CN110651035A - 高含有双链rna的乳酸菌的制造方法和该乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供用于以良好的效率得到含有大量双链RNA的乳酸菌的方法和利用该方法得到的双链RNA含量高的乳酸菌。上述目的通过下述手段得以解决:(1)一种含有双链RNA的乳酸菌的制造方法,其包括通过将乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养而得到含有双链RNA的乳酸菌的工序;以及(2)一种含有双链RNA的乳酸菌,其双链RNA的含量与在最适温度且非通气条件下以相同的培养时间对相同的菌株进行培养时的双链RNA的含量相比为2.0倍以上;等等。
Description
技术领域
本发明涉及双链RNA的含量高的乳酸菌的制造方法和该乳酸菌。
背景技术
已知在天然免疫系统细胞应答中,树突细胞、巨噬细胞等免疫细胞对来源于细菌、病毒的天然免疫活化物质发生应答而产生干扰素、细胞因子,引起之后的免疫反应。天然免疫系统细胞应答是生物共有的感染防御机制,由于是非特异性的,因此具有反应快速、对多数感染源有效发挥功能的特征。
参与天然免疫系统细胞应答的免疫细胞通常藉由Toll样受体(Toll-likeReceptor;TLR)引起免疫反应。TLR是存在于细胞膜、内体的蛋白质之一,通过识别细胞外的天然免疫活化物质并将其信息传递至细胞内而引导干扰素、细胞因子等生理活性物质的产生。
已知作为TLR之一的TLR3识别病毒的双链RNA,以MyD88非依赖的方式诱导干扰素β启动子的活化和干扰素β的产生。干扰素β使树突细胞活化,诱导白细胞介素12等炎性细胞因子的产生。进而,白细胞介素12使初始T细胞分化诱导为I型辅助T(Th1)细胞,由此确立天然免疫系统细胞应答。
由病毒的双链RNA引起的TLR3介导的天然免疫系统细胞应答会带来免疫反应的活化或抑制,能够将天然免疫调节至正常。但是,为了调节天然免疫而使用病毒本身作为双链RNA在安全性方面是不现实的。
因此,想到利用不会对人体产生不良影响的微生物作为双链RNA含有物、或者利用由该微生物分离出的双链RNA来代替病毒的双链RNA。特别是若使用有食用经验的乳酸菌等作为不会对人体产生不良影响的微生物,能够日常地使天然免疫保持良好。例如,专利文献1中记载了在由盐分所致的应激条件下使菌体内生产双链RNA的乳酸菌及其制造方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第5099649号公报
发明内容
发明所要解决的问题
但是,根据本发明人调查的结果,由盐分所致的应激条件会使乳酸菌中显著地表现出增殖抑制,结果有时难以大量得到含有双链RNA的乳酸菌。这样,根据乳酸菌的不同,会因应激条件的种类引起显著的增殖抑制,结果无法以良好的效率含有双链RNA。
因此,本发明的目的在于提供用于以良好的效率得到含有大量双链RNA的乳酸菌的方法和利用该方法得到的双链RNA的含量高的乳酸菌。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究,结果,令人惊讶地,通过在通气条件下对通常在非通气条件下培养的乳酸菌进行培养,成功地增加了乳酸菌的双链RNA的含量。但是,本发明人发现,难以维持乳酸菌的菌体内的双链RNA量,特别是双链RNA量容易随着培养时间的经过而减少。
因此,经过进一步的反复试验后发现,通过在通气条件的基础上在低温度条件下对乳酸菌进行培养,能够降低乳酸菌的增殖速度,能够相应地减缓菌体内的双链RNA的含量的降低。并且,令人惊讶地,通过将通气条件与低温度条件组合,成功地以工业性规模得到了含有双链RNA的乳酸菌。这些发现和成功例是本发明人首次提出的。并且,本发明是基于这些发现和成功例而完成的发明。
因此,根据本发明的一个方式,提供下述(1)~(12)所示的方式的乳酸菌、组合物和方法。
(1)一种含有双链RNA的乳酸菌的制造方法,其包括通过将乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养而得到含有双链RNA的乳酸菌的工序。
(2)如(1)所述的含有双链RNA的乳酸菌的制造方法,其中,包括通过将乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件下的培养而得到含有双链RNA的乳酸菌的工序。
(3)如(1)或(2)所述的制造方法,其中,含有双链RNA的乳酸菌中的双链RNA的含量与在最适温度且非通气条件下以相同的培养时间对相同的菌株进行培养时的双链RNA的含量相比为2.0倍以上。
(4)如(1)~(3)中任一项所述的制造方法,其中,含有双链RNA的乳酸菌中的双链RNA的含量为每1mg干燥菌体中20ng以上。
(5)如(1)~(4)中任一项所述的制造方法,其中,上述乳酸菌为选自由片球菌(Pediococcus)属乳酸菌、乳球菌(Lactococcus)属乳酸菌、乳杆菌(Lactobacillus)属乳酸菌、链球菌(Streptococcus)属乳酸菌、明串珠菌(Leuconostoc)属乳酸菌和四联球菌(Tetragenococcus)属乳酸菌组成的组中的至少一种。
(6)一种抑制乳酸菌的双链RNA的含量降低的方法,其包括通过将乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养而抑制该乳酸菌的双链RNA的含量降低的工序。
(7)一种含有双链RNA的乳酸菌的筛选方法,其包括通过将多个乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养来筛选含有双链RNA的乳酸菌的工序。
(8)一种含有双链RNA的乳酸菌,其双链RNA的含量与在最适温度且非通气条件下以相同的培养时间对相同的菌株进行培养时的双链RNA的含量相比为2.0倍以上。
(9)一种含有双链RNA的乳酸菌,其双链RNA的含量为每1mg干燥菌体中20ng以上。
(10)如(8)或(9)所述的乳酸菌,其中,上述乳酸菌为选自由片球菌(Pediococcus)属乳酸菌、乳球菌(Lactococcus)属乳酸菌、乳杆菌(Lactobacillus)属乳酸菌、链球菌(Streptococcus)属乳酸菌、明串珠菌(Leuconostoc)属乳酸菌和四联球菌(Tetragenococcus)属乳酸菌组成的组中的至少一种。
(11)一种组合物,其含有(8)~(10)中任一项所述的乳酸菌。
(12)如(11)所述的组合物,其中,上述组合物为选自由饮食品用组合物、饮食品原料用组合物、饲料用组合物和饲料原料用组合物组成的组中的一种。
发明效果
根据本发明的一个方式的方法和乳酸菌,能够以良好的效率得到双链RNA的含量高的乳酸菌。特别是本发明的一个方式的方法是用于以工业性规模制造双链RNA的含量高的乳酸菌的格外显著优良的方法。另外,根据本发明的一个方式的组合物,通过所含有的含有双链RNA的乳酸菌的作用,可以期待摄取个体获得天然免疫,具体而言,可以期待获得抗病毒效果、免疫激活效果、抗感染症效果、抵抗性抗乙型肝炎效果、抗丙型肝炎效果、抗增殖活性效果、抗肿瘤效果、抗癌效果等。
本发明的一个方式的组合物中使用的有效成分具有饮食品的添加物等的使用实际效果。因此,本发明的一个方式的组合物的安全性高,作为抗病毒用组合物、免疫激活用组合物、抗感染症用组合物、抗乙型肝炎用组合物、抗丙型肝炎用组合物、肠道免疫激活用组合物、呼吸道免疫激活用组合物、抗肿瘤用组合物、抗癌用组合物等有用,可以期待以经口或非经口的形态提供。
附图说明
图1(a)和(b)是示出在后述实施例中记载的非通气条件或通气条件下培养时对各种乳酸菌的OD600值进行测定的结果的图。图1(c)和(d)是示出在后述实施例中记载的非通气条件或通气条件下培养时对各种乳酸菌的双链RNA量进行测定的结果的图。图中的(-)表示在未进行通气的情况下培养时的结果,(+)表示在通气条件下培养时的结果。
图2A是示出在后述实施例中记载的各种温度下培养时对K15株的OD600值进行测定的结果的图。
图2B是示出在后述实施例中记载的各种温度下培养时对K15株的双链RNA量进行测定的结果的图。
图3是示出在后述实施例中记载的通气且低温度条件下培养时对K15株的双链RNA量进行测定的结果的图。
图4(a)和(b)是示出在后述实施例中记载的非通气条件或通气条件下培养时对各种乳酸菌的OD600值进行测定的结果的图。图4(c)和(d)是示出在后述实施例中记载的非通气条件或通气条件下培养时对各种乳酸菌的双链RNA量进行测定的结果的图。图中的(-)表示在未进行通气的情况下培养时的结果,(+)表示在通气条件下培养时的结果。
具体实施方式
以下,对作为本发明的一个方式的乳酸菌、组合物和方法的详细情况进行说明,但本发明的技术范围并不仅限于本项目的事项,本发明只要可实现其目的,可以采取各种方式。
本发明的一个方式的乳酸菌为含有双链RNA的乳酸菌。本发明的一个方式的乳酸菌中的双链RNA的含量与在最适温度且非通气条件下以相同的培养时间对相同的菌株进行培养时的该菌株的双链RNA的含量相比为2.0倍以上、优选为3.0倍以上、更优选为5.0倍以上、进一步优选为10倍以上、更进一步优选为30倍以上。另外,上限没有特别限制,典型地为1000倍以下。
另外,在采用如后述实施例中所记载的双链RNA的评价方法的情况下,本发明的一个方式的乳酸菌的双链RNA的含量优选为每1mg干燥菌体中20ng以上、更优选为每1mg干燥菌体中50ng以上、进一步优选为每1mg干燥菌体中100ng以上。另外,上限没有特别限制,典型地为每1mg干燥菌体中200ng/mL以下。
本发明的一个方式的乳酸菌可以通过将乳酸菌供于规定条件下的培养而得到。此时使用的乳酸菌是指通常所知的生成乳酸的微生物。
作为乳酸菌,可以列举例如属于片球菌(Pediococcus)属乳酸菌、乳球菌(Lactococcus)属乳酸菌、乳杆菌(Lactobacillus)属乳酸菌、链球菌(Streptococcus)属乳酸菌、明串珠菌(Leuconostoc)属乳酸菌、四联球菌(Tetragenococcus)属乳酸菌等的乳酸菌。
具体而言,可以列举例如乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii ssp.bulgaricus)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei subsp.casei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacasei subsp.paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostocmesenteroides subsp.mesenteroides)、假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoclactis)等,但不限定于这些。
作为乳酸菌的更具体的非限定性示例,可以列举乳酸片球菌K15株、乳酸乳球菌ATCC19435株、植物乳杆菌ATCC14917株、戊糖乳杆菌ATCC8041株、清酒乳杆菌K41株、嗜盐四联球菌KK221株、嗜盐四联球菌NBRC12172株、戊糖片球菌OS株(NITE P-354)、戊糖片球菌NRIC1915株、戊糖片球菌NRIC0099株、戊糖片球菌NRIC0122株、植物乳杆菌NRIC1930株、植物乳杆菌NRIC1067株、德氏乳杆菌保加利亚亚种NRIC1688株、德氏乳杆菌乳酸亚种NRIC1683株、短乳杆菌NRIC1713株、戊糖乳杆菌NRIC0391株、戊糖乳杆菌NRIC0396株、戊糖乳杆菌NRIC1836株、干酪乳杆菌干酪亚种NRIC0644株、副干酪乳杆菌副干酪亚种NRIC1936、嗜热链球菌NRIC0256株、肠膜明串珠菌肠膜亚种NRIC1982株、假肠膜明串珠菌ATCC12291株、乳明串珠菌NRIC1582株、德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842株、鼠李糖乳杆菌ATCC53103株等。
作为为了得到本发明的一个方式的乳酸菌而使用的乳酸菌,可以单独使用上述之中的一种或者组合使用两种以上。另外,上述之中,从双链RNA的含量的观点出发,优选乳酸片球菌K15株、乳酸乳球菌ATCC19435株、植物乳杆菌ATCC14917株、戊糖乳杆菌ATCC8041株和清酒乳杆菌K41株、德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842株、鼠李糖乳杆菌ATCC53103株,更优选乳酸片球菌K15株。
获得乳酸菌的方法没有特别限定,可以列举例如利用市售或保藏的乳酸菌的方法、从酱油醪、腌制品、市售的乳酸菌饮料等乳酸菌含有物中分离利用的方法等。通常的乳酸菌的最适温度为约30℃~约40℃,例如,作为从米糠腌床中分离出的乳酸菌株的乳酸片球菌K15株的最适温度为约40℃,作为从胡萝卜的腌菜中分离出的乳酸菌株的清酒乳杆菌K41株的最适温度为约30℃。
本发明的一个方式的方法为制造本发明的一个方式的乳酸菌那样的含有双链RNA的乳酸菌的方法。本发明的一个方式的含有双链RNA的乳酸菌的制造方法至少包括通过将乳酸菌供于在通气条件下、比最适温度低的温度条件下、或比最适温度低的温度且通气条件下(以下简称为通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下)的培养而得到含有双链RNA的乳酸菌的工序。
本发明的另一个方式的方法为抑制乳酸菌的双链RNA的含量降低的方法。本发明的一个方式的抑制乳酸菌的双链RNA的含量降低的方法至少包括通过将乳酸菌供于在通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养而抑制该乳酸菌的双链RNA的含量降低的工序。
本发明的另一个方式的方法为从多个乳酸菌中筛选能够大量含有双链RNA的乳酸菌的方法。本发明的一个方式的含有双链RNA的乳酸菌的筛选方法至少包括通过将多个乳酸菌供于在通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养来筛选含有双链RNA的乳酸菌的工序。
上述多个乳酸菌表示例如多个菌株的乳酸菌,具体而言,例如,可以为相同菌种的范围内的不同的多个菌株的乳酸菌,也可以为由不同的菌种构成的多个菌株的乳酸菌。作为上述筛选的工序,具体而言,可以列举例如通过将多个乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养来筛选与在最适温度且非通气条件下以相同的培养时间对相同的菌株进行培养时的该菌株的双链RNA的含量相比为2.0倍以上的乳酸菌、或者双链RNA的含量为每1mg干燥菌体中20ng以上的乳酸菌的工序。
本发明的一个方式的方法具有下述特征:将乳酸菌在通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下这样的与通常培养乳酸菌的条件不同的条件下进行培养。
通气条件下的培养可以列举例如通过供给空气并搅拌等而提高溶解氧浓度这样的条件下进行培养等。此时,也可以使用氧气来代替空气,只要能够提高溶解氧浓度,除了搅拌以外也可以采用振荡等手段。需要说明的是,搅拌速度可以根据培养槽的大小等适当设定。
空气的供给量(通气量)没有特别限定,例如为每单位体积约0.01VVM~约10VVM、优选为约0.1VVM~约1VVM。通气量小于0.01VVM的情况下,可能无法提高溶解氧浓度,通气量大于10VVM的情况下,可能因大量的气泡而使乳酸菌受到物理性损伤,因此不优选这些情况。
在比最适温度低的温度条件下的培养可以列举例如在比适于所使用的乳酸菌的增殖的温度低的温度的条件下进行培养等。比最适温度低的温度例如为比最适温度低1℃~30℃的温度、优选为比最适温度低5℃~20℃的温度、更优选为比最适温度低5℃~15℃的温度。
对乳酸菌进行培养的温度比最适温度低、且其差为1℃以上时,能够抑制乳酸菌的恒常性的影响,能够以良好的效率维持双链RNA的含量或抑制其降低。对乳酸菌进行培养的温度比最适温度低、且其差为30℃以下时,能够抑制乳酸菌的存活或代谢功能的显著降低,能够抑制乳酸菌的收量降低。
需要说明的是,具体而言,例如,在乳酸菌的最适温度为40℃的情况下,比最适温度低1℃~30℃的温度是指比40℃低1℃~30℃的温度、即10℃~39℃。
在比最适温度低的温度且通气条件下的培养是指,将在通气条件下的培养与在比最适温度低的温度条件下的培养组合而成的培养。具体而言,可以列举例如在比最适温度低1℃~30℃的温度且通气量为每单位体积约0.01VVM~约10VVM的条件下的培养等,优选在比最适温度低5℃~15℃的温度且通气量为每单位体积约0.1VVM~约1VVM的条件下的培养。
乳酸菌的培养中,只要在通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下进行培养,作为其他条件,在适于所使用的乳酸菌的增殖的条件下进行培养即可。例如,所使用的培养基可以采用乳酸菌的培养中通常使用的培养基。作为这样的培养基,可以列举例如MRS培养基和M17培养基等,但不限定于此。
作为本发明的一个方式的具体方法,可以列举例如下述方法等,但不限定于此,该方法包括通过将选自由片球菌属乳酸菌、乳球菌属乳酸菌、乳杆菌属乳酸菌、链球菌属乳酸菌、明串珠菌属乳酸菌和四联球菌属乳酸菌组成的组中的乳酸菌中的任意一种或两种以上的乳酸菌在通气量为每单位体积约0.1VVM~约1VVM的条件和比最适温度低5℃~15℃的温度条件中的至少一种条件下使用MRS培养基培养10~30小时而得到包含含有双链RNA的乳酸菌的培养物的工序。
本发明的一个方式的方法中,培养时间只要是确认到乳酸菌的增殖的时间则没有特别限定,例如优选为乳酸菌的增殖速度降低之前的时间。例如,可以经时地测定乳酸菌的培养物的OD600值,接着将测定得到的OD600值相对于培养时间进行绘图,将由此得到的增殖曲线的斜率减小之前的时间称为乳酸菌的增殖速度降低之前的时间。
本发明的一个方式的方法中,由于通过将乳酸菌培养至乳酸菌的增殖速度降低的时间为止,乳酸菌内的双链RNA的含量有降低的倾向,因此优选将培养时间设定为乳酸菌的增殖速度降低的时间之前。关于乳酸菌的增殖速度降低之前的时间的具体例,若参考图2A的40℃的增殖曲线,可以说是培养后6小时之前的时间,更具体而言,可以说是相当于培养后4~6小时之间的时间或培养后5小时的时间,但不限于此。
本发明的一个方式的方法中,通过将乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养,能够减小乳酸菌的增殖速度,由此容易将培养时间控制为乳酸菌的增殖速度降低之前的时间,因此最终能够以良好的效率得到含有大量的双链RNA的乳酸菌。
本发明的一个方式的方法可以为包括如下工序的方法:对所得到的培养物进行灭菌,利用超滤膜、离心浓缩机等通常所知的固液分离手段除去培养基而回收菌体,接着用水、盐水等对所得到的菌体进行清洗,由此得到乳酸菌的菌体。
可以使用这样得到的菌体、将该菌体悬浮于水或盐水等中而得到的菌体悬浮液、将该菌体供于干燥处理而得到的干燥粉末等作为含有双链RNA的乳酸菌。干燥处理的方法没有特别限定,可以列举例如自然干燥、风干、喷雾干燥、冷冻干燥等。
本发明的一个方式的方法中,只要能够达到本发明的目的,可以在上述工序的前段或后段、或者工序中加入各种工序或操作。
含有双链RNA的乳酸菌除了为含有双链RNA的乳酸菌本身、即该乳酸菌的菌体以外,还可以为该乳酸菌的菌体成分和该乳酸菌的培养物等。含有双链RNA的乳酸菌的菌体、菌体成分和培养物由于其中含有的双链RNA所具有的调节、激活、抑制和优化免疫的作用,也被称为免疫调节物、免疫激活物和抗过敏物。
乳酸菌的菌体可以列举例如通过将乳酸菌的培养物使用离心分离等通常所知的固液分离手段除去培养基而得到的菌体等。菌体成分可以列举例如存在于乳酸菌的菌体内、或分泌到菌体外的纯化或非纯化的成分。具体而言,可以列举例如除了双链RNA以外还包含单链RNA、单链DNA、双链DNA等的成分等。乳酸菌的培养物可以列举例如对乳酸菌进行培养而得到的培养液本身等。
作为含有双链RNA的乳酸菌的菌体、菌体成分和培养物可以单独使用这些之中的任意一种或将两种以上组合。例如,可以为从含有双链RNA的乳酸菌的菌体、菌体成分和培养物中分离双链RNA而得到的物质。从含有双链RNA的乳酸菌的菌体、菌体成分和培养物中分离双链RNA的方法没有特别限定,可以列举例如日本专利第5312322号公报中记载的方法等。
作为从含有双链RNA的乳酸菌中分离双链RNA的方法的具体例,可以列举例如下述方法等。即,将含有双链RNA的乳酸菌供于90~100℃下、5~20分钟的加热灭菌处理而得到加热灭菌处理液。
接着,将加热灭菌处理液供于离心分离等固液分离手段,回收固体成分。接着,对固体成分进行清洗,悬浮于缓冲液中,得到悬浮液。接着,在悬浮液中添加溶菌酶,在35~40℃下加温,得到溶菌酶处理液。
接着,在溶菌酶处理液中添加SDS和蛋白酶K,在35~40℃下加温,得到蛋白酶处理液。接着,将蛋白酶处理液供于苯酚/氯仿/异戊醇处理,利用离心分离等固液分离手段得到作为上清的粗制核酸提取液。粗制核酸提取液为含有DNA、单链RNA、双链RNA等的核酸混合物。
接着,将粗制核酸提取液供于纤维素柱色谱,由此能够得到纯化的双链RNA。纤维素柱色谱和之后的高度纯化手段可以依照日本专利第5312322号说明书的记载来实施。
本发明的一个方式的方法中,含有双链RNA的乳酸菌中的双链RNA的含量与在最适温度且非通气条件下以相同的培养时间对相同的菌株进行培养时的双链RNA的含量相比优选为2.0倍以上、更优选为3.0倍以上、进一步优选为5.0倍以上、特别优选为10倍以上、最优选为30倍以上。另外,上限没有特别限制,典型地为1000倍以下。
本发明的一个方式的方法中,在采用后述实施例中记载的双链RNA的评价方法的情况下,含有双链RNA的乳酸菌中的双链RNA的含量优选为每1mg干燥菌体中20ng以上、更优选为每1mg干燥菌体中50ng以上、进一步优选为每1mg干燥菌体中100ng以上。另外,上限没有特别限制,典型地为每1mg干燥菌体中200ng以下。
本发明的一个方式的组合物至少含有本发明的一个方式的含有双链RNA的乳酸菌。含有双链RNA的乳酸菌被期待发挥抗病毒效果、免疫激活效果、抗感染症效果、抗乙型肝炎效果、抗丙型肝炎效果、抗增殖活性效果、抗肿瘤效果和抗癌效果等。因此,本发明的一个方式的组合物可以采取抗病毒用组合物、免疫激活用组合物、抗感染症用组合物、抗乙型肝炎用组合物、抗丙型肝炎用组合物、肠道免疫激活用组合物、呼吸道免疫激活用组合物、抗肿瘤用组合物、抗癌用组合物等方式。
关于本发明的一个方式的组合物可发挥出的抗疾病效果,例如在抗病毒效果的情况下,是指在摄取个体中抑制、延缓目前或未来的病毒性疾病或被认为罹患了病毒性疾病的状态、或者改善其状态。本发明的一个方式的组合物所发挥出的免疫激活效果例如是指在摄取个体中活化目前或未来的免疫系统,使各种疾病或异常达到正常状态。
含有双链RNA的乳酸菌是长期以来被人或动物摄取的具有实际效果的天然物或其来源物,安全性高,因此本发明的一个方式的组合物的实用性高,通过将其本身单独或者与其他组合物一起加工或添加到其他组合物中,能够以经口或非经口的形态应用于各种用途。
本发明的一个方式的组合物的具体方式没有特别限定,可以列举例如饮食品、动物用饲料、化妆品、药品、准药品和用于制造它们的原料或原料用组合物等,从对于摄取个体而言容易日常摄取的观点出发,优选为饮食品用组合物、饮食品原料用组合物、饲料用组合物和饲料原料用组合物,更优选为功能性饮食品、特定保健用饮食品、营养功能饮食品、保健功能饮食品、特殊用途饮食品、营养辅助饮食品、健康辅助饮食品、补充剂、美容饮食品和用于制造它们的原料或原料用组合物。
本发明的一个方式的组合物可以根据用途例如与其他成分混合来使用。这样,只要能够达到本发明的目的,本发明的一个方式的组合物可以在含有双链RNA的乳酸菌的基础上配合各种成分。
本发明的一个方式的组合物中,可以进一步含有例如糖质甜味剂、稳定剂、乳化剂、淀粉、淀粉加工物、淀粉分解物、食盐、香味料、着色料、酸味料、风味原料、营养素、果汁、蛋等动植物性食材、赋形剂、增量剂、粘结剂、增稠剂、香油等通常的食品加工中使用的添加物。添加物的使用量只要不妨碍本发明的课题的解决则没有特别限定,可以适当设定。
本发明的一个方式的组合物只要是通常使用的形态则没有特别限定,可以采用例如固体状、液状、凝胶状、悬浮液状、膏状、片状、棍状、粉状、粒状、颗粒状、药片状、棒状、板状、块状、糊状、胶囊状、囊片状等各形态。
在本发明的一个方式的组合物例如为经口用组合物的情况下,作为能够将从含有双链RNA的乳酸菌中分离出的双链RNA经由食道和胃送达小肠的形态,优选制成肠溶性组合物。肠溶性组合物只要是在胃酸的作用下不溶解而在小肠中溶解的形态的组合物则没有特别限定,可以列举例如耐酸性微胶囊、脂质体的形态的组合物等。
本发明的一个方式的组合物中含有的含有双链RNA的乳酸菌的含量只要是确认到所期待的效果的量则没有特别限定。作为经口用组合物,例如,相对于组合物整体为0.0001质量%以上、优选为0.001质量%以上。作为非经口用组合物,例如为0.00001质量%以上、优选为0.0001质量%以上。本发明的一个方式的组合物的摄取量没有特别限定,根据摄取个体的症状、体格而适当设定即可,例如为1~1000mg/体重60kg/天等。
以下,利用实施例进一步详细地对本发明进行说明,但本发明并不限定于这些实施例,只要能够解决本发明的课题,本发明可以采取各种方式。
实施例
[例1.通气条件下的乳酸菌的双链RNA量的评价]
对将乳酸菌在通气条件下培养时的双链RNA量进行评价。
在MRS培养基(BD公司制造)中按照达到1×107个/mL的方式接种乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)K15株[以下也称为K15株。Front Immunol.2018Jan 23;9:27.doi:10.3389/fimmu.2018.00027.eCollection 2018.和Sci Rep.2018Mar 22;8(1):5065.doi:10.1038/s41598-018-23404-4.]或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ATCC19435株(以下也称为ATCC19435株),制备乳酸菌原液。使用容积200mL的培养槽,在每单位体积的通气量设定为0.5VVM的通气条件下,在31℃下对所得到的乳酸菌原液100mL进行13小时培养。此时,设置以500rpm进行搅拌的试验组和作为对照的在未进行通气的情况下以100rpm搅拌的同时在31℃下进行培养的试验组。
培养开始起13小时后回收培养液,供于95℃下15分钟的煮沸灭菌处理,由此制备灭菌处理液。对所制备的灭菌处理液进行离心分离,将所得到的菌体用生理盐水清洗后,再次离心分离,使所得到的菌体冷冻干燥。
将所得到的冷冻干燥粉末5mg悬浮于STE缓冲液中,得到悬浮液。在所得到的悬浮液中添加将溶菌酶(Sigma-Aldrich公司)悬浮于STE缓冲液中而制备的溶菌酶溶液(终浓度5mg/mL),在37℃下加温30分钟,由此得到溶菌酶处理液。
在所得到的溶菌酶处理液中添加10%SDS(和光纯药工业株式会社)和蛋白酶K(TAKARABIO株式会社),在37℃下加温1小时,得到蛋白酶处理液。用苯酚/氯仿/异戊醇(和光纯药工业株式会社)处理所得到的蛋白酶处理液,以8500×g离心分离15分钟,得到作为上清的粗制核酸提取液。
利用ELISA法由所得到的粗制核酸提取液对双链RNA进行定量。将测定得到的双链RNA量示于图1(c)和(d)。另外,将对各培养液的OD进行测定的结果示于图1(a)和(b)。需要说明的是,OD600为600nm的吸光度,是培养液的浊度。OD600升高的条件可以说是适于乳酸菌的增殖的条件。
如图1(c)和(d)所示,确认到:在通气条件下进行培养的情况下,与在非通气条件下进行培养的情况相比,K15株和ATCC19435株的双链RNA量增多。
需要说明的是,将搅拌速度设定为300rpm、将培养时间设定为18小时而想要提高含有双链RNA的乳酸菌的收量,结果确认到,菌体内的双链RNA含量极端地减少。因此,为了提高含有双链RNA的乳酸菌的收量,关键的是控制培养时间等培养条件而得到菌体内的双链RNA含量提高的状态的乳酸菌。
[例2.各种培养温度条件下的片球菌属乳酸菌的双链RNA量的评价]
对将属于片球菌属的乳酸菌在各种培养温度下培养时的双链RNA量进行评价。
在MRS培养基中按照达到1×107个/mL的方式接种K15株,制备乳酸菌原液。需要说明的是,如上所述,K15株的最适温度为约40℃。
将制备的乳酸菌原液在25℃、31℃或40℃下静置培养22小时,在多个时间点测定OD600。将测定得到的OD600的值示于图2A。
在25℃下培养时在第10、14和22小时回收培养液,在31℃下培养时在第8、13和14小时回收培养液,在40℃下培养时在第4、6和14小时回收培养液,将其供于95℃下15分钟的煮沸灭菌处理,由此制备灭菌处理液。对所制备的灭菌处理液进行离心分离,将所得到的菌体利用生理盐水清洗后,再次离心分离,使所得到的菌体冷冻干燥。
由所得到的冷冻干燥粉末5mg,与例1同样地进行粗制核酸提取和双链RNA量的测定。将测定得到的双链RNA量示于图2B。
如图2A和图2B所示,未观察到双链RNA的含量的最大值随培养温度的大幅变动,但在作为比最适温度低的温度条件的25℃和31℃下进行培养的情况下,与在作为最适温度的40℃下进行培养的情况相比,能够降低菌体增殖速度,相应地能够减缓菌体内的双链RNA的含量的降低速度。由这些结果可知,为了以工业性规模得到含有双链RNA的乳酸菌,优选在比最适温度低的温度条件下对乳酸菌进行培养。
[例3.比最适温度低的温度条件且通气条件下的片球菌属乳酸菌的双链RNA量的评价]
对将属于片球菌属的乳酸菌在比最适温度低的温度条件且通气条件下培养时的双链RNA量进行评价。
在MRS培养基中按照达到1×107个/mL的方式接种K15株,制备乳酸菌原液。设置使用容积为200mL的培养槽将所制备的乳酸菌原液100ml在作为最适温度的40℃下静置培养14小时的试验组。另外,设置使用容积为200mL的培养槽将乳酸菌原液100mL在每单位体积的通气量设定为0.5VVM的通气条件下在25℃下以300rpm搅拌地培养16小时的试验组。
培养后回收培养液,供于95℃下15分钟的煮沸灭菌处理,由此制备灭菌处理液。对所制备的灭菌处理液进行离心分离,将所得到的菌体用生理盐水清洗后,再次离心分离,使所得到的菌体冷冻干燥。
由所得到的冷冻干燥粉末5mg,与例1同样地进行粗制核酸提取和双链RNA量的测定。将测定得到的双链RNA量示于图3。
如图3所示,确认到:在通气条件且比最适温度低的温度条件下进行培养的情况下,与在非通气条件且最适温度条件下进行培养的情况相比,菌体内的双链RNA量达到高值。
[例4.通气条件下的乳杆菌属乳酸菌的双链RNA量的评价]
对在通气条件下培养乳酸菌时的双链RNA量进行评价。
在MRS培养基(BD公司制造)中按照达到1×107个/mL的方式接种德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842株(以下也称为ATCC11842株)或鼠李糖乳杆菌ATCC53103株(以下也称为LGG株;LGG为注册商标),制备乳酸菌原液。对于所得到的乳酸菌原液100mL,使用容积为200mL的培养槽,在每单位体积的通气量设定为0.5VVM的通气条件下,对ATCC11842株在37℃下培养10小时,对LGG株在37℃下培养9小时。此时,设置以500rpm进行搅拌的试验组和作为对照的在不进行通气的情况下以100rpm搅拌的同时进行培养的试验组。
培养结束后回收培养液,供于95℃下15分钟的煮沸灭菌处理,由此制备灭菌处理液。对所制备的灭菌处理液进行离心分离,将所得到的菌体用生理盐水清洗后,再次离心分离,使所得到的菌体冷冻干燥。
将所得到的冷冻干燥粉末5mg悬浮于STE缓冲液中,得到悬浮液。在所得到的悬浮液中添加将溶菌酶(Sigma-Aldrich公司)悬浮于STE缓冲液中而制备的溶菌酶溶液(终浓度5mg/mL),在37℃下加温30分钟,由此得到溶菌酶处理液。
在所得到的溶菌酶处理液中添加10%SDS(和光纯药工业株式会社)和蛋白酶K(TAKARABIO株式会社),在37℃下加温1小时,得到蛋白酶处理液。用苯酚/氯仿/异戊醇(和光纯药工业株式会社)处理所得到的蛋白酶处理液,以8500×g离心分离15分钟,得到作为上清的粗制核酸提取液。
利用ELISA法由所得到的粗制核酸提取液对双链RNA进行定量。将测定得到的双链RNA量示于图4(c)和(d)。另外,将对各培养液的OD进行测定的结果示于图4(a)和(b)。
如图4(c)和(d)所示,确认到:在通气条件下进行培养的情况下,与在非通气条件下进行培养的情况相比,ATCC11842株和LGG株的双链RNA量增多。
由以上结果可以确认,通过在通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下对各种乳酸菌进行培养,能够以良好的效率得到双链RNA的含量高的乳酸菌。
使用特定方式详细地对本发明进行了说明,但对于本领域技术人员而言显而易见的是,可以在不脱离本发明的意图和范围的情况下进行各种变更和变形。需要说明的是,本申请基于2017年5月12日提交的日本专利申请(日本特愿2017-095947),通过引用将其整体援引于此。
产业上的可利用性
本发明的一个方式的乳酸菌和组合物以及利用本发明的一个方式的方法得到的乳酸菌和组合物含有双链RNA,对天然免疫系统细胞应答有贡献,因此对于期待抗病毒活性、免疫激活活性、抗感染症活性、抗乙型肝炎活性、抗丙型肝炎活性、抗增殖活性、抗肿瘤活性、抗癌活性的摄取个体有用,可以用作有助于这样的摄取个体的健康和福利的饮食品、药品、准药品、化妆品、补充剂等。
Claims (12)
1.一种含有双链RNA的乳酸菌的制造方法,其包括通过将乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养而得到含有双链RNA的乳酸菌的工序。
2.如权利要求1所述的含有双链RNA的乳酸菌的制造方法,其中,包括通过将乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件下的培养而得到含有双链RNA的乳酸菌的工序。
3.如权利要求1或2所述的制造方法,其中,含有双链RNA的乳酸菌中的双链RNA的含量与在最适温度且非通气条件下以相同的培养时间对相同的菌株进行培养时的双链RNA的含量相比为2.0倍以上。
4.如权利要求1~3中任一项所述的制造方法,其中,含有双链RNA的乳酸菌中的双链RNA的含量为每1mg干燥菌体中20ng以上。
5.如权利要求1~4中任一项所述的制造方法,其中,所述乳酸菌为选自由片球菌(Pediococcus)属乳酸菌、乳球菌(Lactococcus)属乳酸菌、乳杆菌(Lactobacillus)属乳酸菌、链球菌(Streptococcus)属乳酸菌、明串珠菌(Leuconostoc)属乳酸菌和四联球菌(Tetragenococcus)属乳酸菌组成的组中的至少一种。
6.一种抑制乳酸菌的双链RNA的含量降低的方法,其包括通过将乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养而抑制该乳酸菌的双链RNA的含量降低的工序。
7.一种含有双链RNA的乳酸菌的筛选方法,其包括通过将多个乳酸菌供于通气条件和比最适温度低的温度条件中的至少一种条件下的培养来筛选含有双链RNA的乳酸菌的工序。
8.一种含有双链RNA的乳酸菌,其双链RNA的含量与在最适温度且非通气条件下以相同的培养时间对相同的菌株进行培养时的双链RNA的含量相比为2.0倍以上。
9.一种含有双链RNA的乳酸菌,其双链RNA的含量为每1mg干燥菌体中20ng以上。
10.如权利要求8或9所述的乳酸菌,其中,所述乳酸菌为选自由片球菌(Pediococcus)属乳酸菌、乳球菌(Lactococcus)属乳酸菌、乳杆菌(Lactobacillus)属乳酸菌、链球菌(Streptococcus)属乳酸菌、明串珠菌(Leuconostoc)属乳酸菌和四联球菌(Tetragenococcus)属乳酸菌组成的组中的至少一种。
11.一种组合物,其含有权利要求8~10中任一项所述的乳酸菌。
12.如权利要求11所述的组合物,其中,所述组合物为选自由饮食品用组合物、饮食品原料用组合物、饲料用组合物和饲料原料用组合物组成的组中的一种。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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