KR20220038588A - 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 항염증성 사이토카인의 산생 유도 활성이 높은 비피더스균 - Google Patents
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Abstract
(과제) 본 발명은, 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖고, 식음료 제품에 적합하게 이용할 수 있는 유아 장 내 유래의 비피더스균 및 상기 비피더스균을 함유하는 식음료 제품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
(해결 수단) 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖는 비피도박테리움·브리브 N708주(NITE BP-02958)를 제공한다. 또한, 상기 비피더스균을 함유하는 식음료 제품을 제공한다.
(해결 수단) 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖는 비피도박테리움·브리브 N708주(NITE BP-02958)를 제공한다. 또한, 상기 비피더스균을 함유하는 식음료 제품을 제공한다.
Description
본 발명은, 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖는 유아 장 내 유래의 비피더스균(bifidobacteria)의 균주 및 그의 균체(bacterial cell)를 함유하는 음료 또는 식품에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 비피도박테리움·브리브(Bifidobacterium breve)에 관한 것이다.
비피더스균은, 요구르트 등의 발효유 제품, 각종 절임류 등, 대부분의 가공 식음료 제품에 있어서, 맛이나 풍미의 부여, 영양의 강화, 식품의 보존성 개선 등 여러 가지 목적으로 이용되어 왔다. 최근 비피더스균은 항알레르기 및 면역 자극(immunostimulating) 효과 등과 같은 유효한 생리 활성에 대해서 주목을 끌고 있고, 정력적으로 연구가 수행되고 있다.
면역계는 사이토카인이라고 불리우는 면역 조절 물질에 의해 제어되고 있다. 여기에서, 사이토카인의 일 예로서는, 인터류킨(interleukin)(IL)이 알려져 있다. 예를 들면, IL-10은, 수지상 세포(dendritic cell)나 제어성 T세포 등의 면역 세포가 산생하는 항염증성 사이토카인이다. IL-10은 면역 반응을 억제하는 능력을 갖고, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 알레르기 질환 등을 일으키는 과도한 면역 반응을 억제하는 역할을 담당하고 있다.
한편, IL-12는, 수지상 세포나 2형 도움 T(Th2) 세포 등의 면역 세포가 산생하는 염증성 사이토카인이다. IL-12는 염증을 촉진하는 능력을 갖는다.
항염증성 사이토카인인 IL-10을 높이는 것은, 만성 염증성 질환에서 보이는 결합 조직의 파괴를 제어하는데에 유효하다고 생각되고 있고, IL-10 산생을 효율적으로 유도하는 미생물로서, 락토코쿠스속(genus Lactococcus)의 균주가 얻어진 것이 특허문헌 1에 기재되어 있다. 또한, 염증을 억제하는 관점에서, 염증성 사이토카인인 IL-12의 산생을 억제하는 것도 중요하다고 생각된다. 따라서, IL-10 산생을 촉진하고, 또한 IL-12 산생을 유도하지 않는 소재, 즉 IL-10 산생량/IL-12 산생량의 비율을 높이는 소재를 찾을 수 있다면, 항염증 효과가 높은 소재나 그를 이용한 제품을 제공할 수 있어, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 알레르기 질환의 완화를 기대할 수 있다.
본 발명은, 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖는 유아 장 내 유래의 비피더스균 및 상기 비피더스균을 함유하는 식음료 제품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 분리원(isolation source)으로서 유아 분변을 이용하는 다수의 비피더스균에 대해서 스크리닝을 행했다. 그 결과, 본 발명자들은, 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖는 비피더스균이 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본원 제1 발명은, 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖는 비피도박테리움속에 속하는 비피더스균이다.
본원 제2 발명은, 상기 비피더스균이, 비피도박테리움·브리브 N708주(株)(NITE BP-02958)인, 본원 제1 발명에 기재된 비피더스균이다.
본원 제３ 발명은, 본원 제1 발명 또는 본원 제2 발명에 기재된 비피더스균을 함유하는 식음료 제품이다.
본 발명의 비피더스균은, 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖는다.
도 1은, 본 발명의 균주와 비교 균주 간의 IL-10 산생량(pg/ml)을 비교한 도면이다.
도 2는, 본 발명의 균주와 비교 균주 간의 IL-12 산생량(pg/ml)을 비교한 도면이다.
도 3은, 본 발명의 균주와 비교 균주 간의 IL-10 산생량/IL-12 산생량의 비율을 비교한 도면이다.
도 2는, 본 발명의 균주와 비교 균주 간의 IL-12 산생량(pg/ml)을 비교한 도면이다.
도 3은, 본 발명의 균주와 비교 균주 간의 IL-10 산생량/IL-12 산생량의 비율을 비교한 도면이다.
(발명을 실시하기 위한 형태)
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 비피도박테리움·브리브 N708주(NITE BP-02958)
본 발명의 비피더스균은 비피도박테리움·브리브이다. 본 발명에 있어서의 N708의 기호는, 닛신쇼쿠힝홀딩스가부시키가이샤에서 독자로 균주에 부여한 번호이다. 본 발명의 균주는, 유아 분변으로부터 본 발명자에 의해 처음으로 분리된 것이다.
본 발명의 비피도박테리움·브리브 N708주는, 하기의 조건으로 기탁되어 있다.
(1) 기탁 기관명: 일본의 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터
(2) 연락처: (우)292-0818 일본 지바현 키사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8, #122
(3) 수탁 번호: NITE BP-02958
(4) 식별을 위한 표시: N708
(5) 기탁일: 2019년 5월 29일
본 발명의 비피도박테리움·브리브 N708주의 균학적 성질은, 이하의 표 1 및 표 2에 나타내는 바와 같다. 이들 균학적 성질은, Bergey's manual of systematic bacteriology Vol.2(1986)에 기재된 방법에 따른다. 표 1은 본 균주의 형상 등을, 표 2는 아피(Api) 20A(비오메리으 제조)에 의한 생리적 및 생화학적 성상 시험의 결과를 나타낸다. 표 2에 있어서, 「＋」가 양성, 「－」는 음성을 나타낸다.
2. IL-10 및 IL-12 산생 유도 능력 평가 시험
본 발명의 비피도박테리움·브리브 N708주는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 항염증성의 IL-10 산생 유도능이 높고, 그리고 염증성의 IL-12 산생 유도능이 낮은 균주이다. IL-10 및 IL-12 산생 유도능의 평가는, 이하의 시험 방법에 따라 수행했다.
<균체의 조제>
IL-10 및 IL-12 산생 유도능 평가 시험에 이용된 피험체(사균 분말(killed bacterial cell powder))는, 비피더스균을 표 3에 나타내는 GAM 배지(medium)(닛스이)에서 24시간 동안 37℃로, 전(前) 배양과 본 배양을 했다. 다음으로, 증식한 본 배양액 중의 균체를 원심 분리하여 집균하고, 분리된 균체를 멸균수로 3회 세정하고, 가열 살균 후, 동결(frozen)했다. 그 후, 균체를 동결 건조기를 이용하여 동결 건조를 하여, 건조 사균 분말을 얻었다.
<IL-10 및 IL-12 산생 유도 능력 평가 시험>
본 발명의 균주의 IL-10 및 IL-12 산생 유도능을 평가하기 위해, 인간 말초혈 CD14＋단구(monocyte)를 론자 재팬 가부시키가이샤로부터 구입하고, 참고문헌(Monika et al., Regulation of the IL-10/IL-12 axis in human dendritic cells with probiotic bacteria. (2011) FEMS Immunol Med Microbiol. 63:93-107.)에 따라 수지상 세포로 분화 유도했다. 즉, 인간 말초혈 CD14＋단구를 20ng/mL의 GM-CS(Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor), 20ng/mL의 IL-4 및 10％ FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지에서, 37℃, 5％ CO2 조건하에서 6일간 배양함으로써 수지상 세포로 분화 유도했다. 세포 회수 후에 세포수를 조정하여, 96웰(well) 배양 플레이트에 1×105세포/well씩 분배했다. 거기에 상기에서 얻은 건조 사균 분말을 100ng/mL가 되도록 첨가한 후, 그의 혼합물을 37℃, 5％ CO2 조건하에서 6시간 배양했다. 추가로, IL-12p70 유도제(0.1μL/mL Lipopolysaccharide, 20ng/mL IFN-γ 및 50ng/mL TNF-α)를 더하여 그의 혼합물을 18시간 배양했다. 참고로, IL-12p70 유도제가 첨가된 수지상 세포는, 스트레스 환경하에 놓이면 염증성 사이토카인인 IL-12p70의 산생이 증가한다. 본 발명에서는, 스트레스 환경하에 수지상 세포를 두어도, IL-10의 산생을 유도하고, 또한 IL-12의 산생은 유도하지 않는 균주를 찾을 목적으로, 수지상 세포에 IL-12p70 유도제를 더했다. 배양 후 배양상청액을 회수하고, 배양상청액 중의 IL-10은 IL-10 Human Uncoated ELISA Kit(Invitrogen)에 의해 측정하고, IL-12는 Human IL-12p70 Uncoated ELISA(Invitrogen)에 의해 측정했다.
3. 식음료 제품
본 발명의 비피더스균은 식음료 제품에 함유시켜 사용할 수 있다. 본 발명의 비피더스균은 특히 음료에 적합하게 이용할 수 있고, 예를 들면, 발효유 및 유산균 음료를 생각할 수 있다. 현행의 유(Milk) 및 유제품의 성분 규격 등에 관한 성령(Ministerial Ordinance)에 따르면, 성분 규격으로서, 발효유(무지유 고형분 8.0％ 이상의 것)와 유제품 유산균 음료(무지유 고형분 3.0％ 이상의 것)는 1.0×107cfu/mL 이상이 요구되고, 또한 유산균 음료(무지유 고형분 3.0％ 미만의 것)는 1.0×106cfu/mL 이상이 요구되고, 또한 유 등의 발효액 중에서 유산균을 증식시키거나, 최종 제품의 형태에서 유산균을 증식시키거나 함으로써 상기의 균수를 실현할 수 있다. 비피더스균을 함유하는 발효유 및 유산균 음료에 더하여, 버터 등의 유제품, 마요네즈 등의 달걀 가공품, 버터 케이크 등의 단 빵 등에도, 본 발명의 비피더스균이 이용될 수 있다. 또한, 즉석면이나 쿠키 등의 가공 식품에도, 본 발명의 비피더스균이 적합하게 이용될 수 있다. 상기의 외, 본 발명의 식품은, 상기 비피더스균과 함께, 필요에 따라서 적당한 담체 및 첨가제를 더하여 정제화된(formulated) 형태(예를 들면, 분말, 과립, 캡슐, 정제(tablet))일 수도 좋다.
본 발명의 비피더스균은, 일반의 음료나 식품 이외에도 특정 보건용 식품, 영양 보조 식품 등에 함유시키는 것도 유용하다.
또한, 본 발명의 비피더스균은, 식품 이외에도 스킨 로션 등의 화장품 분야, 정장제 등의 의약품 분야, 치약 등의 일용품 분야, 사일리지, 동물용 먹이, 액체 식물 비료 등의 동물 사료 및 식물 비료 분야에 있어서도 응용 가능하다.
실시예
이하, 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<시험예 1> IL-10 및 IL-12 산생 유도 활성 평가 시험
본 발명의 비피도박테리움·브리브 N708주와, 닛신쇼쿠힝홀딩스가부시키가이샤 보유의 3개의 비피도박테리움·브리브 비교 균주(Bbr1, Bbr2, Bbr3) 및 표준주인 비피도박테리움·브리브 JCM1192에 대해서 IL-10 및 IL-12 산생 유도능을 평가했다.
IL-10 및 IL-12 산생 유도능은, 다음의 순서에 따라 평가했다. 본 발명의 비피더스균, 표준주 및 비교 균주(Bbr1, Bbr2, Bbr3)를, 표 3에 나타내는 GAM 배지(GAM Broth "Nissui")에서 37℃로 24시간 배양하고, 증식한 균체를 원심 분리하여 집균했다. 분리한 균체를 멸균수에서 3회 세정하고, 가열 살균 후, 동결했다. 그 후, 상기 균체를 동결 건조기를 이용하여 동결 건조하여, 건조 사균 분말을 얻었다.
인간 말초혈 CD14＋단구를 20ng/mL의 GM-CS(Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor), 20ng/mL의 IL-4 및 10％ FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지에서, 37℃, 5％ CO2 조건하에서 6일간 배양함으로써 수지상 세포로 분화 유도했다. 세포 회수 후 세포수를 조정하고, 96웰 배양 플레이트에 1×105세포/well씩 분주했다. 거기에, 상기에서 얻은 건조 사균 분말을 100ng/mL가 되도록 첨가한 후, 37℃, 5％ CO2 조건하에서 그의 혼합물을 6시간 배양했다. 추가로, IL-12p70 유도제(0.1μL/mL Lipopolysaccharide, 20ng/mL IFN-γ 및 50ng/mL TNF-α)를 첨가하여 그의 혼합물을 18시간 배양했다. 배양 후, 배양상청액을 회수하고, 배양상청액 중의 IL-10은 IL-10 Human Uncoated ELISA Kit(Invitrogen)에 의해 측정하고, IL-12는 Human IL-12p70 Uncoated ELISA(Invitrogen)에 의해 측정했다. 그의 결과를 도 1∼도 3에 나타낸다.
도 1로부터도 명백한 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움·브리브 N708주의 IL-10 산생량은 145pg/mL이고, 표준주 및 비교 균주(Bbr1, Bbr2, Bbr3)보다 높은 IL-10 산생 유도 능력을 갖고 있는 것이 확인되었다. 도 2로부터, 비피도박테리움·브리브 N708주는 다른 균주와 비교해도 IL-12 산생을 유도하지 않는 것도 확인되었다. 또한, 도 3에 나타내는 바와 같이, 비피도박테리움·브리브 N708주의 IL-10 산생량/IL-12 산생량의 비율이 다른 균주와 비교하여 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 2> 스킴 밀크 배지 증식성 시험
본 발명의 비피도박테리움·브리브 N708주와 표준주인 비피도박테리움·브리브 JCM1192에 대해서, 스킴 밀크 배지 증식성 시험을 실시했다.
10％ SM(스킴 밀크)＋0.5％ 효모 엑기스 배지에 식균하고, 37℃에서 24시간 배양하여, 생균 수(viable cell count)에 따라 스킴 밀크 배지에서의 증식성을 평가했다. 그의 결과를 표 4에 나타낸다.
본 발명의 비피도박테리움·브리브 N708주의 균수는 9.21x108cfu/ml이고, 발효유 및 유산균 음료를 생산하는데에 있어서 문제가 없는 수준이었다.
Claims (3)
- 염증성 사이토카인의 산생 유도 활성은 낮지만 높은 항염증성 사이토카인 산생 유도 활성을 갖는 비피도박테리움속(genus Bifidobacterium)에 속하는 비피더스균.
- 제1항에 있어서,
상기 비피더스균은, 비피도박테리움·브리브(Bifidobacterium breve) N708주(株)(NITE BP-02958)인, 비피더스균. - 제1항 또는 제2항에 기재된 비피더스균을 함유하는 식음료 제품.
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