JP2014140330A - 乳酒の製造方法及び乳酒 - Google Patents

Abstract

【課題】乳臭さや好ましくない酸味が低減された乳酒及びその製造方法を提供すること。
【解決手段】乳成分を含有する基質を乳酸菌と酵母で発酵させる、乳酒の製造方法であって、乳酸菌が、ラクトバチラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ）又はストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属し、該乳酸菌をＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で３０時間好気培養したときの培養液のＯＤ_６００の値が１．０以下であり、かつ、該乳酸菌を５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養したときのラクトース分解率が５５％以上である、乳酒の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、乳酒の製造方法及び乳酒に関する。

乳酒は、家畜等の動物の乳を原料とし、酵母及び乳酸菌により発酵させて造られる。中央アジアの遊牧民族の間で貴重な栄養源として古くから飲用されており、例えば、馬乳、ヤク乳、ラクダ乳を原料とした乳酒がある。

乳酒の製造方法はいくつか知られており、例えば、特許文献１には、酒類の製造工程において、発酵直前の醪が牛乳等の飲用される動物の乳、粉乳、脱脂乳を含み、この醪に酵母又は酵母及び乳酸菌を添加して発酵させることを特徴とする栄養酒の製造方法が記載されている。また、特許文献２には、栄養酒の製造方法において、動物乳成分及び糖類を含有する発酵原料を、２種以上の乳酸菌によって乳酸発酵を先行させ、次に乳酸発酵と併行して１種又は２種以上の酵母によりアルコール発酵を行うか、又はアルコール発酵を先行させ、次にアルコール発酵と併行して乳酸発酵を行うことを特徴とする栄養酒の製造方法が記載されている。

特開昭５９−１５４９７９号公報 特開昭６３−７７７４号公報

乳酒はビタミンやミネラル等を豊富に含んでおり、飲料として魅力的である。しかしながら、特有の乳臭さがある、強い酸味が感じられるなど、風味の点で改良の余地がある。

そこで、本発明は、乳臭さや好ましくない酸味が低減された乳酒及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、乳成分を含有する基質を乳酸菌と酵母で発酵させる、乳酒の製造方法であって、上記乳酸菌が、ラクトバチラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ）又はストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属し、上記乳酸菌をＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で３０時間好気培養したときの培養液のＯＤ_６６０の値が１．０以下であり、かつ、上記乳酸菌を５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養したときのラクトース分解率が５５％以上である、乳酒の製造方法を提供する。

乳成分はラクトース（乳糖）を多く含むが、酵母はラクトースを資化することができない。一方、乳酸菌はラクトースを資化してグルコースとガラクトースを生成することができ、生成したグルコースを酵母が資化することでエタノール等が生成する。従来の乳酒の製造方法においても酵母と乳酸菌による発酵を組合わせていたが、乳臭さや好ましくない酸味の低減には到っていなかった。一方、本発明の乳酒の製造方法によれば、上記特定の乳酸菌を用いることにより、乳臭さが低減され、かつ好ましくない酸味が低減された風味のよい乳酒を得ることができる。また、上記特定の乳酸菌によるグルコース生成量が多いため、通常の乳酒よりもエタノール濃度が高い乳酒を得ることができる。

上記乳酸菌は、ラクトバチラス・デルブレッキ又はストレプトコッカス・サーモフィラスに属する菌株を変異原処理して得られたものであってもよい。

上記乳酸菌は、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の変異株であり、該変異株は、比増殖速度が親株の０．５倍未満であり、且つ単位菌量当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性が親株の９倍以上であるものであってもよい。

上記乳酸菌は、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス４８Ａ１２株であってもよい。

なお、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス４８Ａ１２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に寄託されており、受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−１５１５（受領日：２０１３年１月２１日）の菌株である。

上記製造方法は、上記基質を上記乳酸菌及び上記酵母で並行複発酵させてもよい。すなわち、乳酸菌による発酵と酵母による発酵を同時進行させてもよい。並行複発酵を行うことにより、製造工程を簡略化できると共に工期を短縮することができる。また、乳酸菌がラクトースを資化して生成したグルコースを、酵母が速やかに分解するため、培地中のラクトースが高濃度になるのを避けることができ、代謝阻害の点からも有利である。

上記製造方法は、上記基質を上記乳酸菌及び上記酵母で発酵させて得られた発酵物にエタノールを添加するエタノール添加工程を更に備えていてもよい。上記乳酒は、エタノールの添加によるアルコール感の向上が顕著である。また、エタノールの添加によって乳臭さや好ましくない酸味をより低減できる。さらに、香味やのみ口も向上する。

上記製造方法は、上記乳酸菌及び上記酵母で発酵させる前、又は発酵中に前記基質にグルコースを添加するグルコース添加工程を更に備えていてもよい。これにより、乳臭さや好ましくない酸味がより低減され、よりアルコール感のある乳酒を得ることができる。

上記酵母は、サッカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）及びサッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）からなる群より選択される少なくとも１種とすることができる。

本発明はまた、上記製造方法により得られた乳酒を提供する。本発明の乳酒は、上記製造方法により製造されているため、乳臭さや好ましくない酸味が低減されている。

本発明はさらに、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス４８Ａ１２株又は下記（１）及び（２）を満たすその変異株を提供する。
（１）ＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で３０時間好気培養したときの培養液のＯＤ_６６０の値が１．０以下。
（２）５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養したときのラクトース分解率が９９％以上。

本発明によれば、乳臭さや好ましくない酸味が低減された乳酒及びその製造方法を提供することができる。

ラクトース分解率の測定結果の一例を示すグラフである。 増殖曲線及び乳酸産生量を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本発明の乳酒の製造方法は、乳成分を含有する基質を特定の乳酸菌と酵母で発酵させるものである。

〔乳酸菌〕
本発明に係る乳酸菌は、ラクトバチラス・デルブレッキ又はストレプトコッカス・サーモフィラスに属し、下記（１）かつ（２）の特性を有する。
（１）乳酸菌をＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で３０時間好気培養したときの培養液のＯＤ_６６０の値が１．０以下。
（２）乳酸菌を５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液（以下、「ラクトース分解率測定用溶液」ともいう。）に１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養したときのラクトース分解率が５５％以上。

培養液のＯＤ_６６０の値は、培養液の濁度を表し、培養液中の菌数と相関する。したがって、上記（１）の特性は、少なくとも増殖速度と相関するものである。通常乳酸菌をＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で３０時間好気培養したときの培養液のＯＤ_６６０の値は、５前後であるため、上記（１）の特性を有する乳酸菌は増殖速度が遅いといえる。培養液のＯＤ_６６０の値は、吸光度計（例えば、自記分光光度計Ｕ−３２１０（日立株式会社））により、波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより求めることができる。

上記（１）の特性における培養液のＯＤ_６６０の値は、得られる乳酒の好ましくない酸味をより低減する観点から、０．９以下であることが好ましく、０．８以下であることがより好ましく、０．７以下であることが更に好ましい。下限に特に制限はないが、通常０．１以上である。

上記（２）の特性におけるラクトース分解率とは、乳酸菌を播種した時点でのラクトース分解率測定用溶液中のラクトース濃度をＣ_０、２４時間好気培養した時点でのラクトース分解率測定用溶液中のラクトース濃度をＣ_２４としたとき、下記式（Ｉ）で表される値を意味する。
（Ｃ_０−Ｃ_２４）×１００／Ｃ_０ （Ｉ）

乳酸菌はラクトースを資化し、グルコースとガラクトースを生成する。上記（２）の特性は、乳酸菌によるラクトース分解活性（例えば、分解反応速度）と相関する。通常市販されている乳酸菌を５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養したときのラクトース分解率は、１０〜３０％程度であるため、上記（２）の特性を有する乳酸菌はラクトース分解活性が強いといえる。

ラクトース濃度は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）等により測定することができる。ＨＰＬＣによる測定は、例えば、下記方法により行うことができる。

ラクトース分解率測定用溶液２００μＬを２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清２０μＬに希釈液（イノシトール（６６０ｍｇ／Ｌ）含有６７％アセトニトリル溶液）５００μＬを添加し、振とう、静置する。続いて、この溶液を２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清８０μＬに超純水を１２０μＬ添加し、振とうし、フィルターろ過して固形分を除去したものを、ＨＰＬＣ分析用試料とする。

ＨＰＬＣ分析用試料を、以下の条件で、内部標準（イノシトール）法によりＨＰＬＣ分析することにより、ラクトース濃度を定量することができる。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ ４．６×２５０ｍｍ
サンプル注入量：１０μＬ
移動相：アセトニトリル７０．０％
移動相流速：１．０ｍＬ／分
カラムオーブン温度：４０℃
検出器：ＥＬＳＤ

上記（２）の特性におけるラクトース分解率は、得られる乳酒の乳臭さをより低減する観点から、６０％以上であることが好ましく、６５％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。上限に特に制限はなく、１００％であってもよい。

また、乳酸菌のラクトース分解活性は、β−ガラクトシダーゼ活性と相関する。したがって、上記（２）の特性は、β−ガラクトシダーゼ活性に関する特性と置き換えることもできる。例えば、下記（３）の特性であってもよい。
（３）乳酸菌をβ−ガラクトシダーゼの基質であるＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含む緩衝液に懸濁させたときの懸濁液のＯＤ_６６０と、当該懸濁液を３７℃で３０分間遮光した状態で反応させたときのＯＤ_４２０との吸光度比（ＯＤ_４２０／ＯＤ_６６０）が、１０．０以上。

上記ＯＤ_４２０の値は、ＯＮＰＧとβ−ガラクトシダーゼとの反応により生成するｏ−ニトロフェニルによる吸光を示す。したがって、吸光度比（ＯＤ_４２０／ＯＤ_６６０）は、単位菌体あたりのβ−ガラクトシダーゼ活性と相関する。

懸濁液のＯＤ_６６０の値及びＯＤ_４２０の値は、吸光度計（例えば、自記分光光度計Ｕ−３２１０（日立株式会社））により、それぞれ波長６６０ｎｍ及び４２０ｎｍにおける吸光度を測定することにより求めることができる。

上記（３）の特性における吸光度比（ＯＤ_４２０／ＯＤ_６６０）は、得られる乳酒の乳臭さをより低減する観点から、２０．０以上であることが好ましく、３０．０以上であることがより好ましく、４０．０以上であることが更に好ましい。上限に特に制限はないが、通常１００．０以下である。

本発明に係る乳酸菌は、ラクトバチラス・デルブレッキ又はストレプトコッカス・サーモフィラスに属する菌株を変異原処理して得られた乳酸菌（変異株）であってもよい。

変異原処理は、例えば、紫外線照射、放射線照射等の物理的処理、活性酸素、ニトロソ化合物（例えば、ニトロソアミン、ニトロソグアニジン）、アルキル化剤（例えば、メチルメタンスルホネート、エチルメタンスルホネート）等に暴露することによる化学的処理が挙げられる。

上記変異株は、例えば、変異原処理後の生存率が１％程度となる条件で、乳酸菌に変異原処理を施した後、塗抹培養して単一コロニーを形成させて純化し、得られたコロニーに対して、上記（１）の特性、及び上記（２）の特性（又は上記（３）の特性）について、試験し、目的とする特性を有するコロニーを選別することにより得ることができる。

上記変異株としては、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の変異株であり、該変異株は、比増殖速度が親株の０．５倍未満であり、且つ単位菌量当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性が親株の９倍以上であるものであってもよい。

比増殖速度は、例えば、次のようにして求められる。乳酸菌をＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で好気培養する。培養開始から１２時間後及び３０時間後に培養液をサンプリングし、それぞれＯＤ_６６０の値を測定する。測定されたＯＤ_６６０の値から下記式（ＩＩ）により比増殖速度を算出する。
（ｌｎ（ＯＤ_６６０ｔ_３０／ＯＤ_６６０ｔ_１２））／（３０−１２） （ＩＩ）
ＯＤ_６６０ｔ_３０は培養開始３０時間後のＯＤ_６６０の値、ＯＤ_６６０ｔ_１２は培養開始１２時間後のＯＤ_６６０の値である。「ｌｎ」は自然対数である。

単位菌量当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性は、例えば、次のようにして求められる。乳酸菌をβ−ガラクトシダーゼの基質であるＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含む緩衝液に懸濁させ、懸濁液のＯＤ_６６０の値を測定する。当該懸濁液を３７℃で３０分間遮光した状態で反応させ、ＯＤ_４２０の値を測定する。得られたＯＤ_６６０の値及びＯＤ_４２０の値から吸光度比（ＯＤ_４２０／ＯＤ_６６０）を算出する。

上記乳酸菌は、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス４８Ａ１２株であってもよい。４８Ａ１２株は、（１）ＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で３０時間好気培養したときの培養液のＯＤ_６６０の値が１．０以下、（２）５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養したときのラクトース分解率が９９％以上、（３）β−ガラクトシダーゼの基質であるＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含む緩衝液に懸濁させたときの懸濁液のＯＤ_６６０と、当該懸濁液を３７℃で３０分間遮光した状態で反応させたときのＯＤ_４２０との吸光度比（ＯＤ_４２０／ＯＤ_６６０）が、７０．０以上という優れた特性を有する。

また、上記乳酸菌は、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス４８Ａ１２株の変異株であってもよい。当該変異株は、４８Ａ１２株の上記（１）及び（２）の特性を維持しているもの、４８Ａ１２株の上記（１）及び（３）の特性を維持しているもの、又は４８Ａ１２株の上記（１）〜（３）の特性を維持しているもののいずれであってもよい。

上記乳酸菌は、１種を単独で用いてもよく、また２種以上を用いてもよい。

〔酵母〕
上記酵母としては、アルコール発酵を行う酵母であればよく、例えば、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ウイスキー酵母等の醸造用酵母が挙げられる。より具体的には、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）及びサッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）からなる群より選択される少なくとも１種とすることができる。酵母は、市販されているものであってもよい。

〔乳成分を含有する基質〕
本明細書において、乳成分とは、乳糖（ラクトース）を含む獣乳由来の成分を意味する。獣乳に含まれる全成分であってもよく、一部の成分であってもよい。乳成分としては、具体的には、牛乳、馬乳、ヤク乳、ラクダ乳、ヤギ乳、ヒツジ乳等の獣乳の生乳、並びに生乳を脱脂、濃縮、乾燥、凍結、滅菌、乳糖分解、加熱等により処理した処理乳が挙げられる。処理乳としては、例えば、全粉乳、調製粉乳、脱脂粉乳（スキムミルク）、全脂粉乳、濃縮乳、滅菌乳、乳糖分解乳等が挙げられる。乳成分は１種単独であってもよく、２種以上を組合わせてもよい。

基質は上記乳成分を含有する。基質は乳成分以外の成分を更に含有していてもよく、例えば、ビタミン、ミネラル、フレーバー、果実エキス、果汁、野菜汁、豆乳等を添加してもよい。

〔乳酒の製造方法〕
（発酵工程）
本発明の乳酒の製造方法は、乳成分を含有する基質を上述した乳酸菌と酵母で発酵させる工程（発酵工程）を含む。乳酸菌がラクトースを資化しグルコース及びガラクトースが生成する。また、酵母がグルコースを資化し、エタノール等が生成する。

発酵工程は、乳成分を含有する基質を乳酸菌で発酵させる工程と、乳酸菌の発酵を終了させた後、酵母を添加し、酵母で発酵させる工程とを備えていてもよい。また、当初から、又は乳酸菌の発酵が一定程度進んだ後、乳酸菌による発酵と酵母による発酵を同時進行させる並行複発酵工程であってもよい。

基質に対する乳酸菌及び酵母の添加量は、用いる乳酸菌の種類、酵母の種類、基質の種類等に応じて適宜設定すればよい。これに限られるものではないが、例えば、乳酸菌は１．０×１０^６〜１．０×１０^８ｃｆｕ／ｍＬとすることができ、酵母は１．０×１０^６〜１．０×１０^８ｃｆｕ／ｍＬとすることができる。また、乳酸菌として４８Ａ１２株を用いる場合、１．０×１０^６〜１．０×１０^８ｃｆｕ／ｍＬである。

発酵温度は、用いる乳酸菌の種類、酵母の種類、基質の種類等に応じて適宜設定すればよい。これに限られるものではないが、例えば、乳酸菌による発酵と酵母による発酵を順次行う場合、乳酸菌による発酵を２５〜４５℃で行い、酵母による発酵を１０〜３０℃で行うことができる。また、乳酸菌による発酵と酵母による発酵を同時進行させる場合、発酵を２５〜３０℃で行うことができる。また、乳酸菌として４８Ａ１２株を用いる場合、２５〜３０℃である。

発酵時間は、用いる乳酸菌の種類、酵母の種類、基質の種類等に応じて適宜設定すればよい。これに限られるものではないが、例えば、乳酸菌による発酵と酵母による発酵を順次行う場合、乳酸菌による発酵を２４〜７２時間行い、酵母による発酵を４８〜９６時間行うことができる。また、乳酸菌による発酵と酵母による発酵を同時進行させる場合、発酵を２４〜１６８時間行うことができる。また、乳酸菌として４８Ａ１２株を用いる場合、２４〜１６８時間である。

（エタノール添加工程）
上記製造方法は、基質を乳酸菌及び酵母で発酵させて得られた発酵物にエタノールを添加する工程（エタノール添加工程）を備えていてもよい。エタノールの添加量は、最終エタノール濃度を決定し、当該最終エタノール濃度になるように添加すればよい。最終エタノール濃度は、例えば、消費者の嗜好に合わせて決定すればよい。具体的には、例えば、最終エタノール濃度は、１．０〜１０．０ｖ／ｖ％とすることができる。

（グルコース添加工程）
上記製造方法は、乳酸菌及び酵母で発酵させる前、又は発酵中に基質にグルコースを添加する工程（グルコース添加工程）を更に備えていてもよい。添加したグルコースを酵母が資化するため、得られる乳酒のエタノール濃度をより高めることができる。添加するグルコースの量は、例えば、得られる乳酒のエタノール濃度が１．０〜１０．０ｖ／ｖ％となるように決定することができる。これに限られるものではないが、例えば、グルコースを０．０１〜０．２ｇ／ｍＬとなるように添加することができる。

〔乳酸菌のスクリーニング〕
（実験例１：変異株の取得）
市販されている乳酸菌（ヨーグルトスターター菌）（クリスチャンハンセン社）７種から、ラクトバチラス・デルブレッキに属する乳酸菌１３株及びストレプトコッカス・サーモフィラスに属する乳酸菌１５株を分離した。分離した株をこれらの株のラクトース分解率と併せて下記表１に示す。

［ラクトース分解率の測定］
５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に、上記乳酸菌株をそれぞれ１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養した。播種直後及び培養終了後直ちに上記スキムミルク中のラクトース濃度を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により測定した。ＨＰＬＣによる分析条件は以下のとおりである。
スキムミルク２００μＬを２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清２０μＬに希釈液（イノシトール（６６０ｍｇ／Ｌ）含有６７％アセトニトリル溶液）５００μＬを添加し、振とうし、静置した。続いて、この溶液を２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清８０μＬに超純水を１２０μＬ添加し、振とうし、フィルターろ過して固形分を除去した。これをＨＰＬＣ分析用試料とし、内部標準（イノシトール）法により、ラクトース濃度を測定した。ＨＰＬＣ分析条件は以下のとおりである。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ ４．６×２５０ｍｍ
サンプル注入量：１０μＬ
移動相：アセトニトリル７０．０％
移動相流速：１．０ｍＬ／分
カラムオーブン温度：４０℃
検出器：ＥＬＳＤ

得られたラクトース濃度から、ラクトース分解率を、下記式（Ｉ）により計算した。
ラクトース分解率＝（Ｃ_０−Ｃ_２４）×１００／Ｃ_０ （Ｉ）
Ｃ_０は乳酸菌を播種した時点での１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液中のラクトース濃度、Ｃ_２４は２４時間好気培養した時点での１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液中のラクトース濃度である。

表１に示した乳酸菌株の中から、ラクトバチラス・デルブレッキに属する乳酸菌３株（Ｎｏ．１０１３７、Ｎｏ．１０１４２及びＮｏ．１０１４８）、ストレプトコッカス・サーモフィラスに属する乳酸菌２株（Ｎｏ．１０１４１及びＮｏ．１０１５０）を選択し、変異原処理に供した。

［変異原処理］
各乳酸菌株にニトロソグアニジン処理を施し、変異株を作製した。ＭＲＳ培地に１０^５〜１０^７ｃｆｕ／ｍＬとなるよう各乳酸菌株を播種し、３７℃、２４〜４８時間前培養した。培養液に、生存率が１％程度となるように、ニトロソグアニジンを添加し、６０分間攪拌することによりニトロソグアニジン処理を行った。ニトロソグアニジンの添加量は、Ｎｏ．１０１３７が８００質量ｐｐｍ、Ｎｏ．１０１４２が８００質量ｐｐｍ、Ｎｏ．１０１４８が８００質量ｐｐｍ、Ｎｏ．１０１４１が４００質量ｐｐｍ、Ｎｏ．１０１５０が４００質量ｐｐｍであった。

ニトロソグアニジン処理後の乳酸菌をアナログ培地（１％イーストエキストラクト（日本ＢＤ）、１％ペプトン（日本ＢＤ）、２％２−デオキシ−Ｄ−グルコース（東京化成）、１．５％寒天（Ｗａｋｏ））のプレート上で塗抹培養した後、別のアナログ培地のプレート上で純化し、単一コロニーを得た。

［発酵試験］
変異原処理により得たコロニーを５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液中で３７℃、１６時間前培養した後、５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液０．２ｍＬに１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬとなるよう前培養液を添加し、４３℃で２４時間培養した。播種時点でのスキムミルク水溶液中のラクトース濃度、及び２４時間培養後のスキムミルク水溶液中のラクトース濃度を測定し、上記式（Ｉ）に従ってラクトース分解率を測定した。また、各変異株の親株についても同様にラクトース分解率を測定した。

ラクトース分解率の測定結果の一例を下記表２及び図１に示す。下記表２及び図１中、「Ｌｄ３７親株」は、Ｎｏ．１０１３７の株、「Ｌｄ３７−１〜Ｌｄ３７−１２」は、それぞれＬｄ３７親株から得られた変異株、「Ｌｄ４２親株」は、Ｎｏ．１０１４２の株、「Ｌｄ４２−１〜Ｌｄ４２−３」は、それぞれＬｄ４２親株から得られた変異株、「Ｌｄ４８親株」は、Ｎｏ．１０１４８の株、「Ｌｄ４８−２〜Ｌｄ４８−１２」は、それぞれＬｄ４８親株から得られた変異株である。

ラクトバチラス・デルブレッキに属する乳酸菌３株、ストレプトコッカス・サーモフィラスに属する乳酸菌２株を変異原処理することにより、ラクトース分解率が５５％を超える変異株を得ることができた。これらの変異株の中からラクトース分解率が特に高いＬｄ４８−５株を選択し、以下の実験に供した。

なお、Ｌｄ４８−５株は、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス４８Ａ１２株として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１５１５、受領日：２０１３年１月２１日）。本明細書中、Ｌｄ４８−５株を「４８Ａ１２株」とも称する。また、親株であるＮｏ．１０１４８の株を「４８Ｐ株」とも称する。

（実験例２：４８Ａ１２株の特性）
［増殖速度］
４８Ａ１２株（変異株）及び４８Ｐ株（親株）をＭＲＳ培地２００ｍＬに１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で５６時間好気培養した。経時的に培養液をサンプリングし、ＯＤ_６６０の値及び乳酸濃度を測定した。ＯＤ_６６０の値は、サンプリングした培養液を必要に応じて希釈し、自記分光光度計Ｕ−３２１０（日立株式会社）で測定した。乳酸濃度は高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により測定した。

ＯＤ_６６０の値及び乳酸濃度の測定結果を下記表３及び表４に示す。また、ＯＤ_６６０の値の測定結果を図２に示す。

４８Ａ１２株（変異株）の増殖速度は遅く、３０時間培養した時点でＯＤ_６６０の値が０．６７０であった。また、培養開始１２時間後から培養開始３０時間後までの比増殖速度をＯＤ_６６０の値から下記式（ＩＩ）により算出し、４８Ｐ株（親株）と比較した。
（ｌｎ（ＯＤ_６６０ｔ_３０／ＯＤ_６６０ｔ_１２））／（３０−１２） （ＩＩ）
ＯＤ_６６０ｔ_３０は培養開始３０時間後のＯＤ_６６０の値、ＯＤ_６６０ｔ_１２は培養開始１２時間後のＯＤ_６６０の値である。

その結果、４８Ａ１２株（変異株）の比増殖速度／４８Ｐ株（親株）の比増殖速度＝ｌｎ（０．６７０／０．１３４）／ｌｎ（４．７９／０．１５９）＝ｌｎ（５）／ｌｎ（３０．１３）＝０．４７３であった。すなわち、４８Ａ１２株（変異株）の比増殖速度は、４８Ｐ株（親株）の比増殖速度の０．４７３倍程度であった。

［β−ガラクトシダーゼ活性］
β−ガラクトシダーゼ定量システム（β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、プロメガ社）を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。上記システムは、β−ガラクトシダーゼが、基質であるＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を加水分解することにより、黄色のｏ−ニトロフェニルを生成することを利用するものである。ｏ−ニトロフェニルは４２０ｎｍの波長の光を吸収するため、ＯＤ_４２０の値は、β−ガラクトシダーゼ活性と相関する。

ＭＲＳ培地１０ｍＬを用いて、４８Ａ１２株（変異株）及び４８Ｐ株（親株）を、それぞれ３０℃で２４時間好気培養した。４８Ａ１２株（変異株）及び４８Ｐ株（親株）の菌体を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３分）にて集菌した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。菌懸濁液のＯＤ_６６０の値を自記分光光度計Ｕ−３２１０（日立株式会社）で測定した後、菌懸濁液にガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を３００ｍｇ添加して、ビーズ式破砕装置（ＦａｓｔＰｒｅｐ２４、ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を用いて菌体を破砕した。その後、上記システムのマニュアルに従い、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３分）した上清５０μＬをＯＮＰＧを含む反応液に懸濁させた。反応液は３７℃で３０分間遮光した状態で静置し、反応終了後直ちに反応液のＯＤ_４２０の値をマイクロプレートリーダー（μＱｕａｎｔ、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社）で測定した。

測定結果を表５に示す。ＯＤ_４２０／ＯＤ_６６０で示される４８Ａ１２株（変異株）の単位菌量当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性は７０．４であり、４８Ｐ株（親株）のβ−ガラクトシダーゼ活性（７．３８）の約９．５倍であった。

〔乳酒の製造１〕
（実施例１）
１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク（森永乳業社製）水溶液を基質とし、乳酸菌４８Ａ１２株（変異株）を１０^７ｃｆｕ／ｍＬ、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＡ株を１０^７ｃｆｕ／ｍＬとなるように添加した。２５℃で７２時間並行複発酵させ、実施例１の乳酒を製造した。

（実施例２）
１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に代えて２０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液を基質としたこと以外は実施例１と同様にして、実施例２の乳酒を製造した。

（比較例１）
乳酸菌４８Ａ１２株（変異株）に代えて乳酸菌４８Ｐ株（親株）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、比較例１の乳酒を製造した。

（比較例２）
乳酸菌４８Ａ１２株（変異株）に代えて乳酸菌４８Ｐ株（親株）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、比較例２の乳酒を製造した。

〔乳酒の評価１〕
実施例１〜２及び比較例１〜２の乳酒について、ｐＨ、エタノール濃度及びラクトース分解率を測定した。また、実施例１〜２及び比較例１〜２の乳酒の風味について官能試験により評価した。

（ｐＨの測定）
乳酒のｐＨは、ｐＨメーター（Ｆ−５１、堀場製作所）により測定した。結果を表７に示す。

（エタノール濃度の測定）
乳酒のエタノール濃度は、Ｆ−ｋｉｔ（エタノール、ＪＫインターナショナル社）により測定した。結果を表７に示す。

（ラクトース分解率の測定）
ラクトース分解率は、酵母及び乳酸菌添加前のラクトース含有量（Ｃ_Ｂ）（ｇ／１００ｍＬ）及び乳酒のラクトース含有量（Ｃ_Ａ）（ｇ／１００ｍＬ）を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により測定し、得られた測定値から下記式により算出した。
（ラクトース分解率）＝（Ｃ_Ｂ−Ｃ_Ａ）×１００／Ｃ_Ｂ
結果を表７に示す。

（官能試験）
官能評価は、１５名の訓練されたパネルにより、下記表６に示す基準で、乳臭さ、アルコール感及び総合評価について評点を付け、１５名のパネルの評点の平均値を求めた。結果を表７に示す。なお、乳臭さ、アルコール感及び総合評価のいずれも点数が高い程評価が高いことを意味する。また、各パネルには各乳酒の風味に関して自由にコメントしてもらった。代表的なコメントを併せて表７に示す。

同濃度のスキムミルクを基質とした場合、実施例１及び２の乳酒は比較例１及び２の乳酒と比較して、乳臭さが低減され、アルコール感が強く、かつ総合評価も高かった。また、実施例１及び２の乳酒は比較例１及び２の乳酒と比較してｐＨが高く、ラクトース分解率が高く、エタノール濃度が高い傾向にあった。

比較例１及び２の乳酒は、「酸味」、「ピリピリ感」等のフリーコメントが寄せられ、好ましくない酸味があった。一方、実施例１及び２の乳酒では、酸味に関して否定的なフリーコメントはなく、好ましくない酸味が低減されていた。また、実施例１及び２の乳酒では香りやその他風味に関しても肯定的なフリーコメントが多く、風味が向上していた。

〔乳酒の製造２〕
（実施例３）
実施例１の乳酒にエタノールを添加して、エタノール濃度を３ｖ／ｖ％に調整し、実施例３の乳酒を製造した。

（実施例４）
１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に代えて、１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に、発酵後の乳酒のエタノール濃度が３ｖ／ｖ％となるようにグルコースを０．０５ｇ／ｍＬ添加したものを基質としたこと以外は実施例１と同様にして、実施例４の乳酒を製造した。

（比較例３）
比較例１の乳酒にエタノールを添加して、エタノール濃度を３ｖ／ｖ％に調整し、比較例３の乳酒を製造した。

（比較例４）
１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に代えて、１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に、発酵後の乳酒のエタノール濃度が３ｖ／ｖ％となるようにグルコースを０．０５ｇ／ｍＬ添加したものを基質としたこと以外は比較例１と同様にして、比較例４の乳酒を製造した。

〔乳酒の評価２〕
上述した〔乳酒の評価１〕と同様にして、実施例３〜４及び比較例３〜４の乳酒を評価した。結果を、実施例１及び比較例１の結果と併せて表８に示す。

同じ製造工程を経た場合、変異株を用いた実施例の乳酒は比較例の乳酒と比較して、乳臭さが低減され、アルコール感が強く、かつ総合評価も高かった。また、フリーコメントから明らかなとおり、好ましくない酸味が低減されていた。

エタノールを添加してエタノール濃度を３．０ｖ／ｖ％に調整することにより、アルコール感の向上に加えて、乳臭さの低減が認められ、より総合評価の高い乳酒が得られた（実施例３）。実施例１及び３の比較（アルコール感の評点が０．８向上）、並びに比較例１及び３の比較（アルコール感の評点が０．２向上）から、変異株を用いた乳酒では、アルコール添加によるアルコール感の相乗的な向上効果が認められた。

基質にグルコースを添加することにより、乳臭さが顕著に低減され、アルコール感も向上した乳酒が得られた（実施例４）。実施例１及び４の比較（乳臭さの評点が０．９向上）、並びに比較例１及び４の比較（乳臭さの評点が０．３低下）から、変異株を用いた乳酒では、グルコースを基質に添加することによる乳臭さの低減という顕著な効果が認められた。

なお、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス４８Ａ１２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に寄託されており、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５１５（受託日：２０１３年１月２１日）の菌株である。

なお、Ｌｄ４８−５株は、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス４８Ａ１２株として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５１５、受託日：２０１３年１月２１日）。本明細書中、Ｌｄ４８−５株を「４８Ａ１２株」とも称する。また、親株であるＮｏ．１０１４８の株を「４８Ｐ株」とも称する。

Claims (10)

1. 乳成分を含有する基質を乳酸菌と酵母で発酵させる、乳酒の製造方法であって、
   前記乳酸菌が、ラクトバチラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ）又はストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属し、
   前記乳酸菌をＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で３０時間好気培養したときの培養液のＯＤ_６００の値が１．０以下であり、かつ、
   前記乳酸菌を５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養したときのラクトース分解率が５５％以上である、
   乳酒の製造方法。
2. 前記乳酸菌が、ラクトバチラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ）又はストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属する菌株を変異原処理して得られたものである、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記乳酸菌が、ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の変異株であり、
   前記変異株は、比増殖速度が親株の０．５倍未満であり、且つ単位菌量当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性が親株の９倍以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記乳酸菌がラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）４８Ａ１２株（ＮＩＴＥ ＡＰ−１５１５）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. 前記基質を前記乳酸菌及び前記酵母で並行複発酵させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
6. 前記基質を前記乳酸菌及び前記酵母で発酵させて得られた発酵物にエタノールを添加するエタノール添加工程を更に備える、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 前記乳酸菌及び前記酵母で発酵させる前、又は発酵中に前記基質にグルコースを添加するグルコース添加工程を更に備える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
8. 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）及びサッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
9. 請求項１〜８のいずれか一項の製造方法により得られた乳酒。
10. ラクトバチラス・デルブレッキ亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）４８Ａ１２株（ＮＩＴＥ ＡＰ−１５１５）又は下記（１）及び（２）を満たす、その変異株。
    （１）ＭＲＳ培地に１．１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬで播種し、３０℃で３０時間好気培養したときの培養液のＯＤ_６６０の値が１．０以下
    （２）５０ｇ／Ｌのラクトースを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク水溶液に１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬで播種し、４３℃で２４時間好気培養したときのラクトース分解率が９９％以上

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