CN116836835A - 一株蜡样芽胞杆菌bce01及其在防治生鱼诺卡氏菌病和促生长中的应用 - Google Patents

一株蜡样芽胞杆菌bce01及其在防治生鱼诺卡氏菌病和促生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株蜡样芽胞杆菌BCE01及其在防治生鱼诺卡氏菌病和促生长中的应用。所述蜡样芽胞杆菌于2023年3月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No.63217，分类学命名为Bacillus cereus。本发明中的蜡样芽孢杆菌具有对诺卡氏菌显著的拮抗效果，可用于抑制诺卡氏菌生长，预防或治疗鱼类诺卡氏菌感染。同时，其还能够有效促进鱼类的生长发育，对于渔业养殖具有极为重要的意义。

Description

一株蜡样芽胞杆菌BCE01及其在防治生鱼诺卡氏菌病和促生 长中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株蜡样芽胞杆菌BCE01及其在防治生鱼诺卡氏菌病和促生长中的应用。
背景技术
生鱼，是辐鳍鱼纲、鲈形目、鳢科、鳢属鱼的统称，一般为乌鳢(Channa argus)与斑鳢(Channa maculata)人工杂交而成的杂交鳢，因具有生长快和抗病力强双重优势，已成为生鱼高密度养殖放养比例最高的品种之一。生鱼是鳢科鱼类中个体大、生长快、产量和经济价值较高的名贵经济鱼类，其营养丰富、肉质细嫩，有"鱼中珍品"之称，广东省是其主产区。然而，制约生鱼高密度养殖盈利的关键因素中，病害及其造成的损失排在第1位。其中危害最为严重的是以内脏"白点"为临床症状的诺卡氏菌病。
诺卡菌属(Nocardia spp.)是一种丝状的革兰氏阳性细菌，在自然界中发现作为土壤腐生菌，然而它们也是条件致病菌，诺卡菌属细菌中的某些种类对鱼类具有致病性。在自然感染的情况下诺卡氏菌可从鱼消化道、损伤部位或鳃部位进入其体内，而人工感染如腹腔注射、口灌和浸泡诺卡氏菌同样能使健康鱼致病。近年来，诺卡氏菌病对我国各省市水产养殖业影响很大，先后在大口鲈、七星鲈、斑鳢、大黄鱼、生鱼等养殖鱼类中暴发该病，造成了巨大的经济损失。
目前，鱼类诺卡氏菌病防治研究的主要方向有抗生素、疫苗和中草药等。抗生素滥用所导致的种种弊端已逐步显现，其所引起的内源性感染、环境污染、药物残留、抗药性及扩散等一系列负面效应给动物和人类健康带来巨大的威胁。疫苗防治鱼类诺卡氏菌病有广阔前景，尽管有一些灭活疫苗或弱毒疫苗已问世，但仍然处于实验室阶段，尚无针对鱼类诺卡氏菌病的商业疫苗，疗效还需时间检验，且其研究周期往往也相对较长。中草药对于治疗鱼类诺卡氏菌病有着巨大优势，但目前关于中草药防治鱼类诺卡氏菌病的研究较少，需要进一步研究。近年来，鱼类病害的防治已由化学防治逐渐向生物防治转变，其中以拮抗微生物或其代谢产物为核心的生物防治技术因其靶向性强、可选择范围广、对人畜安全无害、对环境无污染、不耐药等特点而备受学者们关注。生防微生物的应用成为防治动物的重要手段之一，利用拮抗菌防治鱼类病害已有相关报道，但目前关于生鱼诺卡氏菌病生防细菌相关研究几乎空白。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一株蜡样芽胞杆菌BCE01及其在防治生鱼诺卡氏菌病和促生长中的应用。本发明中成功筛选分离得到了一株对生鱼诺卡氏菌病原具有明显拮抗效果的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCE01，并发现该蜡样芽孢杆菌还具有促进生鱼生长发育的效果，可以有效用于生鱼诺卡氏菌的感染防控，从而降低诺卡氏菌感染带来的损失，提高渔业养殖业的稳定性和市场可发展性。
本发明的第一个方面，提供蜡样芽胞杆菌，所述蜡样芽胞杆菌为蜡样芽胞杆菌BCE01，分类学命名为Bacillus cereus，于2023年3月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No.63217。
在本发明的一些实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌的16S rRNA如SEQ ID NO：3所示。
在本发明的一些实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌分离自鱼肠道。
在本发明的一些实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌在营养琼脂上的生长特征为白色、湿润、不透明、不规则菌落。
本发明的第二个方面，提供一种培养物，所述培养物由本发明第一个方面所述的蜡样芽胞杆菌在发酵底物中发酵得到。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵底物为发酵培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养基为：按照每L发酵培养基计，含有胰蛋白胨17.0g、大豆蛋白胨3.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g(pH值7.3±0.2)。
在本发明中，术语“培养物”是指在一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。在本发明中，所述培养物包括但不限于：蜡样芽胞杆菌BCE01接种或移植于任意形态(液体或固体)的培养物培养物中所得到的含菌溶液或培养物。
本发明的第三个方面，提供一种菌剂，所述菌剂中含有本发明第一个方面所述的蜡样芽胞杆菌和/或其培养物。
在本发明的一些实施方式中，所述菌剂中还含有辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括但不限于保护剂、抗氧化剂、微量元素、氮源物质、碳源物质、载体、溶剂、表面活性剂。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的蜡样芽胞杆菌在制备饲料添加剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌的添加量为饲料总重的0.01％～0.05％。
在本发明的一些实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌的添加量为饲料总重的0.02％。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的蜡样芽胞杆菌在促进水产生长发育中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述水产为鱼。
在本发明的一些实施方式中，所述鱼包括生鱼。
在本发明中，通过体内试验验证发现本发明中分离得到的蜡样芽胞杆菌BCE01能够显著促进生鱼的生长性能及肠道消化酶活性，从而促进生鱼的生长发育。
在本发明的一些实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌和饲料混合后使用。
在本发明的一些实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌的添加量为饲料总重的0.01％～0.05％。
在本发明的一些实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌的添加量为饲料总重的0.02％。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的蜡样芽胞杆菌在制备预防和/或治疗水产诺卡氏菌感染的药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述水产为鱼。
在本发明的一些实施方式中，所述鱼包括生鱼。
在本发明中，通过体内试验验证发现本发明中分离得到的蜡样芽胞杆菌BCE01能够延缓诺卡氏菌感染导致的鱼体死亡，为进一步控制诺卡氏菌感染的扩散以及诺卡氏菌病的治疗争取到了更多的宝贵时间。此外，其还极大的降低了诺卡氏菌感染导致的死亡率，产生了显著的治疗效果。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括但不限于粉型、水剂、颗粒剂、片剂、微囊剂、注射剂。当然，本领域技术人员也可以现有工艺制备其他剂型的产品，以便于其在特定环境下的使用，维持其治疗和预防效果。
在本发明的一些实施方式中，所述药物中的蜡样芽胞杆菌BCE01有效含量为108～109CFU/mL。
本发明的有益效果是：
1.本发明成功筛选分离得到了一株蜡样芽孢杆菌，该蜡样芽孢杆菌具有对诺卡氏菌显著的拮抗效果，可用于抑制诺卡氏菌的生长，具有极为广泛的应用性。
2.本发明中的蜡样芽孢杆菌BCE01在兼具抑制诺卡氏菌、预防或治疗鱼类诺卡氏菌感染的效果的同时，还能够有效促进鱼类的生长发育，对于渔业养殖具有极为重要的意义。
附图说明
图1为蜡样芽孢杆菌BCE01发酵液的抑菌活性对照图，其中，A为诺卡氏菌空白对照，B为蜡样芽孢杆菌BCE01发酵液的抑菌(诺卡氏菌)活性结果。
图2为蜡样芽孢杆菌BCE01的16S rRNA系统发育树。
图3为蜡样芽孢杆菌BCE01对生鱼诺卡氏菌感染的防治效果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCE01的分离及筛选
从鱼肠道中分离到多株芽孢杆菌，对这些芽孢杆菌进一步分离、培养和纯化。使用试纸扩散法，以诺卡氏菌为靶标病原菌，对分离出的芽孢杆菌进行拮抗菌株筛选，并测定其抑菌圈直径。
结果如图1所示。通过筛选，得到了一株的抑制诺卡氏菌效果最好的芽孢杆菌，抑菌圈直径约32mm，初步拟定其编号为BCE01。
蜡样芽孢杆菌BCE01的鉴定
为了进一步确认所得BCE01菌株的相关信息，对该菌株进行分子生物学鉴定。
具体步骤为：
提取BCE01菌株的DNA为模板，使用PCR手段对其16S rRNA进行扩增。
PCR扩增体系如表1所示。
表1 PCR扩增体系
组分 含量
2×Taq PCR Master Mix 12.5μL
DNA模板 1μL
上游引物(F) 1μL
下游引物(R) 1μL
无菌水 9.5μL
总体积 25μL
其中，上游引物为：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO：2)。
PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环33次；72℃延长10min。扩增产物进行16S rRNA测序，以确定菌种无误。
得到的BCE01菌株的16S rRNA基因序列为：
5’-TTATTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT-3’(SEQ ID NO：3)。
将得到的BCE01菌株的16S rRNA序列与与Genebank上的相关16S rRNA序列进行比对，比对方法采用Cluster X方法。同时，基于1000个重复的抽样分析，使用MEGA 4.0按邻接法构建系统树。
构建得到的BCE01菌株16S rRNA系统发育树如图2所示。
根据系统发育理论，菌株间相似性只有大于97％，才能认为统一菌株。目标菌株与蜡样芽胞杆菌属相似性达97％，因此，菌株BCE01被界定为蜡样芽胞杆菌(B.cereus)。
该蜡样芽胞杆菌在营养琼脂上的生长特征为白色、湿润、不透明、不规则菌落。可使用的培养基为：按照每L发酵培养基计，含有胰蛋白胨17.0g、大豆蛋白胨3.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g(pH值7.3±0.2)。
将上述实施例中得到的蜡样芽胞杆菌于2023年3月3日送至广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)进行保藏。分类学命名为：Bacillus cereus，保藏编号为：GDMCC No.63217。
蜡样芽孢杆菌BCE01对生鱼的实际影响
(1)蜡样芽孢杆菌BCE01对生鱼的促生作用：
将120尾生鱼随机分为2组，每组设3个重复(每个重复20尾，每组共60尾)。按照分组情况，分别对两组投喂不同的饲料。其中，对照组投喂生鱼基础日粮，BCE01组在投喂等量生鱼基础日粮的基础上，额外添加质量分数为0.02％的蜡样芽孢杆菌BCE01。
投喂量的确定按照以下要求进行：将生鱼暂养7d后称重，按鱼体重的2～4％称取饲料进行投喂，每天投喂3次(8：30、13：30和18：30)。取食结束后吸出未被进食的多余饲料。后续根据饲料剩余情况调整投饲量，尽可能在使其饱食的同时保证无饲料剩余。
饲养期间，水温为19.6～28.8℃，平均为(23.34±3.15)℃。每天9：00、14：00各测水温1次，测溶氧1次(溶氧应保持在6mg/L以上)，早晚采用流水系统各吸污1次。饲养21d后，分析蜡样芽孢杆菌BCE01对生鱼生长性能(体重)和肠道消化酶(肠道α-淀粉酶)活性的影响。
其中，肠道α-淀粉酶活性检测步骤：
(1)取样：试验结束时从每组中随机取鱼6尾于冰盘上解剖。取出肠道(含内容物)组织用4℃的去离子水冲洗然后用滤纸吸干水分放入冰箱中(-20℃)备用。
(2)酶液制备：测定前将肠道组织解冻，取中肠食糜约0.5g放入10mL离心管，加入4mL的预冷(4℃)离子水，充分混匀后在4℃下以4000r/min离心30min，取上清液。
(3)淀粉酶活性测定：
使用淀粉酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，比色法)进行淀粉酶活性测定，使用方法参考其说明书，根据660nm波长下测定吸光度(OD)计算淀粉酶活性。在本实施例中，淀粉酶活性单位的表示形式为：1g食糜在37℃，pH7.0的条件下，每分钟水解1mg的淀粉则为1个淀粉酶活力单位。
淀粉酶活性的计算公式为：
式中，OD空白代表空白管(双蒸水)吸光度，OD测定代表测定管吸光度；
0.4为底物缓冲液浓度，1为1mg淀粉，4为酶液总体积，0.02为测定取样酶液体积；
m表示样品质量。
结果如表1和表2所示。
表1蜡样芽孢杆菌BCE01对生鱼增重率的影响(n＝30)
组别 21d前鱼体重(g) 21d后鱼体重(g) 增重率％
对照组 16.27±0.54 24.66±1.38 51.57±1.79b
BCE01 14.87±0.84 26.30±2.14 76.87±2.76a
其中，相同字母上标表示同样的显著差异性。
表2蜡样芽孢杆菌BCE01对生鱼肠道淀粉酶活性的影响(n＝6)
组别 淀粉酶活性(U/g)
对照组 43.63±15.31a
BCE01 49.18±11.45b
其中，相同字母上标表示同样的显著差异性。
结果显示，以未添加蜡样芽孢杆菌BCE01的饲料作为对照组，以添加蜡样芽孢杆菌BCE01的饲料作为试验组，在进行21d的投喂实验后，添加蜡样芽孢杆菌BCE01的组中的生长性能及肠道消化酶活性与对照组相比存在显著差异。进而可以证明，蜡样芽孢杆菌BCE01的加入有效促进了生鱼的生长发育，其具有生鱼促生效果。
(2)蜡样芽孢杆菌BCE01对生鱼诺卡氏菌感染的防治效果：
按照上述实施例中的方法进行分组，按照各组对应的投喂类别进行投喂，在投喂21d后，进行诺卡氏菌的感染。其中，空白组为日粮投喂+不攻毒处理；对照组为日粮投喂+攻毒处理；BCE01实验组为添加蜡样芽孢杆菌BCE01的日粮投喂+攻毒处理。
攻毒处理的具体操作为：将诺卡氏菌(广州容大养殖基地发病生鱼肝脏组织中分离得到)制备成1×107CFU/mL浓度的菌悬液，采用腹鳍根部注射的方式感染生鱼。空白组注射等体积的TSB液体培养基。每天观察生鱼情况，连续观察2周，并记录生鱼死亡情况。
结果如图3所示。
结果表明，与攻毒对照组(仅日粮投喂，诺卡氏菌攻毒)相比，蜡样芽孢杆菌BCE01投喂组(添加拮抗菌，诺卡氏菌攻毒)的鱼体死亡发生时间延后了4d，延缓了死亡的发生，为进一步控制提供了时间。且在攻毒后第14天，攻毒对照组死亡率为100％(在第8天鱼体均已死亡，达到了100％)。而蜡样芽孢杆菌BCE01投喂组死亡率为60％，极大的降低了诺卡氏菌攻毒造成的死亡。上述结果表明，蜡样芽孢杆菌BCE01的生鱼防治诺卡氏菌导致的疾病有显著效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.蜡样芽胞杆菌，其特征在于，所述蜡样芽胞杆菌为蜡样芽胞杆菌BCE01，分类学命名为Bacillus cereus，于2023年3月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：63217。
2.根据权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌，其特征在于，所述蜡样芽胞杆菌的16S rRNA如SEQ ID NO：3所示。
3.一种培养物，其特征在于，所述培养物由权利要求1中所述的蜡样芽胞杆菌在发酵底物中发酵得到。
4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1中所述的蜡样芽胞杆菌和/或其培养物。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还含有辅料。
6.权利要求1或2所述的蜡样芽胞杆菌、权利要求3所述培养物和/或权利要求4～5任一项所述的菌剂在制备饲料添加剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蜡样芽胞杆菌的添加量为饲料总重的0.01％～0.05％。
8.权利要求1或2所述的蜡样芽胞杆菌、权利要求3所述培养物和/或权利要求4～5任一项所述的菌剂在促进水产动物生长发育中的应用。
9.权利要求1或2所述的蜡样芽胞杆菌、权利要求3所述培养物和/或权利要求4～5任一项所述的菌剂在制备预防和/或治疗水产诺卡氏菌感染的药物中的应用。
10.根据权利要求8～9任一项所述的应用，其特征在于，所述水产为鱼，优选包括生鱼。
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