JP6345642B2 - 新規乳酸菌 - Google Patents
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Description
本発明は、高い免疫調節作用を有するクランベリー由来の乳酸菌の菌株及びその菌体を含有する飲料、食品に関するものである。特に、ラクトコッカス・ラクティスに関するものである。
乳酸菌は、ヨーグルトなどの発酵乳製品、各種漬物類など、多くの加工飲食品において、味や風味の付与、栄養の強化、食品の保存性改善など様々な目的で用いられてきた。また、乳酸菌のアレルギー抑制といった有効な生理活性について近年注目が集まっており、精力的に研究が進められている。
免疫系において重要な役割を担っているTh細胞は、産生するサイトカインによりTh1細胞とTh2細胞に分類される。Th1細胞はインターフェロンγ（以下「IFN-γ」という）など主に細胞性免疫関わるサイトカインを、Th2細胞はインターロイキン4（以下「IL-4」という）など主に液性免疫に関わるサイトカインを産生する。Th2細胞の産生するIL-4は、B細胞からのIgE産生を促進するが、Th1細胞の産生するIFN-γは、IgE産生を抑制する。Th1細胞とTh2細胞はお互いに拮抗し、バランスを保つことにより免疫系の恒常性が維持されているが、Th1細胞が優位に傾くと自己免疫疾患、Th2細胞が優位に傾くとIgE産生が増えてアレルギーが発症される（非特許文献１）。
したがって、アレルギーを抑制するためには、Th1細胞の数あるいはTh1細胞由来のサイトカイン産生量を増やすことによりTh1細胞とTh2細胞のバランスを正常に戻す必要があり、Th1細胞とTh2細胞の共通の前駆細胞（Th0細胞）をTh1細胞に分化誘導することによりTh1細胞を優位にする働きのある、抗原提示細胞由来のインターロイキン12（以下「IL-12」という）産生を促進する乳酸菌株が求められている。
プロバイオティクス・プレバイオティクス・バイオジェニックス-腸内細菌の関わりを中心とした研究と意義-、日本ビフィズス菌センター、2006年、pp.177-180
本発明は、高い免疫調節作用を有するクランベリー由来の乳酸菌及び当該乳酸菌を含有する飲食品を提供することを目的とする。
本発明者らは、種々の果実、野菜等を分離源として、乳酸菌について検討を行った結果、クランベリー由来の乳酸菌に高い免疫調節作用を有する株があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本願第一の発明は、クランベリー由来の免疫調節作用を有するラクトコッカス属菌であり、より詳細には、ラクトコッカス・ラクティスT21株（NITE BP-02164）である。
さらに、本願出願人は、当該乳酸菌を含む飲食品も意図している。すなわち、本願第二の発明は、ラクトコッカス・ラクティスT21株（NITE BP-02164）を含有する飲食品である。
本発明の乳酸菌は、高い免疫調節作用を有する。摂取した場合に免疫機能を賦活化することによりアレルギーを抑制することが可能となる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ラクトコッカス・ラクティスT21株（NITE BP-02164）
本発明の乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティス（lactococcus lactis）である。特にラクトコッカス・ラクティスに属する乳酸菌のうち、ラクトコッカス・ラクティスT21株である。本発明にいうT21の記号は日清食品ホールディングス株式会社で独自に菌株に付与した番号である。本ラクトコッカス・ラクティスT21株はクランベリーより本発明者の一人によって初めて分離されたものである。
１．ラクトコッカス・ラクティスT21株（NITE BP-02164）
本発明の乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティス（lactococcus lactis）である。特にラクトコッカス・ラクティスに属する乳酸菌のうち、ラクトコッカス・ラクティスT21株である。本発明にいうT21の記号は日清食品ホールディングス株式会社で独自に菌株に付与した番号である。本ラクトコッカス・ラクティスT21株はクランベリーより本発明者の一人によって初めて分離されたものである。
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株は、下記の条件で寄託されている。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室
（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２１６４
（４）識別のための表示：Ｔ２１
（５）原寄託日：２０１５年１１月２０日
（６）ブダペスト条約に基づく寄託への移管日：２０１６年１０月１２日
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株の菌学的性質は、以下の表１及び２に示す通りである。本菌学的性質は、Bergey’s manual of systematic bacteriology Vol.2(1986)に記載の方法による。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室
（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２１６４
（４）識別のための表示：Ｔ２１
（５）原寄託日：２０１５年１１月２０日
（６）ブダペスト条約に基づく寄託への移管日：２０１６年１０月１２日
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株の菌学的性質は、以下の表１及び２に示す通りである。本菌学的性質は、Bergey’s manual of systematic bacteriology Vol.2(1986)に記載の方法による。
２．IL-12産生能試験
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株は、後述する実験例に示すように、高い免疫調節作用、すなわちIL-12の高い産生誘導能力を有する。IL-12の産生誘導能力の確認については以下の試験方法によって行った。
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株は、後述する実験例に示すように、高い免疫調節作用、すなわちIL-12の高い産生誘導能力を有する。IL-12の産生誘導能力の確認については以下の試験方法によって行った。
＜菌体の調製＞
菌体を表３に示すMRS培地（Difco Lactobacilli MRS Broth）で30℃ ・48時間培養した。次いで、増殖した菌体を遠心分離して集菌し、分離した菌体を滅菌水にて3回洗浄し、凍結した。その後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、乾燥菌体粉末を得た。
菌体を表３に示すMRS培地（Difco Lactobacilli MRS Broth）で30℃ ・48時間培養した。次いで、増殖した菌体を遠心分離して集菌し、分離した菌体を滅菌水にて3回洗浄し、凍結した。その後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、乾燥菌体粉末を得た。
＜IL-12産生誘導評価＞
IL-12産生誘導評価では、細胞としてマウス由来マクロファージ様細胞株であるJ774.1細胞を使用した。はじめに、10%の非動化FBS（Invitrogen）とPenicillin-Streptomycin（Invitrogen）、NaHCO3（Sigma）、L- glutamine（Invitrogen）を加えたRPMI1640培地（日水製薬）を用いて、J774.1細胞を37℃ CO2 5%の条件下で培養した。そして、24穴の培養プレートの1穴ごとに2.5×105 cells/mlのJ774.1細胞を2mlずつ加え、そこに上記で得た乾燥菌体粉末をJ774.1細胞培養培地で0.1 mg/mlの濃度になるよう懸濁して100μl添加し37℃ 5%CO2条件下で24時間培養した。培養後培地を回収し3500 rpmで2分間遠心分離を行い、培養上清を得た。Mouse Total IL-12 ELISA kit（Thermo scientific）を用いて培養上清中のIL-12を測定した。
IL-12産生誘導評価では、細胞としてマウス由来マクロファージ様細胞株であるJ774.1細胞を使用した。はじめに、10%の非動化FBS（Invitrogen）とPenicillin-Streptomycin（Invitrogen）、NaHCO3（Sigma）、L- glutamine（Invitrogen）を加えたRPMI1640培地（日水製薬）を用いて、J774.1細胞を37℃ CO2 5%の条件下で培養した。そして、24穴の培養プレートの1穴ごとに2.5×105 cells/mlのJ774.1細胞を2mlずつ加え、そこに上記で得た乾燥菌体粉末をJ774.1細胞培養培地で0.1 mg/mlの濃度になるよう懸濁して100μl添加し37℃ 5%CO2条件下で24時間培養した。培養後培地を回収し3500 rpmで2分間遠心分離を行い、培養上清を得た。Mouse Total IL-12 ELISA kit（Thermo scientific）を用いて培養上清中のIL-12を測定した。
３．スキムミルク培地での増殖性試験
＜スキムミルク培地増殖性試験＞
前培養液を10％SM（スキムミルク）培地に植菌し、これを30℃ ・48時間培養し、乳酸菌数、pHによってミルク培地での増殖性を評価した。
＜スキムミルク培地増殖性試験＞
前培養液を10％SM（スキムミルク）培地に植菌し、これを30℃ ・48時間培養し、乳酸菌数、pHによってミルク培地での増殖性を評価した。
４．飲食品
本発明の乳酸菌は飲食品に含有せしめて使用することができる。本発明の乳酸菌は特に飲料に好適に用いることができるが、例えば、発酵乳及び乳酸菌飲料が考えられる。現行の乳及び乳製品の成分規格等に関する省令では、成分規格として発酵乳（無脂乳固形分8.0％以上のもの）や乳製品乳酸菌飲料（無脂乳固形分3.0％以上のもの）であれば1.0×10７産生誘導能力/ml以上、乳酸菌飲料（無脂乳固形分3.0％未満のもの）であれば1.0×10６cfn/ml以上必要とされるが、乳などのはっ酵液中で増殖させたり、最終製品の形態で増殖させたりすることによって上記の菌数を実現することができる。また、発酵乳及び乳酸菌飲料以外にも、バター等の乳製品、マヨネーズ等の卵加工品、バターケーキ等の菓子パン類等にも利用することができる。また、即席麺やクッキー等の加工食品にも好適に利用することができる。上記の他、本発明の食品は、前記乳酸菌と共に、必要に応じて適当な担体及び添加剤を添加して製剤化された形態（例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤等）であってもよい。
本発明の乳酸菌は飲食品に含有せしめて使用することができる。本発明の乳酸菌は特に飲料に好適に用いることができるが、例えば、発酵乳及び乳酸菌飲料が考えられる。現行の乳及び乳製品の成分規格等に関する省令では、成分規格として発酵乳（無脂乳固形分8.0％以上のもの）や乳製品乳酸菌飲料（無脂乳固形分3.0％以上のもの）であれば1.0×10７産生誘導能力/ml以上、乳酸菌飲料（無脂乳固形分3.0％未満のもの）であれば1.0×10６cfn/ml以上必要とされるが、乳などのはっ酵液中で増殖させたり、最終製品の形態で増殖させたりすることによって上記の菌数を実現することができる。また、発酵乳及び乳酸菌飲料以外にも、バター等の乳製品、マヨネーズ等の卵加工品、バターケーキ等の菓子パン類等にも利用することができる。また、即席麺やクッキー等の加工食品にも好適に利用することができる。上記の他、本発明の食品は、前記乳酸菌と共に、必要に応じて適当な担体及び添加剤を添加して製剤化された形態（例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤等）であってもよい。
本発明の乳酸菌は、一般の飲料や食品以外にも特定保健用食品、栄養補助食品等に含有させることも有用である。
また、本発明の乳酸菌は、食品以外にも化粧水等の化粧品分野、整腸剤等の医薬品分野、歯磨き粉等の日用品分野、サイレージ、動物用餌、植物液体肥料等の動物飼料・植物肥料分野においても応用可能である。
本発明のクランベリー由来の乳酸菌（ラクトコッカス・ラクティスT21株）は、高い免疫調節作用を有する。摂取した場合に免疫機能を賦活化することによりアレルギーを抑制することが可能となる。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜試験例１＞IL-12産生誘導評価
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株と、自社保有の3つのラクトコッカス・ラクティス比較菌株（LL1、LL2、LL3）についてIL-12産生誘導評価を実施した。
＜試験例１＞IL-12産生誘導評価
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株と、自社保有の3つのラクトコッカス・ラクティス比較菌株（LL1、LL2、LL3）についてIL-12産生誘導評価を実施した。
IL-12産生誘導評価は次の手順により行った。本発明の菌株と比較菌株のそれぞれについて、表３に示すMRS培地（Difco Lactobacilli MRS Broth）で30℃ ・48時間培養し、増殖した菌体を遠心分離して集菌し、分離した菌体を滅菌水にて3回洗浄し、凍結した。その後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、乾燥菌体粉末を得た。
別途、10%の非動化FBS（Invitrogen）とPenicillin-Streptomycin（Invitrogen）、NaHCO3（Sigma）、L- glutamine（Invitrogen）を加えたRPMI1640培地（日水製薬）を用いて、J774.1細胞を37℃ CO2 5%の条件下で培養した。そして、24穴の培養プレートの1穴ごとに2.5×105 cells/mlのJ774.1細胞を2mlずつ加え、そこに上記で得た乾燥菌体粉末をJ774.1細胞培養培地で0.1 mg/mlの濃度になるよう懸濁してそれぞれ100 μl添加し、37℃ 5%CO2条件下で24時間培養した。培養後培地を回収し3500 rpmで2分間遠心分離を行い、培養上清を得た。Mouse Total IL-12 ELISA kit（Thermo scientific）を用いて培養上清中のIL-12を測定した。
その結果を表４及び図１に示す。
表４及び図１からも明らかなように、本発明の乳酸菌（ラクトコッカス・ラクティスT21株）のIL-12産生量は6056 pg/mlであり、他の自社保有のラクトコッカス・ラクティスと比べて高いIL-12産生誘導能力を有していることが確認された。
＜試験例２＞スキムミルク培地増殖性試験
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株と、自社保有の3つのラクトコッカス・ラクティス比較菌株（LL1、LL2、LL3）について、スキムミルク培地増殖性試験を実施した。
本発明のラクトコッカス・ラクティスT21株と、自社保有の3つのラクトコッカス・ラクティス比較菌株（LL1、LL2、LL3）について、スキムミルク培地増殖性試験を実施した。
10％SM（スキムミルク）培地に植菌し、これを30℃ ・48時間培養し、乳酸菌数、pHによってスキムミルク培地での増殖性を評価した。
結果を表５及び図２に示す。
本発明の菌株（ラクトコッカス・ラクティスT21株）の菌数は7.6×108cfu/mlであり、はっ酵乳、乳酸菌飲料を生産する上で問題のないレベルであった。
Claims (3)
- ラクトコッカス・ラクティスＴ２１（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２１６４）株。
- 請求項１に記載の菌株を含む飲食品。
- 請求項１に記載の菌株を含む錠剤。
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