터 단리한 B세포(비장 B세포)를 사용하여 유산균을 첨가하고 있지 않은 시료 중에 있어서의, 활성화하고 있는 B세포의 수와 활성화하고 있지 않은 B세포의 수와의 비를 기준(기준치 100)으로 했을 때, 유산균을 첨가한 시료 중에 있어서의, 활성화하고 있는 B세포의 수와 활성화하고 있지 않은 B세포의 수와의 비의 값(측정치)이 100 초과가 되는 것을 말한다(단, 상기 기준치 및 측정값은 각각, 평균값으로부터 표준 오차를 뺀 값이다). 또한,「활성화하고 있는 B세포의 수」는 항B220 항체와 항CD86 항체의 양쪽 모두에 반응한 세포의 수를 유세포 분석에 의해 측정하여 구할 수 있다. 「활성화 하고 있지 않은 B세포의 수」는, 항CD86 항체와는 반응하지 않고 , 항B220 항체와 반응한 세포의 수를 유세포 분석에 의해 측정하여 구할 수 있다. 또한, 이들 세포는 생 세포(PI로 염색되지 않는 세포)인 것을 전제로 하고 있다.

또한,「B세포의 활성화능을 갖는다」란, 상기와 같지만 구체적으로는, 실시예 1에 나타내는 방법(즉, (2) B세포의 조제, (3) 세포 배양, (4) B세포의 생존능 및 활성화능의 측정의 「B세포의 활성화능」의 순서)에 의해서 얻어지는 값(측정치)이 100 초과가 되는 것을 말한다.

또, 「된장의 양조 공정에서 단리되는」내염성 유산균이란, 된장 양조 공정에 있어서의 「창고」, 「방」, 「통」 등에 정착하고 있는 내염성 유산균을 말한다. 또한, 된장의 사입에서부터 숙성 공정에서 증식 가능한 균을 말한다. 이 「된장의 양조 공정에서 단리되는」내염성 유산균은, 된장에 포함되는 내염성의 유산균(즉, 된장 유산균)이라고 할 수도 있으며, 환언하면, 된장 유래의 내염성의 유산균(즉, 된장을 기원으로 하는 내염성의 유산균)이다. 또한, 본 발명에서 「된장의 양조 공정에서 단리되는」내염성 유산균이란, 된장의 양조 공정에서 단리한 그것으로 한정하지 않으며, 된장의 양조 공정에서 단리되며, 그 후에 배양(계대 배양)된 것도 포함한다.

종래, 유산균은 사균체라도 면역 부활 작용을 갖는 것이 알려졌으며, 이 작용(면역 부활화 기능)을 활용한 상품이 널리 개발되고 있다.

이 유산균은 원심분리나 건조 등에서 농축하기 쉽고, 균수도 안정시키기 쉽고, 핸들링도 비교적 용이한 것 등의 이점이 있다.

실제로 면역 부활 효과를 얻으려면 다량의 균체를 섭취할 필요가 있지만, 다량의 균체를 조제하려면, 그 배양을 위한 대규모 탱크가 필수가 되기 때문에, 고액의 설비 투자가 필요하다. 또, 균체의 농축이나 정제, 오토클레이브 상당의 살균 등 배양액의 처리도 필요하다는 등의 과제가 있다.

따라서 발명자들은 식품 적성이 높고, 제조하기 쉬우며, 면역을 자극할 수 있는 유산균에 대해 열심히 연구를 실시했다. 그리고 내염성 유산균(예를 들면, 된장의 양조 공정에서 단리되는 것)은 식품 적성이 높고, 간단하고 쉬운 배양 설비로 다량으로 제조 가능하고 간단하게 제조할 수 있기 때문에 유용한 것으로 주목됐다.

또, 발명자들은 내염성 유산균을 사용하여 생체 방어에 필요한 항체를 산생하는 B세포의 생존능 및 활성화능을 향상시킬 수 있으면, 면역계를 부활화할 수 있어 더욱, 면역 응답에 유효하게 작용하여 매우 유용한 것으로 주목했다.

즉, 내염성 유산균은 된장이나 간장 등의 식품에 포함되어 있는 것이기 때문에 식품 적성이 높다. 그리고 본 발명의 내염성 유산균으로서는 예를 들면, 된장의 양조 공정에서 단리되는 것(된장 유산균)을 사용할 수 있으며, 이 된장 유산균도 식품 적성이 높은 것이다. 또, 본 발명의 내염성 유산균은 후술하는 배양 방법에서 나타낸 바와 같이 염분 농도가 높은 배지에서 배양 가능하고, 오염균이 증식하기 어려운 환경하에서 간단하게 생육할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 내염성 스타필로코쿠스속 세균보다 증균 속도가 빠른 내염성 유산균이면, 염분 농도를 높게 하는 경우(염분 농도 18w/v% 초과)에 비해, 배양 날짜를 단축할 수 있으며, 또한 최종 수량이 올라간다. 그 결과, 간단하고 쉬운 배양 설비로 보다 효율적이면서 다량으로 내염성 유산균을 제조할 수 있고, 일반의 유산균의 배양과 비교해서 배양 장치에 대한 설비 투자를 억제할 수 있다.

본 발명의 내염성 유산균은 보다 구체적으로는, 내염성 스타필로코쿠스속 세균(SN－2820주)의 증식 배율보다 큰 증식 배율인 것으로 할 수 있다. 이러한 경우, 배양 날짜를 단축할 수 있고, 최종 수량이 많아진다. 그 결과, 간단하고 쉬운 배양 설비로 보다 효율적이면서 다량으로 내염성 유산균을 제조할 수 있고, 일반의 유산균의 배양과 비교하여 배양 장치에 대한 설비 투자를 억제할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 「증식 배율」은, 실시예 4의 조건으로 배양했을 경우에서, 식：「20시간 배양 후의 균수(cfu/㎖)/초발 균수(cfu/㎖)」로 산출되는 값을 의미한다.

여기서, 면역 세포는 외부로부터의 병원체에 대항하는 신체의 방어 시스템, 면역계의 기능을 담당하고 있다. 그리고 면역 세포의 주체는 백혈구이며, 백혈구는 대식세포, 림프구, 과립구로 구성되어 있다. 이들 안에서, 림프구 세포는 면역 기능의 중심적 역할을 하고 있으며, T세포, B세포, NK세포(NK 세포 세포)와 각각 중요한 역할을 완수하는 세포로 구성되어 있다. 림프구 세포 중, B세포는 체내에 침입한 병원체를 배제하기 위해서 필요한 항체를 산생하는 유일한 세포이며, 체액성 면역에 대해 중심적인 역할을 완수한다. 또, B세포는 T세포에 항원의 정보 전달을 하는 항원 제시 세포의 하나로서도 알려져 있다.

본 발명의 내염성 유산균은 B세포의 생존능 및 활성화능을 갖는 것이면 어떠한 균이라도 된다. 예를 들면, 본 발명의 내염성 유산균은 된장의 테트라게노코쿠스·할로필러스로 할 수 있다.

본 발명의 내염성 유산균은 히스타민산 생능이 낮은 유산균인 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 내염성 유산균은 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생을 유도하는 것인 것이 바람직하다. 이들 내염성 유산균은 인터류킨 22의 산생을 유도하기 때문에, 각화 세포를 증식하여, 피부의 턴 오버를 촉진할 수 있기 때문에, 고운 피부 소재, 항균 소재 등의 용도에 매우 적합하게 사용되는 것을 기대할 수 있다. 인터류킨 22는 인터류킨 10 패밀리에 속하는 사이토카인이며, 피부나 장관의 점막 배리어 방어, 조직 수복, 세포 생존·증식에 관련되는 것이며, 아토피성 피부염 등의 피부 질환이나, 지방간 질환, C.Difficile(디피실균(Clostridium difficile)) 등에 의한 감염증의 예방·치료 등의 용도를 기대할 수 있다.

특히, 본 발명의 내염성 유산균은 B세포로부터의, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생을 유도하는 것인 것이 바람직하다. 인터페론-γ는 바이러스 등을 공격하는 킬러 T세포나 대식세포의 세포성 면역능을 증대시키는 것이 알려졌으며, 면역 부활화에 작용하는 것이 알려졌다. 인터류킨 10은 강력한 항염증 작용을 가지는 사이토카인이며, B세포 중, 제어성 B세포에 의해 산생된다. 이 제어성 B세포는 염증이나 자기면역 질환, 감염 면역 등에 대한 억제능이 있는 것이 보고되고 있으며, 부적절한 면역 반응을 억제하는 기능(면역 관용)이 있다. 이와 같이, 본 발명의 내염성 유산균에 의해서 B세포를 자극하는 것으로, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ와 같은 다양한 사이토카인의 산생이 유도되고, 그 결과, 적절한 면역 응답이 항진하기 때문에 생체 방어가 증강된다는 이점이 있다.

［1－1］바람직한 내염성 유산균：

본 발명의 내염성 유산균은 수탁 번호 NITE BP－02318(이하, 「No.1의 균주」또는 간단히 「No.1」이라고 기재하기도 함)의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02319(이하, 「No.3의 균주」또는 간단히 「No.3」라고 기재하기도 함)의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02320(이하, 「No.13의 균주」또는 간단히 「No.13」이라고 기재하기도 함)의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02321(이하, 「No.15의 균주」또는 간단히 「No.15」라고 기재하기도 함)의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02322(이하, 「No.19의 균주」또는 간단히 「No.19」라고 기재하기도 함)의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02323(이하, 「No.30의 균주」또는 간단히 「No.30」이라고 기재하기도 함)의 내염성 유산균, 및 수탁 번호 NITE BP－02324(이하, 「No.31의 균주」또는 간단히 「No.31」이라고 기재하기도 함)의 내염성 유산균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 내염성 유산균은 수탁 번호 NITE BP－02318의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02319의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02320의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02321의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02322의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02323의 내염성 유산균, 또는 수탁 번호 NITE BP－02324의 내염성 유산균이다.

이들 내염성 유산균은 예를 들면 된장 유래의 유산균(즉, 된장 유산균)이기 때문에 안전성이 높고, 생육이 간단하기 때문에 제조하기 쉬우며, 또한, B세포에 직접 작용하여 B세포에 있어서의 생존능 및 활성화능을 실현할 수 있어 양호하게 면역계를 부활화할 수 있다(즉, 양호한 면역 부활 작용을 가짐). 상기의 내염성 유산균은 T세포에도 작용할 수 있으며, 또한, 수장 세포 등에도 작용하는 것을 생각된다. 또한, 상기의 내염성 유산균은, 혈청 중의 IgA(Immunoglobulin A) 농도를 증대시킬 수 있어 면역 부활화능을 향상시킬 수 있다. 또한, 상술한 No.1, 3, 13, 15, 19, 30, 31의 균주의 내염성 유산균은 테트라게노코쿠스·할로필러스이다.

또한, 수탁 번호 NITE BP－02318의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02319의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02320의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02321의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02322의 내염성 유산균, 수탁 번호 NITE BP－02323의 내염성 유산균, 및 수탁 번호 NITE BP－02324의 내염성 유산균은, 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구의 특허 미생물 기탁 센터(NPMD)에 기탁되어 있다.

「바람직한 내염성 유산균」 중에서도, No.1의 균주, No.13의 균주, No.19의 균주, 및 No.30의 균주의 내염성 유산균은, 각 세포(B세포, T세포를 포함)의 생존능이 대체로 뛰어나다(실시예 2 참조). 이 때문에, No.1의 균주, No.13의 균주, No.19의 균주, 및 No.30의 균주의 내염성 유산균에 의하면, 면역 세포 전체가 증가하는 것으로 면역 부활 작용이 발휘되어 면역 부활제의 유효 성분으로서 매우 적합하게 사용할 수 있다.

「바람직한 내염성 유산균」 중, No.1의 균주, No.31의 균주의 내염성 유산균은, B세포의 생존능 및 B세포의 활성화능이 뛰어나다. 특히, No.31의 균주의 내염성 유산균은 B세포의 활성화능이 매우 높다. 그리고, No.1의 균주, No.31의 균주의 내염성 유산균은 효율성이 높은 면역 부활제의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 내염성 유산균은 No.1의 균주, No.3의 균주, No.13의 균주, No.15의 균주, No.30의 균주, 및 No.31의 균주의 내염성 유산균으로부터 선택되는 어느 1종인 것도 바람직하다. 이들 내염성 유산균은 배양 날짜가 짧으면서 최종 수량이 많다. 보다 구체적으로는, 이들 내염성 유산균은 내염성 스타필로코쿠스속 세균(SN－2820주)의 증식 배율보다 큰 증식 배율인 것으로 한다. 이 때문에, No.19의 균주의 내염성 유산균에 비해, 배양 날짜를 단축할 수 있으며, 또한 최종 수량이 많아진다. 그 결과, 더욱 간단하고 쉬운 배양 설비로 보다 효율적이면서 다량으로 제조할 수 있다. 또한, No.1, 3, 13, 15, 19, 30, 31의 균주의 내염성 유산균 중, 매우 뛰어난 면역 부활 효과를 가지며, 또한, 간단하고 쉬운 배양 설비로의 제조가 적합한 균은 No.1의 균주의 내염성 유산균이다.

［1－1a］수탁 번호 NITE BP－02318의 내염성 유산균：

수탁 번호 NITE BP－02318(No.1의 균주)의 내염성 유산균은 B세포의 생존능 및 B세포의 활성화능 양쪽 모두가 매우 뛰어나다. 이 때문에, No.1의 균주의 내염성 유산균에 의하면, 매우 뛰어난 면역 부활 작용이 발휘된다.

또, No.1의 균주의 내염성 유산균은 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생 유발능이 뛰어나다. 이 No.1의 균주의 내염성 유산균은 인터류킨 22의 산생 유발능이 뛰어나기 때문에, 상술한 바와 같이, 각화 세포를 증식하고 피부의 턴 오버를 촉진시킬 수 있다. 이 때문에, No.1의 균주의 내염성 유산균은 고운 피부 소재, 항균 소재 등의 용도에 매우 적합하게 사용할 수 있다. 또한, No.3, 13, 15, 19, 30, 31의 균주의 내염성 유산균에 대해서도 인터류킨 22의 산생 유발능이 뛰어나며, No.1의 균주의 내염성 유산균과 동일하게, 고운 피부 소재, 항균 소재 등의 용도에 매우 적합하게 사용할 수 있다.

특히, No.1의 균주의 내염성 유산균은, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ 가운데, 인터류킨 10의 산생 유발능이 뛰어나고, 한편, 이들 중, 인터페론-γ의 산생 유발능은 약하다(도 9∼도 14 참조). 이 때문에, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ중에서도, 인터류킨 10을 많이 산생시키고 싶은 경우에, No.1의 균주의 내염성 유산균을 사용하는 것이 매우 유효하다고 생각된다. 여기서, 면역계에서는 면역 부활 기능과 면역 관용 기능과의 양쪽 모두가 밸런스 좋게 작용하는 것이 하나의 중요한 요소이다. 이와 같은 관점에서 No.1의 균주의 내염성 유산균에 의하면, 인터페론-γ에 의한 면역 부활화능이 향상하고, 또한, 인터류킨 10 패밀리에 속하는 인터류킨 10 및 인터류킨 22에 의해서 부적절한 면역 반응을 억제하는 기능(면역 관용)을 발휘시킬 수 있어 전체적으로 면역 부활 기능과 면역 관용 기능과의 양쪽 모두가 밸런스 좋게 작용하게 된다. 이와 같이 No.1의 균주의 내염성 유산균을 사용하면 인터류킨 22 및 인터페론-γ뿐만이 아니라, 강력한 항염증성을 갖는 사이토카인인 인터류킨 10도 충분히 작용하게 되어, 면역계를 성숙시키고, 그 결과, 면역계 전체가 밸런스 좋게 기능하여, 병원체 등에 대해 적절한 면역 응답 기능을 높이는 것을 기대할 수 있다.

No.1의 균주의 내염성 유산균은 혈청 중의 IgA(Immunoglobulin A) 농도를 증대시킬 수 있다(표 7, 도 18 참조). 이 IgA는 점막면에서의 국소 면역에 관여하기 때문에, 예를 들면 No.1의 균주의 내염성 유산균을 사용하는 것으로, IgA 농도도 아울러 증대시켜 면역 부활화능을 향상시킬 수 있다.

No.1의 균주의 내염성 유산균은 인터류킨 12의 발현에는 B세포를 통해 직접적으로 영향을 주지 않는 것이다. 즉, No.1의 균주의 내염성 유산균은 B세포를 개입시키는 인터류킨 12의 산생 유발능을 갖지 않는다(표 3 참조).

［1－1b］수탁 번호 NITE BP－02319∼BP－02322의 내염성 유산균：

수탁 번호 NITE BP－02319∼BP－02322(No.3의 균주, No.13의 균주, No.15의 균주, No.19의 균주)의 내염성 유산균에 대해서도, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생 유발능이 뛰어나다. 특히, 이들의 내염성 유산균은 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ 중, 인터페론-γ의 산생 유발능이 뛰어나다. 이 때문에, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ중에서도 인터페론-γ를 많이 산생시키고 싶은 경우에, 이들 내염성 유산균을 사용하는 것이 유효하다. 인터페론-γ는 NK세포의 증식을 촉진하거나 NK세포의 공격력을 높이거나 하는 작용이 있으므로, 이들 인터페론-γ의 기능도 강하게 하고 싶은 경우에 이와 같은 균주의 내염성 유산균을 사용할 수 있다.

［1－1c］수탁 번호 NITE BP－02323의 내염성 유산균：

수탁 번호 NITE BP－02323(No.30의 균주)의 내염성 유산균에 대해서도, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생 유발능이 뛰어나다. 특히, No.30의 균주의 내염성 유산균은, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ 중, 인터페론-γ의 산생 유발능이 뛰어나다.

또한, 이 No.30의 균주의 내염성 유산균은 혈청 중의 IgA 농도를 증대시킬 수 있다(표 8, 도 19 참조). 예를 들면 No.30의 균주의 내염성 유산균을 사용하는 것으로, IgA 농도도 함께 증대시켜서 면역 부활화능을 향상시킬 수 있다.

No.30의 균주의 내염성 유산균은 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ중에서도, 인터페론-γ를 많이 산생시킴과 동시에, 혈청 중의 IgA 농도를 증대시키고 싶은 경우에 사용하는 것이 유효하다고 생각된다.

［1－1d］수탁 번호 NITE BP－02324의 내염성 유산균：

수탁 번호 NITE BP－02324(No.31의 균주)의 내염성 유산균은, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생 유발능에 매우 우수하다. 즉, No.31의 균주의 내염성 유산균은 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 전부를 더욱 많이 산생시키고 싶은 경우에 사용하는 것이 유효하다라고 생각할 수 있다.

［2］내염성 유산균의 배양 방법：

본 발명의 내염성 유산균의 배양 방법은, 본 발명의 내염성 유산균을 염분 농도가 11∼18w/v%인 배지에서 배양한다. 또한, 「w/v%」는, (질량(g)/체적(100㎖))%를 의미한다.

이와 같은 조건으로 배양함으로써, 본 발명의 내염성 유산균을 간단하면서도 양호하게 배양할 수 있다. 구체적으로는, 상업적인 유산균 제조에서는 18w/v% 초과의 염분 농도로 배양하면, 오염균이 증균하지 않게 되지만, 배양 날짜가 길어지고, 또한, 최종 수량도 낮아진다(예를 들면, 1.0×10⁹cfu/㎖ 정도). 이 때문에, 18w/v% 초과의 염분 농도로 배양하는 방법은 반드시, 염가이면서 효율적이라는 조건은 아니다. 한편, 배양 날짜를 단축하여 수량을 올리는 것을 목적으로 하여, 배지의 염분 농도를 18w/v% 초과에서 12∼14w/v%로 내리면, 내염성이 높은 오염균(특히, 스타필로코쿠스속 세균의 일부의 것(내염성 스타필로코쿠스속 세균))이 증식해 버린다는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명의 내염성 유산균을 상기 염분 농도의 배지에서 배양하는 것으로, 내염성을 갖지 않는 오염균에 대해서는 증균을 방지하고, 또한, 내염성 스타필로코쿠스속 세균보다 증균 속도가 빨라지기 때문에, 내염성을 갖는 오염균이 증균하기 전에 배양을 종료시킬 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 배양 방법에 의하면, 간단하고 쉬운 배양 설비로 보다 효율적이면서 다량으로 내염성 유산균을 제조할 수 있어 일반의 유산균의 배양과 비교해서 배양 장치에 대한 설비 투자를 억제할 수 있다.

배지로서는, 질소원 및 탄소원을 함유하는 것을 사용할 수 있다.

질소원으로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 간장, 된장, 고기 엑기스, 펩톤, 글루텐, 카제인, 효모 엑기스, 아미노산 등을 들 수 있다. 또, 탄소원으로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 글루코오스, 누룩 소화액, 쌀의 당화액, 수크로스, 전분, 물엿 가루, 글리세린 등을 들 수 있다. 또한, 질소원 및 탄소원 외에, 무기질로서 예를 들면, 초산나트륨, 마그네슘, 망간, 철 등의 무기염 등을 함유할 수 있고, 비타민류 등을 함유할 수도 있다.

배지의 염분 농도는 11∼18w/v%로 하는 것이 바람직하고, 11∼16w/v%로 하는 것이 더욱 바람직하고, 12∼14w/v%로 하는 것이 특히 바람직하다. 양지의 염분 농도는, 18w/v%을 초과하면 잡균(오염균)보다도 내염성 유산균이 왕성하게 증식한다. 그러나 염분 농도가 18w/v% 초과하면, 내염성 유산균의 증식 속도가 다른 염분 농도의 경우에 비교하여 늦어지며, 또한, 최종 수량이 낮아진다는 문제가 있다.

배양 온도는 20∼40℃가 바람직하고, 28∼37℃가 더욱 바람직하다. 배양 시간은 24∼120시간 정도이며, 배양 중에 교반할 수도 있다. 또, 배지의 pH는 5∼9가 바람직하고, 6∼7이 더욱 바람직하다.

본 방법에 의하면, 배지에 식염이 고농도로 포함되기 때문에, 대장균이나 토양 세균 등의 오염균이 증균하기 어렵다. 여기서, 배양 시간을 단축, 최종 수량을 올리기 위해서, 배지의 염분 농도를 18w/v%에서 12∼14w/v%로 내리면, 내염성 스타필로코쿠스속 세균이 증균할 가능성이 있다. 그러나 염분 농도를 내렸다고 해도, 내염성 스타필로코쿠스속 세균보다 증균 속도가 빠르면, 오염균의 영향을 받지 않게 된다. 본 발명의 방법에 의하면, 내염성을 갖지 않는 오염균을 제어하면서, 내염성을 갖는 오염균에 대해서는, 그 증균 속도가 빠른 내염성 유산균을 채용하는 것으로, 용이하면서 양호하게 내염성 유산균을 배양할 수 있다.

본 발명의 배양 방법에 의하면, 본 발명의 내염성 유산균을 밀폐계의 무균배양 장치를 사용하지 않고, 개방계의 배양 장치(단, 살균·보온을 할 수 있는 것)에서도 충분히 배양할 수 있다.

［3］내염성 유산균의 조제 방법：

본 발명의 내염성 유산균은 배양 후, 살균 등의 처리를 실시하여 조제할 수 있다. 구체적으로는, 배양 종료 후, 원심분리 등의 수단에 의해 식염을 포함한 배지 성분을 제거하고 세정·정제한다. 그리고 가열 살균을 실시하고, 그 후, 동결 건조·감압 건조·열풍 건조 등의 수단에 의해 건조·농축한다. 이와 같이 하여 본 발명의 내염성 유산균을 조제할 수 있다.

또한, 가열 살균은 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는 오토클레이브 살균(121℃, 20분 ) 또는 동일한 정도의 살균(105℃, 30분)이 바람직하다.

［4］면역 부활제：

본 발명의 면역 부활제는 본 발명의 내염성 유산균을 함유하는 것이다. 이 면역 부활제는 내염성 유산균(예를 들면 된장 유래의 내염성 유산균)을 함유하는 것으로부터 안전성이 높고(식품 적성이 높고), 내염성 유산균을 사용하기 때문에 제조하기 쉽다. 그리고 본 발명의 내염성 유산균을 함유하는 것에 의해서, 면역 부활 작용이 발휘된다.

본 발명의 면역 부활제는 본 발명의 내염성 유산균을 유효 성분으로서 함유 하는 한 그 함유 비율은 특별히 제한은 없다. 또한, 본 발명의 면역 부활제는 본 발명의 내염성 유산균 이외에 그 외의 성분으로서 난소화성 덱스트린, 올리고당, 덱스트린, 이산화 규소 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 면역 부활제는 본 발명의 내염성 유산균의 배양 방법으로 얻어지는 배양물, 균체 또는 균체 성분을 함유할 수도 있다.

또한, 본 발명의 면역 부활제는 그것 자체를, 음식품, 서플리먼트, 의약품 등으로 할 수 있고, 음식품, 서플리먼트, 의약품 등에 첨가하여 사용할 수도 있다. 음식품으로서는, 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 된장, 즉석 된장국, 조리 된장(된장 가공품), 킨잔지(Kinzanji) 된장 등의 나메 된장, 간장, 국물, 조미 소스, 조미한 국물, 절임(아사즈케)의 소 등의 가공 조미료, 밥의 소 등의 조미 식품, 반찬, 아마자케(누룩 음료), 단팥죽 등을 들 수 있다.

(실시예)

이하, 본 발명을 실시예에 근거해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

＜B세포의 생존능 및 활성화능의 측정 시험＞

실험용 마우스(C57BL/6)의 비장 유래의 B세포(B220 양성 세포)에, 살균 처리를 가한, 된장의 양조 공정에서 단리된 (즉, 된장 유래의 것) 테트라게노코쿠스·할로필러스(즉, 내염성 유산균)의 균체를 첨가하여 세포 배양하고, 비장 B세포의 생존능 및 비장 B세포의 활성화능을 조사했다. 이하, 본 실시예에서는 「비장 B세포」를 간단히 「B세포」라고 기재하기도 한다.

(1) 유산균 현탁액의 조제：

된장의 양조 공정에서부터 단리한 유산균의 56주에 대해서, 각각, 「10 SG10N 배지」를 사용하여, 30℃, 4∼7일간 배양했다. 그 후, 상기 56주의 모두에 대해 121℃에서 15분간 오토클레이브 멸균 처리를 하여 균주마다 배양액을 얻었다.

또한, 「10 SG10N 배지」는, 간장(이치비키사 제조의 상품명 「코이쿠치쇼유」) 10v/v％, 포도당 1.0w/v%, 효모 엑기스 1.0w/v%, 폴리펩톤 0.5w/v%, 초산나트륨 3 수화물 0.2w/v%, 염화나트륨 10w/v%, 「Tween80(폴리(옥시에틸렌) 소르비탄 모노 올리에이트)」0.0025w/v%, 황산마그네슘 7수화물 0.02w/v%, 황산망간 4수화물 0.001w/v%, 및 황산철 7수화물 0.001w/v%를 혼합하고, pH 6.8로 조정하여 오토클레이브한 것이다. 또한, 「v/v％」은 (체적/체적)%를 나타낸다.

이어서, 멸균 처리하여 얻어지는 각 배양액을 5000rpm로 10분간 원심 분리를 실시했다. 그 후, 각각 집균하고, 증류수로 3회 세정한 후, 증류수로 현탁하고 동결 건조하여 균체(56주분)를 얻었다. 그 후, 동결건조한 균체의 각각에 대해, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)으로 0.1mg/㎖가 되도록 현탁하고, 56주분의 유산균 현탁액을 조제했다.

(2) B세포의 조제：

실험용 마우스(C57BL/6)의 비장으로부터 채취한 세포를 1.5㎖ 리액션 튜브(Greiner Bio－One사 제조)에 모아 0.5㎖의 적혈구 용해 버퍼(0.155M NH₄Cl, 0.01M Tris－HCl, pH 7.5)를 더하여 세포를 현탁하였다. 그 후, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)을 0.5㎖ 더하여 1200rpm로 5분간 원심 분리하고, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)으로 1회 세정했다.

기본 배지에서 현탁 후, 비오틴-항B220 항체(TONBO Biosciences사 제조)를 더하고, 냉장(5℃)하여 30분간 정치하였다. 또한, 기본 배지는, 페니실린-스트랩토마이신 혼합 용액(배양기 속에 100U/㎖－100μg/㎖, 나카라이테스크사 제조) 및 2－메르캅토 에탄올(배양기 속에 50μM, 나카라이테스크사 제조)을 더한, L－글루타민산(0.3g/L)첨가 RPMI 1640(나카라이테스크사 제조)에, 55℃에서 30분간 가열하여 비동화한 우태아 혈청(SAFCBiosciences사 제조)을 배양기 속에서 9(w/v%)%가 되도록 첨가한 것을 사용했다.

정치 후, 1200rpm로 5분간 원심 분리하고, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)으로 2회 세정한 후, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)으로 현탁하였다. 그 후, 자기 비즈인 Streptavidin Particles Plus·DM(일본 BD사 제조)를 더하여 냉장(5℃)하고 30분간 정치했다.

그 후, 1200 rpm로 5분간 원심 분리하고, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)으로 1회 세정한 후, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)에 재차 현탁하여 라운드 튜브로 옮겼다.

그 후, BDIMagCellSeparationSystem(일본 BD사 제조)에서 세포 분리를 실시하여, 자석으로 끌어 당겨지는 세포를 포지티브 프릭션(positive fraction)로서 회수했다. 회수한 포지티브 프릭션을 「B세포(B220 양성 세포)」로서, 재차 기본 배지에 현탁하여 B세포 부유액을 조제했다. 또한, 얻어진 B세포 부유액은 혈구 계산판을 사용하여 세포수를 계측했다.

(3) 세포 배양：

2×10⁶cells/㎖가 되도록 B세포 부유액을 기본 배지에서 조정하고, 조정 후의 B세포 부유액을 48well 마이크로 플레이트(FALCON사 제조)에 0.5㎖씩 파종하여 1×10⁶ cells/0.5㎖/well로 했다. 그 후, 각 유산균 현탁액(0.1mg/㎖)을 5㎕씩 더하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 2일간 배양했다. 또한, 조정 후의 B세포 부유액에 균체(유산균 현탁액)를 첨가하지 않고, 균체를 첨가한 수준과 동일 조건(37℃, 5% CO₂의 조건)으로 2일간 배양한 것을 대조군로 했다.

(4) B세포의 생존능 및 활성화능의 측정：

배양 후, 유세포 분석(밀테니바이오텍사 제조 MACSQuant Analyzer)를 사용하여 각 시료(세포 배양액)에 대해 생존능 및 활성화능의 측정을 실시했다.

우선, 48 well 마이크로 플레이트에 배양하고 있던 세포 배양액을 1.5㎖ 리액션 튜브(Greiner Bio－One사 제조)로 옮겨서, 1200rpm로 5분간 원심 분리하고, 세포를 회수했다. 그 후, 회수한 세포를 pH 6.8의 인산 완충액(PBS) 0.2㎖에 현탁하고, violetFluor450 표지 항B220 항체(TONBO Biosciences사 제조)와 APC 표지 항CD86 항체(TONBO Biosciences사 제조)를 1㎕씩 더하여 냉장(5℃)에서 60분간 정치했다.

정치 후, 1200rpm로 5분간 원심 분리하여 세포를 회수하고, pH 6.8의 인산 완충액(PBS) 0.5㎖로 현탁하였다. 그 후, Propidium Iodide(PI) 핵염색액(코스모바이오사 제조)을 0.5㎕ 더하여 측정용 시료를 얻었다. 이 측정용 시료에서 유세포 분석를 사용한 측정을 실시했다. 또한, 해석은 FCS 데이터 해석 소프트 FlowJo(FlowJo, LLC사 제조)를 사용했다. 또한, Propidium Iodide(PI) 핵염색액을 사용한 것은 이 염색액은 생 세포의 세포막을 투과하지 않는 시약이며, 죽은 세포를 염색할 수 있기 때문이다.

(B세포의 생존능)

측정용 시료 중에서, 카운트된 세포수로부터, 첨가한 유산균의 수(유산균 현탁액 중의 균체의 수)를 뺀 수를 총 세포의 수로 하였다. 또, 측정용 시료 중, PI 검출된 세포(즉, PI핵염색액으로 염색된 세포)를 죽음 세포로 간주하고, 그 수를 카운트하여 총 세포의 수와 죽은 세포의 수와의 차이를 생세포 수로 하였다. 그리고 총 세포 중의 생세포의 비율(생 세포의 수/총 세포의 수×100)을 산출했다. 동일하게 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않았던 것)에 있어서의, 총 세포 중의 생세포의 비율을 산출했다. 그 후, 이들 값을 비교하여 대조군을 기준(100)으로 했을 때의 비의 값을 산출하여 B세포의 생존능(세포 생존능)의 값으로 했다. 또한, 세포 생존능의 시험은 반복하여 실시하고, B세포의 생존능의 값에 대해 평균값(X^－)과 표준 오차(S.E.)를 구했다. 결과를 도 1 및 표 1에 나타낸다. 또한, 도 1∼도 7, 도 9∼도 14 중, 「CTL」는, 대조군(control)을 나타낸다. 본 실시예에서 「평균값(X ^－)」는 6회의 시험(n=6)에 의한 평균값이다.

B세포의 생존능에 대해서, 이하의 기준으로 평가를 실시했다.

식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이, 100 초과에서 110 미만의 경우를 「A」라고 하고, 110 초과에서 130 미만의 경우를 「AA」라고 하며, 130 이상의 경우를 「AAA」라고 한다. 결과를 표 1에 나타낸다.

(B세포의 활성화능)

B세포의 세포 표면 마커인 violetFluor450 표지 항B220 항체와 B세포의 활성화 마커인 APC 표지 항CD86 항체에 의해서, B220 및 CD86를 발현하는 B세포를 검출하고 그 수를 세었다. 그리고, B세포(B220 양성 세포) 중, 활성화하고 있는 B세포(CD86^＋, B220^＋)와 활성화하고 있지 않은 B세포(CD86^－, B220^＋)의 몫(활성화하고 있는 B세포의 수와 활성화 하고 있지 않은 B세포의 수와의 비)을 산출했다. 동일하게 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않았던 것)에 있어서의, 활성화하고 있는 B세포(CD86^＋, B220^＋)와 활성화하고 있지 않은 B세포(CD86^－, B220^＋)의 몫을 산출했다. 그 후, 이들 값을 비교하여, 대조군을 기준(100)으로 했을 때의 비의 값을 산출하고 B세포의 활성화능의 값으로 했다. 또한, B세포의 활성화능의 시험은 반복 실시하여 B세포의 활성화능의 값에 대해 평균값(X^－)과 표준 오차(S.E.)를 구했다. 결과를 도 2 및 표 1에 나타낸다.

B세포의 활성화능에 대해서, 이하의 기준으로 평가를 실시했다. 식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이, 100 초과에서 110 미만의 경우를 「A」라고 하고, 110 초과에서 130 미만의 경우를 「AA」라고 하며, 130 이상의 경우를 「AAA」라고 한다. 결과를 표 1에 나타낸다.

또한, 표 1, 표 2 중, 「평가」 란의 「^－」은, 식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이 100 이하인 것을 의미한다. 또, 표 1 중, 「평가」 란의 「OK/NG」는, 식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이 100 초과인 경우(즉, A, AA, AAA의 어느 하나의 평가인 경우)를 「OK」라고 하고, 식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이 100 이하인 경우를 「NG」라고 했다. 또, 표 1 중, 「종합 평가」의 란의 「OK/NG」는, B세포의 생존능 및 활성화능의 평가가 모두 「OK」인 경우를 「OK」라고 하고, 그 이외를 「NG」라고 했다. 「종합 평가」의 란에서「OK」인 균주는 B세포의 생존능 및 B세포의 활성화능을 갖는 것을 알 수 있다.

「CD86⁺, B220⁺」는 CD86 및 B220의 양쪽 모두가 세포 표면에 발현하고 있는 것을 나타낸다. 또, 「CD86^－, B220⁺」는, CD86는 발현하지 않고, B220가 발현하고 있는 것을 나타낸다.

된장의 양조 공정에서부터 단리한 유산균의 56주 가운데, No.1, 3, 13, 15, 19, 30, 31의 7개의 균주(이하, 「대표 균주」라고 기재하기도 함)는 B세포의 생존능이 높고, 또한, B세포의 활성화능도 높은 결과였다(표 1 참조). 이들 내염성 유산균은 표 1에 나타낸 바와 같이, B세포에 직접 작용하는 것에 의해서 B세포의 생존능 및 활성화능을 향상시키고 있다고 생각된다. 또, 이들 내염성 유산균은 된장 유래의 것이기 때문에 식품 적성이 높다(즉, 안전성이 높다). 또한, 오염균이 번식 하기 어려운 높은 염분 농도로 생육 가능하기 때문에, 배양이 간단하다. 이 때문에, 이들 내염성 유산균은 제조하기 쉽다.

본 실시예에서는 B220 양성 세포에 주목하여 B세포에 대해 해석했지만, B220 양성 세포를 대신하여 CD19 양성 세포로 해석한 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 이것으로부터도, 소정의 균주에 의해서 B세포의 생존능 및 활성화능이 향상되고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, No.1의 균주는 수탁 번호 NITE BP－02318의 내염성 유산균이고, No.3의 균주는 수탁 번호 NITE BP－02319의 내염성 유산균이며, No.13의 균주는 수탁 번호 NITE BP－02320의 내염성 유산균이고, No.15의 균주는 수탁 번호 NITE BP－02321의 내염성 유산균이며, No.19의 균주는 수탁 번호 NITE BP－02322의 내염성 유산균이고, No.30의 균주는 수탁 번호 NITE BP－02323의 내염성 유산균이며, No.31의 균주는 수탁 번호 NITE BP－02324의 내염성 유산균이다.

(실시예 2)

B세포의 생존능 및 활성화능 양쪽 모두가 높은 균주(No.1, 3, 13, 15, 19, 30, 31)와 그 외의 임의의 균주(No.2, 20, 26, 28, 34, 49)를 시험 균주로서 비장 세포 전체(전비장 세포)에 대한 영향을 조사했다.

＜세포의 생존능 및 활성화능의 측정 시험＞

각 시험 균주를 살균 처리하고, 살균 처리 후의 균체를 실험용 마우스(C57BL/6)의 비장 세포에 첨가하여 배양하고, 배양 후에 있어서의, 비장 세포 전체의 생존능, 비장 B세포와 비장 T세포의 생존능, 및 비장 B세포와 비장 T세포의 활성화능을 조사했다. 이하, 본 실시예에서는, 「비장 B세포」를 간단히 「B세포」라고 기재하기도 하며, 「비장 T세포」를 간단히 「T세포」라고 기재하기도 한다. 또한, 본 실시예 2는 실시예 1과는 달리 B세포를 단리하고 있지 않다. 즉, 시험에 사용한 세포(전비장 세포) 안에는, B세포, T세포, 수장 세포, NK세포 등이 포함되어 있었다.

(1) 유산균 현탁액의 조제：

실시예 1에서 조제한 유산균 현탁액과 같은 것을 사용했다.

(2) 비장 세포 부유액의 조제：

실험용 마우스(C57BL/6)의 비장으로부터 채취한 세포를 1.5㎖ 리액션 튜브(Greiner Bio－One사 제조)에 모아 0.5 ㎖의 적혈구 용해 버퍼(0.155M NH₄Cl, 0.01M Tris－HCl, pH7.5)를 더하여 비장 세포를 현탁하였다. 그 후, pH 6.8의 인산 완충액(PBS) 0.5㎖를 더하여 1200rpm로 5분간 원심 분리하고, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)으로 2회 세정했다.

기본 배지에서 현탁하여 비장 세포 부유액을 조제했다. 또한, 기본 배지는 실시예 1과 같은 것을 사용했다. 얻어진 비장 세포 부유액은 혈구 계산판을 사용하여 세포수를 계측했다.

(3) 세포 배양：

2×10⁶ cells/㎖가 되도록 비장 세포 부유액을 기본 배지에서 조정하고, 조정 후의 비장 세포 부유액을 48 well 마이크로 플레이트(FALCON사 제조)에 0.5 ㎖씩 파종하여 1×10⁶ cells/0.5㎖/well로 했다. 그 후, 각 유산균 현탁액(0.1mg/㎖)를 5㎕씩 더하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 2일간 배양했다. 또한, 조정 후의 비장 세포 부유액에 균체(유산균 현탁액)를 첨가하지 않고, 균체를 첨가한 수준과 동일 조건(37℃, 5% CO₂의 조건)으로 2일간 배양한 것을 대조군으로 했다.

(4) 세포의 생존능 및 활성화능의 측정：

배양 후, 유세포 분석(밀테니바이오텍사 제조 MACSQuant Analyzer)를 사용하여 각 시료(세포 배양액)에 대해 세포의 생존능 및 활성화능의 측정을 실시했다.

우선, 48 well 마이크로 플레이트로 배양하고 있던 세포 배양액을 1.5㎖ 리액션 튜브(GreinerBio－One사 제조)로 옮겨서, 1200rpm로 5분간 원심 분리하여 세포를 회수했다. 그 후, 회수한 세포를 pH 6.8의 인산 완충액(PBS) 0.2㎖에 현탁하고, 이하의 4개의 항체를 1㎕씩 더하여 냉장(5℃)에서 60분간 정치했다.

첨가한 4개의 항체는 violetFluor450 표지 항B220 항체(TONBO Biosciences 사 제조), APC 표지 항CD86 항체(TONBO Biosciences사 제조), Brilliant Violet510 표지 항CD4 항체(BioLegend사 제조), 및 PE표지 항CD69 항체(BioLegend사 제조)였다.

정치 후, 1200rpm에서 5분간 원심 분리하고, 세포를 회수하여 pH 6.8의 인산 완충액(PBS) 0.5㎖에 현탁하였다. 그 후, Propidium Iodide(PI) 핵염색액(코스모바이오사 제조)을 0.5㎕ 더하여 측정용 시료를 얻었다. 이 측정용 시료에서 유세포 분석를 사용한 측정을 실시했다. 또한, 해석은 FCS 데이터 해석 소프트 FlowJo(FlowJo, LLC사 제조)를 사용했다.

(세포의 생존능)

측정용 시료 중에서, 카운트된 세포수로부터, 첨가한 유산균의 수(유산균 현탁액 중의 균체의 수)를 뺀 수를 총 세포수로 하였다. 또, 측정용 시료 중, PI검출된 세포(PI핵염색액으로 염색된 세포)를 죽은 세포로 간주하고, 그 수를 카운트하여 총 세포의 수와 죽은 세포의 수와의 차이를 생 세포의 수로 하였다. 그리고 총 세포 중의 생 세포의 비율(생 세포의 수/총 세포의 수×100)을 산출했다. 동일하게 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않았던 것)에 있어서의, 총 세포 중의 생 세포의 비율을 산출했다. 그 후, 이들 값을 비교하여 대조군을 기준(100)으로 했을 때의 비의 값을 산출하고 세포의 생존능(세포 생존능)의 값으로 했다. 또한, 세포 생존능의 시험은 반복하여 실시하고, 세포의 생존능의 값에 대해 평균값(X^－)과 표준 오차(S.E.)를 구했다. 결과를 도 3 및 표 2에 나타낸다. 본 실시예에서 「평균값(X ^－)」은 8회의 시험(n=8)에 의한 평균값이다.

세포의 생존능에 대해서, 이하의 기준으로 평가를 실시했다. 식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이 100 초과에서 120 미만의 경우를 「A」라고 하고, 120 이상에서 150 미만의 경우를 「AA」라고 하며, 150 이상의 경우를 「AAA」라고 한다. 결과를 표 2에 나타낸다.

(B세포의 생존능)

B세포의 세포 표면 마커인 violetFluor450 표지 항B220 항체(TONBO Biosciences사 제조)로 B세포를 검출했다. 생 세포 중 B세포의 수와 총 세포의 수와의 몫(총 세포의 수에 대한 생존하는 B세포의 수의 비율)을 산출했다. 또한, 본 실시예에서는 측정용 시료 중에서 카운트된 세포수로부터, 첨가한 유산균의 수(유산균 현탁액 중의 균체의 수)를 뺀 수를 「총 세포의 수」라고 했다. 또, 측정용 시료 중, PI검출된 세포(PI핵염색액으로 염색된 세포)를 죽은 세포로 간주하고, 그 수를 카운트하여, 총 세포의 수와 죽음 세포의 수와의 차를 「생 세포의 수」라고 했다. 그리고 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않았던 것)에 있어서의, 총 세포 중의 생 세포의 비율을 산출했다. 그 후, 이들 값을 비교하여 대조군을 기준(100)으로 했을 때의 비의 값을 산출하고 B세포의 생존능의 값으로 했다. 또한, B세포의 생존능의 시험은 반복 실시하며, B세포의 생존능의 값에 대해 평균값(X^－)과 표준 오차(S.E.)를 구했다. 결과를 도 4 및 표 2에 나타낸다.

B세포의 생존능에 대해서, 이하의 기준으로 평가를 실시했다. 식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이, 100 초과에서 120 미만의 경우를 「A」라고 하고, 120 이상에서 150 미만의 경우를 「AA」라고 하며, 150 이상의 경우를 「AAA」라고 한다. 결과를 표 2에 나타낸다.

(T세포의 생존능)

T세포의 세포 표면 마커인 Brilliant Violet 510표지 항CD4 항체(BioLegend사 제조)로 T세포를 검출했다. 생 세포 중 T세포의 수와 총 세포의 수와의 몫(총 세포의 수에 대한 생존하는 T세포의 수의 비율)을 산출했다. 그리고 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않았던 것)에 있어서의, 총 세포 중의 생 세포의 비율을 산출했다. 그 후, 이들 값을 비교하여 대조군을 기준(100)으로 했을 때의 비의 값을 산출하여 T세포의 생존능의 값으로 했다. 또한, T세포의 생존능의 시험은 반복 실시하고, T세포의 생존능의 값에 대해 평균값(X^－)과 표준 오차(S.E.)를 구했다. 결과를 도 5 및 표 2에 나타낸다.

T세포의 생존능에 대해서, 이하의 기준으로 평가를 실시했다. 식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이 100 초과에서 120 미만의 경우를 「A」라고 하고, 120 이상에서 150 미만의 경우를 「AA」라고 하며, 150 이상의 경우를 「AAA」라고 한다. 결과를 표 2에 나타낸다.

(B세포의 활성화능)

B세포의 세포 표면 마커인 violetFluor450 표지 항B220 항체와 B세포의 활성화 마커인 APC표지 항CD86 항체에 의해서, B220 및 CD86를 발현하는 B세포를 검출하여 그 수를 세었다. 그리고, B세포(B220 양성 세포) 중, 활성화하고 있는 B세포(CD86^＋, B220^＋)와 활성화하고 있지 않은 B세포(CD86^－, B220^＋)의 몫(활성화하고 있는 B세포/활성화하고 있지 않은 B세포의 비의 값)을 산출했다. 동일하게 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않았던 것)에 있어서의, 활성화하고 있는 B세포(CD86^＋, B220^＋)와 활성화하고 있지 않은 B세포(CD86^－, B220^＋)의 몫을 산출했다. 그 후, 이들 값을 비교하여 대조군을 기준(100)으로 했을 때의 비의 값을 산출하고 B세포의 활성화능의 값으로 했다. 또한, B세포의 활성화능의 시험은 반복 실시하고 B세포의 활성화능의 값에 대해 평균값(X^－)과 표준 오차(S. E.)를 구했다. 결과를 도 6 및 표 2에 나타낸다.

B세포의 활성화능에 대해서, 이하의 기준으로 평가를 실시했다. 식：「평균값(X^-)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이, 100 초과에서 120 미만의 경우를 「A」라고 하고, 120 이상에서 150 미만의 경우를 「AA」라고 하며, 150 이상의 경우를 「AAA」라고 한다. 결과를 표 2에 나타낸다.

(T세포의 활성화능)

T세포의 세포 표면 마커인 Brilliant Violet510 표지 항CD4 항체(BioLegend 사제)와 T세포의 활성화 마커인 PE표지 항CD69 항체(BioLegend사 제조)에 의해서, CD4 및 CD69를 발현하는 세포를 검출하여 그 수를 세었다. 그리고, T세포(CD4 양성(CD4^＋) 세포) 중, 활성화하고 있는 T세포(CD69^＋, CD4^＋)와 활성화하고 있지 않은 T세포(CD69^-, CD4^＋)의 몫(활성화하고 있는 T세포/활성화하고 있지 않은 T세포의 비의 값)을 산출했다. 동일하게 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않았던 것)에 있어서의, 활성화하고 있는 T세포(CD69^＋, CD4^＋)와 활성화하고 있지 않은 T세포(CD69-, CD4^＋)의 몫을 산출했다. 그 후, 이들 값을 비교하여 대조군을 기준(100)으로 했을 때의 비의 값을 산출하고 T세포의 활성화능의 값으로 했다. 또한, T세포의 활성화능의 시험은, 반복 실시하고 T세포의 활성화능의 값에 대해 평균값(X^-)과 표준 오차(S.E.)를 구했다. 결과를 도 7 및 표 2에 나타낸다.

T세포의 활성화능에 대해서, 이하의 기준으로 평가를 실시했다. 식：「평균값(X^－)－표준 오차(S.E.)」에 의해 산출되는 값이, 100 초과에서 120 미만의 경우를 「A」라고 하고, 120 이상에서 150 미만의 경우를 「AA」라고 하며, 150 이상의 경우를 「AAA」라고 한다. 결과를 표 2에 나타낸다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 대표 균주(No.1, 3, 13, 15, 19, 30, 31)은 비장 세포 중에서도 동일하게 B세포의 생존능 및 활성화능이 높고, 또, T세포에 대해도 생존능 및 활성화능이 높았다. 즉, 이들 내염성 유산균은 B세포에 직접적으로 작용하는 것에 의해서 B세포의 생존능 및 활성화능을 높이고 또한, T세포의 생존능 및 활성화능도 높이고 있다고 생각된다. 그 때문에, 이들 대표 균주는 면역 부활 작용을 발휘시키는 면역 부활제의 유효 성분으로서 채용할 수 있다고 생각된다.

또, 보다 구체적으로는 표 2로부터 분명한 바와 같이, No.1의 균주, No.13의 균주, No.19의 균주, 및 No.30의 균주의 내염성 유산균은 세포 생존능의 평가 및 B세포의 생존능의 평가가 모두 「AAA」이며, 또한, T세포의 생존능이 「A」이상이었다. 이 결과로부터, 각 세포(B세포, T세포를 포함)의 생존능이 대체로 뛰어난 것을 알 수 있다. 또, No.1의 균주, No.31의 균주의 내염성 유산균은 B세포의 생존능 및 활성화능의 모두가 매우 높고(B세포의 생존능의 평가가 「AAA」이며, B세포의 활성화능의 평가가 「AA」였다), 특히, No.31의 균주의 내염성 유산균은 B세포의 활성화능에 있어서의 평균값(X^－)이 다른 균주에 비해 높고, B세포의 활성화능이 매우 높은 것을 알 수 있다.

표 2 중, 「B220^＋생 세포수/총 세포수」는 총 세포의 수에 대한 「PI 검출되지 않고, violetFluor450 표지 항B220 항체와 반응한 B세포의 수」의 비율을 산출하고 있는 것을 나타낸다. 「CD4^＋생 세포수/총 세포수」는, 총 세포의 수에 대한 「PI 검출되지 않고, Brilliant Violet510 표지 항CD4 항체(BioLegend사 제조)와 반응한 T세포의 수」의 비율을 산출하고 있는 것을 나타낸다. 「CD86^＋, B220^＋／CD86^-, B220^＋」는 활성화하고 있는 B세포(CD86^＋, B220^＋)/활성화하고 있지 않은 B 세포(CD86-, B220＋)의 비의 값을 산출하고 있는 것을 나타낸다. 「CD4^＋, CD69^＋／CD4 ^＋, CD69^-」는 활성화하고 있는 T세포/활성화하고 있지 않은 T세포의 비의 값을 산출하고 있는 것을 나타낸다.

또한, 본 실시예에서는 B220 양성 세포에 주목하여 B세포에 대해 해석했지만, B220 양성 세포를 대신하여 CD19 양성 세포로 해석했을 경우에도 같은 결과를 얻을 수 있었다. 이것으로부터도, 소정의 균주에 의해서 B세포의 생존능 및 활성화능이 향상되고 있는 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 3)

대표 균주 중 No.1의 균주와 그 외의 균주(No.2, 20)에 대해서, 마이크로 어레이 해석을 실시하여 유전자 발현 상태를 조사했다.

＜DNA 마이크로 어레이 해석에 의한 유전자 발현 패턴의 조사＞

(1) RNA의 조제：

실험용 마우스(C57BL/6)의 비장으로부터 채취한 세포를 기본 배지 중에서, 5×10⁶ cells/5㎖/well가 되도록 6well 마이크로 플레이트(FALCON사 제조)에 파종했다. 그 후, 유산균 현탁액(0.1mg/㎖)를 50㎕씩 더하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 24시간 배양했다. 또한, 비장 세포 부유액에 균체(유산균 현탁액)를 첨가하지 않고, 균체를 첨가한 수준과 동일 조건(37℃, 5% CO₂의 조건하에서 24시간)으로 배양한 것을 대조군으로 하였다.

배양한 세포는, 비오틴-항B220 항체(TONBO Biosciences사 제조) 및 자기 비즈인 Streptavidin Particles Plus·DM(일본 BD사 제조)와 반응시킨 후, BD IMag Cell Separation System(일본 BD사 제조)에서 세포 분리를 실시하여 자석으로 끌어 당겨지는 세포(포지티브 프릭션)를 「B세포(B220 양성 세포)」로서 회수했다.

또한, 비장 세포의 조제는 실시예 2와 같은 방법으로 실시하고, 유산균 현탁액의 조제 및 B세포의 회수는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

RNA 추출은 ISOGEN II(닛폰·진 제조)를 사용하여 배양한 비장 세포로부터 분리한 B세포로부터 토탈 RNA를 추출했다. 그 후, 추출한 토탈 RNA를 주형으로 하여, 라벨링한 cDNA를 조제하고, DNA 마이크로 어레이 해석에 제공했다.

DNA 마이크로 어레이 해석은 아지렌트사 제조의 「SurePrint G3 Mouse Gene Expression 8×60K」를 사용했다. 그 후, 유전자 발현 소프트웨어 「Rversion 2.15.1(The R Foundation.)」에 의해서 해석했다.

「대조군에 있어서의 유전자 발현량」에 대한 「유산균 현탁액을 첨가했을 경우에 있어서의 유전자 발현량」을 산출했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또한, 표 3 중, 「2.0」이상인 경우에 대조군에 대해서 유의차가 있게 된다.

DNA 마이크로 어레이 해석의 결과, B세포에 No.1의 균주를 첨가하는 것으로, CD86 유전자나 CD70 유전자의 발현이 증가하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이들 유전자 발현이 증가하고 있는 것으로부터, B세포가 활성화하고 있는 것을 알 수 있다. 또, CD86나 CD70는 T세포 상의 각각 CD28, CD27를 통해 보조 시그널을 유도하고, T세포의 활성화에 중요하다는 것이 알려졌다. No.1의 균주를 첨가하는 것으로, T세포의 활성화에도 영향을 준다고 생각된다.

DNA 마이크로 어레이 해석의 결과로부터, No.1의 균주는 유전자 레벨에서도 B세포 및 T세포의 양쪽 모두를 활성하고 있는 것(즉, B세포의 생존능 및 활성화능을 향상시키고, 또한, T세포의 생존능 및 활성화능을 향상시키는 것)을 알 수 있었다.

또, 본 발명의 내염성 유산균을 첨가함으로써, 인터페론-γ의 발현량이 증가하고 있으며, 인터페론-γ의 산생을 유도하는 것에 의한 면역 부활 작용도 갖는 것을 알았다. 인터페론-γ은 항바이러스 효과를 갖는 사이토카인인 것이 알려졌다.

또, 본 발명의 내염성 유산균을 첨가함으로써, 인터류킨 10의 발현량도 증가하고 있었다. 인터류킨 10은, 강력한 항염증 작용을 갖는 사이토카인이며, 여러 가지 세포로 염증 작용이 있는 사이토카인의 방출을 억제한다. 따라서, 본 발명의 내염성 유산균에 의하면, 면역 부활 작용뿐만이 아니라, 면역 관용에도 작용하여, 면역 기능을 성숙시킨다고 생각된다.

또한, 본 발명의 내염성 유산균을 첨가함으로써, 인터류킨 22의 발현이 증가하고 있었다. 인터류킨 22는 조직 수복, 세포 생존·증식, 점막 바리어 방어에 관여하는 것이다.

또한, No.1의 균주는 인터류킨 12과 인터페론-β의 발현에는 B세포를 통해 직접적으로 영향을 주지 않는 것을 알았다. 인터류킨 12는 킬러 T세포나 NK세포(내츄럴 킬러 세포)에 대한 활성화 작용을 특징으로 하는 사이토카인이다. 인터페론-β는 면역 세포가 항바이러스 기능을 작용시키는데 있어서 최초로 산생되는 생리 활성 물질이다.

No.1의 균주를 첨가하는 것으로 얻어진 유전자 발현 패턴은 종래 알려지지 않고, 미지의 작용 기구로 면역 부활 작용을 나타내는 것이라고 추측된다.

또, 인터류킨 22는 CD4 양성 T세포, NK세포, NKT 세포 등의 면역 세포로부터 산생되는 것이 알려졌지만, B세포로부터의 산생에 대해서는 알려지지 않고, B세포에 근거하여 인터류킨 22의 발현량을 올리는 유산균에 대해서도 보고가 없다.

(비교예 1)

＜배지의 염분 농도의 검토＞

간장 양조에서 사용하고 있는 대표적인 내염성 유산균(테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주)에 대해서, 배지의 염분 농도를 6단계(6 샘플) 준비하고, 각 단계에 있어서의 배양 속도를 비교했다. 또한, 내염성 유산균(테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주)과 동시에 잡균도 첨가하여 공배양을 실시하고, 이들 배양 속도를 비교했다.

잡균으로서는 내염성 스타필로코쿠스속 세균을 사용했다. 또한, 식중독균을 포함하여 일반적인 균(세균)은, 식염에 대한 내성이 없고, 염분을 8w/v% 더욱 높게 하면, 충분히 증식을 억제할 수 있지만, 스타필로코쿠스속 세균의 일부는, 내염성인 것이 알려졌다. 이 때문에, 테트라게노코쿠스·할로필러스균의 배양에서 가장 오염(contamination)의 리스크가 있는 미생물의 1종이라고 할 수 있다.

또한, 사용한 스타필로코쿠스속 세균은 간장 제조 공정에 있어서, 간장 유산균을 배양하는 공정에서, 배지에 35℃에서 혼입해 오는 균이며, 그 중에 가장 내염성이 높은 균주(SN－2820주)이다. 또한, 배지에는 간장(이치비키사 제조의 상품명 「코이치쇼우」) 20w/v%, 포도당 1.7w/v%를 포함하며, 염분 농도 14w/v%가 되도록 식염을 첨가하여 pH 6.8로 조정한 것을 사용했다. 이 균주는 식염의 농도가 가장 높은 배지(염분 농도 18w/v%)에서도 조금 증식 가능했다.

또한, 배열표에 내염성 스타필로코쿠스속 세균 SN－2820주의 16 SrDNA 부분 염기 배열을 나타낸다. 배열표에 나타내는 염기 배열을 기존의 염기 배열 데이타베이스로부터 상동성이 높은 염기 배열을 검색한 결과, 스타필로코쿠스·사프로피티쿠스·서브스페시즈·사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus)의 16 SrDNA 부분 염기 배열과 일치했다. 이 결과로부터, SN－2820주는 스타필로코쿠스·사프로피티쿠스·서브스페시즈·사프로피티쿠스로 동정(同定)했다.

(배지)

질소원 및 미량 미네랄분으로서 코이쿠치쇼유(이치비키사 제조), 탄소원으로서 포도당(칸토카가쿠사 제조)을 사용하고, 그 외의 원료로서는, 식염(칸토카가쿠사 제조)과 물을 사용했다. 이와 같이, 간소하면서도 식품 원료만으로 이루어진 배지에서 검토했다.

코이쿠치쇼유는 모든 샘플에 대해 20v/v％로 하고, 포도당은 모든 샘플에 대해 1.7w/v%로 했다. 또한, 배지의 염분 농도가 8, 10, 12, 14, 16, 18w/v%의 6단계가 되도록 식염의 첨가량을 조정했다. 그리고 모든 샘플에 대해 pH가 7.0이 되도록 식품 첨가물의 수산화 나트륨(칸토카가쿠사 제조)으로 조정했다.

배지는 시험관(직경 18mm×180mm)에 10㎖씩 넣어 실리코센(신에츠 폴리머사 제조, 등록상표)으로 마개를 한 후, 121℃, 15분간 오토클레이브로 멸균을 했다.

(배양)

계대 배양을 상정하고, 동배지에서 전 배양해 둔 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주를 1v／v％ 첨가하여 초발 균수가 1.5×10⁷cfu/㎖가 되도록 식균했다. 또, 스타필로코쿠스속 세균은, 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주에 대해서 0.1v／v％혼입하는 것을 상정하고, 전 배양해 둔 스타필로코쿠스속 세균 SN－2820주를 첨가했다. 이때의 스타필로코쿠스속 세균의 초발 균수는 1.1×10⁴cfu/㎖였다. 그 후, 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주에 대해 30℃의 항온기 안에서 24시간, 및 72시간 정치 배양했다.

(균수의 측정)

24시간 정치 배양한 후의 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주의 생균수는, 「10 SG10N 평판 배지」에 희석균액을 도포하여 배양(30℃에서 4일간, 혐기 배양)한 후에 콜로니수를 계측했다. 또, 스타필로코쿠스속 세균은 표준 한천 배지(SA) 평판 배양법으로 배양한 후, 균수(생균)를 측정했다.

「10 SG10N 평판 배지」는, 간장(이치비키사 제조의 상품명 「코이쿠치쇼유」) 10v／v％, 포도당 1.0w/v%, 효모 엑기스 1.0w/v%, 폴리펩톤 0.5w/v%, 초산나트륨 3수화물 0.2w/v%, 염화나트륨 10w/v%, 「Tween80」0.0025w/v%, 황산마그네슘 7수화물 0.02w/v%, 황산 망간 4수화물 0.001w/v%, 황산철 7수화물 0.001w/v%를 함유하는 pH 6.8, 한천 2%의 것이었다.

그리고 24시간 후의 균수(생균)를 초발 균수로 나눈 값(24시간 후의 균수/초발 균수)을 24시간의 증식 배율(배/24시간)로서 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.

또한, 72시간 후의 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주의 균수를 「총 균수」라고 하고, 이 총 균수(생균과 사균의 합계(최종 수량))에 대해서는, 현미경 하에서 혈구 계산판을 사용하여 균수를 계측했다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주는 염분 농도 8∼14w/로 왕성하게 증식하고, 18w/에서도 충분히 증식할 수 있는 것을 알았다. 한편, 스타필로코쿠스속 세균은 염분 농도 8∼18w/v%의 범위에서는 염분 농도가 낮을수록 양호하게 증식했다. 또, 염분 농도 10w/v% 이하에서는, 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주보다 증식 배율이 높고, 염분 농도 8w/v%에서는 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주보다 약 8배의 속도로 증균했다.

이상의 결과로부터, 테트라게노코쿠스·할로필러스 DA－297주에서는 배지의 염분 농도를 14w/v% 이상으로 하는 것이 좋다는 것을 알았다. 한편, 내염성 유산균의 최종 수량은 염분 농도가 높을수록 낮아진다. 이 때문에, 염분 12w/v%에서도 내염성 스타필로코쿠스속 세균보다 생육 속도가 빠른 된장 유래의 내염성 유산균에 대해 이하의 실시예 4에서 검토했다.

(실시예 4)

＜내염성 유산균의 선발＞

본 실시예에서는, 배지의 염분 농도를 12w/v%로 한 경우에 대하여, No.1, 3, 13, 15, 19, 30, 31의 7개의 균주(7개의 샘플)를 대상으로 하고, 내염성 스타필로코쿠스속 세균 SN－2820주보다 증균 속도가 빠른 내염성 유산균의 선발을 실시했다.

(배지)

질소원 및 미량 미네랄분으로서 코이쿠치쇼유(이치비키사 제조), 탄소원으로서 포도당(칸토카가쿠사 제조)을 사용하고, 그 외의 원료로서는 식염(칸토카가쿠사 제조)과 물을 사용했다. 이와 같이, 간소하면서도 식품 원료만으로 이루어진 배지에서 검토했다.

상기 배지는 구체적으로는, 코이쿠치쇼유가 20v／v％, 포도당이 1.7w/v%, 염분 농도가 12w/v%가 되도록, 코이쿠치쇼유, 포도당, 및 식염을 물과 혼합하고 그 후, 식품 첨가물의 수산화나트륨(칸토카가구사 제조)으로 pH가 7.0이 되도록 조정한 것을 사용했다.

제작한 배지를 시험관(직경 18mm×180mm)에 10㎖씩 넣어 실리코센(등록상표)으로 마개를 한 후, 121℃, 15분간 오토클레이브로 멸균 처리했다.

(배양)

계대 배양을 상정하고, 동배지에서 전 배양해 둔 각 내염성 유산균을 1v／v％첨가했다. 이때 초발 균수는 3.7×10⁶∼1.5×10⁷ cfu/㎖였다. 또, 내염성 유산균에 대해서 스타필로코쿠스속 세균이 1v／v％ 혼입하는 것을 상정하여 전 배양해 둔 스타필로코쿠스속 세균 SN－2820주를 첨가했다. 이때의 스타필로코쿠스속 세균의 초발 균수는 1.8×10⁵∼5.7×10⁵cfu/㎖였다. 그 후, 모든 샘플(7개의 균주와 내염성 스타필로코쿠스속 세균 SN－2820주)을 30℃의 항온기 안에서 20시간 정치 배양했다.

(균수의 측정)

*이어서, 균수의 측정을 실시했다. 균수의 측정은 비교예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

20시간 배양 후의 균수를 초발 균수로 나눈 값(20시간 후의 균수/초발 균수)을 20시간의 증식 배율(배/20시간)로서 산출했다. 결과를 표 5에 나타낸다.

표 5에 나타낸 바와 같이, No.19의 균주 이외의 균주(No.1, No.3, No.13, No.15, No.30, No.31)에 대해서는, 염분 농도 12w/v%로 왕성하게 증식하고, 내염성 스타필로코쿠스속 세균보다 우위에 증식하는 것을 알았다. 또, 같은 결과는 염분 농도 14∼18w/v%에서도 얻을 수 있었다. 이와 같이, 본 발명의 내염성 유산균은 염분 농도 12∼18w/v%에서도 내염성 유산균을 양호하게 배양할 수 있고, 내염성 유산균에 대해서 1v／v％ 정도의 내염성 스타필로코쿠스속 세균이 혼입했다고 해도 내염성 유산균을 우선적으로 배양할 수 있는 것을 알았다.

배지의 염분 농도는 염분 농도 11w/v% 이상이면, 잡균(오염균)으로서 상정되는 내염성 스타필로코쿠스속 세균 등의 균보다 왕성하게 증식하기 때문에 바람직하다. 한편, 염분 농도 18w/v%에서는 내염성 유산균 자체의 증식 속도가 다른 염분 농도의 경우에 비교하여 늦어지는 경향이 있다. 이 때문에, 본 발명의 내염성 유산균은 염분 농도 11∼16w/v%로 배양하는 것이 바람직하고, 염분 농도 12∼16w/v%로 배양하는 것이 더욱 바람직하고, 염분 농도 12∼14w/v%로 하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 이 실험에서 사용한 전 배양액 상청에 대해 히스타민량을 측정했다. 측정에는, 「체크 칼라 히스타민(킷코만바이오케미파사 제조)」를 사용했다. 측정 결과, 모든 유산균 배양액으로 히스타민 농도가 20ppm 미만이 되어, 히스타민산생능은 없는 것을 알았다. 또한, 측정 방법은, 「체크 칼라 히스타민」에 첨부된 취급 설명서에 따랐다.

(실시예 5)

＜사이토카인 산생 세포의 측정 시험＞

실험용 마우스(C57BL/6)의 비장 세포에 살균 처리 후의 시험균체를 첨가하여 공배양하고, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 인터페론-γ의 각종 사이토카인의 산생 세포의 비율을 측정했다. 시험 균주로서는 대표 균주(No.1, 3, 13, 15, 19, 30, 31)과 그 외의 임의의 균주(No.2, 20)을 사용했다.

(1) 유산균 현탁액의 조제：

pH 6.8의 인산 완충액(PBS)으로 1mg/㎖의 농도가 되도록 현탁한 것 이외는, 실시예 1에서 조제한 유산균 현탁액과 동일하게 하여 조제했다.

(2) 비장 세포 부유액의 조제：

실험용 마우스(C57BL/6)의 비장으로부터 채취한 세포를 1.5㎖ 리액션 튜브(Greiner Bio－One사 제조)에 모아 0.5㎖의 적혈구 용해 버퍼(0.155M NH₄Cl, 0.01M Tris－HCl, pH7.5)를 더하여 비장 세포를 현탁하였다. 그 후, pH 6.8의 인산 완충액(PBS) 0.5㎖를 더하여 1200rpm로 5분간 원심 분리하고, pH 6.8의 인산 완충액(PBS)으로 2회 세정했다.

그 후, 기본 배지에서 현탁하고 비장 세포 부유액을 조제했다. 또한, 기본 배지는, 실시예 1과 동일한 것을 사용했다. 얻어진 비장 세포 부유액은 혈구 계산판을 사용하여 세포수를 계측했다.

(3) 세포 배양：

상기 비장 세포 부유액을 2×10⁶ cells/㎖가 되도록 기본 배지에서 조정하고, 6 well 마이크로 플레이트(FALCON사 제조)에 3㎖씩 파종하여, 6×10⁶ cells/3㎖/well로 했다. 그 후, 각 유산균 현탁액(1mg/㎖)을 30㎕씩 더하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 2일간 배양하고, 유산균 첨가 배양물을 얻었다. 또한, 상기 비장 세포 부유액에 균체(유산균 현탁액)를 첨가하지 않고, 균체를 첨가한 수준과 동일 조건(37℃, 5% CO₂의 조건)으로 배양한 것을 대조군으로 했다.

(4) 사이토카인의 측정：

상기 2일간 배양 중 42시간의 배양 후의 단계에서 각 배양액에 BD GolgiStop ^TM(BD사 제조)를 2㎕ 더하여 혼합하고, 그 후, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 다시 6시간 배양했다(배양 시간의 합계 48시간). 그 후, 배양한 세포 배양액을 15㎖ 코니칼튜브(BD사 제조)로 옮겨서, 1200rpm로 5분간 원심 분리하고, 세포를 회수했다. 그 후, 회수한 세포에 대해서, BD Cytofix/Cytoperm^TMFixation/Permeabilization Kit(BD사 제조)를 사용하여 고정·투과의 조작을 실시했다. 조작은 첨부의 설명서에 따랐다.

여기서, 사용하는 항체의 형편상, 인터류킨 22를 산생하는 세포와 인터페론-γ를 산생하는 세포의 확인을 실시하는 제1군과 인터류킨 10을 산생하는 세포의 확인을 실시하는 제2군의 2개의 군으로 나누어 세포 염색을 실시했다.

제1군에서는, PE표지 항인터류킨 22 항체(affymetrixe Bioscience사 제조), Alexa647 표지 항인터페론-γ항체(BD Pharmingen사 제조), 및 violetFluor450 표지 항B220 항체(TONBO Biosciences사 제조)를 사용했다.

제2군에서는, PE표지 항인터류킨 10 항체(BioLegend사 제조), Alexa647 표지 항인터페론-γ항체(BD Pharmingen사 제조), 및 violetFluor450 표지 항B220 항체(TONBO Biosciences사 제조)를 사용했다.

또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 인터류킨 22를 산생하는 세포와 인터류킨 10을 산생하는 세포를 동시에 검출할 때, PER 표지 항인터류킨 22 항체(affymetrixe Bioscience사 제조), Alexa647 표지 항인터류킨 10 항체(BDPharmingen사 제조), 및 violetFluor450 표지 항B220 항체(TONBO Biosciences사 제조)를 사용했다(제3군). 도 15∼도 17에서는, 염색 전의 세포를 3개의 군(상기 제1군에서부터 제3군)으로 나누어 각각에 대해 세포 염색을 한 결과를 나타내고 있다.

염색 후, 1200rpm로 5분간 원심 분리하여 세포를 회수하고, pH 6.8의 인산 완충액(PBS) 0.5㎖에 현탁하여 측정용 시료로 했다.

사이토카인의 측정은 유세포 분석(밀테니바이오텍사 제조 MACSQuant Analyzer)를 사용하여 실시하였다. 또한, 해석은 FCS 데이터 해석 소프트 FlowJo(FlowJo, LLC사 제조)를 사용했다.

(5) 사이토카인산생 세포량의 측정：

(5－1) 인터류킨 22의 산생 세포량：

유세포 분석으로 얻어진 유산균 첨가 배양물의 해석 결과에 대해서, 전비장 세포의 림프구 중의 인터류킨 22 양성 세포의 비율을 구했다. 아울러, B220 양성 세포(비장 B세포) 중의 인터류킨 22 양성 세포의 비율을 구했다.

또한, 유세포 분석으로 얻어진 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않고 배양한 것)의 해석 결과에 대해서, 상기 유산균 첨가 배양물의 경우와 동일하게 하여, 전비장 세포 중의 인터류킨 22 양성 세포의 비율을 구했다. 또한, 대조군에 있어서의 B220 양성 세포 중의 인터류킨 22 양성 세포의 비율을 구했다. 또한, 도 8에서는 유세포 분석에 있어서의 측정의 일례를 나타내며, 세로축이 B220의 발현을 나타내고, 가로축이 인터류킨 22의 발현을 나타내고 있다. 도 8중의 상단에는 대조군(control), 하단에는 No.1의 균주를 첨가했을 경우(「＋No.1」라고 기재)에 대해 나타내고 있으며, 또한, 도 8중의 좌측에는 전비장 세포의 림프구 중의 인터류킨 22 양성 세포의 비율을 나타내고, 우측에는 B220 양성 세포(비장 B세포) 중의 인터류킨 22 양성 세포의 비율을 나타낸다.

그리고 대조군에서 산출된 값을 기준(100)으로 했을 때의 상기 「전비장 세포 중의 인터류킨 22 양성 세포의 비율」을 산출해, 이 산출값을 전비장 세포 중의 인터류킨 22의 산생 세포량(IL－22^＋/전비장 세포)으로 했다. 같이 대조군으로 산출된 값을 기준(100)으로 했을 때의 상기 「B220 양성 세포 중의 인터류킨 22 양성 세포의 비율」을 산출하고, 이 산출치를 비장 B세포 중의 인터류킨 22의 산생 세포량(IL－22^＋／비장 B세포)으로 했다. 또한, 시험은, 반복해 실시하고, 평균값(X^-)과 표준 오차(S.E.)를 구했다. 본 실시예에 대해 「평균값(X^-)」는 6회의 시험(n=6)에 의한 평균값이다.

비장 B세포의 인터류킨 22의 산생 세포량(IL－22^＋／비장 B세포)에 대해서, 결과를 도 9, 및 표 6(「IL－22 산생량」의 「비장 B세포」의 란)에 나타낸다. 또한, 도 9 중, 「IL－22^＋／비장 B세포」는 비장 세포의 B세포 중 인터류킨 22의 산생 세포량(IL－22^＋／비장 B세포)을 나타낸다.

비장 세포 중 인터류킨 22의 산생 세포량(IL－22^＋／전비장 세포)에 대해서, 결과를 도 10, 및 표 6(「IL－22산생량」의 「전비장 세포」의 란)에 나타낸다. 도 10 중, 「IL－22^＋／전비장 세포」는 비장 세포 중 인터류킨 22의 산생 세포량(IL－22^＋／전비장 세포)을 나타낸다.

(5－2) 인터류킨 10의 산생 세포량：

인터류킨 10의 산생 세포량에 대해서도 상기 「인터류킨 22의 산생 세포량」의 측정 시험과 동일하게 하여 산출했다. 비장 세포의 B세포 중 인터류킨 10의 산생 세포량의 결과에 대해서는, 도 11 및 표 6에 나타내고, 비장 세포 중 인터류킨 10의 산생 세포의 양의 결과에 대해서는, 도 12 및 표 6에 나타낸다. 또한, 표 6중, 비장 세포의 B세포 중 인터류킨 10의 산생 세포의 양의 결과는 「IL－10 산생량」의 「비장 B세포」의 란에 나타내며, 비장 세포 중 인터류킨 10의 산생 세포의 양의 결과는 「IL－10산생량」의 「전비장 세포」의 란에 나타낸다.

또한, 도 11 중, 「IL－10^＋/비장 B세포」는, 비장 세포의 B세포 중 인터류킨 10의 산생 세포의 양을 나타낸다. 도 12 중, 「IL－10^＋／전비장 세포」는 비장 세포 중 인터류킨 10의 산생 세포의 양을 나타낸다.

(5－3) 인터페론-γ의 산생 세포량：

인터페론-γ의 산생 세포량에 대해서도 상기 「인터류킨 22의 산생 세포량」의 측정 시험과 동일하게 하여 산출했다.

또한, 비장 세포의 B세포 중 인터페론-γ의 산생 세포의 양의 결과에 대해서는 도 13 및 표 6에 나타내고, 비장 세포 중 인터페론-γ의 산생 세포의 양의 결과에 대해서는 도 14 및 표 6에 나타낸다. 또한, 표 6 중, 비장 세포의 B세포 중 인터류킨 22의 산생 세포의 양의 결과는 「IFN－γ산생량」의 「비장 B세포」의 란에 나타내며, 비장 세포 중 인터류킨 22의 산생 세포의 양의 결과는 「IFN－γ산생량」의 「전비장 세포」의 란에 나타낸다.

도 13 중, 「IFN－γ^＋／비장 B세포」는 비장 세포의 B세포 중 인터페론-γ의 산생 세포의 양을 나타낸다. 도 14 중, 「IFN－γ^＋／전비장 세포」는 비장 세포 중 인터페론-γ의 산생 세포의 양을 나타낸다.

이상의 결과로부터 대표 균주(No.1, 3, 13, 15, 19, 30, 31)과 비장 세포를 공배양하면, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ를 산생하는 B세포의 비율이 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않고 배양한 것)에 비해 증대하는 것을 알았다(도 9, 도 11, 도 13 참조). 또, B세포에만 한정되지 않고, 비장 세포 전체에서도 이들 대표 균주에 의해, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ를 산생하는 세포의 비율이 증대하는 것을 알았다(도 10, 도 12, 도 14 참조).

또한, 실시예 3의 DNA 마이크로 어레이 해석에서는 대표 균주의 No.1의 균주에 의해서, B세포에 대해 인터류킨 22, 인터류킨 10, 인터페론-γ의 산생이 유도되는 것을 나타낸다. 또한, 본 실시예에서는 in vitro에서의 세포 배양에 있어서의 사이토카인의 측정 시험을 실시했다. 그 결과, No.1의 균주로 한정되지 않으며 대표 균주의 모두에서 인터류킨 22, 인터류킨 10, 인터페론-γ의 산생이 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로는, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 인터페론-γ는 B세포를 포함한 비장 세포 중에서 산생이 유도되어 내염성 유산균인 상기 대표 균주와의 공배양에 의해서, 상기 사이토카인을 산생하는 세포의 양이 1.1∼5배 정도로 증대하는 것을 알았다(도 9∼도 14, 표 6 참조).

(B세포의 서브세트)

도 15∼도 17에는, 전비장 세포의 림프구, 및 비장 B세포(B220 양성(B220 ^＋) 세포의 사이토카인 산생을 유세포 분석으로 해석한 결과를 나타낸다. 구체적으로는, 도 15는 인터류킨 22와 인터류킨 10으로 전개한 결과를 나타내며, 도 16은 인터류킨 22와 인터페론-γ로 전개한 결과를 나타내고, 도 17은 인터류킨 10과 인터페론-γ로 전개한 결과를 나타낸다.

도 15∼도 17로부터 알 수 있듯이, 전비장 세포 및 비장 B세포(B220 양성(B220^＋) 세포)의 어느 경우에서도, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 인터페론-γ 중 2종 이상을 산생하는 세포는 확인할 수 없었다. 즉, 한 개의 세포는 인터류킨 22, 인터류킨 10, 인터페론-γ 중 1종만을 산생하고 있는 것을 알았다.

또한, 도 15∼도 17에는 No.1의 균주를 첨가한 결과를 나타내고 있지만, 대표 균주를 포함한 어느 검사대상 물체에서도 No.1의 균주와 같은 결과를 얻을 수 있었다.

여기서, 헬퍼 T세포에는 사이토카인 산생의 특징에 의해서 분류되는 서브세트(아집단)이 존재하는 것이 알려졌다. 구체적으로는, 헬퍼 T세포에는, Th1 세포(인터페론-γ를 산생하는 것을 특징으로 하는 것)나, Th2 세포(인터류킨 4를 산생하는 것을 특징으로 하는 것), Th9 세포(인터류킨 9를 산생하는 것을 특징으로 하는 것), Th17 세포(인터류킨 17을 산생하는 것을 특징으로 하는 것), Th22 세포(인터류킨 22를 산생하는 것을 특징으로 하는 것) 등과 같이, 다른 사이토카인을 산생하는 역할을 갖는 것이 존재하는 것이 알려져 있다.

한편, B세포에 대해서는 서브세트가 존재하는 것은 알려지지 않았지만, 도 15∼도 17의 결과로는 B세포에 대해서도 헬퍼 T세포와 같이 서브세트가 존재하는 것을 알았다. 즉, B세포에는 「인터류킨 22를 산생하는 B세포」, 「인터류킨 10을 산생하는 B세포」, 「인터페론-γ를 산생하는 B세포」가 따로따로 존재하는 것을 알았다. B세포 중 제어성 B세포는 인터류킨 10을 산생하는 것이 알려졌다. 이 중에서 「인터류킨 10을 산생하는 B세포」란 제어성 B세포라고 생각되며 이들 유산균에 의해 제어성 B세포도 증가 또는 활성화 된다고 생각된다.

또한, 대조군(유산균 현탁액을 첨가하지 않고 배양한 것)에서도 인터류킨 22, 인터류킨 10, 인터페론-γ를 산생하는 B세포가 미량이지만 검출되었다. 그 결과, 통상의 조건(유산균을 포함하지 않는 배양 조건) 하에서도 B세포가 상기 사이토카인(인터류킨 22, 인터류킨 10, 인터페론-γ)을 산생하는 것을 알았다.

본 실시예에서는 B220 양성 세포를 검출하여 B세포에 대해 해석했지만, B220 양성 세포를 대신하여 CD19 양성 세포로 해석했을 경우에도 동일하게 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ를 산생하는 세포가 검출되었다. 이 결과로부터도 B세포가 상기 사이토카인을 산생하고, 대표 균주에 의해 상기 사이토카인의 산생이 유도되는 것을 알았다.

(실시예 6)

＜유산균의 급이 시험＞

살균 처리한 유산균의 균체를 실험용 마우스(C57BL/6)에 급이하고, 그 후의 마우스의 혈액 중의 혈청 IgA를 측정했다. 유산균으로서는 대표 균주 중, No.1 및 No.30의 균주를 사용했다.

(1) 유산균 배합사료의 조제：

통상의 마우스용 사료에 살균 처리하고, 그 후 동결 건조한 유산균의 균체를 1(w/w)%량 함유한 사료를 조제했다. 또한, 통상의 마우스용 사료로서는 마우스 사육 번식용 사료 CE－2(일본 쿠레아사 제조)를 사용했다.

(2) 급이 시험：

통상의 실험용 마우스(C57BL/6)(8주령·암컷) 6마리를 2군으로 나누고, 한쪽에는 유산균 배합사료를 주고(유산균 투여군), 다른 한쪽에는 유산균의 균체를 포함하지 않는 통상의 마우스용 사료를 주어 사육했다(대조군(유산균 비투여군)). 시험 개시보다 14일간 후에 각각 혈액을 채취하여 원심분리에 의해 혈청을 회수하여 조제했다.

(3) IgA의 측정：

조제한 혈청 중의 총 IgA 농도를 ELISA법에 의해 측정했다.

측정에는 MICROLON 96 웰 마이크로 플레이트(Greiner Bio－One사 제조)를 사용했다. 항원으로서 Goat Anti－Mouse IgA－UNLB 항체(Southern Biotech사 제조), 2차 항체로서 Goat Anti－Mouse IgA－AP conjugate(Southern Biotech사 제조)를 사용하여 발색 기질에 Alkaline Phosphatase Substrate(SIGMA사 제조)를 사용했다. 또, 흡광도(405nm)의 측정은 Vmax Kinetic Microplate Reader(Molecular Devices 사 제조)를 사용했다. 여기서, 단계 희석한 대조군의 검사대상 물체를 사용하여 흡광도와 IgA 농도의 검량선을 작성했다. 그리고 이 검량선을 사용하여 유산균 투여군의 검사대상 물체와 대조군(유산균 비투여군)의 검사대상 물체에 대한 IgA 농도를 산출했다. 그 후, 대조군(유산균 비투여군)에 있어서의 IgA 농도의 평균값을 기준값(100)으로 하여 각 검사대상 물체의 IgA 농도의 상대값을 구했다.

유산균 투여군과 대조군(유산균 비투여군)의 각 수치에 대해서, F검정을 실시하여 분산에 유의차가 있는지를 확인을 했다. 그 후, Student'st검정(이것은, 등분산을 가정한 2표본에 의한 검정임)을 실시했다.

그 결과, 표 7, 표 8, 도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, No.1균, No.30균의 유산균 투여군은 대조군(유산균 비투여군)과 비교하여 혈청 중의 IgA 농도가 각각 약 25%, 약 22% 상승하고 있었다. 그리고 Student'st검정의 결과는 각각 p＜0.05(p=0.038), p＜0.01(p=0.0001)되어, 유의 수준 5% 및 1%로 유의차가 인정되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 내염성 유산균의 섭취에 의해서, 혈청 중의 총 IgA 농도가 증대하고 본 발명의 내염성 유산균에 의해 면역 부활화능이 증대하는 것을 알았다.

이상으로부터, 표 1∼표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 내염성 유산균은 B세포에 직접 작용하는 것에 의해서 B세포의 생존능 및 활성화능을 향상시키고, 또한, T세포의 생존능 및 활성화능을 향상시키는 것을 알았다. 이러한 것으로부터, 본 발명의 내염성 유산균은 면역 부활 작용을 갖는다는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 내염성 유산균 중 No.1의 균주는 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생을 유도하는 것을 알았다. 또한, 표 6에 나타낸 바와 같이, No.1의 균주 이외에, No.3, 13, 15, 19, 30, 31의 균주에 대해서도, 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생을 유도하는 것을 알았다. 그리고 대표 균주의 내염성 유산균은, 혈청 중의 총IgA 농도를 증대시키고, 이들 유산균에 의해 면역 부활화능이 증대한다고 생각된다(표 7, 표 8, 도 18 및 도 19 참조). 또, 표 4, 표 5에 나타낸 바와 같이, 염분 농도 11∼18w/v%이면, 본 발명의 내염성 유산균을 선택적으로 양호하게 배양할 수 있고, 오염균의 증식을 억제할 수 있다는 것을 알았다.

본 발명의 내염성 유산균은 음식품, 서플리먼트, 의약품 등에 첨가하여 면역 부활 작용을 발휘시키는 면역 부활제의 유효 성분으로서 채용하거나 이를 음식품, 서플리먼트, 의약품 등으로 하거나 할 수 있다. 본 발명의 내염성 유산균의 배양 방법은 본 발명의 내염성 유산균의 배양 방법으로서 채용할 수 있다. 본 발명의 면역 부활제는 음식품, 서플리먼트, 의약품 등에 첨가하여 면역 부활 작용을 발휘시키는 면역 부활제로서 사용하거나 이를 음식품, 서플리먼트, 의약품 등으로 하거나 할 수 있다. 음식품으로서는 예를 들면, 된장, 즉석 된장국, 조리 된장(된장 가공품), 킨잔지(Kinzanji) 된장 등의 나메 된장, 간장, 국물, 조미 소스, 조미한 국물, 절임(아사즈케)의 소 등의 가공 조미료, 밥의 소 등의 조미 식품, 반찬, 아마자케(누룩 음료), 단팥죽 등을 들 수 있다.

NATIONAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY AND EVALUATION (NITE) PATENT MICROORGANISMS DEPOSITARY

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SEQUENCE LISTING <110> ICHIBIKI CO., LTD. NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO MEDICAL AND DENTAL UNIVERSITY <120> Halophilic lactic acid bacteria, method for culturing halophilic lactic acid bacteria, immunostimulant <130> WA-2199 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1000 <212> DNA <213> Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus <400> 1 gggcaatgcg ggtgctatac atgcagtcga gcgaacagat aaggagcttg ctcctttgac 60 gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctacc tataagactg ggataacttc 120 gggaaaccgg agctaatacc ggataacatt tggaaccgca tggttctaaa gtgaaagatg 180 gttttgctat cacttataga tggacccgcg ccgtattagc tagttggtaa ggtaacggct 240 taccaaggca acgatacgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg gaactgagac 300 acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg 360 acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggg tttcggctcg taaaactctg ttattaggga 420 agaacaaatg tgtaagtaac tgtgcacatc ttgacggtac ctaatcagaa agccacggct 480 aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540 cgtaaagcgc gcgtaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600 agggtcattg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag 660 cggtgaaatg cgcagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta 720 actgacgctg atgtgcgaaa gcgtggggat caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780 gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840 cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg 900 gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa 960 atcttgacat cctttgaaaa ctctagagat agagccttcc 1000

Claims

B세포의 생존능을 향상시키는 능력 및 B세포의 활성화능을 갖는, 면역 부활 작용을 갖는 수탁 번호 NITE BP－02318의 내염성 유산균.
청구항 1에 있어서,
상기 내염성 유산균은 인터류킨 22, 인터류킨 10, 및 인터페론-γ의 산생을 유도하는, 내염성 유산균.
청구항 1 또는 2의 내염성 유산균을 함유하는 면역 부활제.